Cloning and Characterization of Genes Related to Biological Control of Grapevine Crown Gall from Agrobacterium vitis Strain E26

Cloning and Characterization of Genes Related to Biological Control of Grapevine Crown Gall from Agrobacterium vitis Strain E26

葡萄土壤杆菌E26菌株（Agrobacterium vitis strain E26）是本实验室分离到的一株对葡萄根癌病（grapevine crown gall）有良好防效的生防细菌。已有研究结果表明，E26菌株防治葡萄根癌病的机制除了产生抑制病原菌的细菌素以外，还存在其他的生防因子，是多种生防因子共同作用的结果。为此本研究直接克隆A.vitis E26菌株中的生物防治相关基因，从分子遗传学的角度进一步解析该菌株的生防机制。从本研究室已构建的E26菌株的 Tn5插入突变体库中，以向日葵幼苗为指示植物在茎部接种，筛选到一株防治根癌病能力稳定下降（50%）的突变体ME19。Southern 杂交表明该突变体为Tn5单拷贝插入。与野生型E26菌株相比，ME19的生长速度及产生细菌素的能力均没有显著差异。通过鸟枪法克隆到mini-Tn5插入的侧翼序列，根据侧翼序列设计一对引物，用PCR介导的文库筛选方法，从E26基因组文库中获得了一个阳性黏粒p1543。将该黏粒通过三亲杂交的方法互补突变体ME19，互补菌株在向日葵及葡萄上的生防能力得到了恢复。将黏粒p1543进行亚克隆，测序，得到5.6kb片段，命名为K2。将该片段连接到穿梭载体pRK415G，互补突变体ME19，进行向日葵和葡萄的温室防效试验，结果表明该片段可以使突变体防治根癌病能力得到恢复。序列分析表明该亚克隆片段上存在6个完整开放阅读框，分别为：mcp（methyl-accepting chemotaxis protein）、chp（conserved hypothetical protein）、citE（citrate lyase beta subunit）、hp（hypothetical protein）、leuD（3-isopropylmalate dehydratase small subunit）、leuB（3-isopropylmalate dehydrogenase），其中Tn5插入在chp内。目前，已构建了Tn5插入位点下游mcp 和chp的缺失突变体和互补突变体。mcp 和chp基因的生物学功能还有待于进一步研究确认。