Review of the Mechanism of Action and Resistance of Systemic Fungicides used for Controlling Oomycete Disease

Review of the Mechanism of Action and Resistance of Systemic Fungicides used for Controlling Oomycete Disease

Cavalier-Smith（1981；1988）提出将细胞生物分为八界，《真菌词典》第八版（1995）和第九版（2001）均接受了这一分类系统。在这一分界系统中，卵菌门（Oomycota）属于色菌界（Chromista），有1纲9目及其他地位待定的4目，其中引起植物病害的有水霉目（Saprolegniales）、腐霉目（Pythiales）、指梗霉目（Sclerosporales）和霜霉目（Peronosporales）[1]。卵菌门的共同特征是游动孢子具有一根茸鞭和一根尾鞭，鞭毛呈直管状，有性生殖为卵配生殖，线粒体呈脊管状。在许多方面卵菌与真菌有明显差异，而与藻类更为相似，因此又称卵菌为假真菌（pseudofungi）。卵菌中有许多是重要的植物病原菌，它们的世代短，产孢量大，潜育期短，再侵染次数多，对寄主植物的破坏性强，流行速度快，造成严重的经济损失[2]。

在对卵菌的综合防治的措施中，化学防治仍然是控制卵菌病害的主要手段之一，但目前生产中普遍发生了卵菌对现有杀菌剂的抗药性问题，这对当前农业的发展构成了严重的威胁[3]。随着显微技术、化学分析技术和分子生物学的发展，已经能从病原真菌的形态、生理生化和分子等不同水平进行杀菌剂作用机理和抗药性机理的研究[4]。本文就目前常用的四类内吸性杀菌剂对卵菌的作用机理及抗性机理进行了概述，希望能对杀菌剂的合理使用和新型杀菌剂的开发提供一定的理论基础。

病害名称病原物病害名称病原物十字花科白锈病白锈菌（Albugocandida）马铃薯晚疫病致病疫霉菌（Phytophthorainfes-tans）谷子白发病禾指梗霉菌（Sclerosporagra-minicola）瓜类疫病掘氏疫霉菌（P.drechsleri）烟草猝倒病瓜果腐霉菌（Pythiumaphanider-matum）辣椒疫病辣椒疫霉菌（P.capsici）黄瓜霜霉病古巴假霜霉菌（Pseudoperonospo-racubensis）柑橘褐腐柑橘褐腐疫霉菌（P.citrophthora）葡萄霜霉病葡萄生轴霜霉菌（Plasmoparaviticola）

表1 我国卵菌引起的主要植物病害

1 苯基酰胺类杀菌剂

苯基酰胺类杀菌剂的特点是低毒，选择性强，可以被植物的根、叶和幼茎迅速吸收，并通过导管和细胞间隙等质外体系统向植株上部转移[5]。目前我国使用量较大的有甲霜灵（瑞毒霉）、恶霜灵和湖南省化工研究院开发的苯霜灵等。

Dr.P.A.Urech在1977年研究开发了甲霜灵，它是苯基酰胺类杀菌剂中第一个商品化的品种，其特点是病菌在植物体内形成吸胞后抑菌作用才能发挥，对卵菌侵入寄主前的各阶段，如游动孢子的释放、萌发和侵入的抑制作用不明显，但对侵入寄主后的各阶段，如菌丝在植物体内的生长、吸器形成及孢子囊的产生等有显著的抑制作用[6]。

最初对苯基酰胺类杀菌剂容易引起病原菌抗药性的问题并未引起注意，直到 1981年荷兰的Dekker发现甲霜灵单剂在葡萄上使用仅一个季度就发生田间抗药性之后才给以重视。Davides等[7]、Shattock等[8]先后证实，甲霜灵的杀菌机理是抑制卵菌的核糖体 RNA聚合酶的活性，从而抑制病菌 RNA 的合成，干扰病菌在寄主体内的发展。特别是 γ-RNA的合成，最敏感的是使尿苷掺入 RNA受阻，但不影响尿苷的吸收和尿苷转化为尿苷酸。用不同种的菌试验结果说明，RNA合成受阻的程度不同，通常达 40%～80%，这表明不是全部的 RNA合成受阻。现已知道有3种RNA的聚合物担负着细胞内核苷酸的聚合。这3种聚合酶称为聚合酶A、B、C，A主要是负责核糖体内γ-RNA的合成，B是用于m-RNA的合成，C则用于 t-RNA和5SRNA 的合成。这3种酶一般是用对α-鹅膏碱的敏感性来区分的。甲霜灵和其相似物对3种酶有选择性抑制作用，主要是对聚合酶A的毒力最大，也就是γ-RNA的合成受阻，核糖体就不正常。因此，对菌的生长有抑制作用，但是对菌的孢子囊的直接和间接萌发以及游动孢子的萌发都没有影响[9～11]。

通过对抗药和敏感菌株杂交后代的分析，表明抗药性是由隐性的单基因或核内的单作用位点控制，发展速度快，抗性水平高，抗药菌株遗传稳定，适合度、致病力几乎与野生的敏感菌相同，故经过施药的选择敏感菌很快消亡，抗性菌在群体中得以繁殖发展，并很快成为优势种群，出现田间突然药剂失效[12]。研究表明敏感菌系细胞核中有编码敏感 RNA 聚合酶的基因，而抗性菌系则不含这个基因，因而对药物的反应不敏感而表现抗药性。同时苯基酰胺类杀菌剂之间具有正交互抗性，这给该药剂的进一步开发带来了很大的困难[13，14]。

2 丙烯酰胺类杀菌剂

丙烯酰胺类杀菌剂中对卵菌病害有很好防治效果的药剂主要有烯酰吗啉和氟吗啉，其作用机理基本上都是抑制菌体内麦角甾醇的生物合成。麦角甾醇是菌体细胞膜的重要组成部分，它与膜脂中的碳氢键相互作用，有保持膜的流动性和稳定膜分子结构的重要作用。如果麦角甾醇生物合成受阻，膜的结构和选择性屏障作用就受到损害，造成细胞内物质的泄漏，最后导致菌体死亡。用丙烯酰胺类杀菌剂处理真菌后往往能使芽管短而膨胀、过度扭曲，菌丝分枝增加。

烯酰吗啉在1988年由Shen Group公司研制开发。烯酰吗啉可强烈抑制游动孢子囊的形成、休眠孢子的萌发和菌丝生长，但不影响游动孢子的释放。与菌丝细胞壁合成相比，孢子囊壁的合成对烯酰吗啉更为敏感。Bartnicki[15]认为由于休止孢萌发和芽管伸长这些阶段菌体内有相对较少碳水化合物来调节渗透压和形成细胞壁，所以烯酰吗啉作用后细胞壁容易产生破裂。Kuhn等[16]和Albert等[17]研究表明烯酰吗啉能导致菌丝生长过程中细胞壁畸形和加厚，最终导致菌丝顶端破裂，认为烯酰吗啉明显干扰了病原菌的形态调节因子或抑制细胞壁结构的正确组合，影响细胞壁的合成。

烯酰吗啉1992年获得注册登记并投放市场，尽管已经使用多年，但国内外的室内和田间实践均证明，烯酰吗啉在田间表现为低抗药性风险。Dereviagina等[18]对田间采集的110株马铃薯晚疫病菌的测定发现，存在0.3%～0.8%的抗烯酰吗啉突变体，但抗性菌株的适合度低，而且在连续转代培养过程中抗性丧失。Bagirova等[19]在室内通过化学诱变获得了马铃薯晚疫病菌对烯酰吗啉的抗药突变体，但突变频率低，而且突变株的适合度明显下降。王文桥等[20]获得了葡萄霜霉病菌抗烯酰吗啉的突变体，但未获得马铃薯晚疫病菌的抗药突变体。袁善奎等[21]对马铃薯晚疫病菌抗烯酰吗啉突变体的研究结果与以上学者的报道一致，没有获得高抗药性水平的突变体，但突变体的抗性比较稳定。

3 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂

甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是以天然抗生素Strobilurin A为先导化合物而开发的新型杀菌剂，自1969年Musikek及其合作者首先报道以来，对此类化合物的研究已成为杀菌剂开发的新热点。这类杀菌剂具有杀菌谱广和杀菌活性高的特性，具有保护、治疗、铲除、渗透作用，对环境和非靶标生物安全[22]。

甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的作用位点独特，不同于以往任何抑制剂作用于呼吸链上的位置。Cyt bc1呼吸抑制剂有两类：一类是位于线粒体内膜内壁Qi位点（CoQ的还原位点）的cyt b高势能血红色素结合的抑制剂，这类抑制剂称为Qi位点抑制剂，简称QiIs，如抗霉素，cyanoimidazole等。另一类与位于线粒体内膜外壁的Qo位点（CoQ的氧化位点）的cyt b低势能血红色素结合的抑制剂，这类抑制剂称为Qo位点抑制剂，简称QoIs，如甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂、咪唑菌酮、唑菌酮等[22，23]。

甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂为能量生成抑制剂，其作用机理是通过与真菌细胞色素b上的辅酶Q0氧化中心结合，阻止细胞ATP的合成，影响能量代谢，从而抑制线粒体的呼吸作用。这种作用阻止氢醌（QH2）向Fe-S中心传递电子，而不是直接阻止与氢醌的结合[24～26]。细胞色素b属于细胞色素bc1复合体的一部分，位于真核生物线粒体膜的内侧，一旦某个抑制剂与之键合，它将阻止细胞色素b和c1之间的电子传递，阻止ATP的产生而干扰真菌内的能量循环，从而杀灭病原菌。

在甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂开发和应用的早期，人们认为这类杀菌剂的抗性风险是中等水平，但是1998年德国使用苯氧菌酯防治小麦白粉病2年后发现防效明显下降，原因是小麦白粉病菌产生了抗药性，而且抗药性个体的适合度很高。目前认为这类杀菌剂的抗药性风险是高水平[26]。已经报道QoIs的两种类型的抗药性机理[27，28]。第一种是细胞色素b基因上的氨基酸序列发生改变，从而降低了与药剂的亲和力，主要是143位甘氨酸被丙氨酸取代（G143A）（如黄瓜霜霉病菌、小麦白粉病菌、葡萄霜霉病菌等）和129位苯丙氨酸被亮氨酸取代（F129L）（如稻瘟病菌）。由于cyt bc1基因是线粒体编码的，其抗性遗传方式表现为母性遗传。第二种抗性机理涉及电子传递链中旁路氧化酶（Alternative Oxidase，AOX）的活性，通过旁路途径减少甚至消除QoIs对病菌电子传递的抑制作用。

4417407（咪）唑类杀菌剂

（咪）唑类杀菌剂活性高、作用机理独特，与现有杀菌剂无交互抗性，能与多种杀菌剂混配，可有效缓解内吸性杀菌剂的抗性问题。

唑菌酮由杜邦公司开发，对锈病、霜霉病、晚疫病等均具有良好保护、治疗、渗透、内吸等作用。它对病原菌在生长过程中所释放出的孢子影响最大，药剂一旦与孢子接触，孢子即停止活动，出现崩死。另外，对孢子的萌发和菌丝的伸长也有一定的抑制作用[30]。

唑菌酮能抑制病原菌线粒体的电子传递，主要阻断细胞色素b和细胞色素c之间的电子传递通道中ADP-ATP的氧化磷酸化作用，使病原菌无法产生所必需的能量。417407唑菌酮也是QoIs，作用机理同于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂。由于分子结构的差异，它与cyt b的结合方式不同[31]。

唑菌酮能抑制病原菌线粒体的电子传递，主要阻断细胞色素b和细胞色素c之间的电子传递通道中ADP-ATP的氧化磷酸化作用，使病原菌无法产生所必需的能量。417407唑菌酮也是QoIs，作用机理同于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂。由于分子结构的差异，它与cyt b的结合方式不同[31]。

类型代表品种杀菌机理抗药性风险水平苯基酰胺类甲霜灵恶霜灵苯霜灵抑制卵菌的核糖体RNA聚合酶的活性，从而抑制病菌RNA的合成，干扰病菌在寄主体内的发展作用位点单一，容易产生高水平抗药性突变菌株丙烯酰胺类烯酰吗啉氟吗啉抑制菌体内麦角甾醇的生物合成，造成细胞内物质的泄漏，最后导致菌体死亡突变频率低，突变菌株适合度差，表现为低抗药性风险甲氧基丙烯酸酯类嘧菌酯苯氧菌酯烯肟菌酯通过与细胞色素b上的辅酶QO氧化中心结合，阻止细胞ATP的合成，从而抑制线粒体的呼吸作用单一位点的突变，表现为高水平的抗药性（咪）唑类唑菌酮咪唑菌酮阻断细胞色素b和细胞色素c之间的电子传递通道中ADP-ATP的氧化磷酸化作用，抑制病原菌线粒体的电子传递田间使用较少，抗药性风险水平暂时不明确

表2 防治卵菌病害的内吸性杀菌剂的主要类型、代表品种、杀菌机理、抗药性风险水平

5 结语

杀菌剂对病菌的影响是多方面的，其作用位点也相对比较复杂，由于病原菌抗药性的不断出现和抗性程度的不断上升，对研制开发广谱、新型杀菌剂的要求越来越强烈。但化学杀菌剂开发的难度越来越大，开发费用越来越高，开发新型农药的速度远远落后于病原菌抗性发展的速度。因此，明确杀菌剂的作用机理和抗性机理，对创制作用机理独特、环境友好的杀菌剂尤为重要。

卵菌的进化一般认为是从水生到陆生，由腐生到专性寄生。卵菌大部分生活在水中或潮湿的土壤中，部分比较高等接近陆生的卵菌主要寄生在高等植物体内。因此，卵菌具有一个共同的特点“亲水—疏油”。因此，在农药剂型的选择上，水剂、水乳剂、水分散粒剂、悬浮剂与卵菌有更好的亲合性，更适合卵菌病害的防治，能更好地发挥药效[32]。在新型农药品种开发的时候，要进行抗性风险评估，采取科学合理的防治措施和使用规范。在未产生抗药性之前推广使用混合制剂，这样能减少选择压力，延缓抗性的产生，延长已开发产品的使用寿命。

因此，根据卵菌的生物学特性、卵菌病害循环的规律和药剂的作用机理，要将病害的预测预报、农药剂型、用药规范、作物种类、作物品种、当地的气候条件和当地作物的抗性水平等因素结合起来，综合考虑制定防治策略，才能保证农业的可持续发展和生态环境的和谐发展。