绿色木霉菌Tr9701的抑病机理及其在黄瓜叶片、根部定殖初探
木霉菌（Trichoderma spp.）广泛存在于土壤及其他基物中，作为生防菌以其生长速度快，产孢量大、作用谱广、作用机制多样、能在植株、土壤中增殖并形成有效群体等诸多优势而备受关注。我们针对蔬菜上常见病害，从土壤中分离、筛选获得对蔬菜病原菌具有较强抑菌活性的绿色木霉菌株Tr9701，通过对其产几丁质酶活性等对其抗病机理进行了初探，同时试验了其在黄瓜叶片、根部的定殖能力，为今后开发可替代某些化学农药的微生物杀菌剂做了基础性工作，现将初步研究结果记述如下。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 供试菌株 绿色木霉Tr9701（Trichderma viride），由天津市植物保护研究所生防室筛选、鉴定。
供试病原菌立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、番茄灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea），由天津市植物保护研究所病害室分离、鉴定。
1.2 研究方法
1.2.1 绿色木霉菌制剂几丁质酶检测据Harman等的方法[1]，在胶体几丁质培养基中培养绿色木霉菌，进行产几丁质酶预试验，然后将绿色木霉菌分生孢子液接种到合成诱导液体培养基中诱发几丁质酶产生，以不加胶体几丁质为阳性对照，在28℃，150r/min振荡培养，连续提取培养液制备几丁质酶粗提液。检测采用还原糖法[2]处理，在试管中加入几丁质酶粗提液、10g/L胶态几丁质各1ml，37℃恒温水浴30min，加入DNS10ml，混匀后沸水浴10min，用水冷却至室温，观察颜色变化，以100℃高温灭活处理15min几丁质酶粗提液为对照，试验重复3次。
1.2.2 绿色木霉几丁质酶粗提液对病菌的抑菌活性测定 将黄瓜立枯丝核菌、番茄灰葡萄孢霉菌菌丝块转移到平板上，每平皿接种4块，分布于4角，平皿中心放滤纸片并加入100μl几丁质酶粗提液或阳性对照液，重复3次，空白加入等量无菌水，定期观察抑菌圈大小。
1.2.3 绿色木霉菌对立枯丝核菌重寄生作用的显微观察 将灭菌赛璐玢膜置于直径90mm的水琼脂培养皿上，在平板两侧各植入经活化培养的绿色木霉和立枯丝核菌菌丝块，25℃下对峙培养，待菌丝接触后置于光学显微镜下观察。
1.2.4 绿色木霉菌在黄瓜叶片和根部的定殖 取菜田表层10cm深处土壤，混腐熟的猪粪和蛭石（按3：1：1比例），过筛后，用150倍甲醛液消毒，边喷边混，喷匀后堆起，盖塑料布闷5天，然后晾晒14天，待残药挥发后铺于苗床待用。同时将冰箱保存的绿色木霉菌活化，转接到小麦粉培养基上，在25℃温度下培养7天，培养基上长满菌丝和孢子后，在组织捣碎机中捣碎、过滤，配成绿色木霉菌孢子悬浮液（5×106个孢子/ml）备用。
木霉菌叶面定殖：将培养制成的孢子悬浮液用消过毒的手持喷雾器喷雾，均匀喷至黄瓜叶面正反两面，直到叶面上均匀布满一层细微水珠而不流淌为止。喷雾后1h取第一次样，以后每隔一周取一次样，共4次。每次每处理取的叶片剪成0.5cm见方小片，称量取样叶片加入10倍无菌水中振荡（120r/分）15min。取稀释液0.1ml涂布于木霉选择性培养基上，25℃下培养3～4天，5皿重复，计菌落数。以第一次取样所检测到的菌量为接种量，菌量以cfu/g叶表示。
木霉菌根际定殖：将培养制成的孢子悬浮液，均匀浇灌至黄瓜根部，直至黄瓜苗根部土壤全部浸润为止。浇灌后1h取第一次样（地下1～2cm处根围土壤），以后每隔3天取一次样，共4次。检查时，分别称取根围土壤1g，加入无菌水20ml中振荡（120rpm）15min。取稀释液0.1ml涂布于木霉选择性培养基上，25℃下培养3～4天，5皿重复，计菌落数。以第一次取样所检测到的菌量为接种量，菌量以cfu/g叶表示。
2 结果与分析
2.1 绿色木霉菌几丁质酶的诱导
通过预试验，绿色木霉菌Tr9701在胶体几丁质培养基上生长可以形成显著几丁质酶解透明圈，因此进行了绿色木霉菌几丁质酶的诱导试验。诱导条件下几丁质酶粗酶液加入DNS后变为深棕红色，与阳性对照相比有显著差异，说明绿色木霉菌菌株产生几丁质酶，且经诱导处理的绿色木霉菌几丁质酶产生量明显提高，经检测，在培养第5d时达到最大值。
2.2 绿色木霉菌几丁质酶粗提液对病菌的抑菌活性测定
绿色木霉菌Tr9701几丁质酶粗提液对立枯丝核菌、灰葡萄孢霉的抑菌活性在平皿接种后2天内，立枯丝核菌、灰葡萄孢霉菌丝生长迅速，但菌丝接近木霉几丁质酶粗提液接种点周围时，生长缓慢，最后停止，从而形成明显抑菌圈。空白对照无抑菌圈，立枯丝核菌菌丝长满平皿，灰葡萄孢霉菌丝长满平皿并形成大量菌核。试验表明，绿色木霉Tr9701的几丁质酶粗提液对立枯丝核菌、灰葡萄孢霉的抑菌圈直径分别为28mm和15mm，比阳性对照的抑菌圈直径大，其差异达到了显著水平。
2.3 绿色木霉菌对立枯丝核菌重寄生作用的显微观察
显微观察显示绿色木霉菌对立枯丝核菌具有较强的寄生能力，绿色木霉菌丝与立枯丝核菌菌丝接触后并列生长或缠绕，有时以钩状结构入侵立枯丝核菌菌丝。在接触后期则观察到被寄生的立枯丝核菌菌丝断裂和消解的现象。
2.4 绿色木霉菌在黄瓜上的定殖
2.4.1 绿色木霉菌在黄瓜叶面的定殖 绿色木霉菌在叶面上的定殖动态见表1。由结果可知，绿色木霉菌在叶面环境中由于各种条件的影响，第一周内的菌量比初始菌量降低。此后绿色木霉菌适应了叶面环境，菌量逐渐回升，第14天检测菌量为1.02×104cfu/g叶片。21天后菌量持续下降，尤其是第28天菌量降至0.12×104cfu/g叶片。镜检观察绿色木霉菌Tr9701在叶面喷雾后，主要定殖于叶面气孔周围、腺毛基部及叶面凹陷处。这些位点或是分泌物产生处，或是叶面水分分布较多处，能为绿色木霉菌的生长繁殖提供适宜的条件。同时，这些位点也是其他病原菌的竞争位点，通过绿色木霉菌的人工接种，相比病原菌具有种群数量大，出现早的特点。因此，绿色木霉菌对这些位点的抢先占领，不仅有利于本身的生存，而且使黄瓜叶面受到保护，免于病原菌的侵染。
重复调查时间1h3天7天14天21天28天11.241.210.941.150.830.1820.960.950.810.920.660.0831.151.080.860.980.790.1441.371.400.951.030.720.10平均1.181.160.891.020.750.12
表1 绿色木霉菌孢子在黄瓜叶片上定殖情况（孢子着生量×104个孢子/g）
2.4.2 绿色木霉菌在黄瓜根际的定殖 绿色木霉菌在黄瓜根际土壤中定殖结果见表2。由结果可知，第一周内土壤的菌量比初始菌量降低，可能是在根际土壤环境中，由于各种因素的影响，木霉菌受到一定抑制，此后绿色木霉菌适应了土壤环境，菌量逐渐回升，第14天检测菌量为2.64×104cfu/g叶片。21天后菌量持续下降，尤其是第28天菌量降至0.68×104cfu/g叶片。在调查中发现，绿色木霉菌定殖黄瓜根部能力受水分含量和pH值影响明显，水分偏高或偏低都影响绿色木霉菌菌株在黄瓜根部的定殖，pH偏酸性条件下的定殖量明显高于偏碱性条件下的定殖。
重复调查时间1h3天7天14天21天28天12.432.371.852.521.090.6422.692.592.032.731.240.7232.362.321.892.611.080.6542.842.561.942.701.110.71平均2.582.461.922.641.130.68
表2 绿色木霉菌孢子在黄瓜根部定殖情况（孢子着生量×104个孢子/g）
3 结论
木霉菌腐生性强，适应性广，生长和繁殖快，可迅速利用营养和占据空间，是当前微生物菌剂控制病害的研究热点[3]。本试验结果表明，我们所筛选的绿色木霉菌Tr9701有较强的产几丁质酶活性，且经诱导处理酶产量明显提高，其酶粗提液经试验对立枯丝核菌、灰葡萄孢霉有显著抑制作用，通过诱导产生的木霉几丁质酶在对于抑制病原菌的生长具有重要意义。经显微观察发现，绿色木霉Tr9701对于立枯丝核菌是通过趋向生长、识别、接触缠绕和穿透，寄生于病原真菌之上，对立枯丝核菌具有较强的寄生能力。此现象证明，当绿色木霉菌遇到立枯丝核菌等病原菌时，受到刺激和诱导，产生溶菌酶，抑制立枯丝核菌等的生长，并可降解菌丝。
生防菌在植物表面的定殖能力反映了生防菌在植物表面与病原菌竞争空间和营养的能力。本研究表明，绿色木霉菌可以在黄瓜叶面和根部定殖。据Darah（1991）报道，根圈微生物的分布与沿根的可溶性碳的分布距离有关，微生物量的积累有赖于根分泌物的释放，因此添加一定的营养可以促进绿色木霉Tr9701的定殖。
本研究进一步证明，绿色木霉Tr9701产几丁质酶、寄生、定殖能力强，是较好的生防材料。当前由于生防微生物控制植物病害具无污染、价格低廉的优点，具有广阔的应用前景。因此对绿色木霉菌Tr9701的发酵工艺、田间应用范围等有待进一步研究。
