前言
苹果炭疽菌叶枯病 （ Glomerella Leaf Spot，GLS） 是中国苹果产区新出现的一种为害严重的流行性病害，主要为害苹果叶片，造成病叶早期干枯、脱落，也侵染果实引起坏死性斑点。该病不仅导致当季果实产量和品质的下降，而且大大削弱了翌年的树势，严重的威胁着苹果产业的发展。目前，对苹果炭疽菌叶枯病的防治仍以化学防治为主，但成效甚微。培育和种植抗病性强的优良品种是控制该病最为经济、安全、有效的措施。
随着分子生物学的快速发展，分子标记辅助选择技术逐渐成为植物抗病育种的有效手段。本书作者首先利用人工离体接种鉴定的方法，评价了苹果对炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，之后筛选出与苹果炭疽菌叶枯病抗性基因位点 （ R gls） 紧密连锁的 SSR 分子标记，然后通过全基因组重测序技术开发了与苹果抗炭疽菌叶枯病相关的SNP 及Indel标记，结合SSR标记定位的结果，进行了 SNP 及 Indel标记的验证，完成了对R gls基因位点的精细定位，最后利用筛选出的四个与R gls基因位点紧密连锁的分子标记在苹果栽培品种及品系中验证了标记的可靠性。
一是抗性遗传规律评价。利用2 个对苹果炭疽菌叶枯病高抗品种（系） ‘富士’ ‘QF-2’ 和两个高感品种 ‘金冠’ ‘嘎拉’ 为亲本配制了4个杂交群体 （‘富士’ב金冠’；‘金冠’ב富士’；‘嘎拉’ב富士’；‘富士’בQF-2’）。以杂交群体F1 植株为试验材料，对苹果炭疽菌叶枯病的抗性进行了鉴定评价和遗传分析。结果表明，4个杂交群体中抗、感植株的分离比分别符合1∶1、1∶1、0∶1和1∶0的理论比值，初步推测苹果抗炭疽菌叶枯病性状受隐性单基因控制，抗病基因型为rr，感病基因型为RR和Rr。
二是SSR标记的开发及抗性基因位点 Rgls的遗传定位。利用 207株 ‘金冠’ב富士’ 的杂交后代为试材，采用分离群体分组分析（BSA） 方法，构建 SSR 标记与抗性基因位点 Rgls连锁图谱。通过对300对均匀覆盖苹果染色体组的已发表的 SSR引物在亲本及抗感池中进行初步筛选，将产生多态性条带的引物进行群体验证，获得了两个与抗病性状相关的分子标记 CH01d08 和 CH05g05，这两个标记位于抗性基因位点 Rgls两侧，将其定位于 15 条染色体上。重组率分别为7.3%和23.2%。依据苹果基因组CH01d08和CH05g05标记之间的序列，自行设计了276对SSR 引物。最终筛选出9 对与 Rgls基因位点连锁的分子标记。这11个标记的遗传距离从0.5 cM 到33.8 cM，覆盖了49.2 cM的遗传距离，最近的标记为S0405127遗传距离为0.5 cM。Rgls基因位点两侧最近的两个标记 S0304673 和 S0405127 之间的物理距离为500 kb。
三是 SNP 标记和 Indel标记的开发、验证 R gls基因位点的精细定位。基于全基因组重测序技术共开发 SNP 位点 3399950个，InDel位点573040个。通过对△ （SNP-index） 的筛选，在全基因组范围内共得到33 个候选的 SNP 位点及所对应的29 个候选基因。通过与SSR标记定位结果相结合最终锁定 18 个 SNP 位点、30 个 InDel 位点，以及5 个候选基因。通过高分辨熔解曲线 （HRM） 分析技术对SNP 及 InDel标记进行验证。获得了 6 个 SNP 及 5 个 InDel 标记与R gls基因位点紧密连锁。通过对这1 1 个标记重组个体的分析，将 R gls基因所在位点的范围缩小为58 kb。
四是 5 个抗病候选基因的鉴定。通过对 5 个候选基因MDP0000686092、 MDP0000205432、 MDP0000120033、 MDP0000864010、MDP0000945764的生物信息学分析，并利用实时荧光定量PCR对经过炭疽叶枯病病原菌侵染后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h的7个时间段内，叶片中5个候选基因表达量变化进行分析。结果表明，5个候选基因均不同程度的响应炭疽叶枯病病菌的诱导，是苹果炭疽叶枯病的抗病相关基因。
五是分子标记可靠性验证。利用 4 个紧密连锁的分子标记S0405127、S0304673、SNP4236 和 InDel4254 对 50 个田间栽培品种和青岛农业大学选育出的优系进行了抗炭疽菌叶枯病的基因型鉴定，并结合其抗病的表型鉴定对4个标记的准确性进行了分析。结果表明4个标记的准确率分别为90.0%、94.0%、98.0%和96.0%，可以有效的应用于分子标记辅助育种。通过苗期对炭疽菌叶枯病抗性的选择，可以显著的减少成本，缩短抗病育种周期，加快抗病育种进程。
本书获得国家现代苹果产业技术体系岗位科学家专项资金建设项目 （CARS-27） 资助，具有一定的理论意义和实际应用价值。
青岛农业大学 刘源霞
2019年4月
