文献综述
苹果 （ Malus pumila Mill.） 是世界上栽培最为普遍的落叶果树之一，有着很强的生态适应性，地域分布极为广泛。中国不仅是苹果属植物的发源地之一，拥有悠久栽培历史和极为丰富的苹果种质资源，也是世界上最大的苹果生产国和消费国，在世界苹果产业中占有重要的地位。近年来，我国苹果栽培面积快速增长，苹果产量和质量得到了稳步提髙。据统计数据显示，2015年我国苹果栽培面积和产量分别达到232 万 hm2和 4300万 t，居世界首位。苹果在调整农业产业结构、增加农民收入、促进地方经济快速发展等方面发挥着越来越重要的作用。
病害是制约着苹果产业发展的重要影响因素。其中苹果炭疽病是苹果生产中普遍发生的一种重要病害，包括发生在果实上的苦腐病（Bitter rot of apple） 和主要发生在叶片上的炭疽菌叶枯病 （ Glomerella leaf spot，GLS）。苦腐病又被称作晚腐病，是苹果果实的三大病害之一，多在果实成熟期或半成熟期发病，主要是引起大量落果、果实腐烂，降低了果实的产量和商品价值。而苹果炭疽菌叶枯病是一种流行性很强的病害，由于该病潜育期短、发病快，在外界环境条件适宜的情况下从侵染到发病落叶仅需要3d或者更短的时间，造成树叶大量干枯、脱落，严重时形成二次开花，也侵染果实引起坏死性斑点，不仅导致当季果实产量和品质的下降，而且大大削弱了翌年的树势，严重地威胁着苹果产业的发展。特别是广泛种植于我国各大苹果产区的重要栽培品种 ‘金冠’ ‘嘎拉’ 品种极易感病，尤其是 ‘金冠’ 在世界苹果生产国中 （中国除外） 品种比例最高，这也是选择 ‘金冠’作为苹果基因组测序材料的重要原因。它不仅是生产上的优良品种，同时也是苹果育种的核心亲本 （陈学森，2015），所以炭疽菌叶枯病的侵染不仅仅是对 ‘金冠’ ‘嘎拉’ 等品种的侵害，而可能是对 ‘金冠’ 系、‘嘎拉’ 系苹果的为害。
化学药物防治是目前采用的主要防治方法，但成效甚微。所以急需培育出抗病品种从根本上解决该问题，同时也减少了果园化学试剂的使用，降低农药残留，保证果品的安全。但育种实践表明，要实现育种目标，在亲本选择与选配恰当的前提条件下，必须保证每个杂交组合有足够数量的后代群体，至少 3000株 （陈学森，2010），加上果树具有童期长 （6～12 年），基因组高度杂合，杂种后代广泛分离，自交不亲和，许多重要的经济性状是多基因控制的数量性状等特点，使得常规育种工作难度大、周期长。因此利用杂交后代早期选择技术，及早地剔除非目标基因的单株，减少杂种后代的数目，提高筛选效率，减少盲目性是提高育种效率的最实用有效的方法。
随着分子生物学技术的快速发展，特别是以DNA多态性为基础的分子标记技术在苹果育种中的应用，大大提高了目标性状早期选择的效率，缩短了育种周期，加快了新品种选育的速率。同时，通过构建高密度分子标记遗传图谱对重要农艺性状基因进行标记定位，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并验证其功能，阐明其作用机制，通过基因工程实现对果树性状的改良。
因此，揭示苹果炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，发掘与抗性基因紧密连锁的分子标记，构建精细的抗病遗传图谱对于定位抗病基因，研究基因功能，探索、掌握抗病机制，培育抗病品种有着重要的意义。
第一节 苹果炭疽菌叶枯病的发生与为害
苹果炭疽菌叶枯病 （ Glomerella Leaf Spot，GLS） 是近几年在中国大部分苹果主产区新出现的一种流行性很强的真菌病害。主要为害苹果叶片，造成病叶早期的干枯、脱落，也侵染果实引起坏死性斑点，导致苹果失去商品价值 （刘源霞等，2015）。该病于1988年首次报道于巴西，导致感病的 ‘嘎拉’ 苹果70%以上的叶片脱落，经鉴定其病原为围小丛壳Glomerella cingulate （Leite et al.，1988；Camilo＆Denar-di，2002；González et al.，1999，2003），为盘长孢状刺盘孢 Colleto-trichum gloeosporioides 的有性态，定名为围小丛壳叶斑病 （ Glomerella leaf spot，GLS），在中国被称为炭疽菌叶枯病。
1997—1999年在巴西6个苹果产区均发现了炭疽菌叶枯病，由于‘嘎拉’ 品种是巴西的主栽品种，所以该病严重威胁着巴西苹果产业，成为巴西苹果的主要病害 （Katsurayama et al.，2000；Crusius et al.，2002；Velho et al.，2014）。1998 年在美国田纳西州的两个 ‘嘎拉’果园中暴发了苹果炭疽菌叶枯病，引起大量落叶，这也是美国首次报道苹果炭疽菌叶枯病的发生，随后在佐治亚州和北卡罗来纳州也发现了这种病害 （González，1999，2003）。我国最早于2008 年发现了炭疽菌叶枯病 （王素芳，2009），2010年相继报道了在黄河故道苹果主产区发现了炭疽叶枯病，该病引起 ‘嘎拉’ ‘金冠’ 等苹果的大量落叶。尤为严重的是在 2011 年，据报道江苏丰县、安徽砀山、淮北等地栽培的 ‘嘎拉’ ‘金冠’ 等苹果品种大面积发生叶斑病，导致叶片干枯脱落，严重的造成果树二次开花 （宋清等，2012） （附图1-1）。经鉴定该病为苹果炭疽菌叶枯病，病原为围小丛壳 G. cingulata （宋清等，2012；Wang et al.，2012）。González 等 （2006）通过利用mtDNA-RFLP 对病原菌的甘油酸脱氢酶核苷酸序列进行分析，认为引起 GLS 的病原分别属于尖孢炭疽菌 C. acutatum 和围小丛壳G. cingulata。这两种菌分别归属于尖胞刺盘孢复合群和盘长孢状刺盘孢复合群 （王嶶等，2015）。王薇等 （2015） 的研究明确了在我国引起该病害的病原为果生刺盘孢 （ Colletotrichum fructicola） 和隐秘刺盘孢 （ C. aenigma），均归属于盘长孢状刺盘孢复合群。中国是否存在尖孢刺盘孢复合群的病原，还没有明确的结论。
一、苹果炭疽菌叶枯病的为害症状
由苹果叶枯炭疽菌引起的苹果炭疽菌叶枯病症状为 （附图1-2）：在幼叶上发病时，初期表现为红至黄褐色或红褐色小点，针尖大小，边缘不规则，病健交界不清晰。在老叶上发病时，初期表现为黑色坏死性病斑，病斑边缘模糊。在7—8月高温高湿或连续阴雨的条件下，病斑迅速扩展，2～3d便可使整个叶片失水、焦枯、变黑、坏死，很快脱落。感病叶片在环境条件不适宜时，病斑停止扩展，在叶片上形成大小不等的枯死斑，病斑周围的健康组织逐渐变黄，叶片呈现花叶状，病重叶片逐渐脱落。病斑的形状多为圆形或椭圆形，也可能形成不规则的形状。病原菌侵染果实时，前期为红褐色小点，然后变为圆形或近圆形红褐色斑点，病斑周围有红褐色晕圈，中间变为灰白色，微凹。在自然环境条件下果实病斑上很少产生分生孢子，与常见的苹果炭疽病的症状明显不同。叶片上的病斑多为直径在 1～2 mm的小斑点，也有少数病斑直径超过1 cm。后期病斑中央产生黑色小点 （分生孢子盘），呈轮纹状排列，病斑上形成大量淡黄色分生孢子堆，当孢子萌发时会在病斑上产生白色丝状物 （宋清等，2012；符丹丹，2014）。
二、苹果炭疽菌叶枯病的病原
苹果炭疽菌叶枯病的病原菌有性世代为 Glomerella cingulata （Stonem） Spauld＆Schrenk，属真菌子囊菌 （亚） 门，球壳目，小丛壳属，围小丛壳菌；无性世代为胶孢炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides （Penz.） Penz.＆Sacc.和尖孢炭疽菌C. acutatum J.H.Simmonds （González，2003）。在PDA 平板上培养的菌落特征为（附图1-2e）：菌落边缘完整，呈规则圆形，气生菌丝呈絮状，比较稀疏，边缘颜色为白色中间为淡灰色。分生孢子堆呈柠檬色或橙色（符丹丹，2014）。
三、苹果炭疽菌叶枯病的侵染规律
在一般情况下，苹果炭疽叶枯病病原菌主要在苹果的休眠芽和枝条上越冬，也可以以菌丝体的形态在病僵果、干枝、果台和有虫害的树枝上越冬。5月在条件适宜的情况下产生分生孢子，成为初侵染源，越冬的子囊壳也是初侵染源之一 （宋清等，2012）。病原孢子可以随着雨水或气流传播，经皮孔或伤口侵染后，进入苹果叶片或果实内。病害发生时，首先形成中心病株，随后迅速的向四周蔓延侵染，可多次侵染，最终造成病害大面积的发生。
Wang等 （2015） 的试验结果表明，温度和湿度是炭疽菌叶枯病发生的必要条件。苹果炭疽菌叶枯病病原菌分生孢子萌发的温度范围在15～35℃，最适宜温度为30℃。菌丝生长的温度范围在15～35℃，最适宜温度为25℃。炭疽菌叶枯病病原菌主要依靠雨水传播，病原菌分生孢子的萌发和侵染也需要自由水或高湿环境，而我国北方苹果主产区6—8月气温多在30℃左右，雨水充沛，满足了苹果炭疽菌叶枯病病原菌的传播、侵染和发病条件，是苹果炭疽菌叶枯病病害发生的高峰期。
第二节 植物与病原微生物互作的机制
植物虽然在充满多种潜在病原微生物的环境中生长，但是在多数情况下植物并不表现出感病，这表明，植物在与病原微生物共同进化过程中，为了防御病原微生物的入侵，逐渐形成一套天然的免疫系统（Takken et al.，2009；Boller et al.，2009）。
一、植物对病原微生物侵染的基础抗性（PTI）
研究表明，病原微生物表面存在着一些保守分子，而且很少发生变异，对维持微生物的基本生物学特征非常重要。这些保守的分子特征被称为病原相关分子模式 （Pathogen Associated Molecular Patterns，PAMPs） （Jones and Dangl，2006），例如细菌的鞭毛蛋白 （flagellin）。这些保守的分子并非病原微生物所特有，而是广泛的存在于微生物中（Zipfel et al.，2008），所以它们也被称之为微生物相关分子模式（Microbe-associated Molecular Pattern，MAMPs）。真菌的病原相关分子模式主要包括多聚半乳糖醛酸内切酶、麦角甾醇、木聚糖酶以及细胞壁衍生物葡聚糖和几丁质等；细菌的病原相关分子模式主要包括冷激蛋白、脂多糖、延伸因子 （EF-Tu） 及鞭毛蛋白等，卵菌的病原相关分子模式主要包括 β-葡聚糖及转谷氨酰胺酶等 （Van et al.，2008；Naito et al.，2008）。与之相对应，植物的细胞表面存在着识别病原相关分子模式的模式识别受体 （Pattern Recognition Receptors，PRRs）。P RRs是一类跨膜蛋白，具有高度的灵敏性和专化性，大都是存在于细胞表面的受体激酶或者具有亮氨酸重复序列的受体样蛋白 （LRR-RLP） （Fritz-Laylin et al.，2005）。例如，鞭毛蛋白的识别受体 FLS2 （Gomez-Gomez，et al.，2000；Chinchilla，et al.，2006）、水稻几丁质酶的识别受体CEBiP （Kaku et al.，2006）、延伸因子的识别受体EFR （EF-Tu receptor） （Zipfel et al.，2006）、水稻 Ax21 的识别受体 XA21 （Park et al.，2010）、拟南芥几丁质酶的识别受体CERKl （Miya et al.，2007；Wan et al.，2008）、水稻几丁质酶的识别受体OsCERK1 （Chen et al.，2010）等。在病原微生物与植物表面接触的瞬间，植物通过其细胞表面的PRRs感知病原微生物的 PAMPs，从而识别各类微生物，激活一系列的信号元件，启动植物的先天免疫反应 （Zhang，2010）。这种通过植物的PRRs感知 PAMPs并启动的主动防卫反应被定义为植物的基础抗性 （Basal Disease Resistance），也称为基础免疫 （Basal Immunity） （Boller et al.，2009）。该免疫过程被称为病原物相关分子模式触发免疫 （PAMP-triggered Immunity，PTI），可以激活植物体内的一系列抗病反应，包括激酶的活化、胼胝质沉积、PR-蛋白的表达以及miRNA 的合成等 （Navarro et al.，2008），从而帮助植物阻止了环境中绝大多数病原微生物的入侵 （赵开军等，2011；柏素花，2012；程曦等，2012）。
在PTI中，研究最为清楚的 PAMPs 及其相应 PRR 是细菌的鞭毛蛋白以及拟南芥中鞭毛蛋白的识别受体 FLS2 （Flagellin-sensing 2）。鞭毛蛋白是一种构成细菌鞭毛的粒状蛋白。在对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa） 的序列分析中发现，其鞭毛蛋白 N 端存在着一个肽段 （flg22），含有22个氨基酸，具有激发子活性。该区域在革兰氏阴性菌中高度保守 （Felix et al.，1999）。Chinchilla等 （2006）发现在模式植物拟南芥中，鞭毛蛋白的识别受体是富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶 （Leucine-rich repeat receptor-like kinase，LRR-RLK） FLS2。LRR-RLK是一类单跨膜蛋白，通常由富含亮氨酸重复序列的膜外功能区，跨膜区以及胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶区组成。FLS2能特异性识别并结合 flg22。现已证明番茄、烟草以及水稻中的FLS2 同源蛋白均对鞭毛蛋白具有识别功能 （程曦等，2012）。水稻白叶枯病菌 （ Xanthomonas oryzae pv.Oryzae） 的病原相关分子模式（PAMP） 是N末端具有一个硫酸化肽段 （axYS22） 的蛋白 Ax21，由17个氨基酸组成。 axYS22 结构在所有黄单胞菌属细菌中高度保守。而在水稻中能够结合并识别 axYS22的模式识别受体是LRRXII 亚家族的类受体激酶XA21 蛋白 （Lee et al.，2009）。几丁质是大多数高等真菌细胞壁的主要组成成份。源于几丁质的 N-乙酰几丁寡糖是许多植物的PAMP。水稻几丁质结合蛋白 （Chitin elicitor binding protein，CE-BiP） 和拟南芥的受体激酶 （LysM-containing chitin elicitor receptor ki-nase，CERKl） 是典型的真菌病原识别受体。水稻的几丁质结合蛋白是一类跨膜蛋白，带有两个胞外 LysM 基序，能够与几丁质结合，但缺少胞内蛋白激酶区域。这很可能暗示着CEBiP 介导的免疫反应需要其他受体的参与 （Kaku et al.，2006）。拟南芥的受体激酶含有三个胞外LysM基序和一个胞内丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，它能够在体外直接结合几丁质 （Lizasa et al.，2010）。
二、病原微生物对PTI的抑制
植物通过PRRs识别外来病原微生物的 PAMPs触发 PTI，成功抵挡了大部分病原微生物的侵入，保护宿主免受侵染。然而有少数病原微生物依然能够通过效应子抑制 PTI，从而成功避开宿主的防御，进而展开进一步入侵。效应子对P TI的抑制方式是多样的，一部分效应子可能促进病原物扩散或植物细胞养分渗漏 （Badel et al.，2002），一部分效应子有可能在卵菌及真菌侵染植物细胞并形成吸器外基质的过程中起到了框架结构作用 （Schulze-Lefert et al.，2003），一部分效应子则有可能对P TI过程中的一个或多个成分起到了抑制作用。
在植物的许多致病细菌中都具有III型分泌系统 （Type III secretion system，TTSS）。该系统能够使致病细菌直接将效应子送入宿主植物细胞中。细菌效应子常常通过模仿或抑制真核生物的细胞功能来实现病原菌对宿主的侵染。在拟南芥及烟草中，丁香假单胞菌株 DC3000 所分泌的效应子AvrPto以及 AvrPtoB 能够成功的抑制 PTI的防卫反应并促进细菌繁殖。对这两种蛋白结构的分析表明， AvrPto可能作为一种蛋白激酶抑制剂，与FLS2、 BAK1及EFR的激酶区域相互作用，抑制了 PRRs的激酶活性 （Xiang et al.，2008），并干扰了 FLS2-BAK1 复合体的形成 （Shan et al.，2008）。 AvrPtoB是一种类泛素连接酶蛋白，其酶活性与 FLS2 的泛素化及降解有关 （Gohre et al.，2008）。丁香假单胞菌的另一个效应子 HopAI1 是一个磷酸苏氨酸裂解酶，能够使丝裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activatedprotein kinases，MAPKs） MPK3和MPK6去磷酸化，从而实现了对PRR信号的传导终止，抑制了宿主PTI的功能 （Zhang et al.，2007）。
三、植物对病原微生物的基因对基因抗性（ETI）
病原微生物能够通过效应子的作用抑制宿主的 P TI防卫反应，从而成功的进入宿主体内。病原微生物的效应子是菌种甚至小种所特有的。然而在自然选择压力下，植物也相应的进化出能够特异性的识别这些效应子的受体，在植物细胞内部开启了由效应子触发的免疫反应（Effector-triggered immunity，ETI） （Takken and Tameling，2009）。该免疫主要依靠抗病基因 （Resistance gene，R gene） 所编码的NB-LRR （Nucleotide binding-leucine rich repeat） 蛋白产物起作用，它们能够识别病原菌效应子，激活并介导小种专化抗性。这种抗性通常伴随有局部细胞死亡即超敏反应 （hypersensitive response，HR）。
植物 NB-LRR 蛋白是植物细胞内的一类能与核苷酸结合并具有亮氨酸重复序列的蛋白质，是由一个多变的N 末端，C末端的LRR区域及一个NB-ARC结构域构成 （Elmore et al.，2011）。植物识别效应子并导致NB-LRR蛋白构象发生改变，从而将 NB-LRR 蛋白由抑制状态转变为激活状态，进一步诱导下游信号的转导 （Collier et al.，2009），从而实现对病原菌的防御反应。NB-LRR 蛋白对效应子的识别一般采用两种方式：间接识别和直接识别。间接识别大都是由病原效应子诱导特定的宿主蛋白发生修饰，修饰的宿主蛋白再激活 NB-LRR蛋白，完成抗病反应。拟南芥中的 RIN4 蛋白就是一种能够被病原效应子特定诱导的宿主蛋白。该蛋白是多种病原效应子 （ AvrRpt2、AvrRpm1、 AvrB 及 HopF2） 的靶标，在病原效应子的诱导作用下，RIN4蛋白被修饰，从而激活NB-LRR 蛋白，触发下游免疫应答。 Avr-Rpt2对RIN4的修饰作用是通过对RIN4蛋白的直接裂解完成的，从而激活NB-LRR蛋白RPS2介导的 ETI （Axtell et al.，2003）。直接识别是NB-LRR 蛋白与病原菌的效应子直接结合。例如，拟南芥中的RRS1-R 蛋白能够与茄科雷尔氏菌 （ Ralstoniasolanacearum） 的效应子Pop2 直接结合，从而启动了ETI应答 （Deslandes et al.，2003）。通过酵母双杂交实验也证明了亚麻的 TIR-NB-LRR 蛋白能够与亚麻锈病病菌的效应子Avr567相互作用，开启ETI应答 （Dodds et al.，2006）。
植物与病原微生物之间相互作用并协同进化的过程被 Jones 等（2006） 总结为 “之” 字形模型 （附图1-3）：这个过程可以分为四个阶段，第一阶段：触发 P TI。植物通过 P RRs识别绝大多数病原微生物的 PAMPs，从而引发基础抗性。第二阶段：抑制 PTI。病原微生物相应的进化出效应子来抑制 PTI，避开宿主的防御，对植物展开再次侵染，此时植物对病原微生物是感病的。第三阶段：触发 ETI。在自然选择压力下，植物进化出能够特异性识别相应效应子的 NB-LRR蛋白，激发防御反应，阻止病原微生物的进一步侵染。第四阶段：避开 ETI。病原微生物通过不同的进化策略，产生新的效应子，展开新一轮的入侵。
四、抗病分子机理研究对作物抗病育种的影响
长期以来，作物的抗病育种主要使用了小种专化性抗病性 （即过敏性坏死反应类型），由于病原微生物生理小种的变异，导致作物抗病性的 “丧失”，缩短了抗病品种的使用年限。而且随着作物产量水平的不断提高，农田生态条件的变化和作物抗性资源的消耗，许多新的病害逐渐显现。再加上抗病性多与不良农艺性状相连锁，所以要培育出优良的抗病品种越来越难。抗病分子机理的研究为作物抗病育种提供了新的发展思路。
一是重视 P TI的利用。植物细胞表面的模式识别受体对病原微生物相关分子模式的识别，诱导 P TI，是植物免受病害侵染的第一道防线。因此将 P TI 有效应用于作物抗病品种的选育，有望获得广谱性抗病品种。拟南芥中的受体基因 EFR 能够识别细菌延伸因子EF-Tu。Lacombe等 （2010） 利用农杆菌介导法将拟南芥中的受体基因 EFR 转入到烟草和番茄的基因组中，成功获得了转基因植株。经验证，转入 EFR 基因的植株可以抗假单胞菌属 （ Pseudomonas）、黄单胞菌属 （ Xanthomonas）、拉尔氏菌属 （ Ralstonia） 和农杆菌属（ Agrobacterium） 等不同属的病原细菌。这说明在育种中可以充分利用不同植物的模式识别受体基因来培育出具有广谱性、持久性抗性的作物新品种。
二是将 ETI 与 PTI 相结合。植物大多数 R-基因是专门为识别病原微生物效应子而进化的，而病原微生物的效应子是菌种甚至小种所特有的，所以尽管植物ETI 能很强的特异性抵抗某种病害，但是也容易激发病原微生物产生新的效应子而避开原有的 ETI，使抗性消失。如果在利用 ETI 时，结合利用 PTI，便可以达到两道防线共同作用的效果，可以有效地避免大面积推广的抗病品种因 ETI的丧失而造成重大的产量损失。在育种实践中，利用P TI 抗性较好的栽培品种作为育种材料，利用多基因聚合或多基因转化将多个优良抗病基因导入其中，有利于扩大作物的抗病广谱性，改良作物的 ETI 抗性。
第三节 抗病基因的分子鉴定方法
近等基因系法 （Near-isogenic Lines，NIL） 和分离群体分析法（Bulked Segregant Analysis，BSA） 是获取与抗病基因紧密连锁的分子标记的两种最经典的方法。
一、近等基因系法
近等基因系是指仅在目标性状存在差异的两种基因型个体，通过杂交及多代自交或回交分离而获得的群体 （Young，1998）。近等基因系法的基本原理是比较轮回亲本与近等基因系及供体亲本三者的标记基因型。当近等基因系与供体亲本具有相同的标记基因型，但与轮回亲本的不同时，则该标记就有可能与目标基因连锁 （Muehlbauer，1988）。近等基因系的建立一般需要连续自交或回交6～8 代，耗时较长，而且常会导致一些重要基因的丢失或形成连锁累赘，因而限制了它的应用。
二、分离群体分组分析法
分离群体分组分析法又称近等基因池法，是从近等基因系法演化而来的，属于双尾分析中的选择 DNA 基因池法 （selective DNA pooling，SDP）。Michelmore等 （1991） 首先利用 BSA 法在没有近等基因系的条件下通过对F2分离群体进行RAPD分析，成功的从100 个引物中筛选出3 个与莴苣霜霉病抗性基因 Dm5/8紧密连锁的 RAPD 标记。该实验的基本原理是：具有相对性状 （如抗病、感病） 的一对亲本杂交，在其后代分离群体中，根据个体表型或基因型分为两组 （如抗病组、感病组），选取两组中相同数量的极端差异个体，提取DNA，并进行等量混合，构建两个相当于近等基因系的基因池 （如抗病基因池、感病基因池），并对两个基因池进行标记的多态性筛选。由于两个基因池在遗传背景上是相似的，表型上的差异就有可能是由于某一目的基因的改变而造成的。因此两池间筛选出的多态性 DNA 标记就有可能是与目的基因连锁的分子标记。将多态性分子标记在后代分离群体上进行进一步验证，就可以分析出多态性标记与目的基因是否连锁以及连锁程度 （廖毅等，2009）。
分离群体分组分析法包括基于标记基因型的 BSA 法 （Giovannoni et al.，1991） 和基于性状表现型的 BSA 法 （Michelmore et al.，1991）。前者是根据已有图谱或标记信息对基因进行精细定位，后者是通过对分离群体中就某一性状表现极端差异的个体进行分组，构建两个相对性状的 DNA 池，并筛选与目的基因连锁的多态性标记，实现对基因的初步定位。BSA 法具有许多优点：如原理简单、操作方便、实用经济等，重要一点是克服了许多作物没有或者难以创建近等基因系的限制，所以被广泛应用于质量性状单基因的定位以及数量性状主效基因的定位。2007 年，Korol等对 BSA法进行了优化，在精密仪器的辅助作用下实现了对定位效应较大QTL的定位。许多学者从理论上和实践上都证明了 BSA 法对数量性状基因定位的合理性 （Wang and Paterson，1994；William et al.，1997；Chagué et al.，1997；Hill，1998；Mackay and Caligari，2000；Chantret et al.，2000）。
第四节 分子标记技术研究进展
一、分子标记概述
分子标记 （Molecular markers） 是 20 世纪 80 年代以来，继形态标记 （Morphological marker）、细胞标记 （Cytological marker）、生化标记 （Biochemical marker） 三大遗传标记之后，又诞生的一种以 DNA一级序列的多态性为基础的新的遗传标记。分子标记与其他遗传标记的不同之处在于，分子标记能够直接从 DNA 序列上找出差异。因此其具有如下的优点：一是准确性高，不受组织器官、个体发育时期状况、环境条件等因素的干扰；二是检测定位多，几乎遍及整个基因组；三是共显性好，有些共显性分子标记可有效的鉴别出二倍体中纯合和杂合基因型；四是多态性高，无需专门去创造特殊的遗传材料，自然就存在着许多等位变异；五是表现为 “中性” （即无基因多效性），与不良性状没有必然的连锁遗传，也不影响目标性状的正常表达；六是遗传稳定，可靠性强，检测速度快，操作简单。
二、分子标记的种类
根据分子标记的发展进程，可以将其归类划分为三代分子标记：第一代分子标记以扩增片段长度多态性分子标记 AFLP （Amplified fragment length polymorphism）、限制性片段长度多态性分子标记 RFLP （Restriction fragment length polymorphisms）、随机扩增多态性DNA分子标记 RAPD （Random amplified polymorphism DNA） 为代表。第二代分子标记以重复序列的重复次数作为标记，操作较为简单，易于分型，且为共显性标记，更便于进行遗传分析。其代表性标记为简单重复序列标记 SSR （Simple sequence repeat） 和简单重复序列间扩增标记ISSR （Inter-simple sequence repeat）。第三代分子标记以核苷酸多态性标记SNP （Single nucleotide polymorphism）、插入缺失标记 InDel （In-sertion-deletion）、拷贝数变异标记 CNV （Copy Number Variation） 为代表，在后基因组时代已被大量开发，并被广泛使用。这类标记的最大特点是数量多、范围广、为显性标记、易于高通量分型。
1.SSR标记
SSR （Simple sequence repeat），即简单重复序列，又称微卫星（Microsatellite），是Litt等1989 年提出，Moore等1991 年创立的。由1～6 个核苷酸为单位组成的串联重复序列 （Wang，1994），是 DNA复制和修复过程中，微卫星序列内发生滑链错配或不均等重组时，导致增加或缺失一个或更多的重复单元 （Levinson and Gutman，1987；Richards，1992），广泛分布于植物和动物的基因组中 （Tautz and Renz，1984）。每个SSR两侧具有相对保守的单拷贝序列，这为设计特异引物扩增SSR序列提供了模板。由于扩增产物中基本单元重复次数的不同，就形成了SSR座位的多态性。通常经过SSR引物扩增出来的PCR产物，可以经过聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳进行检测其多态性。SSR分子标记的优点在于信息量大、多态性高、重复性好、操作简单、呈共显性 （Kalia et al.，2011），因此被广泛应用于作物及果树等目标基因的遗传定位、遗传连锁图谱的构建、遗传多样性的检测以及分子标记辅助育种等方面。
SSR标记的开发：目前常见的 SSR标记开发的方法包括数据库检索法、构建与筛选基因组文库法、微卫星富集法以及省略筛库法等。其中数据库检索法是开发SSR标记既经济又有效的方法。充分利用现有的DNA序列数据库中的信息，搜索 SSR 序列，可以轻松的获得全基因组的所有SSR引物，省去构建基因文库、杂交、测序等烦琐的工作，节省了大量的时间和财力。随着高通量测序技术的快速发展，使得如GenBank、EMBL/EBI （European Bioinformatics Institute，http：//www.embl-heidelberg.de/）、NCBI （National Center for Biotechnology Information， http：//www.ncbi.rdm.nih.gov/） 以及 DDBJ （DNA Data Bank of Japan，http：//www.Ddbj.nig.ac.jp） 等公共数据库中各物种的基因组序列、转录组序列及EST序列等不断增多。结合在线软件SSRIT （ http：//archive.gramene.org/db/markers/ssrtool） 以及 SSRHunter 等来搜索SSR位点，利用 Primer Premier 5.0 或者利用在线引物设计软件Primer 3.0 （http：//primer3.ut.ee/） 根据位点两侧保守核苷酸序列设计特异性引物。
2.SNP标记
SNP 即单核苷酸多态性，是两个DNA序列中的某个位点由于单个核苷酸的变化而引起的多态性。SNP 标记的优点在于数量多，分布广，相对稳定，易于快速筛查和基因分型。
SNP 标记的开发：可以通过多种方式和方法实现对SNP 标记的检测和分析。一是质谱分析法。通过 PCR 扩增后，用质谱进行分析检测。二是HRM分析法。利用高分辨率熔解曲线 （High resolution melt-ing，HRM） 分析方法进行分型检测。三是芯片法。利用 SNP 标记芯片进行分型检测。四是测序法。通过高通量测序手段进行检测 （孙瑞，2015）。SNP 标记的开发主要依赖于含有大量测序序列的数据库，具有速度快、高通量的特点。随着测序技术的发展，特别是全基因组测序，不仅可以从全基因组中获得大量的SNP 位点，而且还可以了解到SNP 位点在基因组中的分布状况，对于我们进一步分析基因的功能及表达提供了更多的可能。基于参考基因组序列的分析方法包括：全基因组重测序 （Whole-genome re-sequencing，WGR）、转录组测序（RNA-seq） 和简化基因组测序 （Reduced-Representation Genome Se-quencing，RRGS）。
全基因组重测序是对已知物种基因组序列的前提下所进行的全基因组范围内的测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。优点：快速进行资源普查筛选，寻找到大量遗传变异，实现遗传分析及重要性状候选基因的预测。转录组测序的研究对象为某个体在某一特定的功能状态下所能转录出来的所有 RNA 的总和，检测的是某个体位于编码区的碱基差异。优点是能够降低成本，能够直接检测功能区碱基的序列变化，能够有效的检测分析基因的表达水平，更有可能找到直接与表型相关的 SNP 差异 （Geraldes et al.，2011；Li et al.，2012a）。简化基因组测序是对与限制性核酸内切酶识别位点相关的DNA进行高通量测序。RAD-seq （Restriction-site Associated DNA Se-quence） 和 GBS （Genotyping-by Sequencing） 技术是目前应用最为广泛的简化基因组技术，优点是可以大幅度地降低基因组的复杂程度，简化操作，同时不受有无参考基因组的限制，可快速有效地鉴定出高密度的SNP 位点，从而实现遗传分析及重要性状候选基因的预测。
3.InDel标记
InDel是指父母本之间在全基因组序列范围内存在的差异。一个亲本相对于另一个亲本而言，在基因组中存在着一定数量的核苷酸插入或缺失 （Jander et al.，2002）。InDel标记就是根据基因组中的这些插入或缺失位点，依据一定原则，在其上下游设计一些PCR引物能扩增出包含这些插入缺失位点的碱基片段，成为 InDel标记。基于全基因组重测序的 InDel 标记是遗传标记的一个重要来源，因其具有分布广、密度高、变异稳定、多态性强、基因型判别简单、检测容易等优点，受到越来越多的关注。InDel标记已广泛应用于目标基因的遗传定位、高密度遗传图谱的构建、目的基因的精细定位、生物遗传多样性的分析、种子纯度鉴定及分子标记辅助育种等多方面。Yu等 （2003） 利用InDel标记、RFLP 标记、SSR标记构建了一张向日葵的高饱和度分子标记遗传连锁图谱。Feng等 （2005） 利用日本晴和9311 序列筛选得到的分布于每条染色体的20 对 InDel标记和53 对 SSR 标记，分析鉴定了46份粳稻和47份籼稻的遗传多样性。葛敏等 （2013） 利用生物信息学对玉米全基因组进行扫描，发现可用于开发 Indel分子标记的插入缺失位点，同时成功地运用 Indel分子标记鉴定了玉米杂交种的纯度。Hayashi等将开发的9对InDel标记成功的应用于水稻抗性基因的筛选。
三、分子标记在苹果上的应用
1.分子遗传图谱的构建
分子遗传图谱 （Genetic linkage map） 是不同分子标记在染色体上的位置和相对距离的排列图，遗传图谱上的每个分子标记反映的都是与遗传特征有关的相应染色体座位上的遗传变异和多态性。分子遗传图谱的构建是基于染色体交换与重组的理论，它是分子遗传学研究中的重要领域，是对基因进行定位及克隆的基础，也是遗传育种的重要依据。随着分子标记技术的发展，图谱上标记的种类越来越多，标记的密度也越来越高。
起源于 “欧洲苹果基因组作图计划” 的第一张遗传连锁图谱于1994年由 Hemmat等人完成发表。该图谱以56 株 ‘Rome Beauty’בWhite Angel’ 的杂交后代为作图群体，构建了包含 360 个标记的父本和母本两个苹果品种的遗传连锁图 （Hemmat et al.，1994），实现了苹果遗传图谱构建的突破。2003 年，Liebhard 等以 ‘Fiesta’בDiscovery’ 的 267 株 F1 代杂交群体为试材，利用 SCAR、AFLP、SSR、RAPD标记等840个不同类型的分子标记构建了高密度的遗传连锁图谱 （Liebhard et al.，2003）。2009 年，Celton 等利用 93 个‘M.9’בR.5’ 的F1 杂交群体构建了17 个连锁群，包含了224 个SSR标记，42 个 RAPD 标记、18 个 SCAR 标记和 14 个 SNP 标记（Celton et al.，2009）。随着苹果基因组全序列的公布 （Velasco et al.，2010），利用全基因组重测序技术大规模开发 SNP 标记构建高密度遗传连锁图谱成为现实。2012 年，Antanaviciute等完成了以 ‘M.27’בM.116’ F1 代杂交后代为群体，构建了由306个SSR标记和2272个SNP 标记组成的高密度遗传连锁图谱，平均每一个标记间的遗传距离为0.5 cM （Antanaviciute et al.，2012）。同年 Khan 等构建了包含2033个SNP 和843 个SSR共2875个分子标记的苹果整合遗传图谱，总长为1991.38 cM。
2.DNA指纹图谱的构建与品种的鉴定
DNA指纹图谱因具有高度的特异性、稳定的遗传性和体细胞稳定性的特点，因此不受植物组织和器官的种类、生长发育阶段、环境条件等因素的影响，所以在苗期即可对品种进行快速、有效的鉴定，提高了鉴定的准确性和效率。高质量的指纹图谱不仅可以应用于种质资源亲缘关系的分析，遗传多样性的研究，还可以通过对苹果 DNA 指纹图谱的比较分析，从本质上找出生物个体间的差异，实现对苹果栽培品种的鉴别、新品种登记、注册和产权保护。
Koller等 （1993） 利用RAPD标记对11 个苹果栽培品种进行了鉴别。Gianfranceschi等 （1998） 利用两对SSR 引物对19 个苹果栽培品种的DNA进行扩增，成功的将 17 个苹果品种区分开来。祝军等（2000a） 应用 AFLP 技术，用筛选出的引物P32M46 绘制了我国苹果生产中常见的 25 个重要品种的 DNA 指纹图谱，通过对该指纹图谱的分析表明，苹果栽培品种在 DNA结构组成上具有较高的遗传多样性。祝军等 （2000b） 还利用AFLP 引物 P44M64 构建了5 个苹果矮化砧木基因型的DNA 指纹图谱，区分了供试的5 个矮化砧木的基因型并确定了他们之间的遗传关系。Liu等 （2014） 利用8 对SSR引物和60个苹果样品 （包括几个栽培品种和 ‘富士’בTelamon’ F1 实生苗）运用品种鉴定图 （Cultivar identification diagram，CID） 策略完成了第一张苹果品种鉴定图谱的构建，并证明了该方法能高效地应用于品种鉴别。
3.目标性状基因的定位
分子标记辅助选择育种和基因定位克隆的前提是筛选与目的基因紧密连锁的分子标记。控制苹果重要农艺性状的基因大多属于数量性状由多基因或主效基因控制，受环境因素影响大，并且由于果树的基因高度杂和，更增加了筛选分子遗传标记的难度。目前，研究进展较快，所获得的遗传距离较近的分子标记多来自于单基因控制的质量性状。
在苹果抗病性育种工作方面，研究最为广泛和深入的是对抗黑星病基因的研究。Yang 和 Krüger （1994） 首次报道了利用改进的分离分析法发现了一个与苹果抗黑星病基因Vf连锁的分子标记。随后，经过不懈的研究，不同类型的分子标记如 RAP D 标记、RFLP 标记、AFLP 标记、SSR标记等众多与苹果抗黑星病 V 基因连锁的标记被挖掘，与抗病位点连锁最紧密的分子标记的遗传距离仅为 0.5cM （Koller et al.，1994；Durham and Korban，1994；Tartarini，1996；Yang and Korban，1996；Yang et al.，1997；Tartarin et al.，1998；Xu and Korban，2000；Benaouf and Parisi.，2000；Gygax et al.，2004；Dunemann and Egerer，2010；Galli et al.，2010）。在果实品质育种方面，筛选出与控制果皮颜色主基因Rf连锁的分子标记，并将其定位在第九连锁群上 （Cheng et al.，1996；何晓薇等，2009）。与控制果实酸度、果形指数、果肉褐变等性状基因连锁的分子标记都有报道 （王雷存等，2012；Sun et al.，2012）。在矮化密植育种方面，田义柯等（2003） 筛选出一个与柱形基因Co基因位点的连锁距离为8.66 cM的RAPD标记。Moriya等 （2012） 在苹果第十条染色体上筛选出3 个与Co基因位点共分离的分子标记 （Mdo.ch10.12、Mdo.ch10.13 和Mdo.ch10.14），将Co基因定位在196 kb 个碱基区间内。
4.分子标记辅助选择
分子标记辅助选择 （Molecular marker-assisted selection，MAS） 是利用与目标性状紧密连锁的分子标记作为辅助手段进行选择育种。MAS可以不用测交或后裔测定，加速遗传改良的速度；独立于环境，增加可靠性；进行育种早期选择，提高育种效率；实验室操作，降低成本；对多基因、多个性状甚至全基因组选择，增加选择效率 （徐云碧，2014）。主要应用于：种质资源的有效鉴定、量化和表征遗传变异 （Tanksley et al.，1989；Gur and Zamir，2004）；对改良目标性状的基因或数量性状基因座 （Quantitative trait loci，QTL） 的定位、克隆和导入 （Peters et al.，2003；Gur and Zamir，2004；Holland，2004；Salvi and Tuberosa，2005）；对遗传变异的操作 （包括鉴定、选择、聚合及整合） （Collard et al.，2005；Francia et al.，2005；Varshney et al.，2005；Wang et al.，2007）；植物品种保护和特殊性、均匀性及稳定性测试过程 （CFIA/NFS，2005；Heckenberger et al.，2006；IBRD/World Bank，2006） 等。
MAS在苹果育种中主要应用于重要性状的筛选，杂种实生苗的早期选择，杂交亲本的选配，遗传转化中目的基因的检测等。Tartarini等（2000）报道了利用获得的与抗苹果黑星病的显性单基因Vf紧密连锁的RAPD标记测验了携带该基因个体，淘汰错误率为3%，保留错选率仅为0.02%。Cheng等（1996）利用与控制果色的Thd01基因紧密连锁的RAPD标记，在苹果实生苗发育早期进行了标记筛选，实现了对果色这一特定性状的早期选择，大大减少了人力物力的浪费。由苹果单基因Co控制的柱型性状有利于形成集约高效的现代苹果栽培模式，能够降低生产成本，提高产量。Moriya等（2012）所得到的3个与Co基因共分离的标记Mdo.chlO.12、Mdo.chlO.13和Mdo.chlO.14，对于柱型苹果杂交育种中对群体材料的早期选择、基因的克隆及转化有着重要意义。Nybom等（1990）利用M13作为探针，对64株枫树实生苗进行了DNA指纹验证，通过亲缘关系和系统分类分析，成功的实现了对其中56株枫树实生苗的身份认证。
第五节 研究目的与意义
苹果炭疽菌叶枯病是近年来高发且蔓延速度极快的一种真菌病害，目前尚没有有效的药物进行预防和治疗，对于感病的品种，特别是在高温高湿的季节，一旦发病将会带来毁灭性的为害。培育和种植抗病品种是防控植物病害的重要途径之一。随着分子生物学的快速发展，分子标记辅助选择技术逐渐成为植物抗病育种的有效手段。研究苹果对炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，筛选与苹果抗炭疽菌叶枯病基因连锁的分子标记对于抗病基因的定位、构建精细遗传图谱、进行图位克隆、基因功能验证及苹果抗病分子育种有着极其重要的意义。
本书采用两个高抗苹果炭疽菌叶枯病品种 （系） ‘富士’ ‘QF-2’ （‘秦冠’ב富士’ 杂交后代中的高抗品系） 和两个高感病品种‘金冠’ ‘嘎拉’ 做亲本配制了4个杂交群体 （‘金冠’ב富士’ F1代 207 株，‘富士’ב金冠’ F1代 95 株，‘嘎拉’ב富士’ F1代262 株，‘富士’בQF-2’ F1代 198 株），采用室内人工离体接种的方法对 F1单株进行了苹果炭疽菌叶枯病的抗性鉴定。首先采用 BSA （bulked segregation analysis，分离群体分组分析） 法和 SSR （simple se-quence repeats，简单重复序列） 分子标记相结合的手段筛选抗性标记，然后通过全基因重测序与BSA相结合的方法筛选与目标基因相关的SNP 标记和Indel标记，并运用高分辨率熔解曲线 （High Resolution Melting，HRM） 分析技术验证 SNP 及 Indel标记，进一步将目标基因进行精细定位，筛选与抗炭疽菌叶枯病相关的候选基因，以期揭示苹果炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，获得与目标基因紧密连锁的分子标记，实现抗性基因定位，为挖掘抗病的关键基因，探索病原菌与抗病基因的互作机制，实现分子标记辅助育种，提高苹果抗病育种效率打下基础。
