Detection of Candidatus Liberibacter Asiaticus from Wampee (Clausena lansium) by Nested-PCR and Cloning and Sequenceing of 16S rDNA?

Detection of Candidatus Liberibacter Asiaticus from Wampee (Clausena lansium) by Nested-PCR and Cloning and Sequenceing of 16S rDNA?

黄皮原产于我国华南，在我国至少已有1500年的栽培历史，目前主要分布于广东、广西、福建、海南、台湾、四川、云南等地。越南、印度、泰国、马来西亚以及美国的佛罗里达州等有零星栽种。黄皮属于芸香科黄皮属植物，与柑橘同科，过去一直认为黄皮不会感染黄龙病病原。2006年8月，作者在广东罗定索龙镇柑橘园附近发现有些黄皮的叶片变黄，而且黄化的叶片一般从植株的顶端开始，逐渐向下扩展直至中部，这与柑橘黄龙病的黄化症状及发病规律很相似，那么黄皮的黄化症状是不是由黄龙病病原（Candidatus Liberobacter spp.）所引致的呢？黄皮是芸香科植物，同时也是柑橘木虱的寄主植物，究竟黄皮是否会发生黄龙病？其病原与柑橘黄龙病病原有何异同？值得进一步的探讨和研究。

本研究从田间采集叶脉表现黄化症状的黄皮叶片，用CTAB法提取叶脉组织DNA。以α亚纲细菌的通用引物27F/1500R为外套引物，取2μl待测黄皮样品进行第一轮的PCR扩增，用已感染了柑橘黄龙病的病叶材料提取的DNA为阳性对照，健康黄皮材料提取的DNA模板为阴性对照，第一轮的PCR先进行10个循环；再以OI1/OI2c为内嵌引物，取第一轮扩增的2μl PCR为模板，在内嵌引物的引导下进行第二轮Nested-PCR扩增。通过Nested-PCR的扩增，在表现黄化症状的2个黄皮样品中则有1160bp的特异条带扩增，初步证明在表现黄化症状的黄皮样品中含有黄龙病病原。XbalⅠ酶切显示，该片段可被切成大小分别约为640bp和520bp的两个片段，初步证明黄龙病病原为亚洲种（Candidatus Liberobacter asiaticus）。扩增产物经纯化，与pMD18-TVector连接，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH 5α，筛选克隆重组子。对PCR产物进行测序及序列分析，结果表明黄皮黄龙病病原16SrDNA片段序列与柑橘黄龙病亚洲种16SrDNA片段序列的同源率为：98.3%～99.6%；与非洲种16SrDNA片段序列的同源率为96.8%；与美洲种16SrDNA片段序列的同源率为94.1%～94.6%；与非洲种亚种的16SrDNA片段序列的同源率94.5%。而与其他的根瘤菌、难培养菌和另外的α亚纲细菌的同源率都在87%～89%之间。因此，认为黄皮叶脉黄化的症状是由黄龙病病原引致的，称之为黄皮黄龙病，而且该黄皮黄龙病病原属于柑橘黄龙病病原亚洲种中的一个成员。系统进化树分析显示，黄皮黄龙病病原与中国柑橘黄龙病病原亲缘关系最近，推测是直可能来自柑橘黄龙病病原。

过去人们对黄皮黄龙病关注较少，本研究从分子水平上证实了黄皮确实会感染黄龙病，建议今后在黄皮生产上应重视黄龙病的问题。但由于黄皮植株内的黄龙病病原含菌量却要比柑橘植株体内的要低得多，而且黄皮也较少表现柑橘黄龙病的典型的斑驳症状，这是否和黄皮的生理特性或者是其体内的某种物质有关，值得深入研究和探讨。