A New Method to Improve the Transformation Efficiency of Sclerotinia sclerotiorum with Agrobacterium tumefacies

A New Method to Improve the Transformation Efficiency of Sclerotinia sclerotiorum with Agrobacterium tumefacies

核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）是一种世界性分布的重要真菌病害，能够侵染75个科450多种的植物。核盘菌在作物的各个生长期都能引起发病，并造成严重危害。2006年，核盘菌已经完成了全基因组测序，但是由于缺乏一个高效的遗传转化体系，其分子生物学方面的研究仍然十分滞后。Jeffery等（2001）利用PEG介导的方法对核盘菌的原生质体进行了转化，并获得成功，而其他人在重复试验时未得到结果。Richard等（2006）利用农杆菌介导对核盘菌的子囊孢子进行转化，开辟了核盘菌介导转化的新途径，但是在实验室里诱导产生子囊孢子十分困难，限制了这种转化方法的使用。江明等（2006）报道用核盘菌菌丝为材料，建立了农杆菌介导转化核盘菌技术体系，但该方法转化效率低，整个操作过程易被杂菌污染。为此，我们对此方法进行了改进，获得了较理想的效果，并降低了污染频率，现简要报道如下：

将核盘菌在PDA平皿上活化，移至新PDA平皿上培养2天，用打孔器（φ 6mm）于菌落边缘打取菌丝块。将菌丝块与带有转化载体的农杆菌置于铺有玻璃纸的共培养基上于20℃培养室黑暗培养2天。将菌丝块移走后，将带有菌丝的玻璃纸平铺于无菌的培养皿中，加入15～20ml含有潮霉素（30μg/ml）的PDA培养基，在乙酰丁香酮的作用下，3～4天后在培养基表面有小的菌落形。将小菌落抑制含有潮霉素（50μg/ml）的PDA培养基上进一步筛选，获得候选转化子。经PCR鉴定，证实为转化子；转化子性状稳定，在不含潮霉素的PDA培养基上继代培养6代之后仍然能保持潮霉素的抗性。这种转化方法效率较高，且结果稳定，平均每个培养皿中会有1～3个转化子。目前，正在研究通过改变乙酰丁香酮的浓度和共培养时间等条件来提高转化效率，以便得到更多的转化子，为下一步筛选表型异常的突变菌株建立平台。