Identification of the Pathogen Causing Anthracnose and Screening of Endophytic Antagonists from Wampee Fruits
虽然应用化学杀菌剂在一定程度上可控制病害的发生，但目前已有越来越多的化学杀菌剂因“3R”现象（Resistance、Resurgence、Residue）而被禁止用于果蔬采后处理。因此，迫切需要寻求新的安全高效的防腐技术以逐步取代化学杀菌剂在果蔬防腐上的使用[1]，因而研究无公害采后病害防治措施势在必行。
大量研究表明，植物内生菌除可以给植物提供所需要的营养物质及一些激素外，还参与植物的防卫功能，增强植物抗逆境、抗病害、抗动物危害的能力[2～4]。利用内生菌防治植物病害是个尚待开发的微生物新资源，植物学家、植物病理学家、微生物学家、生态学家及药物学家对此广泛关注和重视。
黄皮[Clausena lansium（Lour.）Skeels]属芸香科（Rutaceae）亚热带常绿果树。原产华南，有1500多年栽培史。果实酸甜可口，风味独特，营养价值高且具有保健及药用价值，是深受人们喜爱的特产果品[5]。近年来，我国黄皮栽培面积不断扩大，产量逐年提高。但黄皮果实采后极不耐贮藏，在自然条件下极易变软腐烂，其中炭疽病是造成采后腐烂的重要原因之一，而极大地制约了黄皮果实的销售[6～8]。本研究拟对黄皮果实炭疽病病原菌的鉴定，并对无病果实果皮中存在的拮抗内生菌进行分离筛选，为黄皮果实炭疽病的生物防治打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
黄皮果实：黄皮病果来自院校市场，无病果实采自中国热带农业科学院试验场五队。
1.2 方法
1.2.1 黄皮果实炭疽病病原菌分离鉴定
1.2.1.1 黄皮果实炭疽病病原分离、纯化与形态学观察 采用组织分离法对典型黄皮果实炭疽病病果进行病原菌分离、纯化，获得菌种，并进行单胞分离、纯化、保存备用。将纯化的菌种移至PDA平板上28℃恒温培养，记录病原菌的培养性状，显微观察菌丝体形态、孢子形态大小等。
1.2.1.2 黄皮果实炭疽病病原致病性测定 将上述纯化的病原菌随机选取10个菌株在PDA培养基上培养7天后，采用刺伤和无伤两种方式进行致病性测定。每菌株刺伤和无伤接种时均接种5个果实，以无菌PDA培养基块接种为对照，重复3次，接种点用湿脱脂棉保湿24h后，将接种的病原菌和培养基清除，逐日观察发病情况。
1.2.1.3 黄皮果实炭疽病病原菌鉴定 经分离纯化后获得的病原菌进行显微观察和采用病组织切片直接显微观察病原菌的形态特征，根据形态学鉴定其种类[6]。
1.2.2 黄皮果实炭疽病拮抗内生菌筛选
1.2.2.1 黄皮果实内生菌的分离纯化 将无病黄皮果实果皮剪成若干小块，经表面消毒与无菌水漂洗后，一部分组织块直接接种于PDA、NA和GSA培养基上，取剩余的材料1g加入10ml灭菌水研碎混匀，用50μl分别涂布于NA和GSA培养基上，28℃下恒温培养，逐日观察内生菌的生长情况，将不同形态的菌落及时转接到相应的斜面培养基上，并统一编号后于4℃保存备用。
1.2.2.2 拮抗菌筛选 采用平板对峙法[9]进行对黄皮果实炭疽病病原菌具有拮抗活性的内生菌筛选。将培养7天的病原菌菌丝块（Φ=5mm）接种于PDA平板中央，采用十字交叉法在离菌块中心40mm处接种分离获得的内生菌，每菌株接种4点，以接种纯PDA培养基或NA培养基为对照，28℃下恒温培养3天后，分别测量对照及接种内生菌后的病原菌菌落直径、接种内生菌后的抑菌带宽度、显微观察接种内生菌后的病原菌边缘菌丝体及孢子的变化，计算平均抑菌率及平均抑菌带宽度、显微观察病原菌有无变化。
1.2.3 拮抗菌鉴定 对5株具有强拮抗活性的内生菌进行鉴定。内生菌的培养特征、形态特征及生理生化特性测定采用东秀珠[10]的方法进行测定，试验结果参考《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）[11]及《常见细菌系统鉴定手册》[10]鉴定其种类。
2 结果与分析
2.1 黄皮果实炭疽病症状及病原菌鉴定
2.1.1 黄皮果实炭疽病症状 黄皮果实感病初期，果皮出现水渍状褐色小点，后扩展为圆形、稍凹陷的褐腐状病斑，湿度大时病部表面产生橘红色孢子堆，果汁从病部裂口处溢出。
2.1.2 病原菌培养特征及形态特征 经分离纯化，从病健交界处分离获得的病原菌基本表现一致的培养特征，在PDA平板培养基上，菌落初为白色，后变为灰白色，气生菌丝绒毛状，后期产生橘红色黏孢团。直接从黄皮果实病部的橘红色孢子堆镜检观察，分生孢子盘内产生大量褐色有隔刚毛，产孢细胞圆筒形，无色，分生孢子无色单胞，圆筒形，两端钝圆，内含物颗粒状，对分离纯化培养的病原菌进行镜检，菌丝无色，有隔，分生孢子无色，单胞，圆筒形，两端钝圆，大小9.5～16.7（13.6）μm×3.2～5.5（4.2）μm，具1～2个油球。分生孢子萌发后遇硬物则在芽管端部产生一褐色、近圆形或不规则形附着胞。
2.1.3 病原菌鉴定 根据病原菌的形态特征、培养特性和致病性测定结果，参考有关文献[8，12～13]，将引起黄皮果实炭疽病的病原菌鉴定为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）。
2.2 内生菌的分离
先后12批次从健康黄皮果皮组织上分离获得内生菌532株，其中真菌169株，占总分离物的31.77%；细菌363株，占总分离物的68.23%；但在整个试验中，未分离获得放线菌（见表1）。
123456789101112合计百分比（%）内生真菌1212139181814171713101616931.77内生细菌35295616212828314323223136368.23内生放线菌00000000000000合计474169253946424860363247532
表1 不同批次分离的内生菌数量
2.2.1 拮抗内生菌的筛选 根据平均抑菌率及平均抑菌带宽度、显微观察病原菌菌丝体及孢子有无变化的测定结果看，分离获得的169株内生真菌对黄皮炭疽病病原菌均无拮抗作用，对内生真菌与病原菌交界处的病原菌进行观察，未发现病原菌菌丝体或分生孢子有异常变化。而在分离获得的363株内生细菌中，105株对黄皮炭疽病病原菌有不同程度的拮抗作用，占内生细菌的28.93%（见表2）。对峙培养3天后，5株内生细菌的平均抑菌率大于80%或抑菌带宽度大于10mm，分别为B98、B131、B232、B247和B294。
拮抗活性无拮抗活性弱拮抗活性中度拮抗活性强拮抗活性菌株数25852485比例（%）71.0714.3313.221.38
表2 内生细菌对黄皮炭疽病菌的拮抗活性
2.3 拮抗内生菌的鉴定
5株内生细菌的菌落形态及经染色后观察的菌体形态见表3，生理生化特征见表4。依据参考文献《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）[11]和《常见细菌系统鉴定手册》[1]，5菌株初步鉴定为：B98为荧光假单胞杆菌Pseudomonas fluorescens Migula，B131、B232、B247和B294均为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis（Ehrenberg）Cohn。
菌株菌落特征形状颜色边缘表面透明度可溶性色素革兰氏染色形态鞭毛染色芽孢运动性B98圆形淡黄色整齐光滑不透明黄绿荧光色素-杆状单根极生-+B131圆形白色不整齐粗糙不透明-+杆状多根周生++B232圆形白色不整齐粗糙不透明-+杆状多根周生++B247圆形白色不整齐粗糙不透明-+杆状多根周生++B294圆形白色不整齐粗糙不透明-+杆状多根周生++
表3 黄皮拮抗内生菌的培养特性及形态学
菌株厌氧生长氧化酶接触酶明胶液化淀粉水解碳源利用D-葡萄糖L-阿拉伯糖D-木糖D-甘露糖柠檬酸盐葡萄糖产酸B98-+++-+++-++B131--+++++++++B232--+++++++++B247--+++++++++B294--+++++++++石蕊牛奶丙酸盐硝酸盐甲基红V-P反应pH值5.745℃生长吲哚产生H2S产生7%NaClB98还原、胨化++--+--++B131还原、胨化-+-+++--+B232还原、胨化-+-+++--+B247还原、胨化-+-+++--+B294还原、胨化-+-+++--+
表4 黄皮拮抗内生菌的生理生化特征
3 讨论
3.1 黄皮炭疽病病原菌鉴定
通过对病害症状的观察、病原菌的分离纯化、形态学鉴定及致病性进行测定，确定引起黄皮果实炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.），该病原菌是造成黄皮果实腐烂的主要原因之一。
3.2 黄皮果实内生菌的研究
通过对无病黄皮果实果皮组织中的内生菌研究表明，果皮中存在丰富的内生菌资源。大量的内生菌与黄皮的生长发育、抗病性等之间的关系有待进一步研究。
3.3 黄皮果实拮抗内生菌的筛选
通过对分离获得的内生菌与黄皮果实炭疽病病原菌（C.gloeosporioides）进行对峙培养，28.93%的内生细菌具有拮抗作用，可见在黄皮果实组织中存在对该病原菌有抑制作用的拮抗菌具有多样性，这可能是黄皮果实抗病力较强的重要原因之一，为开辟黄皮炭疽病的生物防治提供了重要的原材料，为黄皮的无公害生产打下了基础。
