Primary Study of Oligochitosan Inducing Resistance to Sclerotinia sclerotiorum on Brassica napus

Primary Study of Oligochitosan Inducing Resistance to Sclerotinia sclerotiorum on Brassica napus

菌核病为我国油菜三大病害之首，严重影响油菜的产量和品质，目前通过使用化学农药等措施对其进行防治，但是效果不很明显，且长期使用化学农药会造成对环境的严重污染。所以利用植物自身诱导抗病性对菌核病进行防治是现在农业生产中的新趋势。植物诱导抗病性是植物抵御病害侵袭的重要机制之一，具有作用效果明显，广谱性及环境友好等优点，作为一种经济有效的抗病策略，在农业可持续病害防治中具有广阔的应用前景，日益受到人们的关注。我们实验室开发研制的生物农药中科六号（壳寡糖）在田间及温室实验中被证实可诱导烟草等作物对相应的病害产生防治作用[1]；田间使用中科六号可减轻油菜菌核病对油菜的影响，故本文中利用植物生理生化方法进行温室实验及生化实验，初步探讨壳寡糖诱导油菜抗菌核病的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试药剂 壳寡糖（oligochitosan、COS），脱乙酰度>95%，聚合度为3-10，由中国科学院大连化学物理研究所研制；配制成50μg/ml使用。

1.1.2 供试植物 甘蓝型油菜沪油15（Brassica napus L.）温室中培养至4～6片叶期。

1.1.3 供试病原菌 油菜菌核病病原菌 核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）本实验室保存。

1.2 温室试验? 基金项目：国家高科技研究发展专项经费（2006AA10A213；2007AA091600）；中国科学院知识创新工程重要方向项目（KSCX2-YW-N-007）。

1.2.1 实验设计 为考察接菌前不同时间壳寡糖预处理对诱抗作用的影响，分别在接菌前0～4天处理油菜植株。新鲜配置的50μg/ml壳寡糖溶液喷雾油菜植株，每株取两片叶子，确保其正反面均润湿，确保其他叶片未被喷上壳寡糖溶液。

1.2.2 油菜菌核病接种方法 保存的菌核用70%乙醇浸泡30s，1%的升汞消毒10min，无菌水冲洗3次后，接种于PDA（potato dextrose agar）培养基中。在25℃下暗培养3～5天，待菌丝长满培养皿后即可进行接种。接种试验之前，先将4～6片叶期油菜植株喷上雾状水珠，用打孔器将菌丝截成直径为0.15cm大小的菌丝琼脂块，将有菌丝的一面与壳寡糖预处理的油菜叶片接触，每株取一片叶子，每片叶子上放一块菌丝琼脂块，然后用保鲜膜盖上，再喷一次雾状水珠，保持温度20℃左右，接种后每天喷一次水。

1.2.3 病情指数调查方法 在接菌后第五天根据病斑占叶片面积比例调查病情指数，分级标准为：0=没有病斑；1=病斑面积占叶面积11%以下；2=病斑面积占叶面积11%～30%；3=病斑面积占叶面积31%～50%；4=病斑面积占叶面积51%以上。

1.3 脂氧合酶测定

1.3.1 粗酶提取 取提前三天壳寡糖预处理植株进行试验，以正常、壳寡糖处理不接核盘菌和未经壳寡糖预处理接核盘菌的植株为对照。每个试验点选取4株植株，每株取系统叶和处理叶各一片，迅速放入液氮中保存。取样叶1.4g，10.0ml含5mmol/L巯基乙醇的硼酸缓冲液（0.05M，pH 8.8），加入0.5g PVP和石英砂在研钵中研磨，在冰水中研磨成浆。10000r/min 4℃离心10min，上清液即为酶液。考马斯亮蓝法测定总蛋白含量。

1.3.2 脂氧合酶（LOX）活性测定 0.1ml粗酶液与3ml 0.20mM亚麻酸溶液混匀后放入30℃水浴中反应，监测5min后OD234变化值，酶活由以下公式计算：（A234末-A234初）/0.001/总蛋白含量（mg）。

1.4 抑菌试验

用滤纸片法在PDA培养基平板上进行抑菌试验，在培养基平板正中央接0.15cm大小的核盘菌菌丝琼脂块，打孔器取直径5～6mm的滤纸片，在无菌条件下浸泡壳寡糖溶液均匀后放置平板上，每皿放置5点，其中一点为对照即浸无菌水，另设不放滤纸片的培养皿平板为阴性对照，观察不同浓度处理滤纸片后其周围病菌生长状况，与对照相比，经72h恒温培养后，根据抑菌圈大小判断抑菌效果。壳寡糖溶液浓度50mg/kg，200mg/kg，500mg/kg，1000mg/kg。

2 结果与分析

2.1 温室试验结果

依据田间试验诱抗效果取最佳浓度50μg/ml进行温室试验，试图寻找防效最好的预处理时间点。对照植株在12h时就发病明显，96h后叶片枯萎。而经壳寡糖预处理者接核盘菌后12h内症状不明显，24h时产生病症，120h后叶片出现枯萎现象（图1），说明壳寡糖处理能延缓菌核病发病，壳寡糖预处理的植株都表现出一定的抗菌核病的能力接菌（表1），提前三天（72h）预处理有最佳效果，在120h时防效为54.60%，试验结果显示防效可达120h以上。

图1 壳寡糖提前三天预处理后油菜接菌核病后表型变化（0h，12h，24h，48h，120h）

Figure 1 Appearance of 72h before COS pretreated B.napus leaves challenged with S.sclerotiorum.（0h，12h，24h，48h，120h）

预处理时间病情指数（%）防效（%）022.91—提前24h15.6231.8提前48h14.5836.35提前72h10.4154.60提前96h12.5045.44

表1 不同时间壳寡糖预处理对油菜菌核病的影响

Table 1 The resistance of COS pretreated B.napus to S.sclerotiorum

2.2 LOX酶活性变化

不同处理后油菜植株LOX的活性变化如图2所示。处理叶在只接菌和COS预处理后接菌情况下，72h小后活力提高，而COS处理的植株96h后活力才提高，且COS处理后的植株LOX活力高于只接菌者。在系统叶中获利变化更明显，在48时有一个峰值，96h水平又明显提高一个途径使SOD酶活升高。这些复杂现象说明在油菜中COS可通过多种途径诱导LOX活力升高。

图2 壳寡糖和核盘菌引起的LOX酶活力变化 （A）处理叶 （B）系统叶

Figure 2 Effects of oligochitosan and S.sclerotiorum on activities of LOX enzymes in B.napus leafs.（A）Treat leafs （B） System leafs

2.3 抑菌试验结果

如表2所示，低浓度壳寡糖对核盘菌的直接抑制作用不明显。

壳寡糖浓度（mg/kg）抑菌圈直径（cm）壳寡糖浓度（mg/kg）抑菌圈直径（cm）0—5000.34±0.0550无抑制10000.75±0.11100无抑制

表2 不同浓度壳寡糖对核盘菌的抑菌圈直径

Table 2 The inhibitory diameter of S.sclerotiorum by different concentration COS

3 结论与讨论

壳寡糖作为近几年研究较多的一种植物诱抗剂，已经被广泛应用于烟草、棉花、油菜等作物生产中。然而其作用机制尚不明了，本文首次进行了壳寡糖对油菜抗菌核病的研究。发现使用50μg/ml的壳寡糖溶液预处理油菜植株，可以提高其抗菌核病能力，其抗性可持续96h以上，防效可达到54.60%。防治效果虽然没有化学药剂作用明显[2]，但与其他诱抗剂效果相当[3，4]，在环境友好前提下具有良好的防治效果。

壳寡糖对核盘菌的生长没有显著抑制作用，于汉寿等人也发现壳聚糖对核盘菌的直接抑制作用也不明显[3，5]，说明喷施壳寡糖使油菜对菌核病产生抗性主要是因为壳寡糖诱导油菜产生了系统抗性，而不是来源于壳寡糖对菌核病的直接作用。

提前三天预处理的植株有最高防效，说明壳寡糖诱导对菌核病的抗性可能有一个响应和滞后期，Molloy等人[6]报道壳寡糖诱导胡萝卜防治菌核病的最佳处理期也是接菌前三天，说明这种现象是广泛存在的。

脂氧合酶（LOX）在植物抗胁迫响应时扮演重要角色[7]，脂氧合酶可催化多不饱和脂肪酸转化为氢过氧化物，并最终生成重要的植物抗性反应信号分子茉莉酸（JA）。Kim等人[8]报道LOX酶水平可以被JA诱导升高，我们的实验结果说明壳寡糖可同时诱导油菜处理叶和系统叶中LOX酶活性升高，揭示壳寡糖可能是通过JA酸途径诱导植物产生抗病性的，这与我们之前利用基因芯片得出的结论相吻合[9]，但具体的信号转导网络仍有待进一步研究。