绿色木霉Tr9701人工发酵培养条件的研究

绿色木霉Tr9701人工发酵培养条件的研究

为了减少化学杀菌剂对环境的污染和在农产品中的残留，对环境友好的生防微生物制剂受到普遍重视。在已经研究的生防菌中，木霉属下的若干种因适应能力强、抗病谱广、拮抗机制多样化而被广泛用于防治植物病害。研究发现木霉对病原菌的作用机制是多种多样的，主要包括抗菌、溶解、竞争、重寄生等，目前还发现木霉制剂除具有直接抑菌功能外，还具有一定的诱导作物产生抗性的作用，这对提高木霉防病的持效性和稳定性具有重要意义。

我们从土壤中筛选分离出一株具有很强生长势的木霉，经鉴定为绿色木霉Trichoderma viride，通过体外拮抗试验，证明该菌具有极明显的竞争优势，能快速地占据生长空间、获取营养，对灰葡萄孢霉、立枯丝核菌、瓜果腐霉、茄链格孢等均有强烈的抑制效应，盆栽接种和温室防治试验试验表明对立枯丝核菌所致茄子立枯病和灰葡萄孢霉所致番茄灰霉病均具有明显的防治效果。因此，有可能发展成为一种纯生物的植物病害防治剂。作为一类重要的自然资源，木霉已引起国内外研究者的广泛关注。因此，木霉的培养及发酵条件是工业化大批量生产木霉菌制剂的前提。本文主要对我们筛选出的生防有效菌绿色木霉的放大发酵培养条件进行了研究，其结果对于绿色木霉和多功能生物制剂的工业化生产具有一定的指导意义。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

绿色木霉Tr9701（Trichoderma viride），由天津植保所病害室筛选、鉴定、保存菌株。

1.2 绿色木霉的培养条件

1.2.1 不同培养基与绿色木霉生长和孢子形成、萌发的关系 将绿色木霉菌丝块（直径5mm）分别置于MA培养基、小麦粉培养基、豆粉浸出液培养基、PDA培养基、PSA培养基、土壤浸液琼脂培养基、水琼脂培养基、CA培养基等上，在25℃下培养，每处理重复4皿，24h、48h、72h、96h、7天后测量菌落直径，观察菌落生长和孢子着生情况。将木霉菌孢子在1%葡萄糖营养液、1%蔗糖营养液、10%土壤浸出液和蒸馏水中，25℃培养，0h、4h、6h、24h后调查孢子萌发情况。

1.2.2 温度与绿色木霉菌丝生长及孢子形成的关系 将菌块移入PSA平板培养基上（定量为12ml），置于10～35℃共6个温度梯度内培养，分别于培养24h、48h、72h、96h、7天后测量菌落直径，比较不同温度下菌丝生长差异，并观察各处理中产孢情况。同时将试管斜面上培养4天的木霉菌分别放入温度为35℃、45℃、55℃、65℃的水浴锅内，每温度放4个试管，分别在5min、10min、15min、20min各取1管，在无菌条件下将菌丝挑入PSA平板上，于25℃温箱内培养，观察木霉菌生长情况，明确持续高温对绿色木霉菌丝伸长、孢子着生的影响。

1.2.3 pH值与绿色木霉菌丝生长及孢子形成的关系 将灭菌后的PSA培养基，用HCl和NaOH调节其pH值分别为1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13，在不同pH值培养基上接种菌块，25℃恒温培养，24h、48h、72h、96h、7天后观察pH值对绿色木霉菌丝伸长、孢子着生的影响。

1.3 绿色木霉固体发酵培养条件

1.3.1 固体发酵基质原料的确定及培养基的优化 试验设计的培养基配方由固定成分和附加成分组成，固定成分以小麦全麦为主，附加部分黄豆粉、糖类和酵母浸膏（具体见表7）。利用设计的配方培养绿色木霉（接种浓度5×106个孢子/ml，基质：菌液=10：1），观察不同配方培养下绿色木霉菌丝和产孢量的情况，确定利于绿色木霉培养的固体发酵基质配方。

1.3.2 固体发酵基质中含水量的确定 由筛选获得的固体发酵基质配方中，加入不同比例的水分。含水量试验设计为麦粒：水比例1：0.6、1：0.8、1：1、1：1.2、1：1.4，利用设计的不同含水量配方培养绿色木霉（接种浓度5×106个孢子/ml，基质：菌液=10：1），观察不同含水量下培养绿色木霉菌丝和产孢量的情况，确定利于绿色木霉培养的固体基质中含水量。

1.3.3 培养时间对绿色木霉产孢的影响 以筛选获得的固体基质配方作为木霉菌发酵基质培养绿色木霉（接种浓度5×106个孢子/ml，基质：菌液=10：1），观察发酵过程中木霉菌在培养基质中的种群密度变化，定时取样，以血球计数板计数培养物中绿色木霉孢子着生量。

1.3.4 利用食用菌废料的固体发酵基质原料的确定及添加成分、比例的优化 首先通过可行性试验明确食用菌废料是否能够提供木霉菌繁殖的基本营养。

配方筛选试验设计的培养基配方由固定成分和随机成分组成，固定成分以食用菌废弃培养料（自然风干）为主，附加部分麦麸和无机营养元素；随机成分有酱油渣、玉米芯、黄豆渣、锯木屑、稻杆等（自然风干）废弃物。以食用菌废料、麦麸、无机盐为固定成分分别与其他废弃物按照一定的比例称量350g，料：水为1：1，放在广口玻璃瓶中，灭菌后接种木霉孢子悬浮液（接种浓度5×106个孢子/ml，35ml/瓶），设4次重复，25℃恒温培养，6天后调查结果。

2 结果与分析

2.1 不同培养基与绿色木霉生长和孢子形成、萌发的关系

用不同培养基25℃培养绿色木霉，生长速度测定结果见表1。由结果可知，绿色木霉菌在供试的几种培养基上均能生长。从生长速度上看，以小麦粉和豆粉浸出液培养基上生长速度最快，是其生长的最适培养基，菌丝培养72h即长满全皿，且菌丝浓密；PDA、PSA、CA培养基相对次之，三者之间生长速度无明显差异；绿色木霉在水琼脂培养基上7天可以长满全皿，但菌落极为稀疏；以MA培养基、土壤浸出液培养基上生长速度最慢，25℃培养7天菌落直径分别为26.00mm和26.25mm。

培养基菌落直径（mm）24h48h72h96h7天MA培养基5.258.1310.5013.7526.00小麦粉培养基14.2558.50满豆粉浸出液15.2550.50满PDA10.5041.7579.25满PSA11.0037.7568.50满土壤浸出液5.007.3811.3815.5026.25水琼脂5.5022.5040.2557.50满CA培养基13.0041.0068.75满

表1 绿色木霉不同营养条件下菌落生长速度

用不同培养基培养观察其孢子着生情况（结果见表2）。由结果可知，该菌在几种培养基上均能产生孢子，从孢子形成的速度和数量上看，以小麦粉和PDA培养基孢子生成的速度最快，产生的孢子数量最多；其次是豆粉浸出液、PSA和CA培养基；以MA培养基、土壤浸出液和水琼脂3种培养基上孢子生成速度最慢，产生量最低。

培养基孢子分布直径（mm）24h48h72h96h7天附注MA培养基005.885.886.00+小麦粉培养基0034.25满++++豆粉浸出液0022.2561.00满+++PDA014.6330.25满+++PSA07.0023.7565.00满+++土壤浸出液00008.5+水琼脂0000满+CA培养基07.2519.0061.00满++

表2 绿色木霉不同营养条件下培养孢子着生情况

由绿色木霉分生孢子在不同营养液中萌发试验可知（结果见表3），其分生孢子在几种营养液中均可萌发，但以1%葡萄糖溶液中萌发效果最好，24h萌发率为30%，48h萌发率为95.5%；10%土壤浸出液中萌发效果最差，24h萌发率为1.5%，48h萌发率为45%；其他几种液体中孢子萌发率24h为4.00%～5.67%之间，48h为76.0%～78.2%。

营养液孢子萌发率（%）0h4h6h24h48h1%葡萄糖00030.0095.51%蔗糖0004.0076.010%土壤浸出液0001.5045.0蒸馏水0005.6778.2

表3 绿色木霉不同营养液中孢子萌发情况

2.2 温度对绿色木霉生长和孢子形成的关系

绿色木霉于不同温度下培养，测量其生长速度结果见表4。由结果可知，绿色木霉在10～35℃均能生长，25℃时72h内就能长满培养皿，20℃、30℃时需要96h，15℃时则需要7天，10℃、35℃时第7天仍未长满全皿。20～30℃为绿色木霉的生长适温，25℃为生长最适温度。

培养温度（℃）菌落直径（mm）24h48h72h96h7天106.256.317.759.6338.35158.7510.0627.1344.50满2013.5045.3879.83满2519.6358.50满3018.8855.1377.67满3511.3112.2512.5013.7516.5

表4 绿色木霉不同温度下菌落生长速度

将绿色木霉于不同温度下培养，观察其孢子着生情况、测量其孢子蔓延速度，结果见表5。从结果显示，绿色木霉在15～30℃均能形成分生孢子，其中适宜适温为20～30℃，温度在20℃以下和30℃以上能产生分生孢子但速度减慢，如25℃时96h内产生的分生孢子就能布满培养皿，20℃、30℃时需要7天，15℃时第7天分生孢子仍未布满全皿。因此，25℃为绿色木霉的分生孢子形成的最适温度。

培养温度（℃）孢子分布直径（mm）24h48h72h96h7天100000015000066.50200017.7576.5满2506.543.00满300047.2584.5满3500000

表5 绿色木霉不同温度下孢子着生情况

2.3 pH对绿色木霉的影响

绿色木霉在不同pH条件下培养，结果见表6。由结果可明显看出，pH值在5～9环境下培养，绿色木霉可以生长，其中pH在5.5～6间生长最适，pH值在8以上生长较为缓慢，由此可见绿色木霉喜好在中等偏酸性条件下生长。绿色木霉孢子着生也表现相似规律，pH值在5～8环境下孢子均可着生，以pH在5.5～6间最适。

pH菌落直径（mm）孢子分布直径（mm）24h48h72h7天24h48h72h7天100000000200000000300000000400000000512.0036.0063.38满0015.560.05.52163.38满0033.5满621.6366.38满06.242.0满79.5030.5054.00满0028.2满807.7515.5045.75005.549.25907.008.0022.0000001000000000110000000012000000001300000000

表6 pH值对生防木霉菌菌丝伸长、孢子着生的影响

2.4 固体发酵基质原料的确定及培养基的优化

不同固体发酵基质原料培养绿色木霉效果见表7。由结果可以看出，在以小麦粒为主的固定成分中加入糖类和酵母浸膏，菌丝量和产孢量最高，如果在发酵过程多次搅拌，可保证整个基质内、外表充满黄绿色孢子。在加入其他成分的配方中菌丝、产孢量均不及前者多，因此通过试验获得的绿色木霉固体发酵基质原料配方为：小麦粒+葡萄糖+酵母浸膏。

配方菌丝生长量孢子产生量说明全麦粉+黄豆粉+葡萄糖+酵母浸膏++仅表面分布黄绿色孢子通气性较差全麦粉+葡萄糖+酵母浸膏+仅表面分布黄绿色孢子通气性较差全麦粉+黄豆粉++仅表面分布黄绿色孢子通气性较差小麦粒+黄豆粉+葡萄糖+酵母浸膏++麦粒表面密生黄绿孢子麦粒和豆粉附着性稍差小麦粒+葡萄糖+酵母浸膏+++麦粒表面密生黄绿孢子适宜木霉菌生长小麦粒+黄豆粉++麦粒表面密生黄绿孢子麦粒、豆粉附着性稍差

表7 绿色木霉孢子发酵配方筛选试验

2.5 固体发酵基质中含水量的确定

将固体发酵基质中加入不同比例水培养绿色木霉效果见表8。由结果可以看出，在以小麦粒为主的固定成分中加入不同水量，其对绿色木霉的菌丝量和产孢量影响较大，以固麦粒和水比例为1：0.8～1：1.0的菌丝、产孢量最多，如果在发酵过程多次搅拌，可保证整个基质内、外表充满黄绿色孢子。

处理含水比例菌丝生长量孢子产生量说明麦粒：水1∶0.6++菌丝着生处生长黄绿色孢子含水量过低菌丝少麦粒：水1∶0.8+++整个料体着生黄绿色孢子适宜木霉菌生长麦粒：水1∶1+++整个料体着生黄绿色孢子适宜木霉菌生长麦粒：水1∶1.2++孢子主要在上半层分布基料下层含水量较高麦粒：水1∶1.4+孢子着生较少含水量过高

表8 绿色木霉固体发酵基质中含水量试验

2.6 培养时间对绿色木霉产孢的影响

以筛选获得的固体发酵基质配方作为木霉菌发酵基质培养绿色木霉，发酵过程中木霉菌在培养基质中的种群密度变化结果见表9，接种48h后，内部有菌落产生，第3～4天，整个基质全部被白色菌丝覆盖，随后，料体表面有黄绿色孢子大量产生，随着时间的推移，绿色木霉的孢子量增长迅速，到第6天培养料中孢子量达332.4×106个/g，以后孢子量增长缓慢。因此为了缩短发酵时间，降低发酵成本，发酵6天就能达到预期的要求。

重复孢子密度计数（×106个孢子/g）2天3天4天6天8天平均8.3351.798.9332.4357.4

表9 不同时期绿色木霉孢子种群密度变化

2.7 食用菌废料等废弃物的固体发酵基质的确定及优化

为进一步降低生产成本，本试验设计以食用菌废弃培养料为主，附加部分麦麸和无机营养元素；随机成分有5种废弃物。配方设计及其培养木霉孢子效果见表10。由结果可以看出，在以食用菌废料为主的固定成分中加入黄豆渣，菌丝量和产孢量最高，整个基质外表充满黄绿色孢子，内部由于光照不充足产孢量较少，如果在发酵过程搅拌1～2次，可以促进产孢。在加入其他成分的配方中菌丝、产孢量均不及前者多，因此通过试验获得的最佳配方为：食用菌废料+麦麸+黄豆渣+无机营养元素。

配方菌丝生长量孢子产生量食用菌废料+麦麸+无机营养元素+酱油渣++上表面零星分布黄绿色孢子食用菌废料+麦麸+无机营养元素+玉米芯++上表面零星分布黄绿色孢子食用菌废料+麦麸+无机营养元素+黄豆渣+++料体整个表面有黄绿色孢子食用菌废料+麦麸+无机营养元素+锯木屑+几乎没有黄绿色孢子产生食用菌废料+麦麸+无机营养元素+稻杆++上表面零星分布黄绿色孢子

表10 木霉菌利用食用菌废料等的发酵配方筛选

2.8 利用食用菌废料固体基质培养绿色木霉产孢的效果

以筛选获得的食用菌废料培养基作为木霉菌发酵基质培养木霉菌，发酵过程中木霉菌在培养基质中的种群密度变化结果见表11，接种48h后，内部有菌落产生，第3～4天，整个基质全部被白色菌丝覆盖，随后，料体表面有黄绿色孢子大量产生，随着时间的推移，绿色木霉的孢子量增长迅速，到第6天培养料中孢子量达248×106个孢子/g，以后孢子量增长缓慢。因此为了缩短发酵时间，降低发酵成本，发酵6天就能达到预期的要求。

重复孢子密度计数（×106个孢子/g）2天3天4天6天8天平均7.153.899.8248.7259.3

表11 不同时期绿色木霉孢子种群密度变化

3 结果与讨论

迄今为止，利用木霉菌防治植物病害的研究已有近60年的历史，并且研究工作大多集中于木霉菌资源的筛选和作用机理方面，在木霉菌人工发酵方面的报道较少。我们通过对生防木霉菌培养条件的研究，进一步获得了其以麦粒为主及食用菌废料为主的固体发酵技术，可以用于绿色木霉的人工发酵，这将为绿色木霉菌产品的制剂化的生产提供技术支持。