苹果褪绿叶斑病毒干扰性hp-dsRNA基金项目：湖北省自然科学基金资助项目（2006ABA162）。

苹果褪绿叶斑病毒干扰性hp-dsRNA基金项目：湖北省自然科学基金资助项目（2006ABA162）。

RNA介导的病毒抗性主要是基于转录后基因沉默（Post-transcriptional gene silencing，PTGS）作用，在真菌、植物和动物中有PTGS相关的基因存在，这些基因沉默现象可统称为RNA干扰现象（RNA interference，RNAi）。许多证据表明，RNA沉默是由双链RNA（dsRNA）所引发的，且需要细胞内的多种酶参与。基于dsRNA在RNA沉默中的诱导作用，构建能转录后形成dsRNA的载体，转化植物后可有效诱发基因沉默。

苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）是苹果、梨和多种核果类果树上发生普遍的一种病毒，可降低树势和影响果实品质。本研究根据GeneBank上已登陆的ACLSV序列设计合成了一对引物，根据载体pDS1301的限制性内切酶图谱，在引物的两端分别引入了两个不同的限制性内切酶识别位点。以总RNA或dsRNA为模板，通过RT-PCR扩增获得来源于砂梨的2个ACLSV分离物的大小为358bp的片段，该片段位于ACLSV cp基因高度变异区。将扩增片段克隆到载体pMD18-T，筛选阳性克隆后提取质粒，经Kpn I/Bgl II和Spe I/Sac I分别对目标片段及载体pDS1301酶切后，在T4连接酶作用下，将克隆片段以正向和反向方式分别插入植物表达载体pDS1301一内含子两端的多克隆位点，构建了可转录后形成dsRNA的载体pDR358-SMJ和pDR358-HH。将重组质粒转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞后，采用叶盘共培养的方法转化5～6叶期的健康西方烟叶片，经潮霉素抗性筛选获得转基因西方烟植株。从获得的转基因西方烟植株提取总DNA，根据载体pDS1301多克隆位点两侧的序列合成特异引物，采用 PCR方法对这些植株进行了鉴定，已得到了转R358-SMJ的西方烟49株、转R358-HH的西方烟12株（图1）。

图1 部分转基因西方烟的PCR鉴定