苹果对炭疽菌叶枯病抗性遗传的研究

苹果对炭疽菌叶枯病抗性遗传的研究

培育和种植抗病品种是防控植物病害的重要途径之一。研究苹果对炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，对筛选与炭疽菌叶枯病抗性基因连锁的分子标记，利用分子标记辅助育种有着极其重要的意义。

作者采用两个高抗苹果炭疽菌叶枯病品种 （系） ‘富士’和‘QF-2’ （‘秦冠’ב富士’ 杂交后代中的高抗品系）；两个高感病品种 ‘金冠’ 和 ‘嘎拉’ 为亲本配制了4个杂交群体，采用室内人工离体接种的方法对4个杂交组合的F1 单株进行了苹果炭疽菌叶枯病的抗性鉴定，以期揭示苹果炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，为发掘与抗性基因紧密连锁的分子标记，开展苹果抗炭疽菌叶枯病分子育种奠定基础。

第一节 材料与方法

一、植物材料

选择青岛农业大学苹果试验基地 （山东省胶州市） 2009—2014年种植的4个杂交组合的F1 群体及4个亲本作为室内人工接种鉴定的试验材料。4个群体分别是：‘金冠’ב富士’ F1 代 207 株、‘富士’ב金冠’ F1 代95 株、‘嘎拉’ב富士’ F1 代 262 株、‘富士’בQF-2’ F1 代198株。取样期间不喷施农药，其他管理正常。

二、供试病菌

室内人工离体接种采用的病菌取自山东省莱西市南墅镇上庄村的‘嘎拉’ 苹果炭疽菌叶枯病病叶。经鉴定病原为围小丛壳 G. cingulata （Wang et al.，2012）。

三、试验方法

1.菌种的培养及悬浮孢子液的配制

将收集到的 ‘嘎拉’ 苹果炭疽菌叶枯病病叶在25℃室内保湿培养3 d，从病叶上产生的分生孢子中，挑取单孢，在PDA培养基中培养，获得纯培养菌株，并在5℃冰箱中保存。接种前将保存的菌种转接到PDA培养基中，25℃活化，待菌落长满培养皿的2/3时，用接种环刮除气生菌丝，25℃继续培养2～3 d，直至培养基中长出橘黄色分生孢子角。

用接种环挑取适量分生孢子角，放入盛有无菌蒸馏水的烧杯中摇匀，用血球计数板检测孢子悬浮液浓度，调至104 个/ml备用。孢子悬浮液现配现用，放置时间不超过1h。

2.分生孢子萌发力测定

在洁净的单凹载玻片上滴一滴苹果炭疽病菌孢子悬浮液，然后盖上盖玻片，放入底面盛有少许水的培养皿中，盖上皿盖，放入 25℃培养箱中培养12 h。显微镜下观察孢子的萌发力。孢子平均萌发力在20%以上均为可用。

3.样品采集及室内抗病性鉴定

从供试苹果树上剪取一年生健壮的新梢，每个材料取 4 个枝条（2个用于接种鉴定，2 个用作对照），剪除枝条两端，保留顶部4 个完全展开的叶片。

用0.6%的次氯酸钠对叶片表面消毒，然后用无菌水冲洗，沥干，用小型喷雾器将摇匀后的分生孢子悬浮液均匀喷洒到叶片正反两面，至叶片刚刚开始流水为止。将接种及喷有无菌蒸馏水的枝条 （对照）均匀分插到两个孔穴盘上，置于装有适量蒸馏水的泡沫箱内，加盖密封保湿，置于25℃恒温培养箱内暗培养。4d 后进行抗性鉴定和数据记录，将叶片上无病斑的定为 “抗病”，记为 （R），把有病斑的定为“感病”，记为 （S）。卡方检验采用SPSS13.0软件进行分析。

鉴于该病尚无有效防治措施，为防止病原传播，作者未进行田间接种鉴定。

第二节 结果与分析

一、不同苹果品种（系）对炭疽菌叶枯病的抗性表现

通过室内人工接种对4个杂交组合中的4 个亲本及1 个相关品种进行抗性鉴定 （表2-1）。‘富士’ 和 ‘QF-2’ 的叶片无病斑，表现为对炭疽菌叶枯病的高度抗性；‘金冠’ ‘嘎拉’ 和 ‘秦冠’ 的叶片均出现病斑，且病斑数均在20 个以上，表现出对炭疽菌叶枯病易感染性。

亲本叶片平均病斑数抗病性富士0抗病（R）QF-20抗病（R）金冠21.1感病（S）秦冠22.8感病（S）嘎拉22.4感病（S）

表2-1 不同苹果品种 （系） 对炭疽菌叶枯病抗性的室内接种鉴定

离体接种鉴定结果 （附图 2-1） 表明，不同品种和 F1 杂交后代单株对炭疽菌叶枯病抗感表现差异明显。而且这一结果与田间抗性调查结果相符 （附图2-2）。在安徽砀山发病区，‘嘎拉’ （附图2-2 左图） 和 ‘秦冠’ （附图2-2右图） 苹果树干上嫁接 ‘富士’ 枝条，染病后，‘嘎拉’ 和 ‘秦冠’ 的叶片已经全部脱落，‘嘎拉’ 仅剩下光秃的枝干，‘秦冠’ 仅剩下果实，与 ‘富士’ 枝条上翠绿的叶片形成鲜明的对照。这充分显示不同品种 （系） 对苹果炭疽菌叶枯病的抗性差异明显，遗传性对苹果炭疽菌叶枯病的抗性起着主导作用，同时也证实了上述品种 （系） 可以作为苹果炭疽叶枯病遗传规律研究的典型材料。

二、苹果F1植株对炭疽菌叶枯病抗性表现及抗性遗传规律分析

在 ‘金冠’ב富士’ 组合的F1 代群体中，共调查了207株，其中抗病株为 93 株，感病株为 114 株，经适合性检验， x20.05=1.07 （ P＞0.05）；在 ‘富士’ב金冠’ 组合的 F1 代群体共调查 95 株，其中抗病株为 40 株，感病株为 55 株， x20.05=1.20 （ P＞0.05） （表2-2）。二者卡方值均小于 x20.05=3.84， P 值均大于0.05，说明样本的抗病与感病的表型比值符合1∶1的理论分离比，初步判断该试验组合中苹果对炭疽菌叶枯病的抗性由单基因控制。计算 ‘金冠’ב富士’ 组合正反交之间抗感差异得卡方值0.21 （小于 x20.05=3.84），二者没有显著性差异，说明苹果抗炭疽菌叶枯病为细胞核遗传，不受胞质遗传物质影响，即不存在母性遗传效应。

杂交组合株数总株数抗病感病抗感比抗感比期望值x2P金冠×富士207931140.82∶11∶11.070.30富士×金冠9540550.73∶11∶11.200.27嘎拉×富士26242580.02∶10∶1—0.12富士×QF-2198195365∶11∶0—0.25

表2-2 杂交F1 代植株对苹果炭疽菌叶枯病的抗性表现

在 ‘嘎拉’ב富士’ 杂交后代群体中，共调查了262 株，出现了4株抗病单株，经适合性检验， P值为0.12，大于0.05，无显著性差异，符合0∶1 的理论比值，表明该杂交后代抗病对感病呈隐性单基因遗传；‘富士’בQF-2’ 杂交后代群体中共调查了198 株，出现3株感病植株， P值为0.25，符合1∶0的理论比值 （表 2-2），说明该杂交后代抗病性受单基因控制。

综合上述研究结果，可以确定苹果对炭疽菌叶枯病的抗性由隐性单基因控制。

三、苹果杂交亲本及后代对炭疽菌叶枯病抗性的基因型推测

综合不同杂交组合的亲本及后代对苹果炭疽菌叶枯病抗性的表型性状分析结果，可以假设本试验群体中，对苹果炭疽菌叶枯病表现为抗病的植株基因型为rr，感病植株为 RR或 Rr，并由此推测出供试亲本品种 （系） ‘富士’ ‘金冠’ ‘嘎拉’ ‘QF-2’ 的基因型分别为 rr、Rr、RR和rr，‘秦冠’ 为Rr （附图2-3）。

第三节 讨论与小结

病害的发生是寄主与病原菌在一定环境条件下相互作用的结果。所以接种条件和病原菌的致病性对寄主的抗性鉴定结果有着重要的影响。根据Wang等 （2015） 的试验结果，25℃是苹果炭疽菌叶枯侵染的最适温度，自由水或高湿条件是分生孢子萌发的必要条件，接种后第4d病斑数达到最大值，特征最明显。本试验所采用的接种方法和试验条件是根据Wang等 （2015） 所得出的试验结论进行的，采用适宜的孢子浓度、温度、湿度和最佳病斑计数时间，使寄主与病原菌的互作关系得到充分体现。所用的病原菌是从 ‘嘎拉’ 感病叶片上采集、分离、纯化的，对 ‘嘎拉’ ‘金冠’ ‘秦冠’ 等具有强致病性，保证了鉴定结果的可靠性。

目前对于苹果炭疽菌叶枯病的一些报道还仅限于对引起病害的相关因素、病原菌的生理学、致病机制、寄主响应及防治措施等方面的研究 （González，2006；Wang et al.，2012；Velho et al.，2014；Araujol and Stadnik，2013；Wang et al.，2015；王薇等，2015），对于抗性遗传规律、分子标记定位等研究少有报道。

作者利用4个杂交群体的后代个体对炭疽菌叶枯病抗性表现进行了综合分析，得出苹果杂交后代中抗炭疽菌叶枯病受隐性单基因控制的结论，这与Dantas等 （2009） 研究认为 ‘嘎拉’ ‘富士’ 等苹果品种对炭疽菌叶枯病的抗性是由一对隐性基因控制的结果相一致。作者认为抗病基因型为rr，感病基因型为 RR或 Rr，由此推测供试杂交群体的亲本品种 （系） ‘富士’ ‘金冠’ ‘嘎拉’ ‘QF-2’ 的基因型分别为rr、Rr、RR和rr，‘秦冠’ 的基因型为Rr。由于苹果在遗传构成上高度杂合，又是自交不亲和植物，杂种树童期较长，对苹果树抗病遗传规律的研究很难采用和借鉴其他作物的遗传群体创建方法，如通过自交，回交，侧交等手段获得 F2、BC 等分离群体。本试验采用 4个不同的杂交群体后代对炭疽菌叶枯病的抗性进行表型鉴定，这一方法可以为类似的果树抗病性遗传研究提供参考。