Studies on Alternaria solani of Extracts from Asarum siebotdii

Studies on Alternaria solani of Extracts from Asarum siebotdii

番茄早疫病菌（Alternaria solani）是保护地和露地番茄生产的重要病害之一，为真菌性病害，为害植株后出现慢性枯萎，植株矮小，果实膨大等，可大幅度降低番茄的产量和品质。我国自20世纪80年代开始发生以来，已经成为番茄设施栽培的限制性障碍[1]。在防治上由于长期大量的化学农药使用，使病菌产生了抗药性，防效逐年降低，同时造成了一定的农药污染[2]。随着环境保护呼声的日益高涨，高毒农药的负面影响已引起世界范围的广泛关注，以高效，低毒农药逐步替代传统的高毒农药是农药发展的必然趋势。植物源农药可在环境中迅速分解，对环境无任何影响，是符合环境保护，农业持续发展方向的[3]。

细辛（Asarum siebotdii）是多年生草本植物，据中华临床中药学（上卷）记载，根能入药，具有祛风，散寒，风湿弊痛，抗炎等功效，在中药学上有广泛的用途[4]。本实验用中药细辛的根提取物对番茄早疫病菌的菌丝生长及分生孢子萌发的抑制作用进行了室内活性测定，旨在为开发出一种经济、安全、有效的新型杀菌剂提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试样品 试验所用细辛采自山西省历山自然保护区，将采集的植物材料洗净后在室内阴干（约25℃），放入恒温箱内（40～45℃）烘干，磨碎，过60目筛，备用。

1.1.2 供试菌种 番茄早疫菌（Alternaria solani），由山西农业大学农学院植物病理实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 细辛提取物的制备 准确取3份细辛根粉50g，分别装入500ml小烧杯内，加入干粉5倍量的有机溶剂甲醇、氯仿、石油醚。室温下（30±2）℃浸泡3～5天后，过滤并浓缩至稠膏状，称取一定量的提取物，加2～3滴吐温80做乳化剂，并依次配成实验所需的浓度，4℃下保存。

1.2.2 细辛提取物对番茄早疫病菌菌丝生长的抑制作用 采用生长速率法[5]，用打孔器取6mm菌落边缘生长旺盛的菌种，放在加药的PDA平板上培养，以培养基内加等量无菌水作对照，每次重复3次，置25℃下培养。用十字交叉法测每个菌落的直径，以其平均值代表菌落的直径，以下式求出抑制菌丝生长率：

抑制菌丝生长率%=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-0.6）×100%

1.2.3 细辛提取物对孢子萌发的抑制作用 分别将3种有机溶剂的细辛提取物制成最终浓度为1mg/ml的细辛提取液的PDA培养基。待培养基冷却后，取预先配置好的孢子悬浮液10μl，接种到直径为9cm的培养皿中央，用涂布器涂抹均匀，在25℃培养箱中培养48h，观查记录孢子萌发数量。每处理设5个重复，取平均值。计算孢子萌发率和抑制率。

孢子萌发率（%）=已萌发孢子数/镜检孢子总数×100%

抑制率（%）=（对照萌发率-处理萌发率）/对照萌发率×100%

1.2.4 细辛氯仿提取物对番茄早疫病菌菌丝抑制中浓度（MIC）的测试 将细辛氯仿提取物稀释成5个浓度（4mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml），测试不同浓度的提取物对番茄早疫病的病原菌菌丝生长的抑制作用，计算毒力回归方程及抑制中浓度（MIC）。

2 结果与分析

2.1 细辛提取物对番茄早疫病菌菌丝生长的抑制作用

细辛提取物对番茄早疫病菌菌丝生长的抑制作用实验结果如表1。在48h时，石油醚提取物的抑菌率为28%，氯仿提取物的抑菌率为66.67%，而甲醇提取物的抑菌率达到了50%。并且随着时间的推移，3种溶剂提取物的抑菌率都有所下降。同时与对照相比，处理的菌丝在培养皿中出现气生菌丝减少，变粗，向上生长现象。这一结果说明，3种不同溶剂的细辛提取物在浓度为2mg/ml时对番茄早疫病的病原菌均有不同程度的抑制作用。

溶剂menstruum菌落直径（mm）与抑制率（%）ColonyRadiusandInhabitingrate48h抑制率Inhabitingrate96h抑制率Inhabitingrate144h抑制率Inhabitingrate甲醇methanol1.8550.002.9051.584.5748.82氯仿chloroform1.4366.672.5060.002.7359.57石油醚Petroleumether2.428.004.2024.216.918.71CK3.10—5.35—8.35—

表1 细辛提取物对番茄早疫病菌丝生长的抑制作用

Table 1 Inhibitory effect of Asarum siebotdii extract against mycelia Growth of Alternaria solani

2.2 细辛提取物对孢子萌发的抑制作用

细辛提取物对番茄早疫病菌孢子萌发的影响见表2。48h后，石油醚和氯仿提取物表现出了显著的抑制率，对分生孢子萌发抑制率分别为91.48%和88.79%，甲醇提取物表现出了较强的抑菌率，达到53.81%。实验过程中发现，对照皿在接种后32～48h即开始陆续萌发，而提取物各处理均不同程度地表现出萌发推迟的现象。

溶剂menstruum孢子萌发率（%）Rateofgerminationofconidia萌发抑制率（%）Percentageofinhibition甲醇methanol42.8253.81氯仿chloroform10.4288.79石油醚Petroleumether7.9291.48CK92.92—

表2 细辛提取物对番茄早疫病菌孢子萌发的抑制作用

Table 2 Inhabiting effect of the different menstruum of Asarum siebotdii extract against conidiao production of Alternaria solani

2.3 细辛氯仿提取物对番茄早疫病菌菌丝抑制中浓度(MIC)的测试

由表1可见，3种不同溶剂的提取物中氯仿提取物的抑菌效果最好，为了进一步确定其生物活性，求出MIC，将细辛氯仿提取物稀释成5个不同浓度，对病原菌进行测定。结果见表3、表4，6天后，浓度在4mg/ml时，氯仿提取物表现出了显著的抑菌率，达到77.14%，而浓度为0.25mg/ml时，抑菌率显著下降，只有9.5%。这一结果说明，细辛氯仿提取物对番茄早疫病菌菌丝的抑制作用与浓度成正相关，随着浓度的下降，抑菌效果也随之下降。同时在96h时求得毒力方程和氯仿提取物的抑制中浓度（MIC）为1.57mg/ml。

病原菌Pathogen浓度（mg/ml）concentration菌落直径（mm）与抑制率（%）ColonyRadiusandInhabitingrate48h抑制率Inhabitingrate96h抑制率Inhabitingrate144h抑制率Inhabitingrate番茄早疫病菌Botrytiscinerea4.00001001.9573.622.2577.142.0001.2364.682.9354.404.1251.271.0001.6243.303.4344.634.7342.730.5001.8530.304.2329.045.7229.130.2502.0419.505.307.507.139.50CK2.39—5.72—7.82—

表3 不同浓度的细辛提取物对番茄早疫病菌菌丝生长的抑制作用

Table 3 Inhibitory effect of the different concentration of Asarum siebotdii extract against mycelia Growth of Alternaria solani

处理Treatment毒力方程?RegressiveequationMIC??相关系数r番茄早疫病菌AlternariasolaniY=2.0910+1.6950x1.570.9707

表4 细辛提取物对番茄早疫病的毒力

Table 4 Virulence of the extracts of Asarum siebotdii seeds against Alternaria solani

3 结论与讨论

植物源农药活性物质主要来源于植物体内产生的次生代谢产物，据Swain于1977年报道，次生代谢产物已超过400000种，如有机酸、萜烯类、生物碱、类黄酮、甾体、酚类、蛋白质、单宁和多糖等[6]。据文献报道，苦参中含有苦参碱（Matrine）和氧化苦参碱（Oxymat-rine）等17种化学结构相似生物碱，其中以苦参碱为其最主要的活性成分，对病原菌有较强抑制作用[7]。另外，毛蒿植物中的毛蒿素，南欧丹参中的硬尾醇，苜蓿根部的苜蓿酸以及海红豆中的紫檀素，黄连体内的小孽碱等均具有很强的抗真菌作用[8]。

本实验研究表明，3种溶剂的细辛提取物对番茄早疫病菌菌丝和分生孢子萌发都有不同程度的抑制作用，但它们之间的抑制作用存在差异，在抑制菌丝生长方面，氯仿提取物效果最好，甲醇提取物次之，石油醚提取物效果最差。在抑制分生孢子萌发方面，石油醚提取物效果最好，氯仿提取物次之，甲醇提取物效果较差。由于3种溶剂的极性不同，从以上实验结果初步推断细辛体内抑制番茄早疫病菌的活性物质不止一种，而且极性大小在石油醚和氯仿之间。今后的研究方向是探索分离细辛提取物中的活性成分，为进一步产品开发奠定基础。至于细辛提取物是否对其他病菌有抑制作用，有待在以后的实验中证明。