Advances of Study on Burkholderia cepacia1
洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）是一种广泛存在于水、土壤、植物和人体中的革兰氏阴性细菌。1949年美国植物病理学家Burkholder首次发现B.cepacia可以引起洋葱酸皮病[1]。随后在20世纪50年代人们从第一例由B.cepacia引起的心内膜炎开始，发现该菌广泛存在于医院，并且可以使人类患上多种疾病，尤其是囊性肺纤维化（Cystic fibrosis，简称CF）病人的易感细菌之一，严重的会因此患“洋葱伯克霍尔德菌综合症”致死。最近研究表明，该菌致人死亡的一个原因要归咎于它含有脂多糖（Lipopolysaccharide）分子[2]。
在进行医学研究的同时，发现该菌在工业和农业上有生物降解、生物防治等功效，对农业生产和环境保护起着重要的作用，具有广泛的应用前景。近年来，随着细菌分类技术的发展，洋葱伯克霍尔德菌已不仅只是作为一个种，而是一组基因型不同、表型相近的复合物，称为洋葱伯克霍尔德菌复合型（Burkholderia cepacia complex，简称Bcc）[3]。本文将在农业、分类地位等方面对Bcc的研究进展做一综述，以达到全面了解该菌的目的。
1 工农业上的研究进展
1.1 植物致病菌? 基金项目：国家林业局“948”项目（项目编号：2003-4-39）；年湖北省科技攻关计划（项目编号：2007AA201C22）。
人类第一次发现伯克霍尔德菌是由于它导致了洋葱酸皮病，该病菌主要分布在土壤和灌溉水中，在洋葱鳞茎形成后，从其因收割等原因造成的伤口侵入，或者是黏在叶部的菌被水冲刷进入组织内引起鳞茎腐烂。Ulrich在1975年研究表明[1]，该病原菌在低pH值环境下可以产生一种内多聚半乳糖醛酸酶，使洋葱组织软化，利于病原菌的入侵和扩展。后来郭道森等人研究表明，该菌与松材线虫共同侵染黑松和马尾松，导致松林大面积死亡[4]，在后续的研究中发现，松材线虫的分泌物及死虫体均可促进该菌株的生长繁殖和致病作用，且活线虫的促进作用比死虫体更加显著，这可能是由于松材线虫提供给该菌株某些重要的营养物质[5]。2005年，意大利西西里东部地区种植的天堂鸟（Strelitzia reginae Aiton）幼苗（苗龄2～3个月）发生新病害，鉴定发现致病菌为唐菖蒲伯克霍尔德菌（Burkholderia gladioli），这是关于该菌导致天堂鸟叶斑病及枯萎病的首次报道。
1.2 霜冻诱导作用
在植物体上广泛存在着一些细菌，它们都具有诱发植物体内水分结冰的作用，称为冰核细菌。在没有冰核细菌存在的植物能耐-7～-8℃的低温而不发生霜冻，但是在一些B.cepacia 细菌存在的情况下，同样条件的植物在-2～-3℃可诱发多种植物细胞水结冰而发生霜冻。张耀东等从菠菜上分离到一株具有冰核活性的Bcc菌株[6]。
1.3 生物降解作用
1.3.1 对有毒物质的降解 一些工业排放物中含有大量的有害芳香烃类物质，随着工业化进程的加快，残留于自然环境中的芳香烃类物质含量急剧增加，如何解决这类物质造成的危害，成为研究者要解决的问题，而利用微生物降解是消除其危害的重要途径之一。洋葱伯克霍尔德菌可以利用多种物质为唯一碳源，这意味着其能够以土壤和地下水污染的有毒且难降解的物质（邻苯二甲酸盐、除草剂和氯代烃类化合物等）为碳源并将其降解[7]。例如，Bcc的一个菌株G4可通过由苯酚诱导的芳香族途径将三氯乙烯降解，由于苯酚是环境优先污染物之一，因而不宜被推广使用；但该菌株的突变体G45223 PR1可以不利用任何诱导物而直接降解三氯乙烯[8]。另外，许多芳香烃化合物在降解过程中都会形成中间产物邻苯二酚，细菌可以通过邻位裂解和间位裂解两种途径继续降解邻苯二酚[9]。刘涛等[10]从炼油厂废水中分离筛选到一株苯酚高效降解的洋葱伯克霍尔德菌L68，该菌株可产生邻苯二酚2，3-双加氧酶[11]，而邻苯二酚2，3-双加氧酶是降解芳香族化合物的关键酶，在间位降解途径中，该酶可以催化邻苯二酚的苯环裂解，转化为2-羟黏糠酸半醛。因此，洋葱伯克霍尔德菌对消除芳香烃类化合物的污染具有重要作用。
另外，洋葱伯克霍尔德菌对化学农药也有很强的降解作用。如，Sarfraz Hussain 等人研究发现，在pH值为8.0，温度为30℃时，该菌对α-硫丹和β-硫丹的降解率达90%以上，从而减少了杀虫剂硫丹（Endosulfan）对土壤和地下水的污染[12]。
1.3.2 对油脂的降解 洋葱伯克霍尔德菌降解油脂的特性在国外已有研究，Pooja Rathi，Hustavova等人报道了该菌产脂肪酶应用于催化酯化水解反应等研究[13]，洋葱伯克霍尔德菌能在降解利用油脂的同时还分泌出一定量的胞外脂肪酶，同时通过所产生的脂肪酶等降解酶系作用于油脂，将其分解氧化为低级脂肪酸、甘油、醇类等低分子有机物，最后降解为H2O、CO2等代谢产物[14]。徐保成[15]等人对该菌所需的降解工艺条件进行优化研究，结果表明在优化的油脂降解条件下（pH值7.0，30℃，溶解氧3.0mg/L），处理初始油脂浓度1000mg/L废水，24h后其油脂降解率达到90%以上，COD（Chemical Oxygen Demand）去除达到92%。B.cepacia产生的脂酶可以催化拆分外消旋化学农药，使其变为光学活性农药，从而成倍地提高了药效，而且减轻了生物体内的积累与毒副作用，避免了不必要的环境污染[16]。
1.4 植物病害生物防治菌
洋葱伯克霍尔德菌可以防治多种植物病害，如从樱桃果实表面和伤口上分离获得的洋葱伯克霍尔德菌对甜樱桃褐腐病表现出显著的抑制效果[17]；郑维等从堆肥样本中分离的洋葱伯克霍尔德菌株CF-66具有广谱抗菌活性，并初步鉴定该菌属于洋葱伯克霍尔德菌基因型Ⅴ[18]；李纪顺等对伯克霍尔德菌B418进行了研究，表明该菌对小麦纹枯病、小麦全蚀病和番茄南方根结线虫病有很好的防治效果[19]。陈京元等从湿地松苗根际分离得到1株B.cepacia C23菌株，对引起湿地松猝倒病的立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、链格孢菌（Alternaria alternata）有明显的抑制效果。
洋葱伯克霍尔德菌的防病机制主要为其能产生多种具有抗菌活性的代谢产物，如铁载体（Pyochenlin、Pyoverdine）、吩嗪、硝吡咯菌素、苯基吡咯、单萜生物碱、Cepaciamide A（B）、Cepacidine A（B）、Cepacin A（B）；菌株H111 能够有效杀死线虫Caenorhabditis elegans，其作用机理主要是由该细菌产生的细胞外毒素所致死[20]。B.cepacia AMMDR1可以抑制由瓜果腐霉病菌（Pythium aphanidermatum）和根腐丝囊菌（Aphanomyces euteiches）引起的豌豆和甜玉米苗猝倒病，作用机理主要是该菌抑制游动芽孢的裂解，阻止孢囊的萌发而影响病原菌的生长[21]。在不断的研究中发现，该菌可以与杀菌剂共同使用，如I.Omar等人发现，在对大豆根腐霉病菌（Fusarium oxysporum）引起的番茄冠根腐病的研究中，B.cepacia菌株C91与低浓度杀菌剂混合使用，相比单独使用高浓度杀菌剂，杀菌效果提高了20%[22]。这不但减少了杀菌剂的使用，同时减少了杀菌剂对环境的污染。
美国环保署（EPA）已经批准了两种以洋葱伯克霍尔德菌为主要成分的生防菌剂的生产，其商品名为Deny和Intercept，Deny用于防止Rhizoctonia spp.、Pythium spp.、Fusarium spp.和线虫引起的病害，而Intercept则用于防治Rhizoctonia solani、Fusarium spp.、Pythium spp.引起的病害[23]。
1.5 植物生长促生菌
具有拮抗作用的细菌往往与植物的生长有很大的关系，这些细菌都可产生一些抑制真菌生长的物质，如：铁载体（Siderophores），细胞溶酶的分泌物，抗生素等。对真菌生长的抑制就可以直接促使植物生长[24]。
B.cepacia可以产生铁载体，一方面根际促生菌铁载体的产生很快耗尽了病原菌生存所需要的铁，从而使病原菌的繁衍和侵染能力大大下降；另一方面根际促生菌通过铁载体向植物提供铁营养，从而使植物获益[25]；另外，B.cepacia还可以产生抗生素有效地抑制周围其他微生物的繁衍。同时，B.cepacia的一些菌株具有固氮和产生吲哚乙酸（IAA）的作用，有助于植物对营养物质的吸收[26]。Bcc菌株具有较强的溶解磷酸盐的能力，推动植物对释放的磷的吸收，促进植物生长，Babu-Khan等克隆到其溶解磷酸盐的基因[27]。另一方面其通过对病原微生物的生物防治，减轻或抑制有害的根围微生物，从而间接的促进植物生长。例如，玉米种子被Bcc菌株MCI7包衣后，其植株感染病原镰刀菌的几率大大降低，且植株鲜重和株高均显著增加[28]。
2 分类学的研究
B.cepacia 原名Pseudomonas cepacia，1950 年首次被Burkholder报道可引起洋葱酸皮病[29]。该菌的其他名字还包括eugonic oxidizers group 1，Pseudomonas kingii和Pseudomonasmultivorans[30]，但是相关研究明确指出这些命名是P.cepacia的同义词，而且P.cepacia具有命名的优先权[31]。因此，这些命名没有被写入细菌手册，直到1981年，Palleroni 和Holmes才重新找到依据区分这些命名的不同[32]。1992年Yabuuchi 等正式将该菌及其他6个属于rRNAⅡ群的假单胞菌（P.solanacearum，P.pickettii，P.gladioli，P.mallei，P.pseudomallei 和P.caryophylli）归为一个新属，即伯克霍尔德菌属（Burkholderia）。与Pseudomonas属不同的是，该属被归为变形菌门（Proteobacteria）[33]。当Burkholderia属的分类地位被确定以后，该属已包括超过30个不同的种：B.cepacia（典型种），B.caryophylli，B.mallei，B.pseudomallei，B.gladioli，B.plantarii，B.glumae，B.vietnamiensis，B.andropogonis，B.multivorans，B.glathei，B.pyrrocinia，B.thailandensis，B.graminis，B.phenazinium，B.caribensis，B.kururiensis，B.ubonensis，B.caledonica，B.fungorum，B.stabilis，B.ambifaria，B.hospital，B.terricola，B.sacchari，B.tropicalis，B.brasilensis，B.anthina，B.dolosa，B.cenocepacia，B.xenovorans，B.tuberum，B.phymatum。
通过研究得知B.caryophylli，B plantarii，B.glumae，B.andropogonis是植物的致病病原菌，能够使不同种属的植物患上根腐、叶斑、条斑等病害。在不同植物中分离得到的B.vietnamiensis，B.kururiensis，B.tropicalis，B.brasilensis，B.tuberum，B.phymatum，B.caribensis有促进根瘤形成，增强固氮的能力，同时促进植物根的生长。B.mallei和 B.pseudomallei则能够引起人和动物的鼻疽病。对于B.glathei，B.graminis，B.phenazinium，B.caribensis，B.caledonica，B.hospital，B.terricola，B.sacchari在环境、生态中所起的作用还不是很清楚。同时，还有一些具有多重作用，可以是植物致病菌，植物有益菌或是人类的机会致病菌，例如：Burkholderia cepacia complex，Burkholderia gladioli 和 Burkholderia fungorum[34]。
从20世纪90年代中期开始，一些研究者发现来源于各种环境的Bcc分离物具有明显的遗传异质性，1996年，有报道说利用分子鉴定和临床观察，发现伯克霍尔德菌至少有3个不同的基因型是CF病症的致病菌[35]。直到1997年，Vandamme等运用多相分类研究方法对从CF病人中分离到的致病菌进行研究，才发现所设定的B.cepacia种中，至少存在5种不同的基因型[36]。包括B.vietnamiensis（基因型V）、B.multivorans（基因型II）、基因型I，III和 IV。这5种基因型被统称为伯克霍尔德菌复合型（B.cepacia complex）。
利用不同的方法从医学和环境微生物的角度对伯克霍尔德菌复合型进行了探索研究，其中包括使用不同的选择性培养基。结果发现，农业研究中利用的培养基，能从土壤和植物根际附近发现大量的伯克霍尔德菌复合型的族群[37]；在医学研究中，几乎无法从自然界中发现伯克霍尔德菌复合型的存在[38]。直到伯克霍尔德菌分类的又一次改变，才使这些固有的不同有机的联系起来，一些研究者发现基因型IV与Bcc中的其他基因型有明显的差异，于是被归类B.stabilis[39]。接着从美国和英国的CF致病菌中分离出基因型VI，它除了与B.multivorans没有差异外，与其他基因型均有差异[40]。从人类致病菌与环境中都能分离B.ambifaria（基因型VII），因此它也具有生防菌的特征。最近，发现B.pyrrocinia（基因型Ⅸ）也属于B.cepacia complex[41]。因此，已报道的洋葱伯克霍尔德菌复合型由9个不同基因型组成，分别是B.cepacia（基因型Ⅰ）、B.multivorans（基因型Ⅱ）、B.cenocepacia（基因型Ⅲ）、B.stabilis（基因型Ⅳ）、B.vietnamiensis（基因型Ⅴ）、B.dolosa（基因型Ⅵ）、B.ambifaria（基因型Ⅶ）、B.anthina（基因型Ⅷ）、B.pyrrocinia（基因型Ⅸ）。后来，Yabuuchi E等人在泰国某地的表层土中分离得到的B.thailandensis的一株，被重新归类为Burkholderia ubonensis，经过鉴定初步断定也归类为B.cepacia complex[42]。各基因型间DNA-DNA同源性为30%～50%，其16S rRNA 和recA 基因序列相似性很高，分别为98%～99%和94%～95%[43]。
直到目前，对Bcc的基因型组成仍在研究中，Zhang L等人在玉蜀黍和水稻的根际发现了大量的Bcc菌株，并且通过Bcc recA基因的同源性的分析，发现分离所得的Bcc R456菌株可能属于一种新的基因型[44]。
3 研究的热点
3.1 人类致病菌与环境菌株的区别
虽然能从不同的环境条件下分离获得大量的Bcc，但却不清楚Bcc株系主要的存活环境。事实上，只有很少的研究涉及环境中Bcc的生态特征，一些研究者也仅仅是对Bcc的一个或几个基因型进行研究[45]。现有的伯克霍尔德菌复合型中有许多有生防效果或是作为植物促生剂，现今生产B.cepacia生物农药的菌株都来源于环境，但问题是，对这些菌株是否是非致病菌也无法区分，因为除了Bcc基因型Ⅵ只能从CF病人中分离到，基因型Ⅸ只从土壤中分离到以外，其他所有基因型的B.cepacia均可从环境和医院中分离[46]。同样，无法很清楚的在菌株基因型或是表现型方面来区分环境菌和人类致病菌。同时，每年都可以从CF的致病菌中获得新的Bcc株系，并且也能够从自然环境中获得这些菌株[47]。因此，如何区分环境菌和人体致病菌以及其是否具有致病性，对应用于农业上的Bcc菌株进行风险评估是必要的，也将是今后的研究难点和热点之一。
3.2 鉴定的难点
目前，对细菌的鉴定一般都先选择合适的选择性培养基培养分离出的样本，然后利用生理生化手段检测分离到的菌株，接着利用SDS-PAGE技术，全细胞蛋白电泳，16S rDNA序列分析手段鉴定出分离所得样本的属，最后配合RFLP探针技术或AFLP探针技术以确定菌株的基因型。
现有的伯克霍尔德菌复合型由9个不同的基因型构成，各个基因型在形态上非常相近，这就需要非常便利的生物化学的鉴定手段和具有针对性的分子鉴定方法对各个基因型进行精确的区分[48]。利用16S rDNA测序、recA-RFLP分析、recA 基因特异引物PCR检测、DNA-DNA 同源性分析以及全细胞蛋白电泳（PAGE）方法可区分Bcc中的一些种，但还没有一种技术可以针对性的区分出每个基因型。因此，寻找一种简单可行可靠的鉴定技术是今后研究的热点之一[49]。
3.3 人体致病菌毒力的研究
Bcc致病毒力因子包括脂肪酶、蛋白酶、溶血素、脂多糖、过氧化氢酶、内毒素等，以紫花苜蓿作为植物模型研究Bcc的毒力，发现9个基因型中除了B.multivorans 和B.stabilis外，其余都可以从发病的紫花苜蓿上分离获得[50]。但植物与人类病原菌存在着差异，如革兰氏阴性人体条件致病菌绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）和植物病原菌丁香假单胞菌（P.syringae）均存在Ⅲ型蛋白分泌系统，但后者对人和动物不致病，表明致病因子存在并不能充分说明其能致病。为了确定细菌致病性毒力的决定因子，Chung J W等人利用蛋白质组学描述来比较两种B.cenocepacia在老鼠肺上的存在状态，发现临床分离所得的C1394 很快被致死，C1394mp2依然存活。利用Two-dimensional（2D）凝胶电泳发现从易感病寄主上得到的C1394mp2，缺少烷基氢过氧化物还原酶亚基C（AhpC）蛋白位点，反之增加了鞭毛蛋白，这使C1394mp2增强了在高温和低pH值条件下的氧化应激能力。这揭示了B.cenocepacia致病毒力在易感模型上出现不同的表现与应激能力的内在原因[51]。对于使用易感动物作为模型进行研究是一个进步，但是对于动物模型的选择、如何利用等都受到时间、道德等原因的制约，寻找合适的动物模型仍是今后需要解决的问题之一。
4 小结
洋葱伯克霍尔德菌对于人本身来讲，是一种可怕的致病菌，不但污染医院的药品和器具，而且引起可怕的“洋葱伯克霍尔德菌综合征”。对于整个人类来讲，有好也有坏。它是自然界中一些植物的病原菌又是一种重要的生防、环保以及工业用菌，减少了对环境的危害，不少国家把它作为生物农药和环保制剂使用。
如何区分哪些是人体致病菌、哪些是植物致病菌、哪些是生防或环保菌，成了一个令人困扰的问题。这有赖于对其生态多样性、致病机制以及分类学的全面了解。只有确定Bcc生防或降解菌株对人体不致病，或者该菌株为单独一个种而不是人体致病菌一员时，才能将其安全的应用于农业生产上，使其为人类造福。现在已经有许多研究者从不同的方面入手来进行研究，但仍有未涉及或很少涉及的领域，如该菌在自然界的分布及多样性研究，其基因型的详细鉴定及针对性的鉴定方法，这些都是需要注意的问题。因此，在今后的研究中，要广泛地参考结合各学科领域的研究进展，充分地认识了解该菌的生物学特性及在不同方面的风险性测试评价，以期更好地使其为人类服务。
