Optimization of Liquid Fermentation Conditions of Bacillus subtilis Xi-55
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是土壤和植物微生态的优势种群，内生芽孢，抗逆能力强，繁殖速度快，营养要求简单，对农作物安全。作为植物根际有益微生物，通过分泌抗生物质和生长竞争，在防治植物病害方面发挥多种有益作用[1]。剂型以活体芽孢为主，田间施用可以较长时间的发挥抑制病菌作用[2～3]。
枯草芽孢杆菌Xi-55是本课题组从水稻植株上分离、筛选出来的一株活性较强的生防菌株，研究发现对多种植物病原菌具有良好的防治作用[4]。芽孢杆菌的发酵培养是工业化大规模生产芽孢杆菌制剂的前提。本文对所筛选出的枯草芽孢杆菌的发酵条件进行优化，进行20L发酵罐的放大培养研究，以提高其发酵水平，为芽孢杆菌制剂的工业化生产提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 枯草芽孢杆菌Xi-55，四川省农业科学院植物保护研究所分离获得。
1.1.2 培养基 斜面培养基（LB培养基）：酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH值7.0。
种子培养基（BPY培养基）：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，酵母膏 5g，葡萄糖 5g，蒸馏水1000ml，pH值7.0。
基础发酵培养基（KB培养基）：蛋白胨 20g，甘油 10ml，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，蒸馏水1000ml，pH值7.0。
1.2 方法
1.2.1 培养方法 将保存在斜面上的菌种用接种环以划线形式接入LB平板上，28℃恒温培养24h活化。将活化的菌株接入装有100ml种子培养基的250ml三角瓶中，在28℃，180rpm条件下，振荡培养36～48h，制备液体种。按1%的接种量接入发酵培养基（100ml/250ml三角瓶），摇床振荡培养，测定发酵菌数量。
1.2.2 生长量的测定 采用平板菌落记数法。培养液用10倍梯度稀释法稀释6～7个梯度（101，102，103，……，107）后，选择3个稀释度较高的梯度稀释液，分别吸取50μl在LB平板上，然后用灭菌的L形玻棒将菌液涂匀，每梯度重复3次。28℃恒温培养24～36h后，调查平板上的菌落数，然后计算活菌数（cfu/ml）[5]。
1.2.3 培养基的优化 采用正交表L9（34）[6]，四因素三水平安排试验。
1.2.4 发酵条件的优化 采用优化培养基通过单因子试验，测定不同时间、温度、初始pH值、接种量和装液量对发酵菌数的影响。
1.2.5 扩大培养 采用德国产Biostat C 20L全自动液体发酵罐，配制发酵培养基10L，添加消泡剂CXX-910 0.5‰。种子培养及接种量均同摇瓶试验。发酵技术参数设为：发酵温度28℃±0.5℃，通气量10L/min，搅拌转速180rpm，溶氧控制设定为以通气量为主、转速为辅，罐压0.05～0.06MPa，初始pH值为7.2。每隔4h取样，测定发酵菌数和观察芽孢形成情况，同时记录罐体内pH值变化。分别以培养时间为横坐标，菌数和pH值为纵坐标，绘制枯草芽孢杆菌在发酵罐中培养的生长曲线和pH值曲线。
2 结果与分析
2.1 培养基优化
采用L9（34）正交设计方案，分四因素三水平对Xi-55发酵培养，测定高峰期菌数，正交试验因素水平见表1，正交设计及结果见表2，极差分析见表3。结果表明：4种营养成分对其菌数影响的顺序是A＞C＞D＞B，培养基成分优化组合为A3B2C1D3，即蛋白胨3%，甘油1.0%，K2HPO4 0.05%，MgSO4·7H2O 0.15%。
试验因素Experimentalfactor水平（Level）（%）123蛋白胨（Peptone）123甘油（Glycerine）0.51.01.5K2HPO40.050.100.15MgSO4·7H2O0.050.100.15
表1 培养基优化正交试验因素水平
Table 1 Orthogonal experimental factor levels for medium optimization
试验号Experimentalnumble水平（Level）（%）A[蛋白胨]PeptoneB[甘油]GlycerineC[K2HPO4]D[MgSO4·7H2O]菌数（Bacteriumamount）（109cfu/ml）111117.01212225.25313331.834212318.585223110.92623129.927313211.428321325.259332123.00
表2 培养基优化L9（34）正交设计及结果
Table 2 L9（34） orthogonal design and results for medium opitization
A[蛋白胨]PeptoneB[甘油]GlycerineC[K2HPO4]D[MgSO4·7H2O]K14.7012.3315.6113.64K213.1413.8114.068.86K319.8911.588.0615.22R15.192.237.556.36优化组合Optimization-groupA3B2C1D3因素顺序FactororderA＞C＞D＞B
表3 培养基优化L9（34）的极差分析
Table 3 Range analysis of L9（34） for medium opitization
2.2 发酵条件优化
2.2.1 时间对Xi-55发酵细菌数量的影响 每隔12h从摇床上取样，测定发酵液中细菌数量，绘制Xi-55生长曲线。结果显示（图1），在发酵0～12h 之间，菌体生长繁殖缓慢；12～36h 为菌体生长加速期，也为菌体繁殖高峰时期，发酵液内细菌数量明显增加；36～48h为稳定期，菌体数量基本稳定；60h以后为孢子衰亡期，活菌由于自身产生的分解物质而使菌体分解，发酵液变透明。根据该试验结果，36～48h为Xi-55适宜发酵时间。
2.2.2 温度对Xi-55发酵细菌数量的影响 分别置于24℃、26℃、28℃、30℃和32℃摇瓶培养，测定不同培养温度的生长量，结果表明（图2），28℃细菌数量最高，28～30℃细菌数基本稳定，低于28℃和超过30℃菌数明显下降。所以28～30℃为Xi-55适宜发酵温度。
图1 时间对发酵菌数的影响
Figure 1 Effects of time on the bacteria amount
图2 温度对发酵菌数的影响
Figure 2 Effects of temperature on the bacteria amount
2.2.3 初始pH值对Xi-55发酵细菌数量的影响 设定pH值分别为5，6，7，8，9的培养基摇瓶培养，测定细菌生长量。结果显示（图3），当pH值为7时，细菌数量最高，当pH值为 7～8时，细菌数量基本稳定；pH值低于7和超过8，菌数明显减少；且 pH值为9或5时，菌体数量急剧减少或为零，据此推断pH值高于9或低于5时，Xi-55生长可能严重受抑制甚至不能生长，有待进一步研究。所以发酵培养基的适宜初始pH值为7～8。
2.2.4 接种量对Xi-55发酵菌数的影响 分别采用0.5%、1%、2%、3%、4%等5个接种量梯度摇瓶培养，测定细菌生长量，结果显示（图4），接种量在0.5%～2%范围内，菌量数随接种量的增加而增加，接种量为2%时，菌量数最高；接种量超过2%，菌数明显减少。总体上来看，菌体生长量并非随着接种量的增加而增加，而是有一个限度。所以，2%为最佳接种量。
图3 初始pH值对发酵菌数的影响
Figure 3 Effects of initial pH value on bacteria amount
图4 接种量对发酵菌数的影响
Figure 4 Effects of inoculation amount on bacteria amount
2.2.5 装液量对Xi-55发酵菌数的影响 采用装液量分别为50ml/500ml、100ml/500ml、150ml/500ml、200ml/500ml锥形瓶摇床振荡培养，测定细菌生长量，试验结果表明，通过摇瓶装液量的不同来调节通气量对Xi-55发酵菌数有较大影响。一定范围内，装液量越少，则通气量越高，氧气供应越充足，那么细菌数量就越高。50ml与100ml装液量差别不明显，但从总生长量考虑，100ml/500ml锥形瓶为最佳装液量（图5）。
图5 装液量对发酵菌数的影响
Figure 5 Effects of pack amount on bacteria amount
2.3 扩大培养
在摇瓶优化发酵条件的基础上，进行了20L发酵罐的扩大培养。从生长曲线（图6）可以看出，发酵罐扩大培养的发酵周期与摇瓶发酵周期基本一致。由于发酵罐的搅拌和通氧条件均优于摇瓶发酵，因此，菌体浓度和芽孢同步形成率都明显优于摇瓶发酵。36h菌体数量达到最高量，50.61×109cfu/ml；然后进入稳定期，开始大量形成芽孢，44h形成芽孢90%以上。分析pH值曲线（图6）发现，初始pH值7.2，随着菌体生长，pH值缓慢下降；对数生长期菌体迅速繁殖，pH值也急剧下降，表明菌体大量利用养分产生了酸性物质；稳定期随着芽孢逐渐形成，pH值回升，44～48h时，芽孢数量达到最大；52h以后pH值上升至7.4左右，可以看到菌体碎片，细胞自溶，表明生长和代谢受到抑制。因此，发酵终止应在52h前，最佳放罐时间应在44～48h。
图6 20L发酵罐中的生长与pH值曲线
Figure 6 The growth and pH curve in 20L fermentation tank
3 结论与讨论
从以上试验可以看出，培养基的组成和时间、温度、培养基初始pH值、接种量、通气量、摇床转速等培养条件均对菌株的生长有很大的影响。通过单因子试验和正交试验方法，确定枯草芽孢杆菌Xi-55优化培养基为：蛋白胨3%，甘油1.0%，K2HPO4 0.05%，MgSO4·7H2O 0.15%；优化发酵条件为：时间36～48h，温度28～30℃，初始pH值7～8，接种量2%，装液量100ml/500ml锥形瓶，摇床转速180～200rpm。并进行了发酵罐扩大培养，36h达到生长高峰期，最适放罐时间44～48h；此时所获得的菌体数量约为50亿个/ml，为大规模工业化发酵培养提供了有益借鉴。
在发酵过程中发现，发酵液的黏度较大，很容易产生泡沫，必须用消泡剂来消除。而本试验中采用的发酵专用含硅消泡剂CXX-910对pH值有轻微影响，故添加消泡剂不宜过多。操作时可预先在培养基里添加少量消泡剂，然后通过发酵罐上的补料装置在发酵过程中自行控制补充，这样可以在满足消泡的同时尽量降低消泡剂的添加量，减少消泡剂对pH值的影响，比一次性添加或单纯通过补料装置添加效果要好。
