Comparison of Viruliferous Rate of Rice Stripe Virus in the Small Brown Planthopper Laodelphax striatellus (Homoptera: Delphacidae) by Bioassay and Dot-immuno Binding Assay

Comparison of Viruliferous Rate of Rice Stripe Virus in the Small Brown Planthopper Laodelphax striatellus (Homoptera: Delphacidae) by Bioassay and Dot-immuno Binding Assay

由RSV引起的水稻条纹叶枯病最早于1897年在日本关东发现，后在朝鲜、乌克兰均有发生。1962年我国在江苏、浙江首先发现RSV。目前该病已经在全国16个省、市、自治区发生，在云南、辽宁、北京、河南、山东、江苏、上海十分常见，特别是云南的保山、楚雄、昆明，北京的双桥，河南原阳，山东济宁及江苏北部的姜堰、洪泽等地，发生更为普遍严重。

RSV由介体灰飞虱（Laodelphax striatellus Fallen）传播，灰飞虱的带毒虫量是水稻条纹叶枯病发生流行的主要影响因子。因此，建立一种快速灵敏检测灰飞虱带毒率的方法对于预测水稻条纹叶枯病的流行及病害防治十分必要。目前国内外用于检测灰飞虱带毒率的方法主要有ELISA、RT-PCR和Northern杂交等。但RT-PCR和Northern杂交成本高，不适于大批量检测样品。用斑点免疫结合（DIBA）法检测快速灵敏，简单易行，适用于大批量检测，并且适合于基层工作人员直接检测灰飞虱携带的病毒，从而为病害的流行预测提供依据。为此，我们利用斑点免疫结合（DIBA）检测RSV的方法对浙江部分市县的灰飞虱进行了水稻条纹叶枯病毒带毒率测定，并与采用生物法测定的灰飞虱传毒率进行了比较。现将研究结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试虫源、水稻品种 2006年供试虫源为采自浙江长兴和嘉兴两地的灰飞虱虫源，2007年供试虫源为浙江湖州和嘉兴海盐、桐乡、秀洲等县区提供的灰飞虱。

供试水稻植株为苗龄15天的嘉991和秀水110两个水稻品种，由嘉兴市农业科学院提供。

1.1.2 供试抗体 RSV抗体由江苏省农业科学院植物保护研究所和浙江大学共同研制，效价为1：5000～10000；酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，由Sigma公司生产（PN为A4416），效价为1：5000～10000。

1.2 试验方法

1.2.1 生物法测定灰飞虱传毒率 选用长度15cm、直径2cm、两端开口的玻璃管，首先用纱布罩住管口一端。将事先育好的供试水稻秧苗置于其中，每管一株，然后接入一头供试灰飞虱，再用纱布罩上玻璃管的另一端。将玻璃管竖直放入盛有清水的育苗盘中，保证秧苗根部朝下刚好浸入水中。对每个玻璃管做好标记，记录灰飞虱采集地，并对每株秧苗进行编号。

2006年供试水稻秧苗数量和灰飞虱虫量均为257，其中长兴虫源104头供试虫全部接在嘉991品种上，嘉兴市新丰虫源中73头供试虫接于嘉991品种上，80头供试虫接于秀水110品种上。

2007年测定了湖州和嘉兴市海盐、桐乡、秀洲共4个不同地区的灰飞虱传毒率。其中湖州和桐乡供试虫口为123头和132头，均接于嘉991秧苗上取食；海盐和秀洲供试虫口分别为159和167头，接于秀水110秧苗上取食。

待该批灰飞虱在供试秧苗上取食24h后，将活的灰飞虱按编号回收冷冻备用。同时将已被取食的供试秧苗按编号移栽到观测圃中，观察并记录回收活虫对应的植株发病情况。

1.2.2 斑点免疫结合（DIBA）法测定灰飞虱带毒率 将生物测定法中收回的供试灰飞虱单头置于100μl碳酸盐包被缓冲液（0.05mol/L，pH值9.6）中，用木质牙签捣碎，5000r/min离心3min后取上清液作为待测样品备用。

在NC膜方格上，每格加入3μl待测样品后在室温下晾干；将干燥的膜正面朝上浸入5%封闭液中，置于37℃水浴锅中30min后，用PBST洗涤3次，浸入用封闭液稀释1000倍的单抗液中置于37℃水浴锅中1.5h；用PBST洗涤3次后，将膜浸入用封闭液稀释5000倍的辣根过氧化物酶标记的二抗中，置于37℃水浴锅中1.5h，洗涤后加入固体显色底物液，置于37℃水浴锅中30min（参见马占鸿等的方法）。随后晾干，统计NC膜上显色格的数量，计算所检测灰飞虱的带毒率。

2 结果与分析

2.1 灰飞虱传毒率测定

在生物法测定灰飞虱传毒率的试验中，被取食供试苗最早于接虫后13天初见发病症状，首先从水稻叶脉附近出现褪绿的斑点，并且斑点排成和叶脉平行的直线，随后病斑逐渐增多，连成互相平行的多条病斑，最后整个叶片发黄直至卷曲。35天后供试苗不再出现新的发病植株。

2006年利用生物法测定传毒率时观察秧苗发病率发现，供试的257株秧苗中有11株发病，发病率为4.28%，其中长兴虫源取食的104株供试苗中有7株发病，即有7头灰飞虱传播病毒，传毒率为6.73%；嘉兴新丰虫源在嘉991和秀水110上取食后的发病植株分别为2株，灰飞虱在嘉991和秀水110上的传毒率分别为2.74%和2.50%。各地平均传毒率为3.99%。

2007年利用生物法测定传毒率观察秧苗发病率时发现，所测4个地区供试的581株秧苗中共有25株发病，发病率为4.30%，其中湖州虫源的传毒率最高，为6.50%；海盐、桐乡和秀洲3个地区的灰飞虱传毒率差异不大，分别为3.77%、3.79%和3.59%，各地平均传毒率为4.41%。

2.2 灰飞虱带毒率测定

利用在生物测定法中回收的供试虫源样本，在实验室采用斑点免疫结合（DIBA）法测定灰飞虱带毒率，试验发现采用斑点免疫结合（DIBA）法测定的灰飞虱带毒率要高于在生物测定法中的传毒率（秧苗发病率）。

2006年采用斑点免疫结合（DIBA）法测定的供试样本平均带毒率为6.15%，其中取自长兴的104头灰飞虱中，检测发现其中11头呈阳性反应，带毒率为10.58%。采自嘉兴的虫源在取食嘉991和秀水110两个品种中分别回收活虫73头和80头，各有3头在检测中发生呈阳性反应，带毒率分别为4.11%和3.75%。对生物学和快速检测法检测结果比较发现，采用斑点免疫结合（DIBA）法检测的带毒率高于生物法测定的传毒率，两者之比平均为1：0.65，幅度为1：0.64～0.67，见表1。

虫源地带毒率测定（DIBA测定）发病率观察（生物法测定）供试虫数反应点带毒率（%）对应检测株反应株传毒率（%）传毒率/带毒率长兴（秀水110）1041110.5810476.730.64嘉兴（嘉991）7334.117322.740.67嘉兴（秀水110）8033.758022.500.67各地平均6.153.990.65

表1 2006年生物法测定结果与DIBA法测定结果比较

2007年采用斑点免疫结合（DIBA）法测定的供试样本平均带毒率为8.68%，其中湖州和嘉兴秀洲虫源的带毒率最高，分别达到了13.01%和11.38%；海盐和桐乡带毒率也较高，分别为5.03%和5.30%。对生物法和快速检测法测定结果比较发现，采用斑点免疫结合（DIBA）法检测的带毒率高于生物法测定的传毒率，两者之比平均为1：0.57，幅度为1：0.32～0.75，见表2。

虫源地带毒率测定（DIBA测定）发病率观察（生物法测定）供试虫数反应点带毒率（%）对应检测株反应株传毒率（%）传毒率/带毒率湖州（嘉991）1231613.0112386.500.50海盐（秀水110）15985.0315963.770.75桐乡（嘉991）13275.3013253.790.72秀洲（秀水110）1671911.3816763.590.32各地平均8.684.410.57

表2 2007年生物法测定结果与DIBA法测定结果比较

3 小结与讨论

通过对不同地区虫源在两个不同水稻品种上的试验发现，在浙江嘉兴和湖州采集的灰飞虱供试虫源中均有一定数量的灰飞虱携带病毒并有传毒能力。通过2006年、2007年两年利用斑点免疫结合法和生物法对灰飞虱带毒率和传毒率检测试验表明，灰飞虱带毒率高于传毒率，而且传毒率与带毒率之比相对较为稳定，两年平均为0.61，其中2006年灰飞虱传毒率与带毒率之比为0.65，2007年灰飞虱传毒率与带毒率的比值为0.51。以上结论初步明确了浙江嘉兴、湖州两地越冬代灰飞虱体内水稻条纹叶枯病带毒率与传毒率之间的关系，为两种检测方法数值转换和病害预测提供科学依据，但其他世代灰飞虱带毒率与传毒率之比是否与此一致尚有待进一步研究。