Application of Gene Expression Research Methods in Plant Pathology

Application of Gene Expression Research Methods in Plant Pathology

基因表达是基因在生物体内转录、翻译以及所有加工的过程，在真核生物中，约有10万个基因，而表达的基因只占基因组的15%左右，了解不同条件下细胞内基因表达的变化，可以帮助我们了解控制生命过程的机理[13]。对于植物来说，在植物不同的发育阶段和不同的环境条件下，基因的时空表达受到严密的调控。当植物受到病原物，如细菌、真菌、病毒、线虫等的侵袭时，植物体内存在防御机制，诱导相关基因表达，或者诱导相关基因表达量增加，产生次生代谢产物或表达抗性基因，从而抵御病原物的侵袭。因此研究植物基因表达变化水平对于揭示植物抗感病机理有重要的意义。

在人类控制植物病虫害的措施中，抗病虫转基因植物是其中的重要手段之一，这样可以减少农药的使用，减少对环境的污染，并且符合可持续发展农业的要求，而基因表达分析又是其中必不可少的一步。它可以检测抗病虫基因能否高效的表达，以及能否在特定的发育阶段或者特定的组织器官中表达。基因表达研究方法有Northern杂交法、表达序列标签、mRNA差别显示技术、基因表达的系列分析方法和基因表达芯片等，本文对主要基因表达研究方法在植物病理学上的应用进行了简单概述。

1 Northern杂交法(Northern Blots)

Northern杂交技术是用于测定真核生物RNA样品中特定mRNA分子的量和大小以及估计其丰度的技术，是研究基因转录产物的重要手段[14]。Northern杂交技术是在Southern技术的基础上建立起来的，具体的步骤是首先从要研究的组织或细胞中分离完整的mRNA，然后将RNA根据大小用变性琼脂糖凝胶电泳分离，再通过毛细管作用或负压法装置使RNA条带转移到纤维膜上，进行必要的处理后，用固相RNA与探针分子杂交，对特异结合的探针分子的图象进行检测、捕获和分析[15]。这种方法具有较高的特异性，主要是应用于检测特异rnRNA，以分析已知基因的表达情况。

李子银等[16]根据已知植物抗病基因的保守区域设计引物，从抗稻瘟水稻品种窄叶青8号第一链cDNA和基因组DNA中扩增出3个与植物抗病基因同源的序列，利用Northern杂交技术，显示其中一个基因在水稻叶片、幼茎和根中均有转录。

程志强等[17]利用已知的植物R类基因保守结构域，设计简并引物作为随机引物，分析水稻愈伤组织受白叶枯病菌诱导的mRNA表达丰度差异，获得3个差异片段。Northern杂交结果证实该片段受白叶枯病菌诱导表达，且在抗性品种中的诱导表达明显强于感病品种的诱导表达。

黄萱等[18]根据已知植物抗病基因的保守结构域设计引物，从抗锈病小麦品种西农88基因组DNA扩增触3条与植物抗病基因同源的序列，通过Northern杂交表明其中一个同源序列在小麦中受水杨酸调控，属于诱导型表达的抗病基因。

2 表达序列标签（Expressed Sequence Tags,EST）

表达序列标签（EST）技术是由Adams等[1]提出的。典型的真核基因mRNA是由5’帽子，5’-UTR，编码区，3’-UTR，3’polyA尾巴五部分组成，其中5’-UTR和3’-UTR对基因具有特异性，3’或5’端的一段序列就可以表示在某种条件下基因的表达情况[19]。表达序列标签即在不同的组织构建的cDNA文库中，随机挑选不同的克隆，进行克隆的部分测序从而产生的cDNA序列。目前，已经建立了大量的EST数据库，可以根据不同时间，不同处理、不同组织，不同条件下EST数据的比对，鉴别特异表达的基因。但是，此技术对实验室的仪器、测序、经费等要求高。

马金彪等[20]利用EST技术构建条锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库，通过序列分析，了解小麦与条锈菌互作过程中表达的基因，为从分子水平揭示寄主与病原菌亲和互作机理奠定了理论基础。

3 mRNA差别显示技术(Differential Display)

mRNA差别显示技术，又称差示反转录PCR（differential display of reverse transcriptional PCR），简称DDRT-PCR，它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。几乎所有的真核基因mRNA分子的3’末端都带有poly（A）尾巴，在RNA聚合酶的作用下，以mRNA为模板，以oligo（dT）为引物合成出cDNA链[21]。此技术的优点在于简单方便、灵敏度高，但同时它也存在局限性，如：假阳性比例高，可达50%～70%；扩增的片段分子量比较小；工作量大等[13]。

mRNA差别显示技术最初是为动物研究设计的，但是从其原理来看，在植物基因表达的研究上也存在很大的潜力，可以应用于植物抗病基因的表达研究上，研究发现，抗病基因中很多都是多基因家族，这样的多基因家族在抗、感病品种中都存在，只是其中的成员有所不同，有的基因缺失，这可能就是造成抗病品种抗病、感病品种感病的原因。所以，可以应用mRNA差别显示技术分析比较抗病品种和感病品种的差异表达的基因，从而进行进一步的分析。

黄旭等[22]通过外源DNA浸泡幼胚将普通野生稻（Oryza rufipogen）抗稻瘟系YD1005总DNA导入受体粳稻寒丰S（Oryzasativa ssp.japonica）育成一抗稻瘟病变异株（D1代），利用mRNA 差别显示技术分离得到一个原品种中没有的与抗稻瘟病相关的一个cDNA。

饶志明等[23]人利用mRNA差别显示技术对水稻感病品系G71受苯并噻二唑诱导3天的应答反应进行分析，从抗病及其相关基因保守结构域设计的10个引物组合的反应中获得11个受BTH诱导的cDNA差异片段，进一步利用Northern杂交证实其中一个阳性片段的表达受BTH和稻瘟病菌的诱导。

4 基因表达的系列分析方法(Serial Analysis of Gene Expression,SAGE)

由于差别杂交技术、mRNA差别显示技术各有缺点，不能够提供全面的表达分析图谱，不能够全面系统的分析基因转录组。因此，在此基础上，1995年Velculesue等[2][3]描述了一种基因表达的序列分析技术（SAGE），该技术能快速详细的分析成千上万个转录子，能够全面的对基因组的表达进行分析，而无须依赖以前的转录信息。在一个转录物中，可以找到一段特异的序列，这个特异的序列就可以代表这个转录物，该序列即转录序列标签（SAGE标签），一般为9～10bp；SAGE 标签经随机连接、扩增并集中在1个克隆中测序，标签重复出现的次数代表该转录物的拷贝数。根据其占总标签数的比例即可分析出其所对应的编码基因的表达频率。

SAGE是分析诱导表达的抗病基因的一种有效的方法，Matsumara等[4]应用SAGE 技术研究水稻在白粉病菌侵染后基因表达的整体变化，旨在发现与稻瘟病抗性相关的新基因；Mitchell 等[5]利用SAGE 方法对水稻与稻瘟病菌之间相互识别及病理反应进行全基因组分析，以了解与病原菌致病力和寄主抗性相关的基因。Mysore 等[6]以番茄为材料，分析了不亲和的植物病原菌互作过程中经诱导产生或被抑制的基因表达图谱。

5 基因表达芯片(cDNA Microarrays)

基因芯片技术最早是由Fodor[7]等提出的，基因芯片是一种用于合成和分析生物分子的微型装置。其原理是指是指将大量生物讯息密码，以预先设计的方式固定在玻片、硅片、塑料和尼龙膜等固相载体上组成的密集分子阵列。微阵列在一定条件下进行生化反应，反应结果用化学荧光法、酶标法、同位素法显示，再用扫描仪等光学仪器进行数据采集，最后通过专门的计算机软件进行数据分析[8]。微阵列芯片主要有两种：基于寡核苷酸微阵列芯片和基于cDNA 片段的微阵列芯片。虽然寡核苷酸阵列芯片的检测灵敏度高，可检测出一个碱基的错配，但寡核苷酸芯片的制作是基于DNA 序列已知的基础上，而cDNA 片段可以来自序列未知的cDNA 克隆、EST 克隆，隐含的基因组克隆，或已知的基因组序列的扩增ORFs [24]。因此，基因表达芯片技术是一种高通量的对两种组织或细胞基因表达进行检测和分析的方法。该方法并且克服了核酸杂交技术的操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等问题[19]。

Whitham等[9][25]通过使用微阵列技术，对不同种RNA病毒对易感的拟南芥基因表达的影响进行了研究，结果发现，不同种RNA病毒在易感植物宿主中诱发相同的反应，此研究有利于深入理解RNA病毒致病机理。

在遗传上有显著差异的植物病原菌Xylellafastidiosa（Xf）的菌株导致了许多种植物病害，在全世界造成了巨大的经济损失。Nunes 等[10]以Xf 9a5c 菌株（导致柑橘花斑缺绿症）的基因组为参照，使用以微阵列技术为基础的方法，比较了12 个Xf 分离菌株，并对菌株间的基因组组成差异进行全面的评价。

6 定量RT-PCR技术( Quantitative RT-PCR,qPCR)

定量RT-PCR技术是在反转录和定量PCR的基础上发展起来的一种检测特定基因表达量的技术，可以根据PCR扩增产物的量确定目的基因的表达水平[26]。包括相对定量RT-PCR，竞争性定量RT-PCR、比较定量RT-PCR 和实时定量RT-PCR[27]。

朱建裕等[28]根据番茄环斑病毒（ToRSV）各株系RNAⅠ聚合酶基因的保守序列，设计并合成1对引物和1条Taqman荧光探针，建立了对ToRSV的实时荧光RT-PCR检测方法。

Chang JH等[11]根据番茄Pto基因家族的序列，设计特异性引物，应用RT-PCR技术，验证了Pto基因家族成员在抗感病番茄中的表达情况，结果发现Pto基因家族成员LescFen、Lescpth2和Lescpth5在感病番茄Rio Grande 76S中表达，Pto、Fen、Lpimpth2和Lpimpth5在抗病番茄Rio Grande 76R中表达。

7 Gene calling

Gene calling是Shimkets等[12]人于1999年提出的，该技术受专利保护（USPYO5871697和USPYO5972693）。主要分为三步：①限制内切酶双酶切②加接头③PCR扩增，并对每个片段回收测序，测序结果数据库比对。具体步骤如下：合成双链cDNA，限制内切酶双酶切，对酶切产物加接头，然后用接头特异性的引物进行PCR扩增，引物分别用生物素和FAM标记，扩增产物毛细管电泳分离，并对每个片段回收测序，测序结果数据库比对。它可以对同一位点的基因表达种类和表达丰度进行分析[29]。此技术的应用有以下几个方面：①确定新的、稀少的表达基因；②当植物受到病原物侵袭时，可以快速检测到特异表达的基因；③可以利用比较基因组学比较种间基因差异，从而确定基因功能；④可以敏感地确定基因表达的微量变化等。

另外，还有一些基因表达研究方法，如差异杂交，但仅适用于基因组基因组复杂程度较低的基因组，如酵母；S1核酸酶保护分析法间接的检测mRNA，适用于基因调控方面的研究，但是费时费力费用高；噬菌斑原位杂交可以分离cDNA中的目的基因，但费用较高；基因表达指纹技术，它采用酶切代替了PCR扩增，所获结果含有一定的编码信息，但是仅能得到高表达的基因，并且受电泳技术限制。

在植物病理学研究领域，基因表达分析技术已经广泛的应用于病原菌的检测、转基因植物的检测、植物病原物互作机理的研究以及植物抗病信号转导研究等方面，使植物病理学研究者根据不同时期基因表达的变化，揭示植物抗感病机理、防治病虫害的发生以及选育植物抗病品种。虽然目前还有一些问题需要解决，但是相信随着各种基因表达研究方法的不断完善和改进，在植物病理学研究上将会有越来越广泛的应用。