Cloning and Identification of a Conidiation Associated to Gene CMPEX2-like of Coniothyrium minitans

Cloning and Identification of a Conidiation Associated to Gene CMPEX2-like of Coniothyrium minitans

盾壳霉（Coniothyrium minitans）是核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）的重要寄生真菌，在世界范围内广泛存在，是菌核病的一种重要生防菌。本研究自盾壳霉ZS-1菌株的T-DNA标记插入突变体库中筛选到一株产孢缺陷型突变体ZS-1T16229，以之为材料进行研究。

突变体ZS-1T16229与出发菌株ZS-1相比，偏向于培养基质中生长，不产孢，或产生少量的分生孢子（3.4×102个孢子/cm2），在与核盘菌对峙培养时，于两菌落融合处，突变体产生大量的分生孢子。突变体ZS-1T16229的生物产量大幅下降，在PDA培养基上培养6天、9天和12天，其生物学产量分别为8.2mg、24.2mg和58.7mg，而野生菌株ZS-1的生物学产量分别为17.4mg、39.3mg和78.8mg。突变体ZS-1T6229同时丧失了产生抗细菌物质的能力。另外，突变体ZS-1T6229的寄生致腐菌核的能力有显著的下降，用突变体的菌丝片段处理核盘菌的菌核，在沙粒上于20℃保湿培养30天，菌核腐烂指数为22%，而用野生菌株ZS-1进行相同处理，菌核腐烂指数为86%。

Southern杂交证实T-DNA标记在突变体ZS-1T16229中为单拷贝插入；以ZS-1T16229为材料，采用TAIL-PCR和RT-PCR技术对T-DNA标记插入位点的基因组DNA进行了克隆，获得了大小为1527bp的DNA片段；对该基因组DNA片段进行了序列分析，并利用GenScan软件进行了阅读框（ORF）预测，结果表明该DNA片段含有一个完整的阅读框：编码508aa。对推定蛋白的氨基酸序列进行功能预测，发现该序列中含有一个保守区域，即Pex2-Pex12结构域，与其他真菌的过氧化物酶体蛋白PEX2具有极高的同源性，如与烟曲霉（Aspergillus fumigatus）的PEX2相同部位等同的氨基酸为54%，类似的氨基酸达68%。故命名该基因为CMPEX2。通过RT-PCR结果表明CMPEX2基因在突变体ZS-1T16229基因组中不表达，在出发菌株ZS-1的基因组中表达。构建了CMPEX2基因敲除载体，利用农杆菌介导转化的方法，获得了3个CMPEX2基因敲除转化子，通过PCR证实这3个转化子确实为CMPEX2基因敲除转化子。这3个转化子的表型与突变体ZS-1T16229相同。初步认为CMPEX2基因与盾壳霉产孢相关，起正调控作用。