Identification of Pathogens Causing Leaf Spot Disease on Zingiber officinale Rosc*

Identification of Pathogens Causing Leaf Spot Disease on Zingiber officinale Rosc*

姜（Zingiber officinale Rosc.）为姜科（Zingiberaceae）、姜属（Zingiber），多年生草本植物，是一种既能作为调味蔬菜，又能入药的重要的经济作物。山东省是我国姜的主要产区，近年来，由于多数品种长期无性繁殖及连年重茬种植，出现了一种严重影响姜产量和质量的病害，该病害主要为害姜叶部，发病初期呈现水浸状小斑点，随后变成黄色，逐渐扩大成为椭圆形、近圆形或不规则形的白色病斑，边缘则为黄褐色，病斑继而彼此融合，导致整叶干枯；在老熟病斑上可见大量黑色小颗粒。

目前国内外有关文献报道认为，引起姜叶斑病的病原菌为姜叶点霉（Phyllosticta zingiberiHori）[1]，白金铠[2]在《中国真菌志》中描述过Phyllosticta zingiberi的形态特征，而Mathur[3]曾提到Phyllosticta zingiberi T.S.Ramakr.为Phoma zingiberi Khune的基原异名，但关于Phoma zingiberi的产孢细胞等形态特征及ITS序列分析未见报道。由于茎点霉属（Phoma）真菌与叶点霉属（Phyllosticta）真菌有诸多类似的地方，如分生孢子器和分生孢子的形态、颜色、大小等。因此，Phoma和Phyllostica两属间的分类及属下种的分类问题一直存在着许多争议。Saccardo[4]认为，两者的主要区别在于寄生部位的不同，即Phoma寄生于植物叶以外的部位，而Phyllosticta寄生于植物叶片上，这种主观的划分受到许多真菌学家的批评。由于产孢方式是Phyllosticta和Phoma两属共同具有的稳定特征。因此，目前已作为被多数学者所接受的分类标准。

对于植物病原真菌，传统的分类方法多以真菌的形态特征为依据，而近年来分子生物学手段的应用为真菌的分类鉴定提供了更多遗传信息方面的依据。核糖体基因内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，简称ITS）在真菌种间存在丰富的差异，已广泛应用于真菌亲缘关系较近分类群的系统发育研究。目前，对于形态学上难以区分的Phoma和Phyllosticta两属真菌，尚未开展ITS序列的比对研究，其ITS序列资源也有待进一步丰富。本文发现的病害症状与已报道的由Phyllosticta zingiberi引起的姜叶斑病症状基本一致。为了正确鉴定分离到的姜叶斑病的致病菌，本文利用传统的形态学观察并结合分子手段对该病原菌的分类归属进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

姜病叶采自山东省生姜主要产地莱芜市姜田。

1. 2 病原菌的分离纯化及形态学观察

1.2.1 病菌的培养及光镜观察 将发病叶片表面消毒后置于PDA培养基上培养4～5天，从菌落边缘取直径为5mm的菌落圆片进行纯培养，在Olympus光学显微镜下观察并描述分生孢子器、分生孢子、产孢细胞形态特征，用显微测量尺测定分生孢子器及分生孢子的大小。

1.2.2 透射电镜样品制备与观察 将新鲜的感病叶片切成小于0.5cm×0.5cm的材料，固定于3%戊二醛中，再用1%锇酸二次固定，乙醇梯度脱水、Epon812树脂浸透、包埋、超薄切片，经醋酸双氧铀、柠檬酸铅双重染色，JEM-1200EX透射电镜观察、拍照。

1.3 致病性测定

将配制好的孢子悬浮液（低倍镜下每视野约30个孢子）喷洒在4～5叶期健康的姜新叶上，接种后套袋保湿48h。定期观察并记录发病情况和症状特点。取病斑上产生的子实体镜检，并从发病组织中再次分离致病菌，观察并描述病原菌形态特征。

1.4 核糖体DNA ITS区域序列测定

菌丝染色体DNA的提取参照何月秋[5]的方法并做适当的修改，质粒提取采用碱裂解法，大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态制备、连接、转化等参考《分子克隆实验指南》（第三版）[6]。以总DNA为模板，以通用引物ITS1：5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′和ITS2：5′-GCT GCG TTC ATC GAT GC-3′，ITS3：5′-GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC-3′和ITS4：5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′分别扩增ITSI和ITSII片段。PCR反应程序如下：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1min，50 ℃退火1min，72 ℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物连接到pMD18-T（大连宝生物工程有限公司），转化E.coli DH5α，经鉴定的重组质粒送上海英俊生物技术公司测序。

2 结果与分析

2.1 病原菌形态观察

该病原菌在PDA培养基上菌丝初为白色，后变为褐色，25 ℃培养20～25天后，逐渐出现分生孢子器。光镜观察分生孢子器为球形、扁球形，暗褐色，直径55～135μm，高75～130μm，器壁褐色，由3～5层细胞组成，壁厚9～13μm，内壁形成产孢细胞，上着生分生孢子；分生孢子椭圆形、卵形，无色，单胞，两端各含有一油球，5～8.5μm×2～4.5μm，其形态与报道的Phyllosticta zingiberi基本一致（Figure 1），但光镜和透射电镜观察其产孢方式为内壁芽生瓶梗式（eb-ph）（Figure 2）。

Figure 1 Picnidium(Micro)(×400)

Figure 2 Morphology of conidiogenous cell(Micro)(×1 000)

2.2 致病性测定

用分生孢子悬浮液接种姜嫩叶后，发病症状和病原菌形态特征与自然发病株相同。取病健交界处组织再分离，其培养性状和形态特征与第1次分离结果一致。根据柯赫氏法则，接种菌即为姜叶斑病的致病菌。

2.3 病原菌的分子鉴定

2.3.1 菌丝染色体DNA的提取与核糖体DNA ITS的PCR扩增 用改进的CTAB法提取该菌染色体DNA，琼脂糖凝胶电泳检测。采用真菌核糖体基因ITS区域通用引物ITS1和ITS2、ITS3和ITS4分别扩增了茎点霉的ITSI和ITSII，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果均为单一条带，大小分别为224bp和343bp。

2.3.2 核糖体DNA ITS序列分析 将克隆到的ITSI和ITSII测序后进行拼接，确定了ITS片段的核苷酸序列（Genbank登录号为EF408240）。用DNAStar软件对所得序列进行编辑和排序比对，得出该病原菌ITS序列与叶点霉的同源性最高为58.7%，与茎点霉的同源性最高为95.6%。利用MEGA3.1软件分析核苷酸组成并计算种间遗传距离，结果显示该病原菌与茎点霉亲缘性更大。

3 讨论

以往报道认为，引起姜叶斑病的病原为Phyllosticta zingiberi Hori，Hara记载并描述了Phyllosticta zingiberi Hori的形态特征：叶上病斑圆形、不规则形，中央灰白色，直径1～3mm；分生孢子器球形、扁球形，暗褐色，直径50～120μm，分生孢子椭圆形、卵形，单胞，无色，两端各含有一油球，5～9μm×2.5～3.5μm。后人Sawada[7]对中国台湾省姜叶上的Phyllosticta zingiberi Hori、戚佩坤等[8]对广东姜叶上的Phyllosticta zingiberi Hori以及本研究对分离菌的描述与上述基本一致，应视为同种。Ramakrishnan[9]描述的印度姜叶上的Phyllosticta zingiberi T.S.Ramakr.的形态特征为，叶上病斑卵圆形，中央灰白色，可形成穿孔，9～10μm×3～4μm；分生孢子器球形，78～150μm，分生孢子无色，椭圆形，3.7～7.4μm×1.2～2.5μm，两端各含有一油球，此形态与Phyllosticta zingiberi Hori基本一致。因此，Phyllosticta zingiberi T.S.Ramakr.应视为Phyllosticta zingiberi Hori的同物异名。

Sutton[10]通过对Phoma和Phyllosticta产孢方式的研究，认为Phoma是内壁芽生瓶梗式（eb-ph），Phyllosticta是全壁芽生单生式（hb-sol），这与Dictionary of the fungi第九版[11]对两属产孢方式的描述一致，而吕国忠电镜观察结果显示，两属的产孢方式相同，均为全壁芽生环痕式（hn-ann），同样，王琪[12]对龙眼叶点霉（Phyllosticta dimocarpi）研究结果也是全壁芽生环痕式（hn-ann），周永力[13]则认为Phyllosticta为内壁芽生瓶梗式（eb-ph）。因此，有关两属的产孢方式目前尚有争论。

本研究对该病原菌的光镜和电镜观察结果表明，其产孢方式为内壁芽生瓶梗式（eb-ph），符合Kendrick等对Phoma产孢细胞特征的描述，ITS序列分析结果发现，该菌与Phoma ITS序列同源性高达95.6%，远远高于与Phyllosticta ITS序列的同源性（58.7%）。本研究结果支持Mathur的观点，认为Phyllosticta zingiberi T.S.Ramakr.为Phoma zingiberi Khune的基原异名。由于Phyllosticta zingiberi T.S.Ramakr.是Phyllosticta zingiberi Hori的同物异名。因此，引起姜叶斑病的病原菌应为姜茎点霉（Phoma zingiberi Hori）。

致谢：山东农业大学张天宇教授、张修国教授对本研究提供了热情帮助，并对论文修改提出了建议。