Primary Study of Oligogalacturonides Inducing Resistance to Tobacco Mosaic Virus

Primary Study of Oligogalacturonides Inducing Resistance to Tobacco Mosaic Virus

烟草病毒病有“烟草癌症”之称，一旦发生和蔓延，就难以控制，严重制约烟草的正常生长。目前发生最普遍、危害最严重的是烟草花叶病毒（TMV），其发生范围遍及各烟区，不仅造成烟草产量的损失，而且使烟草品质严重下降，降低烟草的烟叶等级，严重影响烟叶的经济性状。化学药剂所造成的病原物抗性和环保问题，使其应用受到较多限制；由于植物病毒系活体寄生物，侵入寄主细胞后的增殖需借助寄主的代谢，因此至今尚无安全、有效的治疗药剂。而诱导抗性作为对植物病害的诱导应答减少了植物在抗病方面所付出的种种代价，因此是较为经济有效的抗病策略，并在作物可持续病害防治中具有十分广阔的应用前景。本文着重研究寡聚半乳糖醛酸诱导烟草抗烟草花叶病毒的能力，以期为寡聚半乳糖醛酸用于农业生产提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料? 基金项目：国家“863”计划（2006AA10A213；2007AA091600）；中国科学院知识创新工程重要方向项目（KSCX2-YW-N-007）。

1.1.1 供试药剂 寡聚半乳糖醛酸以及壳寡糖，由中国科学院大连化学物理研究所研制。20%病毒A可湿性粉剂（黑龙江省齐齐哈尔四友化工实业有限公司，市购）。

1.1.2 供试植物 枯斑三生烟（Nicotiana tobacum L.SamSun NN）。

1.1.3 供试毒源 烟草花叶病毒（TMV），本实验室保存于普通烟上。接种病毒汁液为每克含TMV的烟草病叶，加入5倍体积0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH7.0），在研钵中研磨后纱布过滤。

1.2 田间试验

1.2.1 试验处理 供试药剂寡聚半乳糖醛酸设浓度为50μg/ml喷雾；浓度为75μg/ml喷雾；浓度为100μg/ml喷雾。病毒A稀释700倍喷雾。清水对照。共5个处理。

1.2.2 试验实施 试验设在海南试验地中，土壤为红土。试验每个处理15株长势大小一致的6～8叶期的烟草，叶面喷雾施药。24h后汁液摩擦接种TMV病毒。在病毒汁液中加入少量石英砂，用毛笔蘸取汁液摩檫接种。枯斑三生烟苗采用半叶法接种，每株接4片叶。接种后每天观察发病情况。待全面发病后，调查病斑数。

1.3 温室试验

1.3.1 试验方法 选取大小一致、6～8叶期的烟草植株，均匀喷洒供试药剂寡聚半乳糖醛酸50μg/ml。处理24～96h不同时间后，进行接毒试验。采用半叶法摩擦接种。接种7天后，统计叶片上的病斑数。试验重复3次计算防效。

抑制率（%）=[（对照叶片病斑数-处理叶片病斑数）/对照叶片病斑数]×100%

1.4 抗性相关酶的测定

1.4.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性 取样叶1.4g，10.0ml 含5mmol/L巯基乙醇的硼酸缓冲液（0.05mol/L，pH 8.8），加入0.5g PVP和石英砂在研钵中研磨，在冰水中研磨成浆。10000r/min 4℃离心10min，上清液即为酶液。3ml反应体系中含50mmol/L磷酸缓冲液，13mmol/L甲硫氨酸，75μmol/L氮蓝四唑（NBT），100nM EDTA，4μmol/L核黄素，加入50μl粗酶，在日光下反应，以黑暗终止反应，立即在560nm下比色。以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活单位。以不加酶液的光照管为对照。以磷酸缓冲液调零。

1.4.2 过氧化氢酶（CAT）活性 3ml反应体系中含50mmol/L pH 7.0 PBS1.9ml，45mmol/L H2O2（2%）1.0ml和0.1ml酶液。连续记录240nm吸光度的变化。以每分钟变化0.01为一个酶活单位。

2 试验结果

2.1 田间试验

试验结果表明，壳寡糖、寡聚半乳糖醛酸50μg/ml，75μg/ml，100μg/ml，以及病毒A稀释700倍都对烟草花叶病毒侵染烟草产生枯斑有抑制效果。其中寡聚半乳糖醛酸50μg/ml抑制效果最好，抑制率为52.8%，略高于阳性对照壳寡糖（49.7%）以及病毒A（31.8%）。寡聚半乳糖醛酸75μg/ml以及100μg/ml，抑制率分别为49.7%和37.9%，都高于病毒A稀释700倍。寡聚半乳糖醛酸浓度在50～100μg/ml之间是随浓度的增加，抑制率有所降低。

2.2 温室试验

取田间试验诱抗效果最好的寡聚半乳糖醛酸浓度50μg/ml进行温室试验，试图寻找诱抗效果最好的时间点。试验结果表明（3次重复），喷施寡聚半乳糖醛酸96h时，随着时间的延长诱抗效果越明显，枯斑产生的抑制率为62.2%，但是差异不显著，说明96h内寡聚半乳糖醛酸诱导效果基本维持稳定。

处理斑点数抑制率（%）寡聚半乳糖醛酸50μg/ml92±40?52.875μg/ml98±47?49.7100μg/ml121±4337.9病毒A稀释700倍133±4031.8壳寡糖50μg/ml98±32?49.7CK195±48—

表1 寡聚半乳糖醛酸不同浓度喷施对烟草花叶病毒病的防效（P<0.05）

处理斑点数抑制率（%）寡聚半乳糖醛酸24h89±35?37.648h91±61?36.872h80±35?44.396h54±21?64.4CK143±64—

表2 寡聚半乳糖醛酸喷施不同时间对烟草花叶病毒病的防效（P<0.05）

2.3 寡聚半乳糖醛酸处理烟草后抗性相关酶活性变化

2.3.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性变化 寡聚半乳糖醛酸处理烟草植株后SOD的活性变化如图1所示。处理烟草15m～12h的时间内，SOD酶活性升高，均高于对照。其中处理1h内就达到一个峰值。8～12h达到第二个峰值。推测寡聚半乳糖醛酸诱导烟草首先能够产生一个快速的SOD活性升高的反应，然后在8～12h时能诱导另外一个途径使SOD酶活升高。

图1 寡聚半乳糖醛酸诱导烟草不同时间后SOD酶活

2.3.2 过氧化氢酶（CAT）活性变化 寡聚半乳糖醛酸处理烟草植株后，CAT活性明显高于对照，处理15m～2h即达到峰值。在处理后的148h内，CAT均可保持较高的活性。说明寡聚半乳糖醛酸在2h内可以快速诱导CAT的活性，并且可以在较长时间保持诱导烟草植株CAT的活性。

图2 寡聚半乳糖醛酸处理烟草不同时间后CAT活性变化

3 结论与讨论

目前，对于寡聚半乳糖醛酸作为植物诱导子的研究比较多，但是对于诱导烟草抗烟草花叶病毒的研究较少，本实验室研究了寡聚半乳糖醛酸诱导烟草抗性的最佳浓度为50μg/ml，96h以内的诱导抗性不依赖于诱导时间的长短。本实验室也检测了诱导时间长达25天的诱抗效果，诱导抗性随时间的延长而先增加后降低，在16天达到最高。

植物体在抵抗病原菌侵染的过程中，有些保护反应是在酶催化下完成的。许多研究结果表明，植物在逆境条件下，其膜系统的受损与生物氧自由基有关，超氧化物歧化酶SOD被认为是细胞膜的保护酶。酶活性愈高，消除氧自由基的能力越强。植物的抗逆性也愈强[1]。抗病毒剂VA诱导枯斑三生烟后，叶片中SOD活性增加，推测VA诱导枯斑三生烟对TMV的抗性可能与活性氧代谢有关，即可减少活性氧对植物的毒害作用[2]。另外，其他的能够诱导烟草抗TMV的诱导子如VFB[3]以及落葵提取液4]，均可诱导烟草中SOD酶活性的增加。本文寡聚半乳糖醛酸能够诱导烟草抗病毒，并且也伴随着SOD酶活性的升高，间接说明SOD酶活性的升高与植物抗病毒有关系。

过氧化氢酶（CAT）是植物细胞内重要的活性氧清除剂，其生理作用是将H2O2还原为H2O和O2。CAT活性升高或H2O2含量降低意味着活性氧对植物细胞伤害程度的降低。病原菌侵染烟草后，总体上看，抗病品种CAT活性高于感病品种[5]。孔凡明等通过烟草与TMV不同互作体系的研究表明，接种后CAT活性均升高，在非亲和性互作的早期，CAT活性显著高于亲和性互作[6]。因此，我们推测，寡聚半乳糖醛酸诱导烟草植株CAT活性的升高，有利于提高植物抗病毒的能力。但是对于诱导烟草抗性的具体机理还有待于进一步的研究。