Screening and Appraisal of Antagonistic Organism against Verticillium dahliae*

Screening and Appraisal of Antagonistic Organism against Verticillium dahliae*

由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb）引起的棉花黄萎病是棉花的主要病害。该病于1914年在美国弗吉尼亚州首次发现，以后随着棉种的调运传播到世界各个棉花主产国[1，2]。我国每年棉花黄萎病发病面积达2×106hm2，重病田病株率高达95%以上，造成极大的经济损失。棉花黄萎病的防治已成为世界棉花生产中的难题。国内外在抗病育种、农业措施和化学防治等方面做了大量工作，对控制此病的危害起到重要作用[3，4]。但目前生产上高抗丰产品种少、有效化学药剂匮缺、农药残留和抗药性问题突出。由于生物防治能克服上述弊病，被认为是一种有效且具有发展潜力的重要防治方法，而获得高效拮抗菌是生物防治的基础。关于棉花黄萎病拮抗菌的筛选，国内外已做了不少研究工作。有报道指出，芽孢菌、荧光假单孢菌、葡柄霉、链霉菌、黄色蠕形菌对大丽轮枝菌都有拮抗作用；Bacillus和Pseudomonas属的某些细菌能有效抑制大丽轮枝菌的生长和使部分分生孢子死亡；木素木霉（Trichoderma ligmerum）的某些菌系有明显的防病增产作用；植物内生菌及根际土壤细菌诱导棉花对大丽轮枝菌抗性[5～9]。由于棉花黄萎病菌存在生理分化现象，不同地区的温度、湿度、光照、植被等生态条件有异，因而不同地区筛选出的棉花黄萎病拮抗菌菌种的适应性和对棉花黄萎病菌的拮抗作用存在显著差异[10]。安徽目前尚未见关于棉花黄萎病拮抗菌筛选鉴定的研究鲜有报道[11，12]。因此，有必要在安徽地区开展对棉花黄萎病的生防研究。作者从安徽主要棉区广泛采集棉花根围土样，经室内分离获得细菌菌株120株，真菌菌株97株，经拮抗活性筛选，发现ZXC-9等7个菌株对棉花黄萎病菌具有较好的拮抗作用，可望应用于棉花黄萎病的生防。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试病原菌棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae Kleb） 菌株HF和WW3，供试生防菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株BS，均由安徽农业大学植物病原真菌研究室提供。

1.2 培养基

真菌分离采用查氏酵母浸膏培养基和PDA培养基，细菌分离采用营养琼脂培养基（NA）和NB培养液，配制方法均参照文献[13]。

1.3 土样采集及微生物分离

1.3.1 土样的采集 在棉花黄萎病害发病田块采样，采用五点取样方法。取健康的棉花植株根土，取样时拨开土表（约5cm深），每样取50g（同地区取样至少相距100m以上），晾干后4℃保存待用。

1.3.2 微生物的分离 取10g的土样放在量筒中，加入内装100ml无菌水的三角瓶中，于摇床上振荡2h。取1ml的悬浮液，加入9ml的灭菌水中，依次稀释到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，各浓度取上悬浊液0.1ml涂于选择性培养基平板上，每浓度设3个重复。置于28℃±1℃恒温箱中培养24h后进行细菌检查，真菌和放线菌培养72h后调查，分别记录其菌落数。

1.4 棉花黄萎病菌的拮抗真菌的筛选与鉴定

1.4.1 真菌对棉花黄萎病菌的拮抗作用测定 将分离菌与棉花黄萎病菌HF菌株对峙接种于PDA平板上（φ=9cm），菌丝块直径0.7cm，两菌块接种点相距4cm，并以单独接种棉花黄萎病菌的处理为CK，每处理重复3次，25℃恒温培养，连续7天观察菌落的相互影响，并在两菌株接种点连线上测定接种点到菌落前缘的距离，按下式计算抑菌率。

抑菌率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100

1.4.2 棉花黄萎病菌拮抗真菌的鉴定 在PDA平板上对拮抗真菌菌株进行培养，观察、记载菌落、菌丝、产孢结构和孢子形态特征，参照真菌字典[14]，对菌株种类做出鉴定。

1.5 棉花黄萎病菌拮抗细菌的筛选和拮抗作用测定

1.5.1 棉花黄萎病菌拮抗细菌的初步筛选 先将培养48h的病原菌（HF菌株）打成直径0.7cm的菌碟，移植在平板中央，同时将分离到的细菌培养24h后，接种在平板周围，每皿6点，待测菌与病原菌距离为3.5cm，置于28℃培养48h后，检查抑菌圈有无并测量其大小。

抑菌带（D-D0）=细菌抑菌圈直径-细菌菌落直径

拮抗细菌的分级[15]：

0级（-）：D-D0=0（无透明带产生），无拮抗性；

1级（+）：0mm＜D-D0＜3.9mm，弱拮抗性；

2级（++）：4mm＜D-D0＜7.9mm，中等拮抗性；

3 级（+++）：D-D0＞8.0mm，强拮抗性。

1.5.2 拮抗细菌对棉花黄萎病菌的拮抗作用测定

1.5.2.1 划线法测定结果 初步筛选出的4种细菌菌株XZY-6、XSZ-5、XXX-4和XGC2-9也通过连续10代转移培养，再进行复筛试验。复筛试验并以生防菌枯草芽孢杆菌BS菌株作为防效对照。具体操作方法如下：用接种环取1环分离出的细菌在含有PDA培养基的培养皿中间划一直线，在距直线两侧2cm处分别接种直径为0.7cm的病原菌菌碟，并以单独接种棉花黄萎病病原菌的处理为对照1（CK1），以接种枯草芽孢杆菌BS菌株的处理为对照2（CK2）。每处理重复3次，在25℃下恒温培养，测定其抑菌效果。测量病原菌向拮抗菌方向生长的长度和对照中病原菌菌落的半径（cm），以R值表示拮抗作用的大小[16，17]。

1.5.2.2 杯碟法测定结果 在划线法后选取4种细菌菌株XZY-6、XSZ-5、XXX-4和XGC2-9中抑制效果最为明显的XSZ-5菌株进行杯碟法实验。

将活化好的XSZ-5菌株用3ml无菌水洗下，接入100ml的NB培养液中，并置于28℃，转速为100r/min的恒温摇床振荡培养。48h后得到菌量为1010～ 1011cfu/ml的活菌液。然后分别向18ml的PDA培养基中加入2000μl、500μl、100μl和10μl的BS活菌液，混合均匀后倒平板，并在平板上接种直径为0.7cm的病原菌菌碟，同时设置对照（即不加入XSZ-5菌的活菌液），各处理重复3次，25℃下恒温培养7天后测量菌落直径，计算抑菌率[16，17]。

2 结果与分析

2.1 棉花黄萎病菌拮抗真菌的筛选

对自安徽各主要棉区采集土样进行室内分离，共获得真菌菌株97株。以棉花黄萎病菌HF、WW3为目标菌株，采用平皿对峙试验测定各真菌菌株对棉花黄萎病菌的拮抗作用，结果见表1。从表1可见，通过连续7天的测量观察，发现其中有3种菌株ZXC-9、ZZY-3和ZGC1-1对棉花黄萎病菌具有很明显的抑制效果，7天后抑制率分别达到了69.39%、67.52%和74.30%。

拮抗真菌菌株Isolatesofantagonisticfungi项目Item不同处理时间的测定结果Testresultsatdifferenttimeaftertreatment3天4天5天6天7天ZXC-12-1菌落直径（cm）2.012.462.632.853.01抑制率（%）—6.8119.5322.6629.59ZXC-9菌落直径（cm）0.971.131.231.311.31抑制率（%）46.9957.1962.3964.4969.39ZGC1-1菌落直径（cm）0.820.951.001.031.10抑制率（%）55.1964.0269.4272.0974.30ZXC-12-2菌落直径（cm）1.721.932.022.092.18抑制率（%）6.0126.5237.9543.2848.99ZXC-2菌落直径（cm）1.311.721.922.002.12抑制率（%）28.4934.8741.2445.7950.28ZXC-15菌落直径（cm）2.332.672.863.073.08抑制率（%）——12.4716.5528.01ZHS-1菌落直径（cm）2.242.382.762.802.89抑制率（%）—9.8115.6124.0932.54ZXC-14菌落直径（cm）1.321.781.982.072.19抑制率（%）27.6632.5239.5443.7848.89ZZY-3菌落直径（cm）0.961.211.351.361.39抑制率（%）47.5454.1758.7263.1467.52CK菌落直径（cm）1.832.643.273.694.28

表1 拮抗真菌菌株对棉花黄萎病菌的抑制作用测定

Table 1 Inhibition of isolates of antagonistic fungi against V. dahliae

2.2 棉花黄萎病菌拮抗细菌筛选及拮抗作用测定

2.2.1 棉花黄萎病菌拮抗细菌初筛结果 经过营养琼脂培养基（NA）分离，筛选得到12株拮抗细菌菌株。抑菌圈试验结果（表2）表明，这12株拮抗细菌菌株对棉花黄萎病菌HF菌株和WW3菌株都有一定的拮抗性，其中XZY-6、XSZ-5、XXX-4和XGC2-9这4个菌株对棉花黄萎病菌的拮抗作用较强，对两种目标菌株的作用效果相似，无明显差异。

拮抗细菌菌株Strainsofantagonisticbacteria棉花黄萎病菌菌株IsolatesofV.dahliaeHFWW3拮抗细菌菌株Strainsofantagonisticbacteria棉花黄萎病菌菌株IsolatesofV.dahliaeHFWW3XZY-1--XXX-9++++XZY-6+++++XXX-17+++XSZ-5+++++XZY-5++++XSZ-2+++XXC-3-+

表2 12个细菌菌株对棉花黄萎病菌的抑菌试验结果

Table 2 Inhibitory tests of 12 strains of bacteria against V. dahliae

拮抗细菌菌株Strainsofantagonisticbacteria棉花黄萎病菌菌株IsolatesofV.dahliaeHFWW3拮抗细菌菌株Strainsofantagonisticbacteria棉花黄萎病菌菌株IsolatesofV.dahliaeHFWW3XXX-1+++XXC-5--XZY-8++++XXC-9++XZY-13++XXX-4++++++XGC2-9++++++

续表2

2.2.2 拮抗细菌对棉花黄萎病菌的拮抗作用

2.2.2.1 划线法测定结果 测定结果（表3）表明，处理5天后，病原菌菌株向各拮抗细菌方向生长缓慢，各菌株均有明显的抑菌带出现。6天后，各拮抗菌对病原菌菌株的抑制作用R值分别为0.571、0.571、0.563、0.571，均表现出较好的抑制效果，而对照生防菌枯草芽孢杆菌BS菌株R值则为0.579。各拮抗菌对病原菌菌株的抑制效果与生防菌枯草芽孢杆菌BS菌株的防治效果相比无显著差异。

拮抗细菌菌株Strainsofantagonisticbacteria项目Item不同处理时间的测定结果Testresultsatdifferenttimeaftertreatment2天3天4天5天6天XZY-6处理0.650.680.720.750.75R值0.7360.7010.6610.6360.595XSZ-5处理0.640.670.700.740.74R值0.7270.6910.6420.6270.587XXX-4处理0.660.710.740.750.76R值0.7500.7320.6790.6360.603XGC2-9处理0.650.690.710.740.75R值0.7390.7110.6510.6270.595CK2处理0.630.670.710.720.73R值0.7160.6910.6510.6100.579CKI对照0.880.971.091.181.26

表3 拮抗细菌对棉花黄萎病的抑制作用（划线法）

Table 3 Inhibition of 4 strains of antagonistic bacteria against V. dahliae by drawing-line method

2.2.2.2 杯碟法测定结果 测定结果（表4）表明，XSZ-5菌株培养液对各菌株均有较好的抑制效果，抑制率均在70%左右。各供试菌株在含有XSZ-5活菌液的PDA培养基上均生长极为缓慢，表现出明显的拮抗作用。根据统计软件进行方差分析及差异显著性比较，XSZ-5菌株在不同菌量处理间菌丝生长差异显著，抑制率随菌量的增加而提高。WW3菌株在含有2000μl和10μl的XSZ-5活菌液的处理对菌丝生长的抑制率分别为78.33%和68.44%，且差异不显著。XSZ-5菌株对HF菌株的抑制率高于对WW3的抑制率，但各浓度间差异不显著。

处理TreatmentsWW3HF菌落直径Diameter（cm）抑制率Inhibitionrate（%）菌落直径Diameter（cm）抑制率Inhibitionrate（%）CK3.33Aa—3.83Aa—2000μl1.27Bb78.331.17Cc84.98500μl1.30Bb77.191.23BCc83.07100μl1.37Bb74.521.47BCb75.4010μl1.53Bb68.441.67Bb69.01

表4 不同浓度XSZ-5培养液对黄萎病菌生长的影响

Table 4 Inhibitory effects of different concentration of XSZ-5 strain cultural liquid against V. dahliae

2.3 棉花黄萎病菌拮抗真菌的初步鉴定

对以上3种拮抗真菌菌株进行了培养观察。在PDA平板上，ZGC1-1菌落生长呈放射状，浅褐色，孢子生长迅速，覆盖整个平板底部；显微镜下观察发现，菌丝有隔膜，分生孢子梗顶部膨大形成顶囊，顶囊表面生出小梗，自小梗顶端形成具有串珠状的分生孢子（图1）；ZZY-3菌落质地为气生菌丝发达，菌丝致密菌落底部有辐射状皱褶条纹，孢子产生多，菌落颜色为黄色，分生孢子梗顶部膨大形成顶囊，顶囊表面生出小梗，自小梗顶端形成串珠状的分生孢子，分生孢子串生；ZXC-9菌落气生菌丝发达，菌丝亦生长致密，产孢多，底部有辐射状皱褶条纹，菌落颜色为深绿色。分生孢子梗顶端不膨大，经多次分枝，产生几轮对称或不对称小梗，小梗顶端产生成串的青色分生孢子，有些孢子梗形如扫帚（图2）。根据以上特征，参照真菌分类手册，将菌株ZGC1-1和ZZY-3初步鉴定为曲霉属真菌（Aspergillus sp.）；菌株ZXC-9初步鉴定为青霉属（Penicillium sp.）。

图1 两种棉花黄萎病菌拮抗真菌的形态特征

Figure 1 Morphology of two species of antagonistic fungi against V. dahliae

3 讨论

通过室内平板对峙复筛试验表明，3株真菌菌株ZXC-9、ZZY-3、ZGC1-1和4株细菌菌株XZY-6、XSZ-5、XXX-4、XGC2-9对于棉花黄萎病菌均具有很强的抑制作用。经连续10代的转移培养，3种拮抗真菌菌株对棉花黄萎病菌的抑制效果仍保持稳定，其中以第7天的抑制作用最为明显，抑制率分别为66.58%、68.30%和76.90%。而4种拮抗细菌菌株XZY-6、XSZ-5、XXX-4和XGC2-9，与生防菌枯草芽孢杆菌BS菌株的防治效果相比也无显著差异。处理5天后，病原菌菌株向各拮抗细菌方向生长缓慢，各菌株均有明显的抑菌带出现。杯碟法测定结果表明，其中的XSZ-5菌株培养液对两种病原菌菌株均有较好的抑制效果，抑制率均在70%左右，是筛选出的各拮抗细菌中效果最好的一种。

目前生产上对于棉花黄萎病的防治，由于缺乏高抗丰产品种和有效化学药剂，生物防治被认为是一种具有发展潜力的重要防治途径[18]。本研究从安徽主要棉区棉花根围土样中筛选出了对棉花黄萎病菌具有较好拮抗效果拮抗微生物，为研制开发防治棉花黄萎病的新型生防制剂提供了基础和试验依据，对于棉花黄萎病的综合防治以及减少环境污染，减轻棉花黄萎菌的抗药性，促进可持续治理都具有重要意义。关于这些生防菌的鉴定、抗菌活性成分测定、盆钵试验、根际定殖力以及田间试验还需要进一步的试验研究。