Isolation and Identification of Endophytic Fungi from Hot Pepper

Isolation and Identification of Endophytic Fungi from Hot Pepper

内生真菌是指那些生活在植物组织内的真菌，用以区分生活在植物表面的真菌。对植物内生真菌的研究可追溯至19世纪末，在100多年的研究中取得了丰硕的成果[1～3，7～9]。内生真菌与植物之间存在密切的互利共生关系，对植物的生理代谢调控和生长发育有较大的影响，目前还未发现不存在内生真菌的植物种类。我国也从大量的植物中报道了内生真菌的存在，寄主种类涉及林木、蔬菜及花卉植物[10～16]，但还有相当数量的植物内生菌没有被研究过，进一步深入开展植物内生菌的研究，对于丰富各类菌物的生物多样性知识和植物内生菌资源的应用开发具有十分重大意义。

辣椒是国民经济中重要的蔬菜作物，但发生在辣椒上的病害较多，对辣椒的生产带来了不利的影响，在内生真菌表现巨大生防潜力的前提下，未见到辣椒内生真菌的报道，因而开展辣椒内生真菌的研究，以期从中筛选出有生防价值的内生真菌，必将会促进辣椒的生产并带来不可估量的经济和生态效益。

1 材料与方法

1.1 供试辣椒及采样方法

山东省莱阳市莱阳农学院园艺系蔬菜大棚种植干制椒型辣椒。选择生长性良好、无病虫害症状的健康辣椒植株的叶片、茎秆及果实，分别于发芽期、幼苗期、开花坐果期和结果期采样。植株采下后装入无菌塑料袋中，带回实验室立即进行分离。

1.2 研究方法

1.2.1 内生真菌的组织分离法 所有的叶片和茎秆样品在蒸馏水冲洗2次，然后浸没在70%酒精1min，3%次氯酸钠4min，然后再在70%酒精中浸没30s，灭菌水中洗3次，每次洗1min。经过表面消毒的组织，切成5～7mm的组织块，无菌操作下转移至PDA培养基（pH值6.8，马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂15g；121℃灭菌15min）上，倒平板前加入100μg/ml的土霉素以抑制细菌的生长，取最后一次冲洗组织的灭菌水倒于平板上，以检查表面消毒是否彻底。

1.2.2 内生真菌的稀释分离法 组织表面消毒的方法同1.2.1，将经过表面消毒的叶片和茎秆在灭菌的研钵中研碎，加入等体积的灭菌水稀释，然后用移液器吸取1ml组织悬浮液转于PDA培养基（加入100mg/ml的土霉素）上，然后用灭菌玻棒涂平。

1.2.3 种子内部真菌的分离 将种子用70%酒精浸泡30s，很快放入无菌水中冲洗3次，然后置于铺有灭菌滤纸的培养皿内，并加入少量灭菌水，加入的量以润湿滤纸为佳，每皿中放入5粒种子。

1.2.4 内生真菌的培养、纯化、保藏及计数 为了便于分离生长缓慢的真菌和产孢能力低的真菌的生长，将一半平板放入26℃培养箱中培养，另一半平板放入37℃中培养。每天进行检查，一直到30天后，将长出的真菌及时进行分离、纯化及保藏（4℃，PDA斜面）以便进一步进行鉴定，并记录不同部位分离出的菌株数。

1.2.5 内生真菌的鉴定 从培养的菌落上挑取菌丝制成临时玻片进行观察，如果观察的菌丝及分生孢子梗大量聚集在一起，不易看清结构，则应先将菌丝置于滴有1滴70%酒精的载玻片上10s，然后将玻片倾斜倒去酒精，并用吸水纸将酒精彻底吸净后，再在菌丝及分生孢子梗上滴1滴水制成临时玻片放在光学显微镜下观察，拍照，测量孢子大小，并记录形态特征，所有鉴定的菌种均以在PDA培养基上生长的特性为标准，参考有关书籍进行鉴定[4～6]。

2 结果与分析

2.1 不同分离方法对辣椒内生真菌分离的影响

采用不同的分离方法得到的菌株数不同，稀释分离法得到的菌株数较多，而经组织分离法得到的菌株数少（表1），但稀释分离法得到的菌株不易纯化，而组织分离法得到的菌株易纯化。从种子中分离得到的内生真菌数量较少，仅占到总分离菌株数的7.8%；叶片和茎秆上分离到的菌株数无多大差别。

tissuedilutedisolationmethodtissueisolationmethodnumberofisolatesfrequenceofisolationnumberofisolatesfrequenceofisolationleaf4730.03219.1stem4023.83621.4seed——137.8

Table 1 The comparison of endophytic fungi isolated by different methods

2.2 内生真菌的种类

经过对辣椒叶片、茎及种子823份材料中内生真菌的分离，共得到168株菌株，定殖率为20.4%，图1表明了暗色丝孢菌是最常见的分离菌。经鉴定属于14属20种真菌（表2）。其中，弯孢属Curvularia、链格孢属Alternaria、平脐蠕孢属Bipolaris、芽枝孢属Cladosporium、黑附球属Epicoccum、细基格孢属Ulocladium、皮司霉属Pithomyces、拟青霉属Paecilomyces、青霉属Penicillium、曲霉属Aspergillus、枝顶孢属Acremonium、镰刀菌属Fusarium是常见的内生真菌，而黑团孢属Periconia和矛束霉属Doratomyces是首次分离到的内生真菌，从种子中分离获得，对其形态学特征描述见2.3。大多数的菌株在28℃分离培养获得，而在37℃得到的是一些不孕性菌丝。

2.3 一些种类的特征描述

2.3.1 小孢矛束霉（图1～图2）

Doratomyces microsporus(Sacc.)F.J.Morton&G.Smith,Mycol.Pap.86:77,1963.

KindsSpeciesKindsSpeciesNondemati-aceousgen-eraPaecilomycessinensisQ.D.ChenPenicilliumdigitatum(Pers.)Sacc.PenicilliumexpansumLinkAspergillusnigerTieghAspergillusochraceusG.WilhAspergillusversicolor(Vuill.)TirabAcremoniumroseogriseum(S.B.Saksena)W.GamsFusariumoxysporumvar.liniSnyder&H.N.HansenDematia-ceousgeneraCurvularialunatusR.R.Nelson&HaasisCurvulariaintermediaBoedijnUlocladiumconsortiale(Thüm.)E.G.SimmonsPithomycessacchari(Speg.)M.B.EllisAlternariaalternata(Fr.)KeisslAlternariabrassicicola(Schwein.)WiltshireAlternariatenuissima(Kunze)WiltshireBipolarisaustraliensis(Ellis)Tsuda&UeyamaCladosporiumherbarum(Pers.)LinkPericoniabyssoidesPers.SterilehyphaeEpicoccumnigrumLinkDoratomycesmicrosporus(Sacc.)F.J.Morton

Table 2 Kinds of endophytic fungi from hot pepper

菌落在CMA上平展，粉状，灰绿色或灰褐色，背面褐色，培养后期明显可见直立的孢梗束。菌丝体表生或大部分埋生，淡褐色或褐色，常形成菌丝束。孢梗束高100～800μm，柄部暗褐色，由紧密压在一起的分生孢子梗组成，头部圆柱形。产孢小梗多个簇生在分生孢子梗中上部。分生孢子卵形，端部多数尖，基部平钝，无色至淡棕色，聚集在一起呈暗褐色，光滑，3.5～5.5μm×2.5～4μm。

2.3.2 黑团孢（图7～图8）

Periconia byssoides Pers.ex Schweinitz,Persoon,syn.Meth.Fung.(G?ttingen):686,1801.

Figure 1～2 Doratomyces microsporus 1.Conidiophore 2.Conidia; Figure 3 Conidia of Fusarium oxysporum var. lini; Figure 4～5 Cuvurlaria lunatus 4.Conidia; 5.Conidiophores and conidia;Figure 6 Conidiophore of Bipolaris australiensis; Figure 7～8 Periconia byssoides 7.Conidiophores; 8.Conidia; Figure 9～10 Epiccocum nigrum 9.Conidia; 10.Conidiomata

菌落在CMA上絮状，稀薄，白色。菌丝体表生或埋生，无色。26℃培养1周左右，单根或2～5个簇生、直立、黑色的分生孢子梗从菌落中长出，基部暗橄榄褐色或褐色，光滑或粗糙，不分枝，梗长1.0～1.5mm，宽10～15μm，3～6隔膜，顶端为分生孢子和产孢细胞聚集形成的头部结构。产孢细胞近无色，椭圆形，产生单生或链生的分生孢子。分生孢子球形，初淡黄色，后暗褐色，粗糙，壁厚，直径15～17.5μm。

3 讨论

3.1 辣椒内生真菌种类的分析

本文首次研究了辣椒内生真菌的种类，共得到15属20种真菌，均属于无性态真菌。其中暗色丝孢菌数量及种类居多，与已报道的植物内生真菌种类及数量较一致[10，13～16]，但又具有一定的差异性，首次报道了黑团孢（P.byssoides）和小孢矛束霉（D.microsporus）是内生真菌，均由种子内分离得到。总结有关内生真菌的文献，发现内生真菌多数为无性态真菌，其次为子囊菌，接合菌居第三，担子菌及鞭毛菌极少存在[10，13～16]，而本次试验分离出的全部是无性态真菌，未见其他类群的真菌，这并不说明辣椒内生真菌中就不存在其他种类的真菌，下一步应改进分离培养方法并采集不同生长时期的组织和部位进行大量分离，以期全面准确地了解辣椒内生真菌的种类，并对内生真菌进行抗活性的筛选工作。

3.2 内生真菌分离方法的局限性

组织分离是目前内生真菌分离的主要方法，简单易行，但由于有些真菌在人工基质上不能生长，因而不能得到全部的内生真菌，有很大的局限性。本文首次将组织研碎，采用稀释分离的方法分离内生真菌，获得的菌株种类上与组织分离法无多大差异，但较组织分离法获得的菌株数量多，在没有更好的内生真菌分离方法的情况下，应尝试采用多种分离方法和多种培养基进行分离，掌握合适的分离培养条件，尽可能多的得到内生真菌。