Fermentation Conditions for Biocontrol Bacterial Strain SH7
烟草青枯病是由青枯菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种细菌性病害，是烟草的一大毁灭性病害。此病主要分布于世界热带、亚热带及温带等湿热地区。我国烟草青枯病菌在长江以南发生居多，据报道，该病在多发病区旱地烟田的发病率为30%～50%。对烟草青枯病的防治，迄今仍无十分有效的措施，通常采用化学农药方法防治，但由于青枯病是维管束类病害，因而限制了化学农药的使用；而且化学防治易产生抗药性，造成环境污染。近年来，由于生物防治具有无污染、无公害、长效性等特点，所以青枯病的生物防治逐渐引起国内外的高度重视[1～4]。目前已取得了良好的进展，如魏春妹等[5]研制出番茄青枯病和烟草青枯病的生防制剂“青枯散”，田间试验证明该制剂对番茄青枯病、烟草青枯病有70%和80%的防治效果。为了筛选拮抗能力、定殖竞争能力强和效果稳定的优势菌株，本实验室从烟草的根标、根围土壤分离筛选出了拮抗细菌，并进行了室内拮抗能力的测定和盆栽烟苗防病的系列研究，得到了一株拮抗能力较好的菌株SH7，具有较好的商业化前景。本研究进行了SH7摇瓶发酵试验，筛选适合该菌株的发酵培养基配方和发酵条件。
1 材料与方法
1.1 供试菌株和培养基
枯草芽孢杆菌SH7菌株由本室筛选、保存。种子培养基：牛肉汁液体培养基（酵母粉0.5g、葡萄糖10g、蛋白胨5g、牛肉膏3g、pH值7.0，定容至1L）。待测培养基的配制[6]：①号培养基：淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.1%、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.05%、酵母膏0.02%、氯化铁0.01%、碳酸钙0.01%、豆粕1%；②号培养基：淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.1%、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.05%、酵母膏0.02%、氯化铁0.01%、碳酸钙0.01%、豆粕1%、30.8mg/L的硫酸锰溶液0.1%；③号培养基：牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、葡萄糖1%、氯化钠0.5%；④号培养基：牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、葡萄糖1%、氯化钠0.5%、淀粉0.3%、30.8mg/L的硫酸锰溶液0.1%。将4种不同培养基pH值均调为7.2～7.3，装液量为60ml/300ml。121℃灭菌20min，备用。
1.2 方法
1.2.1 种子准备 牛肉汁液体培养基，pH值为7.0，装瓶量为100ml/300ml三角瓶，121℃灭菌20min。将牛肉汁液体培养基接菌后37℃过夜摇菌。
1.2.2 培养基配方筛选 上述4种培养基中接种种子菌液1.5ml，在31℃条件下，摇菌36h后取5ml发酵完毕的菌液，在12000r/min下离心5min，倒掉上清，冷冻干燥沉淀18h后，称重量。
1.2.3 发酵培养条件优化 每次只改变测定的一个发酵条件，其他方法同1.2.2。
2 结果
2.1 培养基配方筛选结果
从表1可以看出，3次重复中5ml培养液中菌体干重的平均值大小依次为④号（0.0094g）＞③号（0.0089g）＞①号（0.0059g）＞②号（0.0054g），因此④号培养基较适合该菌的发酵。
2.2 发酵培养条件优化
2.2.1 pH值 将发酵培养基的pH值分别调为7.0、7.3、7.6、7.9、8.2，3次重复。在装瓶量为60ml/300ml，接种量为1.5ml，31℃，180/min条件下摇菌36h，取5ml发酵液，冷冻干燥后称重。结果为，pH值7.0为0.0081g、pH值7.3为0.0061g、pH值7.6为0.0079g、pH值7.9为0.0082g、pH值8.2为0.0092g。pH值8.2比较适合该菌的发酵（图1）。
重量（g）①号②号③号④号10.00590.00510.00970.013120.00660.00530.00970.006230.00510.00380.00720.0090平均0.00590.00540.00890.0094
表1 培养基配方筛选结果
2.2.2 装瓶量 将发酵培养基的pH值分别调为8.2，接种量为1.5ml，在300ml的三角瓶中分别装入40ml、60ml、80ml、100ml、120ml，3次重复。在31℃、180r/min条件下摇菌36h，取5ml发酵液，冷冻干燥后称重。结果为，40ml的为0.0065g、60ml的为0.0071g、80ml的为0.0065g、100ml的为0.0053g、120ml的为0.0062g。300ml的三角瓶中装60ml培养基较适合该菌生长（图2）。
图1 pH值筛选结果
图2 装瓶量筛选结果
2.2.3 接种量 将培养基的pH值调为8.2，装瓶量为60ml/300ml三角瓶，接种量分别设为2%、4%、6%、8%、10%，3次重复。在31℃、180r/min条件下摇菌36h，取5ml发酵液，冷冻干燥后称重。结果是，接种量2%的为0.0098g、4%的为0.0108g、6%的为0.0103g、8%的为0.0112g、10%的为0.0096g。较合适的接种量为8%（图3）。
2.2.4 培养温度 将培养基的pH值调为8.2，装瓶量为60ml/300ml三角瓶，接种量为8%，将温度分别设为25℃、28℃、31℃、34℃、37℃。在180r/min条件下摇菌36h，取5ml发酵液，冷冻干燥后称重。其结果是，25℃为0.0087g、28℃为0.0107g、31℃为0.0112g、34℃为0.0099g、37℃为0.0106g。较合适的温度为31℃（图4）。
图3 接种量筛选结果
图4 温度筛选结果
2.2.5 培养转速 将培养基的pH值调为8.2，装瓶量为60ml/300ml三角瓶，接种量为8%，温度为31℃。将转速分别设为120r/min、150r/min、180r/min、210r/min、240r/min，摇菌36h，取5ml发酵液，冷冻干燥后称重。其结果是，120r/min为0.0091g、150r/min为0.0109g、180r/min为0.0092g、210r/min为0.0107g、240r/min为0.0101g。150r/min比较适合该菌发酵，所以选定150r/min作为较适转速（图5）。
2.2.6 发酵时间 将培养基的pH值调为8.2，装瓶量为60ml/300ml三角瓶、接种量为8%、温度为31℃、转速为150r/min，将摇菌时间分别设为12h、24h、36h、48h、60h，取5ml发酵液，冷冻干燥后称重。其结果是，12h为0.0038g、24h为0.0062g、36h为0.0063g、48h为0.0067g、60h为0.0063g。发酵时间36h和60h菌体重量相同，但48h菌体重量最大，发酵时间越长对于生产越不经济，所以选取48h为较适发酵时间（图6）。
图5 转速结果筛选
图6 发酵时间筛选结果
2.3 正交试验结果
为了确定最优的培养基配方，我们将摇瓶试验结果相对较好的④号培养基作为基础培养基（培养基中其他营养成分不变），从中选出4种主要成分，采用优化好的发酵条件，按正交设计表L9（34）设计了4个因素、3个水平的正交试验，以进一步优化培养基配比[7，8]。正交试验设计和结果见表2。由表中R值可看出，影响SH7菌量依次为：牛肉膏＞蛋白胨＞NaCl＞葡萄糖。正交试验结果表明最佳培养基组合为：0.9%牛肉膏+2%蛋白胨+2%葡萄糖+1.1%NaCl。
试验号牛肉膏（%）蛋白胨（%）葡萄糖（%）NaCl（%）菌体含量（g/5ml）1号1（0.3%）1（1%）1（1%）1（0.5%）0.009112号12（1.5%）2（1.5%）2（0.8%）0.010563号13（2%）3（2%）3（1.1%）0.011784号2（0.6%）1230.011445号22310.012566号23120.011897号3（0.9%）1320.011228号32130.012679号33210.01233Ⅰj0.03145g0.03177g0.03367g0.03400gⅡj0.03589g0.03579g0.03433g0.03367gⅢj0.03622g0.03600g0.03556g0.03589gR0.00477g0.00423g0.00189g0.00222g
表2 正交试验设计及结果
3 结论与讨论
本文通过对该菌培养基配方和培养条件的优化选择以及正交试验，初步确定最适宜SH7菌株生长的培养基配方及培养条件如下：0.9%牛肉膏+2%蛋白胨+2%葡萄糖+1.1%NaCl；发酵起始pH值为8.2、300ml的三角瓶装瓶量为60ml、接种量为8%、温度为31℃、转速为150r/min，发酵时间为48h。这为SH7菌株的发酵罐放大试验提供了理论依据。
本试验采用渐进法优化发酵条件，每确定一项，就在下一目标筛选中应用，这样使得得到的试验结果更准确。同时也要考虑到实际生产中的成本问题，例如某些营养物质含量不能太高或发酵周期不能过长，否则成本就会升高。
众所周知，烟草业在国民经济中占有重要地位，目前青枯病的化学防治和生防都不甚理想，一定程度上制约了我国的烟草生产和出口。本实验室所筛选出的芽孢杆菌SH7对烟草青枯病菌表现出了良好的拮抗性，温室药效试验达到了较高的水平，前景广阔。本试验筛选出了适合该菌的发酵配方并优化了发酵条件，为该菌的生产应用打下了良好的基础。
