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棉花枯萎病抗性鉴定方法

所属图书：棉花枯萎病综合防治研究作者：陈立昶;王卫军;宋锦花;承泓良;鱼汲胜出版时间：2012-10

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棉花枯萎病抗性鉴定方法

棉花枯萎病抗性鉴定是病原菌致病性分化、寄主抗性遗传、抗病机制、抗病种质筛选、抗病品种（系）选育等研究中一项不可或缺的重要基础之一。因此，建立一套准确而快速的鉴定方法对于开展棉花抗枯萎病育种和提高枯萎病综合防治等具有重要的理论和实践意义。

一、人工病圃鉴定

棉花枯萎病是寄主与病原菌在一定环境条件下相互作用的结果。因此，在研究菌系致病力分化和棉花抗枯萎病遗传育种规律过程中，必须使寄主与病原菌的互作关系得到充分体现，才会获得准确、可靠的试验结果。也就是必须使寄主（棉花）和病原菌（枯萎病菌）均处于良好的生长条件下；接种的病原物必须有适当的浓度和接种量；在寄主发育的适宜时期接种；供试验的寄主应有尽可能大的群体，保证寄主与病原菌的互作关系得以充分体现，还应尽最大可能地减少寄主个体间的互作和病原菌菌系间的互作，避免非接种病原菌的干扰，保证整套试验条件自始至终得以均一化。田间自然病圃鉴定，一般很难达到或满足上述鉴定条件的要求。人工病圃则是通过模拟自然病田的发病环境，设计成可添加接种病原物，又可调节水分，并限制病圃内水分流动，使研究者对鉴定条件的调控能力大为增强，所以，从理论上讲，人工病圃鉴定可获得较为准确可靠的结果。

（一）病圃的建立

在棉花枯萎病区选择地势平坦、肥力均匀、灌排方便、土质适合植棉的病地或重病地，按照植物检疫要求，采用两种接菌方法建立人工诱发病圃。有条件的地方可建立长20m，宽2m，深0.5m的水泥池，将土壤用氯化苦或氨水进行灭菌处理。人工接入带有棉花枯萎病菌的棉籽或麦粒培养物（菌）。

一种方法是在冬耕前，收取感病80%以上的棉秆和残枝落叶，铡成4～6cm长的小节，250～300 kg/亩，均匀地撒于地面，冬耕时翻入耕作层内接菌。若冬耕误了接种时机，可将带病接种用的茎枝，按上法铡成小节后，一层带病茎枝一层土，灌水湿润堆沤，春耕撒于土面，翻耕在耕作层接菌。这种接种方法，我国在20世纪50～60年代的抗性鉴定筛选时普遍采用，效果较好。

另一种方法是采用制备接种用的麦粒砂或棉籽菌载菌体，播种或移栽时，每穴接种培养好的棉籽菌载菌体20～30粒或麦粒砂载菌体5～8g，25～30 kg/亩。这种接菌方法，我国在70年代应用较多。

两种方法接菌建立的大田人工病圃，第一年最好种植感病品种，以检测病圃的均匀性。鉴定应用时一定要种植感病对照，要求用高感品种，发病率达80%以上，病指60以上，以确保病圃鉴定的准确性。

（二）菌种的选择

接种用的菌种，应选择致病力强的菌系，不仅棉花品种间抗性易于鉴别，而且鉴定出的抗病品种在病区适应性也广。谭永久等（1980）采用川F5（四川射洪）菌系，转接1～5代的菌种，寄主是洞庭一号，测定不同菌种的致病力（表4-1）。结果以选择1～2代菌种致病最强，3～4代菌种致病有所减轻。因此，抗性鉴定用的接种病菌来源，应选择本地区致病性强的菌系，采集当年大田发病3级以上的病株分离纯化制备成接种病原菌。

菌种代数发病株率（%）病指病菌含量（%）1100.0093.083.02100.0093.185.9396.071.042.0497.078.046.0591.072.843.0

表4-1 菌种转接代数与致病力

（三）接种病菌的分离繁殖

1.一级菌种分离

在棉花枯萎病的盛发期间，采取感病3级以上的棉花枯萎病株，分离时用镊子（镊子在火焰上灭菌）扯去病棉茎表皮，剪成5cm左右的小段，用0.1%的升汞液（升汞1g、浓盐酸2.5ml、蒸馏水1000ml）表面消毒1～2min，或用10%的漂白粉表面消毒3～5min，再用灭菌水冲洗3次，用灭菌剪刀剪成约5mm的小块，放入马铃薯蔗糖琼脂（PDA）培养基上，在25～28℃的恒温箱中培养，3天后长出菌丝，7天后可镜检菌落，挑取典型棉枯萎病菌丝转入PDA培养基斜面试管，在恒温箱中繁殖培养成一级菌种。

2.二级扩大菌种的培养

以8月中下旬制备为宜。实验室内宜用Zepek's培养液培养，大量培养采用浓淘米水加糖5%，装入500ml三角瓶内；或用按麦粒1份，砂2份配制的麦粒砂培养基，先将麦粒煮沸30mm，混合砂后装入广口瓶内。再经压力1.5kg/cm2灭菌1h，接种一级斜面棉花枯萎菌种每瓶1管，在25℃±1℃的恒温箱内培养10天。若采用浓淘米水培养基，每天必须摇振1～2次，以使病菌均匀加速生长，供制备三级菌种用。

3.三级接种用的菌种培养

以8月中下旬至9月上中旬为宜。菌种培养基用棉籽或玉米，浸泡24h充分吸水，滤至棉籽稍干无滴水，再用麻袋装入棉籽，每袋装相当于棉籽5～6kg，在压力1.5 kg/cm2灭菌1h。取出后冷至50～60℃时，每5kg棉籽接种二级菌液100ml，在26～28℃室内培养7天。待菌丝长满表面后，才逐渐降温，让菌丝生长深透，供翌年土壤接菌用。

（四）土壤接菌量

谭永久等（1980）报道，用每平方米9g、45 g、90 g和450 g棉籽菌粉及每平方米1800g麦粒砂载菌体等5种菌量，以洞庭一号（感）、69-128（耐）、川73-27（抗）3个不同抗感类型的品种研究鉴定菌量。结果以每平方米接种棉籽菌粉45～90g的菌量能明显区分出不同品种的抗性，是达到早期鉴定的适合菌量；每平方米1800g麦粒砂接种土壤发病过重，病势发展快，把抗病品种鉴定成耐病品种，不能正确反映出品种的抗病性。

一般品种的苗期抗枯萎病性鉴定，多在温室或纸钵或营养钵中进行，选用从未种过棉花的深层土壤，将培养出的麦粒沙病菌按土重量2%接菌，或用棉籽菌粉按土重0.5%接菌，充分拌匀，装入废报纸做成的营养钵内（纸钵用高10cm、直径7cm的铁皮卷成圆筒作模子，外面裹上旧报纸抽出后成纸钵），每个纸钵装接菌土250g。

田间病床的苗期抗枯萎病性的鉴定筛选，育苗苗床，松土一次后，每平方米均匀撒上棉籽菌粉90g，再松土6～8cm深，灌水后将苗床抹平，划格播种。人工水泥槽接菌按纸钵接菌方法进行。

（五）鉴定的诱发温度

温度对抗性鉴定的影响极大。朱荷琴等（1994）连续6年的鉴定试验表明，播种后1个月内日平均气温22℃左右，棉花出苗快，棉苗发病早，播种后20天见病株且病情发展迅速，播种后25～30天达发病高峰期，整个鉴定周期40天左右；在播种后1个月日平均气温低于20℃条件下，棉花发病缓慢，鉴定周期延长。综合诸多试验结果，在保持一定土壤湿度时，床温日平均20～25℃，经过25天后，感病品种发病病指达75以上；18℃以下发病最慢，25天的病指仅55.3，鉴定时间只好延长；26℃以上棉花长势快，高温高湿病指难升高，棉苗病症掩蔽，发病反而慢，25天的病指仅46.7，鉴定品种的抗性难区分。因此，鉴定中最适合的病床温度在23℃左右。早春播种气温偏低，可采用塑料薄膜盖病（苗）床以有利于提高床内温度。当气温在16～22℃时，盖上薄膜可提高床内温度4～8℃，对病菌侵染诱发病害有利，达到早期准确鉴定抗性。

（六）鉴定历期

利用不同品种在一定鉴定时期内发病指数的差异，以确定不同程度的抗病类型。朱荷琴等（1994）报道，播种后30天的调查结果抗、感品种（系）差异明显，充分体现出了各品种（系）的抗性水平，且感病对照达鉴定要求（病株率80%或病指50左右）。播种后26天的调查结果鉴别力较差，播种后35天的调查结果掩盖了部分抗病性材料的抗性。因此，棉苗发病后每4天左右调查一次，密切注意棉苗发病情况，掌握好感病对照达鉴定要求时的调查是十分重要的。综合多数试验结果，采用早期病床鉴定方法，感病品种5～10天出现症状，20天达到发病高峰，发病率达95%以上，病指70以上；20～25天增长率不大，只是为害程度加重。耐、抗病品种10～15天见病症，20天内病指分别为48.5和34.4，鉴定25天病指达64.8。说明抗、耐、感病品种早期鉴定的历期以25天为宜。鉴定时间短了，会把耐病品种（系）认为抗病类型，达不到早期快速鉴定目的。

苗期与成株期鉴定结果之间具有显著的相关性。1975～1979年四川省农业科学院棉花研究所对503个棉花品种（系）进行苗期鉴定和大田病圃成株期鉴定相关性的测定。其中，392个品种（系）相关性达极显著标准，79个品种（系）相关显著，这两者占93.7%，仅32个品种呈负相关，占6.3%。朱荷琴等（1994）对34个品种（系）同时进行苗期与成株期鉴定。并对鉴定结果进行相关分析，相关系数r=0.7819，达极显著水平。说明苗期鉴定与成株期鉴定的抗性趋势基本一致，苗期表现抗病的品种（系）蕾期仍然表现抗病，可利用早期（苗期）鉴定方法，鉴定品种（系）的抗病性。

（七）病圃使用年限

一般使用年限较长的老病圃棉花发病程度会逐渐减轻，病圃出现衰退现象。谭永久等（1980）于1976～1979年研究病圃连续种植抗病品种后病菌致病力的变异。结果表明，以连续种植抗病品种4年的病土，病菌致病力显著减轻；连续种植5年的病菌致病力减轻达极显著水准（表4-2）；在连续种植抗病品种8年后的病土，土壤中病菌的菌量减少显著。说明病圃长期种植抗病品种后，病土中病菌的致病力在逐年减弱，病菌数量逐年减少，致使发病程度逐年减轻。

连续种植年数抗病品种（%）感病品种（%）236.441.4352.563.5439.573.5530.159.2625.670.0

表4-2 病土连续种植抗感品种后病株率变化

朱绍琳等（1985）经多年试验后指出，病田连续种植2～5年抗病品种后，换种感病品种，蕾期发病株率及病指均随抗病品种种植年数的增加而呈下降的趋势，种植年数与病株率及病指呈显著的负相关（P＜0.05），r值分别为-0.8571和-0.8358。1983年种植抗病品种2～4年的，换种感病品种后，病株率和病指均显著高于抗病品种；而种植抗病品种5年的，则无明显的差异。1984年在另一块种植抗病品种5年的病田上，重复进行对比试验，感病品种与抗病品种的病株率和病指也无明显的差异。1984年在上年种植抗病品种4年和5年的两块病田上，继续按上年试验地段进行对比试验，结果表明，连续换种2年感病品种，发病株率和病指上升幅度不大，两块病田种感病品种的发病株率仅比上年分别高0.82%和1.28%，病指分别高0.92和0.82。不仅如此，种植抗病品种5年的病田，连续换种两年感病品种，与抗病品种相比，病株率和病指差异仍不显著。据室内平板测定，病田的土壤含枯萎病菌数也随种植抗病品种年数的增加而有减少的趋势。1983年测定，种植抗病品种2年的土壤枯萎病菌量为5.84×103个/g，3年的为3.75×103个/g，4年的为4.50×103个/g，5年的为0.50×103个/g。同一块病田种植抗病品种的土壤菌量，显著少于种植感病品种。

1987～1988年马存等（1992）在枯萎病田种植抗病品种86-1，连作10年后，再种感病品种，病指分别为27.2和6.8，抑菌效果为43.9%和76.2%。1990～1992年辽宁省农业科学院经济作物研究所试验，连作抗病品种10年以上病圃田间抑菌效果为56.2%，连作5年的抑菌效果为17.6%；测定土内菌量减少45.6%和59.2%。

总之，为了防止病圃病菌致病力的减退，影响抗性鉴定的准确性，可采取每年施入一定量带病棉秆补充接菌。同时，也可在病圃中多种植感病品种（系），借以繁殖病菌。朱荷琴等（1994）于1991年在原病圃基础上进行了加生土（多年未种植棉花的生沙土）和再接菌试验，病圃加生土25%和再接菌与对照（不加生土不接种）相比，各品种（系）的病指没有明显差异，加生土45%处理与对照相比，中棉所12病指差异不明显，冀棉11病指下降14.59，再接菌处理严重影响出苗（表4-3）。由于每年大量种植感病品种（系），在连续使用5年9轮鉴定试验后，仍不需要接菌，未出现病圃衰退现象。

品种（系）加生土25（%）45（%）对照接菌5g/m行长10g/m行长86127.83—28.42—×冀棉1172.2261.6176.2077.20×中棉所1230.8130.7328.3430.94×陕115528.74—26.26—×川732735.80—40.30—×北农878249.92—45.74—×

表4-3 病圃加生土和再接种后病指（米荷琴等，1991）

为减少因每年需大量枯萎病培养物接种于病圃所耗费的人力与物力，邵圣才等（1999）于1990～1995年在病圃进行了两种接种方法试验：①在病圃每年采用通气培养法生产二级枯萎菌种，再用棉籽培养物扩大培养后接种于病圃，每亩接种25kg棉籽（简称病圃1）；②在病圃的育种材料两行中间种1行感枯萎病品种，每亩用2.5kg感病品种种子，让枯萎病菌在感病棉株上扩大繁殖，待枯萎病发病达高峰期时，调查感病行和育种材料的病株率和病指后，将感病行棉株翻耕于土中，以扩大土中的枯萎菌量，称为活体繁殖枯萎菌（简称病圃2）。经过6年每年种植统一感病品种，比较两种不同接种方法后可看出，头两年病株率和病指差异不大，第三年后致病力的差异较明显地表现出来，种感病品种活体繁殖枯萎病的病圃，病株率和病指都高于棉籽培养枯萎病菌的病圃（表4-4）。证明生物活体繁殖比试管保存棉籽扩大培养物繁殖的枯萎菌生活力强，致病力高，对筛选抗病品种（系）有利。

处理项目1990年1991年1992年1993年1994年1995年活体接种（病圃2）病株率（%）63.471.293.593.5100.0097.6病指29.526.739.755.860.458.4培养物接种（病圃1）病株率（%）72.168.576.484.379.665.7病指31.227.632.940.839.730.6病圃2比病圃1病株率（%）-7.82.717.19.220.431.9病指-1.7-0.96.8*15.0**20.7**27.8**

表4-4 不同接种方法病圃致病力

1995年在两种病圃中，均于两行育种材料中间种1行感病品种。6月23日枯萎病发病高峰期调查结果，两种病圃的中间感病行平均发病率和病指差异显著，与种植感病品种地段的表现一致。感病品种活体繁殖枯萎病的病圃致病力强，且发病均匀，病株率53.7%～100.0%，平均89.4%；病指22.3～71.7.平均57.4。而棉籽培养菌种接种的病圃病株率7.2%～100.0%，平均63.4%；病指1.2～53.7平均29.7。中间行种感病棉株繁殖枯萎菌，可以克服土壤枯萎病菌的不均匀性。这是因为每年可将发病重地段的病株在翻耕时移至病轻地段，使之逐渐均匀，而培养物接种无法均匀病圃。

1991～1995年分别将上年两个病圃当选的抗病株行（基本无枯萎病）上升为株系，随机种放在两个病圃中继续鉴定抗病性。每年调查结果表明（表4-5），病圃2中筛选出的抗病株行在株系抗性鉴定时有97.3%～100.0%达到抗枯萎病标准，而病圃1筛选出的抗病株行，在株系抗性鉴定时只有82.5%～93.396%达到抗枯萎病标准。由此可见，用活体繁殖病菌的病菌对抗枯萎病鉴定的准确率高。这也与在枯萎病发病高峰时，对材料的抗性选择参照了中间感病行的发病程度有关。

处理项目1991年1992年1993年1994年1995年从病圃2中筛选的株行株系份数110.083.076.065.087.0达标率（%）97.398.8100.0100.098.9从病圃1中筛选的株行株系份数113.094.087.060.075.0达标率（%）82.392.685.193.388.0

表4-5 两种病圃对抗病性鉴定的准确率

二、苗期室内鉴定

与人工病圃法相比，苗期室内鉴定的优点是比较灵活、易搬动，可人为地控制发病条件，适合于种质资源材料和大批新品种（系）的抗枯萎病性筛选。研究结果表明，室内用毒素检测棉苗的致萎度能反映棉花成株期在田间病圃对棉花枯萎病的抗性程度，即室内用毒素检测棉苗为抗的品种（系），在病圃内也为抗病型，室内为感病反应的品种（系），在病圃内也为发病重的感病型。

（一）营养钵育苗鉴定抗性

用旧报纸或牛皮纸卷成10cm×7cm纸钵，每钵放入菌土250g（棉枯萎菌棉籽或麦粒培养物按土重0.08%～1.0%预先接入经消毒的沙壤土中），将钵放在铁皮框盘内然后播种。种子经温汤浸种并用杀菌剂消毒，每个品种（系）播种15个钵，每钵留苗5株。白天温度要求20～25℃，夜间15～18℃，土壤湿度保持在60%～70%。

调查方法、分级标准和抗病类型的划分与人工苗床病圃法相同。

（二）凝集素鉴定抗性

人工病圃诱发筛选抗病或耐病的品种（系）资源，都需要有一个适宜发病的环境条件和发病过程，需要较长时间，且往往受到自然条件的影响，有可能使本来感病的试验材料不能充分表现其感病性，又需较多的人力、物力投入田间鉴定工作。在室内人工控制条件下，用凝集素检测棉苗的抗病性，就可克服上述问题，加快育种进程。

自1888年StillmarK首次从蓖麻籽中发现凝集素以来，人们从植物及动物中陆续发现了凝集素。凝集素是一类具有糖专一性，可促使细胞凝集的蛋白质或糖蛋白。20世纪70年代以来，凝集素的研究在各个方面进展迅速，用途日益广泛，逐渐成为生物学研究中的一类重要物质。一些研究表明，在生物体中，凝集素在寄主与寄生物相互关系的作用中，可能作为对病原微生物的一个防御因素。如草藤（Rleia Cracca）凝集素能抑制土壤中分解其种皮的微生物生长；麦胚凝集素通过与绿色木霉（Trichoderwa viride）和腐皮镰孢（Fusarium solani）的菌丝尖端结合抑制其菌丝生长，孢子萌发和壳多糖合成，起到保护幼苗免被霉菌侵袭的作用。

刘士庄等（1984）研究表明，抗枯萎病棉花品种种子磷酸缓冲液（PBS）抽提液对兔血球的凝集作用明显高于感病品种，且其对兔血球的凝集力与品种抗枯萎病呈显著正相关。随后，刘士庄等（1987、1989、1996），张久绪等（1989、1990）和李琼等（1991、1992）进行了这方面研究，在理论与应用两方面均取得重要成果。

1.凝集力强度的划分标准

因为凝集素能使血红细胞凝集，所以，将棉籽或棉株有关部位浸提液与兔血红细胞发生反应，使兔血凝集。

在室温25℃左右，湿度不低于70%的条件下，用显微镜检查兔血球的凝集情况。凝集力强度用正、负符号分以下六级记录（图4-1）。

①“-”。血球基本分散（图4-1-1）。

②“+-”。血球基本分散，但有2～5个血球凝集（图4-1-2）。

③“+”。血球5～10个凝集在一起者较多，但分散血球仍居多（图4-1-3）。

④“++”。血球20个以下凝集在一起者较多，分散血球减少（图4-1-4）。

⑤“+++”。血球20个以上凝集在一起者较多，分散血球很少（图4-1-5）。

⑥“++++”。血球30个以上凝集在一起者较多，基本无单个血球（图4-1-6）。

2.凝集素与棉花枯萎病抗性的关系

棉花品种（系）对枯萎病抗性强、病指低，其棉浸提液对兔血球的凝集力强，血球分散度低。

109个品种（系）蕾期调查的病指与室内棉种浸提液对兔血球的聚集力测定比较，选用部分品种列于表4-6。从表4-6可知，高抗枯萎病的代表性棉花品种（系）86-1、52-128、57-681、73-27、陕836、鲁抗1号的田间病指较低，平均为1.8、5.4、8.9、9.8、7.4和4.2，其棉籽浸提液对兔血球凝集力都强，血球凝集程度达到+++，血球分散度均在1.0以下；高度感染枯萎病的代表品种岱字棉15号、达棉1号、豫棉69、邯郸14的田间病指很高，平均为82.2、65.0、43.6、71.1，其棉籽浸提液对兔血球的凝集力都很弱，凝集程度仅+-或-，血球分散度很高，均在3.5或4.0；对枯萎病抗性一般的棉品种（系）其病指多介于高抗和高感品种之间，其棉籽浸提液对兔血球的凝集力亦介于高抗和高感品种（系）之间。

图4-1 血红细胞凝集力强度划分（刘士庆等，1984）

棉花品种（系）病指分散度凝集力冀合30185.861.5++～++晋B65.782.5+～++鲁抗1号4.22.0++晋72.82.5+～++中3812.02.0++冀3558.93.0+临汾402310.92.0++

表4-6 棉种凝集力与田间病指比较（刘士庄等，1987）

棉花品种（系）病指分散度凝集力陕8367.41.5+++川41427.21.0+++521285.41.0+++576818.93.0+73279.83.0+8611.81.0+++C724.73.0+邯郸1471.13.5±豫棉6943.63.5±达棉1号65.04.0-岱棉15号82.23.5±珂31073.73.5±苏344635.83.5±

表4-6 棉种凝集力与田间病指比较（刘士庄等，1987）（续）-1

李琼芳等（1992）对4个中棉品种，3个海岛棉品种及6个半野生棉品种进行血凝活性测定与田间病圃抗枯萎病性的相关性分析结果说明，陆地棉中，抗、感品种间血凝活性有明显差异，中棉及半野生棉均有明显的血凝活性，具有一定的抗枯萎病性，海岛棉血凝活性弱，田间表现不抗枯萎病（表4-7）。

种子类型血凝活性病指数幅度平均等级幅度平均病指陆地棉～++++0～4.02.40.3～82.227.24中棉+～++2.0～3.02.525.2～45.730.45海岛棉～±3.5～4.03.7545.2～56.655.40半野生棉+～++2.0～3.02.510.7～17.913.23

表4-7 棉花种子凝集素的血凝活性与田间枯萎病指数的相关

室内测定血凝活性及田间抗性鉴定的相关系数为0.6716（李琼芳等，1992）、0.4937（刘士庄等，1989），均达1%极显著水准。这表明，室内棉籽浸提液对兔血球的凝集力测定，在鉴定棉种抗病性实践中，具有与田间病圃抗性鉴定同样的效果。

张久绪等（1990）报道，凝集素对枯萎病菌孢子萌发具有明显的抑制作用，其抑制效果与凝集素浓度呈正相关，浓度为4mg/ml、2mg/ml、1.25 mg/ml和0.5 mg/ml抑制效果分别为90.61%、991.98%、80.22%和36.67%。

3.棉花生育期中凝集素的形成与枯萎病发生的关系

（1）苗期

棉花子叶期和1～3片真叶期，抗、感品种各行凝集素的活性有明显差异。抗病品种凝集活性物质主要存在于根、茎内，子叶和真叶含量相对较少，感病品种的根、茎血凝活性弱，子叶和真叶无血凝活性。随着棉株生长，4～6片真叶期凝集素分布于全株，抗病品种根、茎、叶均表现血凝活性强，感病品种根、茎、叶的血凝活性均较弱，表明感病品种凝集素的形成较迟（表4-8）。

抗病类型品种子叶期1～3片真叶期4～8片真叶期根茎子叶根茎子叶真叶根茎子叶真叶抗861+～++±++～+++++～+++±～±+++++～+++～++7327+～++±++～+++++～+++±～±++～+++++～++++～+++～++感达棉1号±～+—+±——+±±±726870±—±——±±±±

表4-8 棉花苗蕾期各组织凝集素的活性比较（李琼芳等，1991）

（2）花铃期

在花铃期，抗、感品种间血凝活性差异不很显著，整个棉株各组织均表现明显的血凝活性。感病品种在这一生长发育阶段，凝集物质有逐渐增多的趋势，尤其是主根和中下部茎皮层，表现出较强的血凝活性。抗、感品种间血凝活性差异逐渐缩小，此时也正值棉田感染枯萎病的棉株在蕾期以后病情开始恢复时期，看来棉花生育过程中凝集素的形成，对感染枯萎病病株有促进恢复的作用（表4-9）。

抗病类型品种须根主根中下部茎皮层木质部皮层木质部皮层木质部上部茎皮层真叶抗861+++++++++++++++++++～+++～+++7327+++++++++++++++++++～+++～+++～++感达棉1号+++～++++～++±～+±～++726870+++～++++～+++++

表4-9 棉花花铃期各组织凝集聚的活性比较（李琼芳等，1991）

（3）吐絮期

棉花吐絮至拔秆，几次取样测定结果表明（李琼芳等，1991），皮层、叶、枝、铃柄和铃壳的血凝活性均强，无明显差异。收获时，测定抗、感品种健株的种仁血凝活性，两者有明显差异，抗病品种种仁的血凝活性强，感病品种种仁的血凝活性弱。收取抗病品种73—27棉株不同部位的自交铃种子，测定其血凝活性结果显示，不同部位的棉铃种仁浸提液的血凝活性有明显差异，以中部（3～8台）内围棉铃种子血凝活性强且稳定。

棉花凝集素广泛存在于陆地棉、中棉、海岛棉的3大棉种中。抗病品种的根和种仁凝集素粗提物，对棉枯萎病菌孢子萌发具有明显的抑制作用，棉花种子内凝集素活性程度与品种的抗枯萎病性呈正相关，血凝活性强的品种，抗性好，反之抗性差。至于棉花凝集素对自身的保护抵抗病原菌的生理功能，以及探索应用棉花凝集素导入组织细胞培育生物技术等，还有待进一步研究。

（三）枯萎病菌毒素鉴定抗性

镰刀菌酸（Fusaric Acid，FA）是Fusarium oxysporum中的几个专化型所产生的一种非专化型毒素。自1952年高又曼从F.oxysporum f.sp.lycopersice，F.oxysporum f.sp.vasinfectum和Gibberilla fujikuro首次分离并作为致萎毒素报道以来，先后发现镰刀菌酸可以使棉花、番茄、香蕉、亚麻和西瓜等萎蔫（Mace等，1981）。仇元等（1963）报道，棉花枯萎病病菌的培养滤液的50%稀释液，处理棉苗可使其萎蔫。丁正民（1979）和徐孝华（1984）用棉花枯萎病原菌培养滤液的粗提物，同样可使棉苗萎蔫。王贺祥等（1988）认为，棉花抗镰刀菌酸与抗枯萎病有一定的相互关系。

李成葆等（1990）用单一的镰刀菌酸纯品处理棉花，研究了它与棉花抗枯萎病性的关系。结果认为，镰刀菌酸可以用致萎性作为棉花品种抗枯萎病性鉴定的参考指标。

棉株根系吸收的FA运输到叶片后，具半透性的原生质膜被破坏，叶片的蒸腾作用所失去的水分远大于根系吸收的水分，破坏了水平衡，造成植株萎蔫。从表4-10可以看出，FA对感病品种的致萎性大于抗病品种。棉苗在100μg/ml浓度的FA溶液中处理6h后，抗病品种中，5173的茎萎蔫率和叶萎蔫率分别为41.2%和20.6%，而感病品种鄂荆92却达99.5%和94.7%。50μg/ml的FA对抗病品种作用小，中棉所12的茎、叶萎蔫率仅分别为5.9%和21.2%，感病品种冀棉11已达31.6%和52.6%。FA处理10h后，高浓度（100μg/ml）下，抗、感品种的茎、叶均已全部萎蔫，这表明，此时FA的作用已超过抗病品种所能忍受的范围，抗、感品种均表现出高敏感性，掩盖了其抗性差异。但低浓度（50μg/ml）下，抗病品种中棉所12的茎、叶萎蔫率分别为14.7%和53.7%，感病品种冀棉11已达68.4%和81.6%。由此可见，在一定的条件下，不同抗性品种对FA的致萎性反应差别很大，且与品种抗枯萎病性呈正相关性。

时间100μg/ml50μg/ml中5173鄂荆92中12冀棉11茎萎蔫（%）叶萎蔫（%）茎萎蔫（%）叶萎蔫（%）茎萎蔫（%）叶萎蔫（%）茎萎蔫（%）6h41.220.589.594.75.921.231.6对照0.00.00.00.00.00.00.010h100.0100.0100.0100.014.753.768.4对照0.00.00.00.00.00.00.0

表4-10 FA对棉苗的致萎性作用（李成葆等，1990）

病圃鉴定是评价新品种抗病特性必须经过的程序，其结果对反映该品种在自然情况下的抗病性具有很好的代表性。但因所需时间长和占据空间多，不适于大批材料的抗病性鉴定，而且，受环境条件影响较大，常常会影响鉴定结果的一致性和准确性。此外，还受季节限制。探寻和建立高效、快速、准确的鉴定方法，以满足棉花枯萎病的抗病性鉴定的需要，实属必要。彭姗等（2008）在总结和吸收以往棉花苗期抗枯萎病鉴定方法优点的基础上，研究了病圃鉴定法和液体培养棉花苗期孢子悬浮浸根法鉴定棉花枯萎病抗性的效果。结果表明，液体培养棉花苗期孢子悬浮液浸根法（接种浓度为107个分生孢子）鉴定枯萎病抗性，全周期只需要30天。运用这种方法，不仅可以鉴定出棉花品种对枯萎病菌的抗、感病性，还可以鉴定不同枯萎病菌菌株的致病力。对比不同浸根接种时间（10min、20min、30min、40min、50min、60min）对结果的影响，发现浸根接种40min可加快发病，鉴定结果和田间病圃鉴定的比较一致。

三、棉花枯萎病抗性的划分标准

棉花品种的抗性鉴定，主要是棉花品种或棉株受病菌侵染后不同程度发病的表现，通过发病率及发病强度的调查进行比较鉴别。病害发病高峰期不同，对抗性鉴别时间也有不同要求。

（一）病情调查

成株期鉴定枯萎病一般在花蕾期（6月下旬至7月中旬）进行田间调查，7～10天一次，连续调查3次。11月下旬拔秆时再进行剖秆考察，结合各次调查结果对棉花的抗病性进行综合评价。

苗期鉴定在棉苗开始发病后调查，7天1次，连续调查3次。

（二）病株分级

依棉株的发病程度将其划分为0～4级，共5级，其中，0级为健株，1级发病最轻，4级发病最重，棉株发病分级标准列于表4-11。

病级苗期蕾铃期剖秆0健苗、无病状健株、叶片无病状健株、茎秆木质部无病变症状

表4-11 棉花枯萎病株分级标准

病级苗期蕾铃期剖秆1子叶边缘呈黄色网状或子叶变黄发紫，真叶未显病状病株25%以下叶片表现叶色加深皱缩，叶脉呈黄色网状或叶片变黄，变红紫色等症状茎秆木质部病变（褐色）部分占棉株高度的25%以下2子叶和少数真叶变黄或发紫，叶脉呈黄色网状，株形出现矮化病状病株叶片26%～50%表现病状，株形明显矮化茎秆木质部病变部分占棉株高度的26%～50%3子叶和大部分真叶呈现典型病状，病叶变黄或发紫，叶脉呈黄色网状，株形矮缩或出现萎蔫51%～75%的叶片表现病状，株形矮缩茎秆木质部病变部分占棉株高度的51%～75%4棉苗萎蔫，青枯死亡76%～100%的叶片表现病状，严重时枯焦脱落，枝茎枯死，有时整株出现急性凋萎死亡茎秆木质部病变部分占棉株高度的76%～100%

表4-11 棉花枯萎病株分级标准（续）-1

（三）抗病指标

根据病圃调查结果，可依次求出以下指标。

1.发病株率

发病株率能较好反映棉花群体中棉株发病的频率，人工病圃中，以感病对照品种的发病率在75%左右为宜。由于1级病株与4级病株所造成的为害有较大差别，棉花发病率相同，如果棉花发病程度（级别）不同，棉花受病害损失差别较大，所以，发病株率不宜作为抗病鉴定的唯一指标。

2.病指

病情指数，又称病指，能够同时反映棉株发病率和发病程度，较为准确反映出棉花病害对其产量和品质造成的为害。但棉株发病程度会因病圃菌量、气候因素和发病条件的不同而出现较大差异，抗病鉴定中，很难控制使感病对照的病指正好在50左右，这样，易造成同一品种在不同地点或不同年份因棉株发病程度不同而所得的抗病鉴定结果不一致，重演性差，故病指仍然不宜作为抗病鉴定指标。

3.相对抗性指数（IR）和相对抗病效果（ER）

由于以IR或ER作为抗病鉴定指标，其比较标准的对象是感病对照品种，因为对照品种和鉴定材料所处的环境条件完全一致，这样，可以最大限度排除鉴定条件对鉴定结果的影响，有效提高了棉花抗病鉴定结果的准确性和可比性，大大减少了因鉴定地点或鉴定年份不同而造成的误差，重演性较好。所以，相对抗性指数（IR）和相对抗病效果（ER）最适合作为棉花抗枯萎病的鉴定指标。据吴征彬等（2000）研究结果，用IR和ER作为抗病指标所得抗病鉴定结果完全一致，说明这两种指标的抗病分级标准是合适的，两种指标可在抗病鉴定中选择应用。

（四）棉花抗枯萎病分级标准

以IR和ER为抗病指标，根据棉花的抗枯萎病程度可将棉花的抗病性分为免疫（I）、高抗（HR）、抗病（R）、耐病（T）和感病（S）5级（表4-12）。

指标IHRRTSIR0.00.1～5.05.1～10.010.1～20.0≥20.1ER100.099.9～90.190.0～80.180.0～60.1≤60.0

表4-12 棉花对枯萎病的抗性分级标准

四、棉花种质资源枯萎病抗性鉴定方法及抗性评价标准（马存等，2007）

（一）作物病虫害名称与概况

1.名称

中文名：棉花枯萎病

拉丁学名：Fusarium oxysporum schl.f.sp.vasinfectum（Atk.）Snyder et Hansen

英文名：Cotton Fusarium wilt或Fusarium wilt of cotton

2.概况

棉花枯萎病是棉花生产的重要病害之一，广泛分布于世界各主要产棉国家，对棉花生产造成严重威胁。该病在我国各棉区均有发生。据1982年全国普查，病田面积达2223万亩，占当年棉花种植面积的1/3。20世纪90年代，枯萎病在新疆维吾尔自治区各主产棉区呈扩展蔓延的趋势。1995年在新疆维吾尔自治区莎车县、和田地区因该病绝产3.3万亩，1996年又在新疆维吾尔自治区和田地区大面积流行为害。

（二）棉花枯萎病症状

棉花枯萎病可在棉株整个生长季节侵染为害，田间棉苗现蕾出现发病高峰。主要症状有5种。

1.黄色网纹型

病株子叶和真叶的叶脉褪绿变成黄白色，但叶肉不变色；叶片局部或全部变色，呈现黄色网纹状。这是枯萎病最常见的症状。

2.皱缩型

病株在5～7片真叶期，上部叶片发生皱缩、畸形，叶色深绿，叶片变厚；棉株节间缩短、矮化，表现为皱缩状。这种症状在现蕾期，气候条件适宜的情况下，田间可经常见到。

3.黄化型

病株子叶或真叶首先从叶缘开始，局部或整个叶片变黄，但不呈现黄色网纹，严重时叶片脱落。这种症状在温室抗性鉴定中最常见，也是苗期（三片真叶以前）枯萎病的主要症状。

4.青枯型

病株的子叶或真叶突然失水萎蔫，叶片变软，下垂，严重时棉株呈青枯干死，但叶片不脱落。这种症状在气温变化较大，尤其是大雨之后，气温突然升高的情况下，经常出现。

5.紫红型

病株的子叶或真叶局部或全部变成紫红色，随着病情的发展，叶片从边缘开始凋枯，致使叶片枯萎、脱落，棉株死亡。这种症状较少见，只有在棉花苗期遇较长时间的低温条件下才发生。

棉花枯萎病的症状并不是固定不变的，有时以一种症状为主，有时几种症状混合发生，有时前期是这种症状，后期又发展为另一种症状。其症状类型与品种及气候条件更为密切，尤其是气温和降雨。

（三）抗性鉴定方法

1.适宜鉴定地点和生育期

棉花枯萎病的抗性鉴定采用温室苗期纸钵土壤接菌法鉴定，可在任何具有温室（可保证温度在20～25℃）的地区进行，生育期以三片真叶以前的苗期为宜。

2.标准对照

鉴定中选用一个感病对照和一个抗病对照。抗病对照选择标准：在常规接菌量下病指小于10；感病对照选择标准：在常规接菌量下病指大于50。

3.鉴定材料种植方法

鉴定材料种植于温室，采用纸钵土壤接菌盆栽法。纸钵为直径6cm，高8cm，随后装入30cm×20cm×9cm的塑料盆中，3次重复，每重复6钵，共18钵，装入一盆中。每个鉴定材料1盆。将经160℃干热灭菌的无菌土与棉花枯萎病菌混匀，枯萎病病菌量为土重的2%～3%。随后装入钵中至2/3高度，放入盆中。播种前先浇300ml自来水，使钵中的土吸足水分，随后将已催芽的种子先拌杀菌剂，再摆放于钵中，每钵6～8粒棉籽。最后用无菌土盖上（高度与钵平齐），再浇入200ml自来水。

4.鉴定所用菌种

在我国由于棉花枯萎病菌7号小种分布最广，为此宜选用7号小种，但各地可根据当地的优势小种，选择所用菌系。

5.菌种的繁殖和接种浓度

菌种采用麦粒沙培养（麦沙比为3比1，先将麦粒用水煮涨为止，沥干水分后拌入细沙，装入罐头瓶，湿热灭菌2h；在超净台上将已培养好的枯萎病菌平板或斜面接入其中，随后置25℃温箱培养7～10天。

（四）调查记载方法

1.棉苗的管理

播种后将塑料盆置温室中，进行育苗。温室温度保持在25～28℃之间，切勿超过30℃，进行精心管理。棉苗拱土前，只要钵中土壤不会太干，一般不要再浇水。棉苗出土后，注意保持盆中的干湿度。土壤湿度保持在60%～90%为宜。早晚注意温度变化，防止温度太高和过低。

2.发病调查

在棉苗第一片真叶长出后，棉花枯萎病陆续开始发生，在播种后1个月左右开始调查各品种的枯萎病发生情况。调查采用V级分级法。可进行数次调查，当感病对照病指达50左右时，即可全面调查各品种的发病率，求出病情指数，进行校正后，评判各品种的抗病水平。

3.调查分级标准

温室苗期棉花枯萎病的主要症状为青枯型和黄色网纹型，真叶和子叶发生萎蔫，叶片变软，下垂，叶缘开始凋枯，叶脉变黄色，以致叶片枯萎，棉株死亡。

各病级分级标准如下。

0级棉株健康，无病叶，生长正常；

Ⅰ级 1～2片子叶变黄萎蔫；

Ⅱ级 2片子叶和1片真叶变黄萎蔫，叶脉呈黄色网纹状；

Ⅲ级 2片子叶及1片或1片以上真叶变黄萎蔫，叶脉呈黄色网纹状；棉株矮化或萎蔫；

Ⅳ级棉苗所有叶片发病，棉株枯死。

4.调查结果的统计

根据调查的结果，计算各品种的发病率和病情指数（简称病指）。

（五）鉴定结果的校正

由于地区间的鉴定存在差异，即使同一地点，年度、批次间，由于鉴定的外界条件不可能完全一致，鉴定结果可能有轻重不同。为此，必须对鉴定结果进行校正，即采用相对病指（简称相对病指）进行校正，方法为鉴定中必须设感病对照，在感病对照病指达50.0左右时进行发病调查。由于感病对照病指不可能刚好为50.0。为此，采用校正系数K来进行校正。K值的求法：感病对照标准病指50.0除以本次鉴定感病对照病指。