Screening and Analysis on T-DNA Insertional Pathogenicity Mutants of Magnaporthe grisea

Screening and Analysis on T-DNA Insertional Pathogenicity Mutants of Magnaporthe grisea

Keywords:Magnaporthe grisea;pathogenicity;T-DNA insertional mutants;gene function

稻瘟病菌[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr.，无性世代为Pyricularia grisea（Cooke）Sacc.]侵染水稻引起的稻瘟病是水稻“三大病害”之一[1，2]，严重限制世界水稻产量，但迄今为止对其致病性及其变异的机制了解得仍然不够透彻。

已知水稻与稻瘟病菌之间的特异性互作，符合Flor提出的“基因对基因”关系假说[3]。对稻瘟病菌无毒基因的研究，将有助于进一步了解稻瘟病菌致病性变异的机制以及水稻与稻瘟病菌之间分子水平特异性互作的机制。目前，通过遗传分析或分子标记技术，已鉴定了至少30个稻瘟病菌无毒基因[4～7]，其中仅有5个无毒基因（PWL1、PWL2、AVR1-CO39、AVR-Pita、ACE1）被克隆[8～12]。此外，稻瘟病菌的侵染过程是一个错综复杂的循环过程，涉及一系列形态结构与生理生化的变化，故而除了无毒基因之外，与稻瘟病菌致病过程有关的基因的研究也是研究者关注的焦点，目前已经克隆和分析了包括MPG1，CPKA1，PTH11，PMK1，MPS1，MAGB，MAC1，PDE1，PSL1，TPS1等40余个参与稻瘟病菌生活史各个阶段的功能基因[13，14]。

稻瘟病菌基因组全序列测定已经完成[15]，伴随着生物信息学的飞速发展，进一步以功能基因组学的研究方法从全基因组水平研究水稻与稻瘟病菌之间特异性互作的分子机制、诠释关键基因的功能已经成为解决持久抗瘟问题的关键所在。本研究正是通过接种筛选本实验室已建成的稻瘟病菌菌株FJ95054 B T-DNA插入突变体库，获得致病性变异稳定的突变体，运用TAIL-PCR方法获得了突变体被T-DNA标记的侧翼序列，并通过一系列表型分析、分子生物学实验及生物信息学分析初步分析了T-DNA插入区域的基因功能，为进一步获得相关病菌小种的无毒基因或与致病性相关的基因奠定良好的基础。

1 材料与方法

1.1 供试稻瘟菌株及水稻品种

稻瘟病菌菌株FJ95054B，是本研究的野生型对照菌株，由本实验室从福建田间单孢分离得到的菌株；供筛选的突变体菌株，是随机从本实验室已建成的稻瘟病菌菌株FJ95054B T-DNA插入突变体库中抽取的。

供接种筛选的水稻品种CO39近等基因系：C101LAC Pi-1（t）、C101A51 Pi-2（t）、C104PKT Pi-3（t）、C101PKT Pi-4a、C105TTP-4L-23 Pi-4b及感病对照CO39，由国际水稻研究所提供。

1.2 突变体致病性的测定

稻瘟病菌菌株的活化、扩大培养及产孢方法参照王宝华等[16]，育苗及接种方法参照张学博等[17]。接种后8～10 天，采用目测法调查并记载各品种水稻叶片上的病斑反应型。病斑反应型的记载标准参照Valent等[18]的方法，具体分级标准如下：0级：无病斑；1级：只有针尖大小的褐色斑点（病斑直径可达0.5cm）；2级：直径约0.5～1mm褐色病斑，病斑有明显黄褐色中心；3级：直径约为2mm的褐色眼状病斑，中央灰色，边缘褐色；4级：长约3～4mm中等大小的灰色梭形病斑，边缘褐色；5级：病斑达到最大（CO39的眼状病斑最长约为5mm），甚至多个病斑连片，叶枯死，如出现暗绿色急性病斑或叶节瘟也属于这一类型。其中，0～2级记为抗病反应，3～5级记为感病反应。

1.3 突变体生长发育的观察

参考李宏宇方法[19]，观察所获得突变体的形态特征及其生长发育过程，记录菌落直径、产孢量、孢子萌发率、附着胞形态和形成率以及洋葱表皮侵入情况。

1.4 稻瘟病菌基因组DNA的提取及TAIL-PCR

稻瘟病菌基因组DNA的提取参照何月秋方法[20]。TAIL-PCR反应使用的T-DNA左、右边界嵌套引物为：LB1：5'-GGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCATG-3'；LB2：5'-CATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCT-3'；LB3：5'-GAATTAATTCGGCGTTAATTCAGT-3'；RB1：5'-GGCACTGGCCGTCGTTTTACAAC-3'；RB2：5'-AACGTCGTGACTGGGAAAACCCT-3'；RB3：5'-CCCTTCCCAACAGTTGCGCA-3'。使用的随机引物为AD7：5'-TG（A/T）GNAG（A/T）ANCA（G/C）AGA-3'；AD9：5'-TCGTTCCGCA-3'；AD12：5'-（A/T）AGTGNAG（A/T）ANCANAGA-3'。以上引物由上海生工生物工程服务有限公司合成。10×PCR Bufer、dNTP、rTaq酶均购自宝生物公司（TAKARA）。TAIL-PCR反应程序参考文献[21]。

将TAIL-PCR第2、3步扩增产物用0.5×TBE制备1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳电压为5 V/CM。电泳结束后，将凝胶放入含EB的0.5×TBE 中染色20～30min，用紫外透射反射仪观察并照相记录。

1.5 T-DNA侧翼序列的获得与生物信息学分析

TAIL-PCR扩增产物通过电泳分离后，回收目的片段，纯化后与pGEM-T Easy Vector（购自Promega公司）连接；连接产物通过热激转化到DH5α感受态细胞中，通过蓝白斑反应初筛转化子；采用碱裂解法少量提取转化子中的质粒DNA，通过PCR及酶切鉴定，挑选。

将含正确插入的转化子的克隆，送由上海鼎安生物科技有限公司测序。测序获得的序列去除T-DNA载体序列后，将剩余的序列与GenBank数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）、稻瘟菌基因组数据库（http：//www.broad.mit.edu/annotation/fungi/magnaporthe/index.html）进行Blast比较分析及相关生物信息学分析，以推断T-DNA所插入的基因及其可能的功能。此外，应用SignalP 3.0 server（Http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）推断所获得的基因序列中是否含有信号肽（signal peptide，SNP）；应用Pfam（http：//www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/）推测基因编码的蛋白可能的结构域；应用TMHMM-v 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测基因编码的蛋白可能的跨膜结构域；应用Protcomp-v 6.0（http：//sun1.softberry.com/berry.phtml）对基因编码的蛋白质进行亚细胞定位，该软件可将蛋白质按细胞核、质膜、胞外分泌、细胞质、线粒体、内质网等归属进行划分；应用TargetP-v 1.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）进一步确定预测蛋白的亚细胞定位，其可将蛋白质的定位归属于线粒体、叶绿体、胞外分泌以及其他亚细胞定位。

2 结果与分析

2.1 致病性突变体的筛选

将随机选取的60个突变体与野生型菌株FJ95054B分别接种在国际水稻研究所提供的CO39近等基因系的6个水稻品种上，即C101LAC Pi-1（t）、C101A51 Pi-2（t）、C104PKT Pi-3（t）、C101PKT Pi-4a、C105TTP-4L-23 Pi-4b、CO39，每个突变体都进行3个平行以上的接种试验。接种后发病情况显示：野生型菌株FJ95054B对Pi-1（t）、Pi-2（t）、Pi-4a均无致病性，对Pi-3（t）、Pi-4b、CO39致病，而在随机选取的突变体中有3个突变体的致病性发生了稳定的变异，如表1、图1所示。其中，突变体2t-2 T940024501对水稻品种Pi-2（t）从无毒转变为有毒，突变体T940084501和T940086501在水稻品种CO39上的致病性减弱。

菌株号IsolatesC101LACPi-1（t）C101A51Pi-2（t）C104PKTPi-3（t）C101PKTPi-4aC101TTP-4L-23Pi-4bCO39FJ95054B（WT）RRSRRS2t-2T940024501/++////T940084501/////—T940086501/////—

表1 稻瘟病菌T-DNA插入致病性突变体接种CO39近等基因系的发病情况*

Table 1 Virulence of T-DNA insertional pathogenicity mutants on CO39 NILs

2.2 致病性突变体的表型分析

稻瘟病菌侵染过程中的任何一个环节被破坏均会导致致病性减弱或丧失，因此，对致病性减弱的突变体进行相关表型分析，有助于了解其致病性减弱的原因。筛选出的两个致病性减弱突变体的生长发育变化情况如表2所示。与野生型FJ95054 B相比，两个突变体均表现出生长速度减缓、单位面积产孢量显著减少、孢子萌发率和附着胞形成率降低的性状（在α=0.05水平上差异显著）， 这些都可能是造成突变体致病性减弱的原因。

图1 稻瘟病菌致病性突变体的变化情况

Figure 1 Pathogenicity of mutants of M.grisea compared with wildtype FJ95054B

菌株Isolate菌落直径Colonydiameter（cm）产孢量Sporulation（105spores/cm2）8h孢子萌发率Percentageofsporegermination8hpi（%）16h附着孢形成率Percentageofappressoriumformation16hpi（%）95054B（WT）5.20±0.100.7499.0693.68T-9400845014.17±0.030.001287.9073.17T-9400865014.22±0.070.003383.8963.69

表2 稻瘟病菌致病性减弱突变体的生长发育变化

Table 2 Morphology and development of pathogenicity-decreased mutants of M.grisea

此外，在洋葱表皮侵入实验中，野生型FJ95054B侵入正常，能形成正常的附着胞以及侵染栓，并能观察到菌丝在洋葱细胞内广泛蔓延。相比之下，突变体T940084501的孢子能够形成附着胞，但随后并未形成侵染栓侵入，未发现菌丝在洋葱细胞内蔓延；而突变体T940086501的部分孢子能够形成附着胞，但同样未能形成侵染栓侵入，也未发现菌丝在洋葱细胞内蔓延，还有部分孢子甚至不会形成附着胞。这些都可能是其致病性减弱的原因。实验结果如图2所示。

图2 稻瘟病菌致病性减弱突变体的洋葱表皮侵入实验结果

Figure 2 The results of onion penetration assays of pathogenicity-decreased mutants of M.grisea

2.3 TAIL-PCR获得T-DNA插入的侧翼序列

使用右边界嵌套特异引物RB与随机简并引物AD7组合，扩增出了突变体2t-2 T940024501的T-DNA侧翼序列（如图3A所示）；使用左边界嵌套特异引物LB与随机简并引物AD9组合，扩增出了突变体T940084501的T-DNA侧翼序列（如图3B所示）。突变体T940086501的T-DNA侧翼序列通过TAIL-PCR反应尚未获得。

2.4 相关生物信息学分析

通过在稻瘟菌基因组数据库进行的比对分析，结果显示突变体2t-2 T940024501 T-DNA侧翼序列中的117～591 bp区段与稻瘟病菌基因组supercontig5.183的776534～777008 bp同源（同源率98%）， T-DNA 插入位点位于基因 MGG_07927.5 的外显子区，该基因位于Chromosome/Linkage GroupⅢ，编码一个假定蛋白（ hypothetical protein）， 该蛋白属于Glyco-syl hydrolases family 18（糖基水解酶家族18）。

图3 TAIL-PCR第二步和第三步产物的电泳图谱

Figure 3 Electrophoresis patterns of secondary and tertiary TAIL-PCR products（secondary and tertiary products of the same isolate are loaded side by side）

分别利用SignalP 3.0、Protcomp-v 6.0、TMHMM-v 2.0、TargetP-v 1.1以及Pfam对该基因编码的蛋白进行分析。首先通过Signal IP 3.0预测，并不包含信号肽结构；继而经TMHMM-v 2.0预测，不含跨膜结构；通过Protcomp-v 6.0和TargetP-v 1.1分析表明，含有胞外分泌信号，是一种胞外分泌蛋白，在胞内无定位。另外，Pfam分析结果表明，该基因可能具有某种糖基水解酶活性。

目前仅知该基因被T-DNA阻断后，突变体菌株对水稻品种Pi-2（t）从无毒转变为有毒，至于其在病原菌致病过程中的具体功能尚需通过进一步的基因敲除和功能互补实验加以确定。至于突变体T940084501的T-DNA侧翼序列，在稻瘟病菌基因组数据库中未比对到其同源序列，而在GenBank数据库中同样未比对到与稻瘟病菌相关的同源序列。由于该序列可能是FJ95054B菌株的特异序列，拟根据该序列扣除与载体有关序列及引物序列后的剩余序列设计引物，筛选FJ95054B BAC文库。

3 讨论

对稻瘟病菌无毒基因以及致病过程有关基因的研究一直是了解稻瘟病菌致病性及其变异机制乃至水稻与稻瘟病菌特异性互作机制的关键所在，而研究某一个具体基因的功能最便捷的方法就是对该基因的突变体进行分析，这也正是本研究筛选T-DNA插入所致致病性突变体的初衷所在。

获得致病性变异稳定的突变体是本研究的关键之一。本研究通过大量平行、重复实验初步筛选出致病性表型稳定的突变体，随后为避免由于菌株污染而造成的致病性变异的假象，还进一步将所获得的致病性突变体进行单孢分离，将分离的单孢与原菌株一同进行接种实验，结果显示单孢与原菌株的发病情况基本保持一致。这为进一步的分子水平的研究奠定了良好的基础。

本研究对所获得的基因的功能还只是做了初步的预测，为了明确其功能尚需要借助进一步的基因敲除和功能互补实验。另外，为了明确致病性变异是否为单基因作用所致，尚且需要对致病性突变体的后代群体进行接种实验和潮霉素抗性分析，通过检测其后代的表型分离比率加以验证。