对于枯萎病的致病机理，历来有不同的解释。其中，Melhus（1924）、Waggoner等（1954）提出堵塞说，认为棉株感病后导管被堵塞，水分不能向上移动之故。而Fahmy（1923）、Schaffnit等（1932）和Elpidina等（1935）认为，病菌对棉株产生有毒物质，并沿植株上行液流，流至各部，使原生膜透性、碳氮代谢、呼吸作用受损，各种酶系统均受影响，提出毒素说。Bishop（1983）研究发现，在适宜条件下接种枯萎菌孢子24～96h后就能发生侵染，孢子萌发后，菌丝体在根表大量生长，主要从根尖分生区和伸长区侵入，很少侵入根冠、根毛。在茎尖的成熟区以上，由于组织发育成熟，病菌难以通过内皮层而进入维管束内。病菌主要是在成熟区之前或在寄主伤根时进入维管束。黄建成（1990）从植物解剖学研究了枯萎病菌入侵途径、病菌与各器官结构的关系之后提出，菌丝的侵入主要在苗期感染下胚轴及其根系，亦可见于子叶，在根、茎中菌丝主要定殖于最初形成的次生木质部。枯萎病菌在棉苗不同生育阶段的侵入途径是不同的。无菌培养的结果，病菌可在棉株任何部位侵入，但主要在下胚轴部位，在温室培养的棉株，常在土面以下5～10mm的下胚轴，此部位因受土壤温湿度、苗株与土壤摩擦等因素的影响，容易受损，使菌丝较易在此部位侵入。下胚轴及根部的侵入。当菌丝接触下胚轴及其根系，常从破损的表皮细胞入侵滋生，并沿破损部位进入皮层，若菌丝比较多，也可从表皮细胞直接进入，表皮细胞无明显病变，菌丝进入皮层后，能在细胞内及细胞间生长，入侵的方法是径向的，菌丝常有粗、细的差异，粗的直径约为3.4μm，细的约为2.8μm，当菌丝进入中柱时，似乎不受内皮层的阻碍，若在下胚轴部位，菌丝沿着两个维管束之间的薄壁细胞到达髓部，然后向维管束的薄壁组织扩散，进入较大的孔纹及网纹导管，菌丝一旦进入维管组织的木质部，大体上就限制在较大的导管内，并向上扩展，以菌丝或分生孢子的形式，进入茎部。子叶部位的侵入。从接种病菌后的幼苗，菌丝入侵子叶，当初菌丝先在表皮上滋生，细胞变褐，部分溃烂，并扩展到邻近细胞，其后细胞胶状破毁，菌丝沿破壁毁处，深入叶肉，菌丝可从细胞间及细胞内穿过。受侵染的叶片厚度变薄，与正常叶比较，约减少102μm。根内的感染。从幼根的横切面看，菌丝可在表皮、皮层、维管组织中的薄壁组织中发现，并呈向心径向侵入，具有次生结构的根中，菌丝常限制在最初形成的次生木质部的导管中，它的纵向扩展则沿导管上升或下移，径向扩展是通过木质部射线细胞引伸。从老根的横切面看，木质部射线感病尤为严重，其壁黑褐色，离心引伸，放射状排列，壁加厚，有时具有菌丝。与射线邻近的薄壁细胞及导管，常先感病。从老根纵切面看，菌丝多集中在导管内，呈分枝状，引伸方向大致与导管主轴平行，菌丝可由一个导管经过纹孔进入另一导管，有时可看到分生孢子的存在，个别导管可看见胶状物和侵填体，呈黄褐色，有时附在导管内壁上，侵填体呈囊状，在一个导管中往往数量较多，个别有可能堵塞。茎内的感染。菌丝从根部侵入后，寄生在根部的导管及其邻近细胞内，随着导管向上输水，菌丝可向上、向下延伸，分生孢子也随水分上升而入侵茎、枝条、叶柄，并在这些部位的导管及其邻近细胞中萌发滋长。最初感染枯萎病的棉株，一般在茎秆外部形态上无特殊表现，稍后的生长，其节间比正常的缩短。从横断面可看到靠近髓部的木质部变黑褐色，若感染黄萎病，则可扩展到整个木质部，这是区别黄萎病及枯萎病的方法之一。在现蕾期前后，进行病株茎的解剖，其菌丝的定殖部位，与根基本相同，即定殖于最初形成的次生木质部中，并有大量的孢子及菌丝存在，有些孢子在导管及其邻近的细胞内萌发，初期即可见菌丝从一个细胞伸入另一细胞。菌丝是不断向邻近细胞入侵，木质部的射线细胞往往感病严重，并存有孢子，可能与其横向感染有关。叶的感染。棉花枯萎病在子叶期即表现病状，可分为黄色网纹型、紫红型、黄化型和急性青枯型，但以黄化型为基本性状，表现为叶子黄色兼有大块变色枯焦斑，最后叶子脱落。苗期从一些叶的横切片中，可看到一些菌丝在栅栏组织及海绵组织中滋长，可在细胞内或细胞间穿行，具有菌丝的细胞，叶绿体相对减少，壁加厚，表皮细胞也受损。后来在该部位呈黄色网纹状及大块枯焦斑。入秋后叶的横切面观察，叶柄的维管束可呈现黑色，细胞壁加厚，导管中可看见菌丝的存在，但不普遍，如具菌丝，多为扭曲或分枝状。当枯萎病菌侵入棉株体内后，因菌丝及孢子的大量繁殖而堵塞了棉株的导管；或者刺激邻近的薄壁细胞产生凝胶体和树胶等胶状物质或侵填体（tylose）而填塞导管；也可能是病菌入侵后，产生果胶酶，使棉株细胞中的胶状物质和细胞壁中的果胶物质被水解，引起组织解体而堵塞导管。导管被堵塞后，机械地阻碍了水分和养分在棉株体内的正常运输，加上地上部的蒸腾作用和呼吸作用旺盛，使水分失去平衡而导致棉株萎蔫。袁红旭等（2002）观察到接种枯萎病菌后棉苗病株茎内大小导管内有数目不等的菌丝体。少的每个导管内1～2根菌丝体，多的可充满整个导管。病菌菌丝多沿导管纵向生长，也能看到菌丝穿过导管壁横向生长进入薄壁细胞或其他导管，导管周围的薄壁细胞中同样存在菌丝，但韧皮部中未发现菌丝体。被侵染的导管数目依发病情况变化而变化，发病严重的感病品种显著高于抗病品种。受侵导管及周围薄壁细胞常发生褐变，这种现象在导管有大量菌丝时很常见，但也能观察到变褐的维管束中并没有菌丝的现象。在病害发展的早期没有明显的褐变现象，只有在病害进一步发展、植株有明显的症状出现时，褐变才大量出现。引起褐变的物质不仅横向扩展而且可随导管汁液纵向扩展。发病棉苗茎部产生填充物充塞导管，这种现象所有品种都存在，未接种的对照中没有观察到填充物。填充物有两种类型：一种为球状物；另一种为胶状物，用酸性品红染色时胶状物为橘红色，球状物为鲜红色；用番红染色时胶状物为鲜红色，而球状物为淡红色；用苏丹Ⅲ染色胶状物为橘红色，球状物无色；用10%三氯化铁染色，两种侵填物均不显色。由此可见，两种侵填物成分不同，但都不是单宁类物质，胶状物可能是脂类。此外，病菌粗毒素诱导的棉苗维管束褐变和导管堵塞现象与发病植株维管束的变化情况基本相同。堵塞导管的填充物也有两种类型：球状和胶状。两种填充物对染料的颜色反应与发病植株中的两种填充物相同。毒素处理后，处理根苗叶柄也存在维管束褐变和导管堵塞反应，而且发生较茎部为早。但试验观测到病株内由菌丝及填充物堵塞的导管仅是一小部分，即使是发病严重的植株被堵塞的导管也只是总导管的1/10。黄建成（1990）的研究结果指出，在现蕾前期调查统计感枯萎病植株维管束的1879个导管中，含菌丝有104个，在此范围内，其他细胞具菌丝可达40个，但有些材料的其他细胞，不含菌丝，具有感病性状。感病的导管和其他细胞的壁均变黑、加厚，其厚度为5.67～8.5μm，而正常壁的厚度为3.4～5.6μm，仅增厚约在3.5μm；具侵填体的导管数占总导管数的0.68%，其比例较小，在未观察的材料略有增加，但增幅不大。这说明单纯的导管堵塞论并不能完全解释病株萎蔫过程。早在1954年，Waggoner的研究报告指出，木质部导管堵塞可以引起水分运输障碍，但并不能完全切断水分流动，使棉株对水分输导功能全部丧失。Talboys（1964）指出，正常的木质部导管的潜在输水能力已远远超过棉株的总需水量，如果把茎部维管柱切去1/2，植株并不萎蔫。尽管如此，导管的堵塞总要在一定程度上影响到水分的输导。不少病原菌能产生可以扩散和转移的、对植物有毒的活性化合物，而导致对某些植物的病害。不少学者认为，棉花枯萎病菌入侵棉株后，引起导管的阻塞，只是导致棉株萎蔫的部分原因。更重要的是棉株体内产生某些有毒物质，使寄主细胞中毒死亡。病原菌对寄主产生有毒物质，早在19世纪末便有人提出。其后，进行了广泛的研究，并取得了较大的进展。在棉花方面，Brand早在1919便指出，棉株枯萎性状的发生，除导管堵塞外，还可能由于植物组织中毒。据国内外报道，当枯萎病菌侵染棉株后，分泌出对寄主有毒的物质，主要有类萜、酚类、糖甙及其衍生物。有的病原菌能分泌出多种的多糖水解酶，不仅可使寄主细胞壁降解，细胞分离，菌丝得以乘机而入；而且使寄主根部受伤，吸水力下降。有的病原菌可分泌出两种水解酶——蛋白酶和酯酶，它们可分解寄主细胞的膜蛋白和膜脂类物质，使细胞膜透性增大，散失水分加快，而引起萎蔫。棉花枯萎病菌的致病毒素是由枯萎病菌产生的镰孢菌酸（Fusaric acid，FA），又称萎蔫酸。它是一种非特异性的活体毒素（Vivotoxin），其学名为5-丁基吡啶-2羧酸（5-N-butylpiocolinic acid）（Keen，1972）。由于它的毒害作用，使寄主的保卫系统受到破坏，因而感病棉株的叶片出现网纹、皱缩或枯死；细胞原生质对水分的溶透性以及整个棉株的水分平衡受到破坏；多酚氧化物被抑制，从而产生明显的病理变化。Ganmann（1958）认为，萎蔫素一方面降低了细胞的保水能力，造成棉株失水；另一方面也破坏了原生质膜的渗透性，损坏了植株细胞膜的功能。仇元等（1963）发现，用枯萎病菌的培养滤液处理棉苗可以导致萎蔫。张献龙等（1993）将鄂棉14品种的3～4叶期切根苗插入盛有不同培养天数获得的毒素液中，以水和理查液处理为对照；进行室内观察。3天后，仅培养30天及40天获得的毒素液使幼苗萎蔫，其他处理（10天、15天、20天、25天）轻度萎蔫，培养5天的病菌产生的毒素液及两对照处理下的幼苗无萎蔫迹象。5天后，各毒素处理均使幼苗完全干枯，仅理查液和水处理下的幼苗叶片仍保持正常，这说明，毒素液确对幼苗有严重致萎作用，且随着病菌培养天数增加，其滤液的毒性增强。吴小月等（1993）也有类似的报道。他们用不同浓度枯萎病菌毒素提取液浸苗，稀释到1/4浓度的提取液对不同抗病品种致萎作用差异最明显。在这一浓度下，浸苗当天各品种均未出现萎蔫现象；第二天感病品种徐州1818开始出现轻度萎蔫；第三天感病品种萎蔫率达到最大，为94.4%，而3个抗病品种萎蔫率均只有5.6%；第四、第五天不同抗病品种间萎蔫率仍差异显著；第六天3个感病品种全部萎蔫，而抗病品种最大萎蔫率仅38.9%。由此可见，棉花品种的抗病力不同，棉苗对病菌毒素提取液的萎蔫反应也不一样。王贺祥等（1988）的研究发现，陆地棉不同品种对FA的抗性与它们在生产中表现出的对枯萎病的抗性相一致，证明FA是枯萎菌导致棉花萎蔫的重要致病因子。李成葆等（1990）用不同浓度的单一镰孢菌酸纯品处理具有不同抗性的棉花品种的种子后发现，感病品种鄂荆92和冀棉11号对镰孢菌酸很敏感，棉籽的萌发率、百苗鲜重都降低，棉苗萎蔫率、电导率增加，气孔阻力增高，蒸腾速率下降。而感病品种中棉12号和中5173对镰孢菌酸的敏感性差。所以，他们认为，当棉株根系吸收的镰孢菌酸运输到叶片后，具有半透性的原生质膜被破坏，叶片蒸腾所失水分大于根系所吸收的水分，破坏了体内的水分平衡，而导致棉株萎蔫。品种对FA的抗性与它在田间抗病性的表现呈正相关。易海艳等（2011）采用不同浓度的枯萎病原菌培养滤液对幼苗进行1h浸泡培养，结果表明，无论是新陆早16号不同抗感品系或新海21号不同抗感品系，病原菌培养滤液浓度不同、处理后时间不同，其病指均不同；随着处理后时间的延长和处理浓度的增加，病指大都呈增加趋势。而且在同一浓度下同一品种的抗感品系病指也存在较大的差异，均表现为在同一浓度下，其抗病转化品系的病指比原感病品种明显降低，且在100%浓度下棉花的抗感品种都呈现严重的萎蔫症状，而对照在观察期内始终不表现任何症状（表3-1）。品系镰刀菌酸培养滤液（%）处理后36h处理后72h处理后108h发病率（%）病指发病率（%）病指发病率（%）病指抗感抗感抗感抗感抗感抗感新陆早16号2531.641.77.914.610.525.02.610.410.533.36.618.85081.8100.031.845.891.7100.061.768.6100.0100.065.979.6100100.0100.039.670.8100.0100.072.975.0100.0100.095.8100.00（ck）0.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.0新海21号258.333.32.116.78.348.32.125.016.751.74.225.05081.890.022.737.5100.0100.047.760.0100.0100.047.779.6100.075.0100.027.152.1100.0100.070.875.0100.0100.091.7100.00（ck）0.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.0表3-1 病原菌培养滤液对新陆早16号和新海21号不同抗感品系的致萎作用镰孢菌酸除可增加植物细胞电解质的渗漏、改变细胞壁的透性外，还能和铁、铜、锰等金属离子螯合，造成植物对可被利用元素的缺乏（Wood，1972；Wilson等，1978；Barna等，1983）。也有的研究表明，镰孢菌酸还能降低光合作用效率，抑制琥珀酸氧化酶及线粒体中细胞色素氧化酶，破坏植物体中的碳、氮代谢等。所以，不少学者认为，枯萎病菌产生的镰孢菌酸的数量和致病力的强弱呈正相关。Chakrabarti（1979）用一个致病力强的菌株和一个致病力中等的菌株进行比较时发现，致病力强的菌株所产生的镰孢菌酸比致病力中等的菌株所产生的镰孢菌酸多2倍。当然，也有学者认为，病原菌致病力的强弱与各菌种产生的镰孢菌酸的数量没有直接关系。王贺祥（1984）用来自全国各地主产棉区的30个枯萎镰孢菌株分析指出，各菌株所产生的镰孢菌酸的数量，没有规律性；各生理型与镰孢菌酸的产量间也无相关性。枯萎病菌分泌的酶类是否参与萎蔫病害的致病过程，多年来一直存在争论。Kumar等（1979）对棉花枯萎病菌在体外及接种后棉花植株中各种果胶酶的变化做了研究发现，病菌毒力与所产生的endo-PG（内切多聚半乳糖醛酸酶）量有相关性，无毒力菌株体外培养时和未接种的健康棉花植株内都不含有endo-PG。Suresh等（1984）从棉花枯萎菌中提纯endo-PG，发现cndo-PG有3种同工酶，这3种同工酶之间在等电点和分子量上有差异，且3种同工酶之间诱导萎蔫的能力不同，共同作用可以造成100%萎蔫，及下胚轴壁的黑褐化。Endo-PG参与致萎的一些机理已有一些研究，Cooper等（1980）认为，病菌侵染时分泌的endo-PG降解寄主细胞壁并从纹孔膜处产生果胶胶体，这些胶体物堵塞了受侵染的木质部导管，使水分的上升运动受阻，从而使植株发生萎蔫。为进一步肯定或否定endo-PG对棉花枯萎致病的作用，郜会荣（1990）利用紫外诱变方法获得了枯萎病的内切多聚半乳糖醛酸酶（Endo-PG）的缺失突变株（PGmⅠ为endo-PG完全缺陷菌株，而PGmⅡ菌株还有微量的endo-PG产生，但它们和母菌株相比差别是十分显著的），用突变株和野生菌株接种棉苗，发现突变株的致萎能力远远低于野生菌株。两周棉苗用母菌株接种时，快速萎蔫的棉苗可达26%～70%，用PGmⅠ接种的只有2%～4%，用母菌株接种，两天根表就满布菌丝，根表变褐色，根下部的维管束以外的组织发生软化烂掉，这种严重损伤的根可达40%～100%；PGmⅠ接种的棉苗，2～3天后根部也能布满菌丝，但根表变褐且颜色浅，3～4天后即有大量新的不定根长出，这些新发出的白色新根，发生软化和腐烂的根仅占6%～10%；PGmⅡ接种后，棉苗根部变化与PGmⅠ接种的相似，但发生软化或腐烂的比例较高，达10%～20%。在测定的病指方面，PGmⅠ接种后的病指高于PGmⅡ接种的，但这种差异在统计学分析上并不显著，而这两个突变菌株的病指都显著低于母菌株（表3-2）。可以看出，突变菌株PGmⅠ产生endo-PG能力完全丧失，致病力也大大降低；PGmⅡ菌株虽有微弱的endo-PG活力，而这种微弱的endo-PG活性可能在一定程度上对病菌的致病过程起一定作用，但这微弱的酶活性却不足以使菌株像母菌株接种那样达到高的病指。说明endo-PG参与了枯萎病菌的致病过程。Endo-PG主要通过降解植物细胞壁的果胶聚合物，使果胶胶体物质堵塞导管，影响棉株的水分运输，造成萎蔫。棉花枯萎菌的致病过程是酶和毒素协同作用的结果。菌株病指重复A重复B平均病指差异显著性*母菌株53.656.054.8aPGmⅡ22.419.621.0bPGmⅠ8.816.012.4bc表3-2 各菌株接种棉苗一个月后病指的比较由于寄主与病原菌之间的关系极为复杂，综合因素构成了棉花的凋萎。水分运输被阻塞或枯萎病原菌产生某种毒素可能只是导致棉株萎蔫的主要原因，有些因素的作用尚有待于进一步研究证实。棉花对枯萎病菌的抗性是一个非常复杂的系统性问题。它涉及寄主（棉花）、病原菌、环境以及它们各自内部的生理代谢变化和相互作用。就寄主来讲，其抗病性可以分为组织结构抗性、生理生化抗性和生态抗性3个方面。但这3个方面的抗性又都可以归结到抗病基因上，即无论是组织结构抗性还是生理生化抗性和生态抗性都是由寄主的抗病基因所决定的。组织结构抗性是以物理的屏障阻止病菌的侵入和扩展。生化抗性是以植株体内所固有的或受到病菌侵染后新合成的抗生性化学物质对病菌的抑制作用。生态抗病性是指棉花根系所处土壤环境中，微生物和棉花根系分泌物对枯萎病菌侵染的影响。这3种类型的抗病性综合起来就决定了棉花是抗病的、耐病的、还是感病的。寄主植株的器官组织结构在抗病性中的作用占有重要的位置。若根、茎表皮细胞厚，根、茎木质部结构坚实，导管腔、木质纤维素腔直径较大，并且有多列髓和较厚细胞壁的棉花品种，均不利于枯萎病菌的侵入。所有品种的根、茎结构都是相同的，均具有初生保护组织的表皮，形状较大。排列较紧密，位于表皮与中柱之间的皮层，由维管束和髓、髓射线组织构成的中柱组织。由于棉花枯萎病系维管束病害，因此，与维管束、髓射线所存在的结构空间或关系密切。解剖测定已经明确，品种抗病性与维管束组织结构有直接关系。前苏联的一些学者研究认为，抗病品种基部具有坚实的木质部和含有大量淀粉贮藏物的多列髓射线，同时木质部的细胞间隙较小，细胞壁较厚。Bugbee（1970）的研究也认为，抗性品系的木质部导管比感病品系形成的多。对髓射线的研究各学者的意见较统一，即髓射线越多抗萎蔫病越强。这是因为在髓射线细胞中有一类称为类黄酮贮藏细胞（Flavarol-storing cell）的特殊细胞，这些细胞散布在髓线中，能阻止菌丝在各导管之间的扩展（Mace等，1981）。王正芬（1984）报道，棉花在6～7片真叶期，枯萎病的病指与茎导管细胞数之间有较强的正相关性。但对3～4片真叶期幼苗的研究却表明，病指与导管细胞数量的相关性很差。贺运春（1984）观察到棉株导管中的枯萎病菌菌丝壁由胞壁和胞膜两层组成，其厚度分别为0.14μm和0.10μm。枯萎病菌菌丝沿寄主导管壁生长时，菌丝细胞壁与导管壁紧密接触，在接触的菌丝细胞壁上产生顶端膨大、扁平、基部粗壮、不具有细胞壁的吸胞，并伸入寄主导管壁内。在菌丝的同一部位有时可以产生并排的两个相同的吸泡。在产生吸泡的菌丝部位，菌丝细胞加厚，厚度可达0.22μm。棉株导管中的枯萎菌丝无色，有分隔和分枝，并着生有小型分生孢子，但未见大型分生孢子及厚垣孢子。Shi等（1992）利用组织化学方法，检测了继发性受阻导管和相邻不受阻导管的交联细胞的超微结构后发现，表现出细胞质成分及活性的增加，接触细胞能够产生脂类物质及其他化合物，所形成的分泌物通过纹孔进入导管。分泌物覆盖导管壁，并且以变态物形式沉积在导管腔，无定形泡状结构聚合在一起，形状、大小不一，导管逐渐被分泌物所包埋覆盖，累积的分泌物完全堵塞了导管腔。在抗病品种中，随着导管腔的分泌物积累以及管壁的增厚，被膜更集中，抗病品种中接触细胞中这种更集中的分泌物活性导致了屏障的形成，从而阻止了导管内病菌的扩展。雷江荣等（2010）利用农杆菌介导法将克隆自拟南芥的抗病基因SNC 1转入棉花中，接种棉花枯萎病菌后，和非转基因棉相比，转基因棉的抗病性得到提高，是非转基因棉的2倍左右。通过石蜡切片技术研究发现，具有抗病性的转SNC 1基因棉花和非转基因棉花均有导管堵塞现象，即形成胼胝体和侵填体等物质，只是转基因棉花的堵塞程度较严重，并且转基因棉花韧皮部细胞排列整齐，细胞间隙小。另外，受体抗病品种“中35”和受体感病品种“军棉1号”相比，它发生茎导管堵塞现象也多于感病品种。表明在棉花枯萎病菌侵染和其代谢物刺激下抗病品种堵塞导管的能力强，是品种抗病机制之一（图3-1，图3-2）。图3-1 棉株根茎木质部石蜡横向切片（胼胝质）图3-2 棉株根茎木质部导管石蜡切片（×255）（侵填体）维管束组织以外的细胞与抗枯萎病性也有一定的关系。史金瑞（1986）对枯萎病抗、感棉花品种根部早期侵染的组织和细胞进行观察发现，侵染菌丝在高抗的亚洲棉品种（石系亚）上局限在表皮细胞及外围1～2层皮层细胞中，而陆地棉中植86-1（抗）、徐州142（感）和高感的海岛棉品种中，菌丝能在皮层中扩展，并能进入中柱。研究中还发现，亚洲棉石系亚的根部表皮层外有一层物质，在菌丝与表皮细胞接触处这层物质被消解之后才能进行侵染，而在其他几个供试的陆地棉、海岛棉中则无此现象。石系亚对棉枯萎病表现较强的抗病性，可能与其表皮层外这层物质有关。棉花抗枯萎病的生理生化机制是个比较复杂的问题，枯萎病菌侵染棉花后，棉株体内的生化物质和生理代谢均会发生变化，反映了棉株抗、感病性的内在原因。抗病性是植物的遗传潜能，其表现受寄主与病原的相互作用和环境条件的共同影响。根据“基因对基因”假说，植物抗病性是植物本身所具有的抗性基因（Resistance Genes）和与之相对应的侵染病原物所具有的无毒基因（Avirulencegenes）结合时所表现出来的（Hammond等，1997）。不同的植株对同一病原物，同一植株对不同种的病原物可具有不同的抗病性（鲁明波等，1998；Heath，2000）。因此，植物不同的抗病性反映在植物生理上就表现出一系列复杂的生理生化变化，包括植物细胞内活性氧的积累与清除、抗病信号的产生与转导、防卫反应的表达与调控等。在这一复杂过程中，一些相关酶类起着很重要的调控作用，如超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD），过氧化氢酶（Catalase，CAT）和过氧化物酶（Peroxidase，POD）等。许多研究都表明，植物病害的发生与这些酶活性变化有着密切关系，并且非亲和性互作（抗病反应）和亲和性互作（感病反应）两者在SOD等酶活性变化方面有着显著不同。近年来研究发现，植物受到病原物侵染后，与抗病性有关的一些主动防卫反应，包括细胞过敏性坏死、植保素、酚类、醌类物质等次生产物的合成、寄主细胞壁的加强和修饰（如木质素的积累）等。寄主的主动防卫反应常与苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine Ammonialyas，PAL）、多酚氧化酶（Polyphenoloxidas，PPO）及POD活性密切相关。（1）活性氧清除酶类近十几年来，活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）因在生物体内广泛存在并具有多种生理功能而引起人们的极大关注。通常所指的ROS仅指氧自由基，如超氧阴离子（O-2）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（·OH）等。ROS通常被认为是植物正常代谢过程中的有毒副产物，随着对其研究的深入，发现其在植物与病原物互作的防卫反应中具有重要作用。首先，ROS具有直接的抗微生物功能，其存在本身就可对病原菌造成伤害；其次，ROS还可以触发植物受侵染点的细胞死亡导致过敏性坏死反应（HR）；再次，ROS还参与细胞壁木质化及富含羟脯酸的糖蛋白的交联，这有利于抵御病原菌侵染；另外，ROS很可能作为第二信使调控抗病相关基因的表达，并启动植物抗毒素合成基因的转录。但是，当植物体内ROS积累过多，就是ROS与其清除酶类之间的动态平衡被打破时，植物就会受到伤害（膜脂过氧化和膜差别透性丧失）。因此，植物在长期的进化过程中，在利用氧的同时也形成了一系列清除活性氧为害的机制，这些机制中有些是通过酶促反应实现的，有些则是由非酶物质如抗坏血酸、维生素E、β-胡萝卜素等来实现的。为了早日弄清植物的抗病机制，许多病理学家就活性氧清除酶活性的变化与植物抗病性之间的关系进行了大量的研究，但目前仍未得到一致结论。不过，研究不同抗病品种感病后棉花体内的防御酶活性变化，有利于探明棉花抗病性机制。①POD 过氧化物酶（POD）及其同工酶在植物机体防御体系中起重要作用。POD不仅参与了木质素的聚合过程，也是细胞内重要的内源活性氧清除剂，因此，POD活性与植物抗病性有着密切的关系。目前，植物抗感病品种POD活性变化与抗病性间的关系观点不一。一种观点认为，植物感病后，抗感品种POD活性均升高，并且抗病品种POD活性比感病品种增加幅度快。Joseph等（1998）的研究结果表明，抗病品种的POD活性较感病品种高，而且在病原菌侵染的早期阶段，其POD活性会迅速升高，从而限制了病原菌的扩展。在棉花上沈其益等（1978）报道，POD与棉花对枯萎病的抗性有关。田秀明等（1991）的研究结果表明，在人工接种枯萎菌后，抗病品种和感病品种POD的活性都显著加强，但感病品种POD同工酶的反应比抗病品种强烈得多，而且感病品种比抗病品种多1～2条酶带，且颜色较深。无论是抗病品种还是感病品种，单株病指越高，POD同工酶带数越多，颜色也越深。从海岛棉、亚洲棉和陆地棉三大棉种接菌后POD同工酶谱来看，也同样有以上趋势。胡小月等（1993）指出，苗、蕾期，在未感病的情况下，抗、感病品种间POD酶带无显著差异；在感病情况下，蕾期不同抗性品种POD酶带数均增加，而且酶带颜色加深，说明病害发生后，抗、感品种酶活性均加强，植株体内代谢旺盛，但不同品种间POD酶带存在差异。在健株中，供试品种均具有P5、P6、P7、P8、P9、P11 6条酶带，感病后抗病品种增加P1、P2、P3、P4、P10、P12、P13 7条酶带，比感病品种鄂荆1号增加4条（图3-3）。不同抗枯萎病类型品种和同一品种内感病株和健株POD活性变化不尽一致（图3-4）。由图3-4可以看出，同一品种（系）内感病株和健株比较，健株叶片内POD的变化幅度很小（差值6个单位），曲线变化比较平稳，而感病株POD变化幅度较大（差值69个单位），曲线表现陡直。对于不同抗病类型的品种（系）来看，感病品种叶片内POD活性的变化幅度最大（差值64个单位），耐病品种次之（差值45个单位），抗病品种变幅最小（差值5个单位）。由此说明，品种的抗病性能越差，过氧化物酶活性的变化幅度也越大。抗病基因SNC 1来自拟南芥。雷江荣等（2010）应用农杆菌介导法将SNC 1基因转入中35和军棉1号两个品种，通过选择鉴定育成转基因棉中35和军棉1号。对转基因中35和军棉1号及其相应授体品种（对照）接种枯萎病菌后，转入SNC 1基因的中35，POD酶活性呈逐渐增强的趋势，明显高于对照中35，并且在接菌第4天达到峰值，由14.706U/（mg·min）迅速增加至76.18U/（mg·min），是对照7.234 U/（mg·min）的10倍多，而后随着时间增加酶活性下降。而转基因军棉1号同样在接菌第4天达到峰值，其POD酶活性变化趋势与转基因中35相同，但仅接菌当天酶活性高于对照军棉1号，随后低于对照军棉1号，并且酶活性变化不大（图3-5）。图3-3 不同抗性品种间健株与病株蕾期叶片POD酶带图3-4 同一品种感病株和健株POD活性变化（李妙等，1995）图3-5 棉株叶片接菌后过氧化物酶活性测定分析POD广泛存在于植物体内的不同细胞定位，这些不同细胞定位的POD在植物抗病性中可能有不同的作用。有研究表明，受病原菌侵染或诱发物处理后，可导致植物叶片细胞间隙POD活性的增加，且与植物抗病性抗性有关。细胞壁中存在着丰富的POD，有人观察到在经诱发处理并产生有系统诱导抗性的植物叶片中结合于细胞壁上的POD活性明显上升，这些POD参与木质素在细胞壁上的沉积，从而与系统诱导抗性的产生相关。（Hammerschmidt等，1982；Ye等，1990）。宋凤鸣等（1997）观察到接种枯萎病菌后第8天的棉苗叶片和根茎部组织中的总可溶性POD、胞内POD和细胞间隙POD活性（表3-3）。由表3-3可知，未接种病菌的棉苗组织中3类可溶性POD活性抗病品种均高于感病品种，但根茎部组织中的总可溶性POD和胞内POD活性差异不明显；枯萎病菌侵染后，3类可溶性POD活性均有明显的提高，其中，胞间POD活性增加最大。这说明POD在棉花对枯萎病的抗病性中起到重要作用。品种处理过氧化物酶活性[△OD179/（mgpro·min）]叶片组织根茎组织总POD胞内POD胞间POD总POD胞内POD胞间POD中棉所12（抗病）不接种30.8121.3125.008.697.4818.47接种70.1332.14145.0038.0321.6439.806037（感病）不接种25.2716.3519.707.907.5010.89接种47.4434.6735.0028.2421.2624.26表3-3 枯萎病侵染后棉苗叶和根茎组织中总可溶性POD、胞内POD和细胞间隙POD活性②SOD 超氧化物歧化酶（SOD）是植物细胞内防御酶系统的重要成员之一，它的生理作用是歧化O-2产生H2O2和O2，在植物与病原物互作过程中，植物体内SOD活性发生变化，不同的植物病害系统或不同的互作类型其SOD活性变化是不同的。植物受到病害侵染后，SOD活性会升高，说明病害的侵染产生的O-2会激发植株体内SOD合成酶基因的表达，表现为SOD活性上升。而感病品种的酶活性低于抗病品种可能是因为感病品种受到病原物侵染后积累的O-2过多造成受害植株SOD防御酶体系崩溃，导致SOD活性降低。至于接种后感病品种SOD活性快速上升而高于对照，可能是因为这种高水平的酶活性可以清除植物—病原物亲和性互作产生的超氧阴离子，使感病品种受到病原物侵染后不发生过敏性反应，病原物可以在寄主内扩展，从而表现为感病。在棉花上，吴小月等（1993）报道，超氧化物歧化酶在健株中均仅有3条酶带：P4、P7和P11。感病后，抗、感病品种增加的酶带数均较多，其中，抗病品种酶带数又多于感病品种。酶带P12在抗病品种中颜色较深，而在感病品种鄂荆1号中却难以见到（图3-6）。在棉花发病高峰期，不同抗病类型品种中，感病类型SOD活性最高，耐病品种次之，抗病类型表现最低。这说明SOD活性与品种在田间感病的程度存在着内在相关关系（表3-4）。对SOD活性与田间病指进行相关分析得出，相关系数r=0.9802。图3-6 不同抗病品种间病株和健株蕾期叶片SOD酶带抗病类型品种名称SOD活性[mg/（pro·min）]抗病中棉所1226.65石抗15524.17石30856.99石310423.79邯32212.77平均值18.87耐病冀8913535.13美861531.47美861639.16冀92.6134.66平均值35.11表3-4 不同抗病类型棉花品种（系）的SOD指标比较（李妙等，1995）抗病类型品种名称SOD活性[mg/（pro·min）]感病邯89s9347.43冀92.10363.22选148142.83选155148.35平均值50.46表3-4 不同抗病类型棉花品种（系）的SOD指标比较（李妙等，1995）（续）-1受病原物侵染后植物体内SOD等保护酶活性的变化在亲和性互作引起的感病反应中SOD酶活性升高，且与病害症状的表现有关，但在非亲和性互作引起的抗病反应中，SOD酶活性无明显变化甚至下降。宋凤鸣等（1999）研究结果指出，健康棉苗中，抗病品种和感病品种间SOD酶活性无明显差异，试验期间酶活性无显著变化；枯萎病菌接种后棉苗组织中SOD酶活性明显升高。感病品种6037在接种病菌后3天时SOD酶活性就显著高于对照，此后呈直线上升，而抗病中棉所12的SOD酶活性在接种病菌后7天才开始上升。雷江荣等（2010）报道，转SCN 1抗病基因中35品种接菌后，在病程早期SOD随时间的增长酶活性增高，与棉花枯萎病抗性呈正相关，抗病品种的酶活高于感病品种；SOD在接菌后第2～6天酶活性达到最高值，其酶活性高低以及达到峰值时间的迟早与棉花对枯萎病的抗性密切相关，活性高、峰值到来得早有利于抗病性的充分发挥。植物受病菌侵染后可选择性地刺激SOD同工酶活性的变化，如亲和性锈菌侵染后菜豆组织中Mn-SOD酶活性大幅度增加，而非亲和性锈菌侵染后Cu、Zn-SOD酶活性明显提高（Montalbin等，1986）。受TMV侵染的烟草叶片中SOD酶活性的增加主要来自于Cu，Zn-SOD（Buonario等，1987）。宋凤鸣等（1999）研究的结果证明，枯萎病菌侵染后棉苗组织中POD酶活性的升高主要是由Cu、Zn-SOD活性的增加引起的（表3-5，表3-6）。叶片组织根茎部组织SOD活性[U/（mg·min）]抑制率（%）SOD活性[U/（mg·min）]抑制率（%）酶粗提液75.4080.63KCN0.01mmol/L74.601.0079.431.490.10mmol/L60.6819.5271.9019.950.20mmol/L40.4840.3162.5022.490.50mmol/L15.3779.0242.1747.701.00mmol/L6.2891.0719.4675.87氯仿乙醇（1∶2）70.935.9067.3416.48表3-5 KCN和氯仿对棉花SOD活性的抑制[U/（mg·min）]品种处理叶片组织根茎部组织总SODCu，ZnSODMnSOD总SODCu，ZnSODMnSOD中棉所12（抗病）不接种35.1833.281.9020.0017.202.80接种39.7037.302.992.8322.835.006037（感病）不接种30.8834.272.3124.2220.903.45接种60.8956.674.2850.2743.656.95表3-6 枯萎病菌接种后7天棉苗组织中总SOD，Cu，Zn-SOD和Mn-SON活性③CAT 在多种植物—病原物互作系统中都有H2O2的积累。过氧化氢酶（CAT）是植物细胞内重要的活性氧清除剂，其生理作用是将H2O2还原为H2O和O2。CAT活性升高或H2O2含量降低意味着活性氧对植物细胞伤害程度的降低。还有研究表明，植物体内H2O2可作为扩散的信号或作为在水杨酸（SA）介导的系统获得性抗性（SAR）信号转导过程中的第二信使，诱导邻近细胞或邻近组织防卫机制的启动。因此，维持植物体内H2O2的正常水平将是植物抗病反应所必需的，CAT在活性氧的清除和维持活性氧的正常水平过程中起着重要作用。在植物与病原物互作中，CAT活性发生变化，并影响植株体内活性氧的积累，最终影响到植物的抗病反应。一般地，植物感染病原菌后CAT活性降低，或抗病品种（非亲和性互作）活性降低，而感病品种（亲和性互作）活性升高。在棉花上，宋凤鸣等（1999）报道，健康棉苗中，两个供试品种组织中CAT酶活性无明显差异；接种枯萎病菌后，棉苗组织中CAT酶活性显著增加，与抗病品种中棉所12相比，感病品种6037的CAT酶活性上升早而显著。雷江荣等（2010）的研究结果指出，采用农杆菌介导法将来自拟南芥的抗病基因SNC 1转入中35和军棉1号两品种后，在受到棉花枯萎病菌侵染后，CAT的酶活性变化非常平缓，并呈现逐渐下降的趋势。而对照（受体品种）中35和军棉1号的CAT酶活性变化十分显著，尤其是军棉1号，随接菌后取样天数的增加，CAT酶活性呈逐渐降低的趋势，由14.989 U/（mg·min）迅速下降到0.865U/（mg·min），这期间相差14倍（表3-7和图3-7）。图3-7 棉株叶片接菌后过氧化氢酶活性测定分析第0天第2天第4天第6天第8天转基因中351.167±0.0291.012±0.0250.868±0.0210.663±0.0160.415±0.010转基因军棉1号2.1217±0.0531.835±0.0451.061±0.0260.645±0.0160.407±0.010表3-7 棉株叶片接菌后过氧化氢酶活性测定分析第0天第2天第4天第6天第8天中35对照5.769±0.1444.086±0.1022.188±0.0541.597±0.0390.611±0.015军棉1号对照14.989±0.3749.504±0.2374.820±0.1201.946±0.0480.866±0.021表3-7 棉株叶片接菌后过氧化氢酶活性测定分析（续）-1（2）抗病反应次生代谢酶类植物次生代谢产物（Secondary Metabolites）是指植物体中一大类并非生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常具有种属、器官、组织和生长发育的特异性；抗生作用是植物次生代谢的一个重要生理功能，也可视为自然选择的结果，参与植物防御的次生物质很多，包括酚类、植保素、木质素和其他一些次生代谢物。与这些次生代谢有关的主要酶类是多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）。①PAL PAL是植物苯丙烷类次生代谢途径总路第一步关键酶，是苯丙烷类代谢途径的关键酶和限速酶，它催化苯丙氨酸脱氨基后产生肉桂酸并最终转化为木质素，因此，它是与细胞内木质素生成和沉积有关的防御酶。当病菌入侵时，细胞受到刺激后启动PAL系统产生木质素并沉积在细胞壁周围，将病原物限制在一定的细胞范围内阻止其进一步扩散为害。自从1964年Minamiawkd和Uritain首次发现植物感病后PAL活性增强以来，陆续有许多研究证明植物受到不同病原体感染后PAL活性均有升高的现象。因为PAL活性的升高往往与植保素、木质素等抗性物质的产生和积累呈正相关。王敬之等（1982）提出，把PAL活性作为植物抗病的生理指标加以研究。在棉花上，冯洁等（1990）研究了棉花抗、感品种感染枯萎病后体内PAL的动态变化。结果表明，在根内，无论抗、感品种接菌后的PAL活性都始终高于未接菌的对照。抗病品种86-1、陕1155在接菌后24h，经病原菌的诱导出现一个酶活性峰，而感病品种在接菌后36h才出现PAL活性峰，比抗病品种晚12h。抗病品种的相对酶活值也明显高于感病品种，其幅度是感病品种的1.38～2倍（图3-8）。在叶片内，抗病品种在接种枯萎菌后分别于12h和24h出现了PAL活性峰（86-1在接种后36h又出现了一个相等的峰）。感病品种于接种后36h才出现PAL活性峰，晚于抗病品种（图3-9），并且相对酶活值也低于抗病品种。根与叶内的PAL活性加以比较，根内PAL活性显著高于叶内PAL活性，前者是后者的3～4倍，这可能是根与病原物的作用更直接的缘故。图3-8 抗、感品种接菌后根内PAL活性峰的相对酶活值图3-9 抗、感品种接菌后叶内PAL活动峰的相对酶活值袁章虎等（1995）报道，接种枯萎病菌后抗病品种的PAL活性迅速提高，并很快在24h到最高峰。而感病品种的PAL活性则相对上升较慢，在36h才达到最高峰。其峰值也比抗病品种低得多，前者最高峰值为5.68U/（g·h），而后者仅4.12 U/（g·h）。这说明品种的抗病性不仅与接种枯萎病菌后其PAL活性峰的高低有关，而且还与PAL活性上升的速度有关。转抗病基因SNC 1棉花中35和军棉1号酶活性均高于对照，在受病原菌感染后叶片内会立即产生反应，PAL活性开始迅速上升，接种后第4天时达到高峰，是此时对照的2倍。对照（受体品种）棉叶片内反应比较迟钝、缓慢，PAL酶活性初始时的变化很小，直到接种后6天才有所提高，且全过程变化幅度也较小（表3-8）。总之，棉株在受到枯萎菌侵害后能够在很短的时间内迅速提高PAL活性，从而合成较多的抗生性物质，抑制病菌在棉株体内的萌发和扩散，使棉株表现抗病性。反之，如果病菌顺利地在寄主体内萌发、定殖和扩散，就使棉株表现感病。[U/（g·h）]品种第0天第2天第2天第2天第2天转基因中353.485±0.0874.685±0.1176.007±0.1515.837±0.1454.835±0.120转基因军棉1号2.072±0.0513.887±0.0974.723±0.1184.091±0.1023.905±0.097中35（对照）2.838±0.0703.255±0.0813.885±0.0974.011±0.1003.778±0.094军棉1号（对照）1.928±0.0482.005±0.0502.394±0.0592.622±0.0642.210±0.055表3-8 棉株叶片接菌后苯丙氨酸解氨酶活性测定分析大量研究表明，多酚氧化酶（PPO）主要参与酚类氧化为醌以及木质素前体的聚合作用，与植物抗病密切相关。病原菌侵染能诱导植物体内PPO活性升高，促进酚类化合物在受侵染部位的合成和积累，大量的酚可由多酚氧化酶氧化成醌，醌类化合物能钝化病原物的呼吸酶，阻碍病原物的生长，醌的次生反应所产生的黑色素的痂可阻止感染的扩散；酚类化合物是细胞形成木质素的前体，可形成木质素，促进细胞壁和组织的木质化，以抵抗病原的侵染。在人工接种枯萎病菌后，感病品种PPO活性的初期受到一定的抑制。直到48～72h才超过对照，而抗病品种PPO活性从24h就明显增强并超过对照（袁章虎等，1995；宁凤鸣等，1997）。这说明抗病品种在受到病菌的侵害时，能迅速以高活性的PPO配合体内的免疫系统形成抗病反应。从而使枯萎病的发展受到抑制，相反，感病品种在受到病菌的侵害时，体内的PPO活性被病菌所抑制，不能产生抗病生理功能。在研究转抗病基因SNC 1棉接种枯萎病菌后酶活性变化时，雷江荣等（2010）发现，接种当天，不管是转基因还是非转基因棉（受体）PPO酶活性没有明显变化，只在接菌1天后，才有明显差异。从图3-10可以看出，转基因中35的PPO酶活性较对照中35的酶活性显著增高，并且在第4天接近峰值，由276.571U/（mg·min）迅速增加至1019.020U/（mg·min），是此时对照的2倍。转基因军棉1号的PPO酶活性比对照军棉1号（受体）略有增加，在第6天出现高峰，对照军棉1号PPO酶活性变化不明显。图3-10 棉株叶片接枯萎病菌后多酚氧化物酶活性测定分析从总体上看，抗病品种和感病品种在接种枯萎病菌后都相继出现不同程度的PPO活性高峰。其区别是抗病品种出现的早，峰值高，而感病品种出现的晚，峰值低，抗病品种的PPO活性不受病菌的抑制，而感病品种则在受侵染的初期受到一定的抑制。研究棉花感病后防御酶活性变化，有助于深入研究棉花抗病机理，为培育和筛选抗病品种提供理论基础。棉花的抗病生理生化机制很复杂，植物体内正常情况下保护酶系处于平衡状态下，而受病原物侵染后活性大大改变。这表明棉花体内保护酶系都是在与病原物的互作中，主要是经病原物诱导而起抗病作用的。因而，在病原物侵染初期测定保护酶活性的相对变化可以作为一个选育指标；而正常棉株酶活性的高低也可作为品种筛选的指标之一。故研究棉花抗感品种接种病原物前后几种酶系的活性变化，优化酶系统选择指标，建立综合选择指标体系，将会提高选择准确性，提高育种效率，同时也将推动与棉花对该病原物抗性有关的其他生理生化指标的研究。而且，可以将防御酶活性的检测作为棉花抗病性鉴定的一个辅助手段。在染病的植物中，糖不仅是植物各类代谢的基础，而且也可以作为病菌的营养。糖代谢能为蛋白质、脂肪、核酸及次生代谢提供碳骨架和能量来源。陈其煐等（1990）以采自河南、湖北、辽宁、江苏、新疆等棉区棉花枯萎菌对具抗枯萎病性的陆地棉品种86-1、陕1155，感病品种岱15、徐州142和鲁棉1号接菌，鉴定品种对枯萎病菌的抗病性及其与含糖量的关系。试验结果表明，含糖量愈高，感病愈重；含糖量愈低，抗病性愈强，其分界值还原糖含量约为样品干重的12%，水溶性总糖为样品干重的15%（表3-9）。棉花枯萎病是一种高糖病害。品种含糖量（%）（干重）抗、感枯萎病表现*还原糖水溶性糖病指反应型鲁棉一号15.12117.8535.07S（感）岱字棉1513.24917.2234.62S徐州14212.11015.2129.44S陕115512.01713.739.69R8618.95812.377.92R（抗）表3-9 不同棉品种苗期含糖水平与抗枯萎病性表现冯洁等（1991）报道，抗病品种（86-1、陕1155）和感病品种（岱字棉15、徐州142）接菌后，果糖、蔗糖含量均为上升趋势。接菌后抗、感病品种在葡萄糖、核糖含量上存在差异，前者接菌后葡萄糖、核糖含量明显上升，分别为26.8%～58.6%和11%～26.9%，后者则下降，分别为-40%～-27.6%和-57.9%～-22.2%（图3-11）。图3-11 棉花叶内糖分含量变化吴小月等（1993）和宋凤鸣等（1996）的研究结果也表明，感病品种棉苗体内的含糖量高于抗病品种（表3-10，表3-11）。品种泗棉2号岱红岱盐棉488618311中棉所12子叶0.4330.4040.3870.2970.2620.259蕾期叶片0.7580.7430.5750.6400.6130.515抗病性SSMRRRR表3-10 不同抗性的陆地棉品种间可溶性糖含量比较（吴小月等，1993）品种处理叶片中葡萄糖含量（mg/g鲜重）根茎部中葡萄糖含量（mg/g鲜重）总糖可溶性糖还原糖总糖可溶性糖还原糖中棉所12（抗病）不接种17.599.332.577.974.141.98接种25.5213.315.5718.5410.432.646037（感病）不接种16.2010.922.7710.004.452.44接种24.8214.827.1520.7110.344.07表3-11 棉苗组织中糖含量的变化（宋凤鸣等，1996）受病原物侵染后，植物体内可溶性酚类物质会大量积累，大量的酚类物质通过延缓入侵病原物的生长而在植物抗病性中起作用。细胞壁上存在大量的酚类物质，这些不溶性胞壁结合酚及细胞壁的快速木质化与植物抗病性有密切关系。棉花体内含有丰富的酚类（主要是多元酚）物质，随着棉苗生长其酚类物质含量增加，同时，可提高对病害的抗性。多酚类物质在棉花抗病性具有重要的作用。刘发敏等（1993）报道，在不接枯萎病菌的条件下，棉花中多酚类含量是感病品种高于抗病品种，但抗、感病品种的多酚类含量都是随着生育期进程由低到高。抗病品种86-1在1叶期为1.41%，开花期为2.99%；感病品种鲁棉1号在1叶期为3.25%，开花期为4.02%。鲁棉1号在各生育期均高于86-1。但在接枯萎病菌的条件下，86-1多酚类含量几乎是直线上升，1叶期为1.62%，开花期为4.38%，开花期为1叶期的2.7倍。鲁棉1号相反，多酚类含量从1～3叶期下降较大，以后下降减缓。1叶期为3.65%，开花期为2.91%，开花期仅为1叶期的4/5。86-1和鲁棉1号相比，从5叶期开始，86-1高于鲁棉1号，到开花期为鲁棉1号的1.5倍。袁章虎等（1995）指出，各品种无论是抗病的还是感病的，接种枯萎菌后体内多酚的含量都有明显提高。抗、感病品种主要差异有以下两点：一是抗病品种多酚的累积高峰出现的早；二是抗病品种在接菌后多酚增加的灵敏量比感病品种高许多。这表明品种所固有的组成性多酚含量是品种间的差异，在一定范围内与抗病性没有关系，而棉株遭受枯萎萎菌侵染后所合成的多酚类物质才是抗病性增强的根本所在。病原物侵染后，植物体内常有大量酚类物质的积累，这些酚类物质主要由苯丙烷类代谢途径合成，其中，绿原酸和阿魏酸是主要的酚类物质。作为苯丙烷类代谢途径的主要产物，在受病菌侵染或诱发物处理后，植物体内绿原酸和阿魏酸的积累是一种常见的现象。在一些植物的抗病反应中绿原酸含量增加快，发生早，而感病反应中则相反。在绿原酸方面，冯洁等（1990）试验结果表明，不同抗病类型品种接种后绿原酸含量存在差异。抗病品种中棉所12、86-1在接菌后24h绿原酸含量迅速上升，最高含量0.47～0.51mg/g干重，48h后又迅速下降，以后又有所回升。感病品种岱字棉15、豫棉1号在接菌初期（24～72h）绿原酸含量始终低于未接菌的对照，直到96h才迅速增加，最大含量为0.49～0.55mg/g干重。在接菌初期感病品种体内酚类植保素积累很慢，到后期含量虽然超过了抗病品种，但已错过了杀伤病菌的时机。抗病品种则不然，在接菌初期绿原酸含量就迅速积累，对病菌的侵入起到阻止和杀伤作用。可见接种枯萎菌后，抗、感品种都可以产生酚类植保素——绿原酸，关键在于产生的量和速度不同。宋凤鸣等（1996）的研究结果也表现了这种特点。Friend等（1973）研究表明，绿原酸可抑制某些病原菌的生长和产孢。阿魏酸虽然无直接的杀菌活性，但它是木质素的前体，其含量的增加可为木质素合成提供更多的底物，促进木质素的积累，导致细胞壁的木质化，从而在植物抗病性中起了间接作用。冯洁等（1990）研究结果表明，抗病品种中棉所12、86-1在接菌后48h均出现了一个阿魏酸增加峰，显著高于对照水平，最大量可达4.27～6.68mg/g干重，86-1在接菌后96h又出现一个增加峰，含量可达5.01mg/g干重。而感染病品种岱字棉15、豫棉1号在接菌后24～72h，阿魏酸含量始终低于未接菌的对照，直到96h才略高于对照，最大量为2.17～3.48mg/g干重。接菌后阿魏酸含量的变化与棉花抗枯萎病性呈正相关。宋凤鸣等（1996）报道，在不接种枯萎病菌条件下，抗、感品种棉苗体内阿魏酸含量明显差异，但接菌后，抗病品种棉苗体内阿魏酸含量的增加幅度更大（表3-12）。处理中棉所12（抗病品种）6037（感病品种）接种后7天接种后11天接种后15天接种后11天接种后15天不接枯萎病菌0.5820.5450.7520.5720.692接枯萎病菌1.3021.7592.1130.8031.201表3-12 棉苗根茎部组织中阿魏酸的含量（OD350/gDW-ml）由于病原真菌和细菌感染，在受损害的植物细胞内或细胞周围高浓度地积累植保素，这些小分子化合物许多是黄酮类化合物。黄酮类化合物以糖苷的形式广泛分布在植物界。它们的合成和转化可能彼此独立地加以调节。刘发敏等（1993）指出，在不接枯萎病菌的条件下，抗、感病品种黄酮类含量随着生育期进程变化较大。抗病品种86-1每克干重在一叶期为10.5473mg，三叶期是高峰为14.0084mg，开花期为9.3064mg；感病品种鲁棉1号每克干重在一叶期为9.3272mg，现蕾期为高峰是12.5100mg，开花期为11.6401mg，86-1在1～3叶期高于鲁棉1号，其余各期都低于鲁棉1号。在接菌的条件下，86-1黄酮类含量每克干重在一叶期为10.7138mg，到五叶期降到最低点为7.2778mg，然后急剧上升，开花期为12.2706mg，曲线呈现“V”字形。鲁棉1号黄酮类含量每克干重在一叶期为9.8407mg，三叶期达到高峰为11.5603mg，现蕾期为10.2887mg，开花期为10.446mg，变化较平缓，曲线略呈“S”形。86-1和鲁棉1号相比，在三叶期和五叶期86-1黄酮类含量低于鲁棉1号外，其余各生育期都高于鲁棉1号（图3-12）。宋凤鸣等（1996）也报道了类似的研究结果。接种枯萎病菌的抗病品种棉苗叶片和根茎部组织中黄酮类物质含量略高于感病品种，枯萎病病菌侵染后，棉苗组织中黄酮类物质含量明显提高，抗病品种棉苗组织中黄酮类物质含量的增加幅度略大（表3-13）。品种处理叶片组织根茎部组织中棉所12号（抗病）不接枯萎病2.041.212.12接枯萎病3.622.643.546037（感病）不接枯萎病1.691.091.68接枯萎病3.031.802.70表3-13 棉苗组织中黄酮类物质的含量（OD509/g·ml min）图3-12 棉花不同生育时期黄酮类含量的变化植物细胞壁上存在着众多的酚类物质。在一些植物病害系统中已经证实植物受侵后组织中不溶性胞壁结合酚类物质在其对抗病性中起重要作用。Glazener等（1982）认为不溶性胞壁结合的简单酚类物质可能参与植物的某些防卫反应过程，且与抗病性有关。Nieman等（1991）和Bonello等（1993）报道，胞壁结合的复杂酚聚合物主要是木质素，其含量的增加，表明细胞壁的木质化，因而在植物抗病性中起到作用。宋凤鸣等（1997，2001）研究结果表明：①抗病品种棉苗组织中胞壁结合的简单酚、酚聚合物及黄酮醇含量高于感病品种棉苗组织中的含量。根茎部组织中胞壁结合酚含量相对较高；②枯萎病菌侵染后棉苗组织中不溶性胞壁结合酚含量有明显的提高（表3-14）。因此认为，受枯萎病菌侵染后棉苗组织中可溶性酚及不溶性胞壁结合酚的积累与棉苗对枯萎病的抗性有关。品种处理叶片组织根茎部组织简单酚复杂酚聚合物黄酮醇简单酚复杂酚聚合物黄酮醇中棉所12号（抗病）不接枯萎病菌0.1900.1132.890.3150.2384.72接枯萎病菌0.3640.1964.810.5610.4357.506037（感病）不接枯萎病菌0.1570.0882.610.2990.1984.20接枯萎病菌0.2440.1443.530.4290.3386.31表3-14 棉苗接种后11天时单位干细胞壁组织[m（DW）]中不溶性胞壁结合酚类物质的含量儿茶素（Catechin）是棉花植株中最主要的多元酚（Howell等1976），随着棉苗生长，组织中儿茶素的含量增加，同时也提高对立枯病的抗性（Hunter等，1974）。在离体条件下，儿茶素可抑制立枯病菌（Rhizoctonia solani）和黄萎病菌（Verticillium dahilae）的菌丝生长及黄萎病菌的产孢（Howell等，1976；Hunter等，1974）；而且儿茶素或其氧化产物可使立枯病菌的多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）失活（Hunter等，1974，1978）。因此，Hunter认为儿茶素可通过抑制真菌生长和PC活性而在棉花抗病性中起重要作用。宋凤鸣等（1996，1998）就儿茶素对棉枯萎病菌的影响以及在棉花抗枯萎病中的作用进行了研究。研究结果指出，抗病品种棉苗组织中儿茶素的含量较高，受侵后其含量明显增加，而感病品种棉苗受侵后儿茶素仅有少量增加（表3-15）；纯培养条件下儿茶素对枯萎病菌菌丝生长、产孢及孢子萌发具有明显的抑制作用（表3-16）；棉苗组织中酚类物质对PG和PL活性有抑制作用，而且证明这种抑制作用主要是由儿茶素引起的（表3-17，表3-18），其抑制作用的强弱与棉苗组织中的儿茶素含量呈显著的正相关。总之，儿茶素通过对病菌生长、产孢和其胞壁降解酶（如PG、PL等）的抑制而阻止病菌在棉花体内的侵入、繁殖和扩展，从而提高棉花对枯萎病菌侵入和扩展能力，由此在棉花抗病性中起作用。品种处理叶片组织根茎部组织中棉所12号（抗病）不接枯萎病菌0.5170.582接枯萎病菌1.4521.172不接枯萎病菌0.6790.706接枯萎病菌1.7681.6056037（感病）不接枯萎病菌0.4050.528接枯萎病菌0.8520.771表3-15 棉苗组织中儿茶素的含量（mg/g 鲜重）儿茶素浓度（mg/ml）菌落直径（cm）菌丝干重（mg）C+S（1）C+NaPP（2）C+SC+NaPP产孢量（%）（×107/ml）孢子萌发（%）0.14.073.47307220757.995.350.053.703.17273199646.790.380.103.773.37257197584.477.680.503.432.67210177553.267.371.002.371.3711384130.551.802.001.120.7797611.433.58EC501.341.121.151.180.791.36表3-16 离体条件下儿茶素对棉花枯萎病菌的影响品种处理对PG的抑制作用*（%）对PL的抑制作用（%）叶片组织根茎部组织叶片组织根茎部组织中棉所12不接枯萎病菌30.3423.0819.5518.91接枯萎病菌54.1855.3451.7548.62不接枯萎病菌24.3819.2016.0712.77接枯萎病菌42.7645.3835.4543.57表3-17 棉苗组织提取液中酚类物质对多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶活性的抑制作用处理PG活性PG（μgglucose/mgprot·h）PL活性PL（△OD550/mgprot·h）对照CK50%926.3091.0含儿茶素部分抽提液673.00（27.32%）*40.3（55.71%）其余部分抽提液874.00（5.62%）86.7（4.76%）表3-18 组织提取液经TLC后含儿茶素部分硅胶抽提液及其余部分硅胶抽提液对多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶活性的影响棉酚是棉花体内主要的酚类物质，在离体条件下，棉酚可抑制黄萎病菌和枯萎病菌某些专化型的菌丝生长和产孢（Bell，1967；Davis，1964），棉花受病原菌侵染后，其体内棉酚含量有明显的增加，因而推测，棉酚及单宁在棉花抗病性中起到作用（Bell，1967；魏守军等，1992；沈其益等，1992；Harrison等，1982）。魏守军等（1992）观察到在棉花受到枯萎菌侵染后，棉酚在棉株木质部和叶柄维管束导管细胞内大量累积（图3-13），并且抗病品种中棉所12和86-1中，染病后根系游离棉酚含量分别提高112%和96%；而感病品种冀棉11号和鄂荆92中，染病后根系游离棉酚含量只分别提高8%和4.8%。宋凤鸣等（1997）也观察到在未接种枯萎病菌的健康棉苗中，抗病品种的游离棉酚含量均显著高于感病品种相应组织中的含量，根茎组织内的含量又高于叶片；接种棉枯萎病菌引起发病并导致棉苗组织中游离棉酚含量明显提高，抗病品种增长显著高于感病品种。图3-13 棉株茎与叶柄横切片图棉花枯萎病是重要的土传病害，枯萎菌由根系直接侵入，根系细胞壁是它需要克服的第一道防线。蛋白质是病原菌赖以生存的重要营养来源，寄主植物细胞壁蛋白质含量十分丰富，一些蛋白质组分（如天冬氨酸、谷氨酸等）经过脱氨后的碳骨架可以直接进入病原菌的代谢系统，合成病菌所需要的蛋白质，因此，对寄主细胞内蛋白质组成成分的氨基酸进行研究的重要意义是显而易见的。冯洁等（1991，1994，1995）在这方面做了较系统的研究，取得了具有科学意义的研究结果。（1）棉花根、叶内的蛋白质含量在感染枯萎病菌后，叶内蛋白质含量，抗病品种接菌后36h以前的蛋白质含量都低于未接菌的对照，36h后则高于对照的水平，表现为先低后高；而感病品种则恰恰相反，出现先高后低的现象。在根内，抗病品种接菌后24h始终保持低于对照品种中蛋白质的水平，直到36h后才有所上升。而感病品种接菌后蛋白质浓度均高于对照。另外，达到高峰时的蛋白质含量感病品种高于抗病品种。（2）棉花细胞壁氨基酸含量用不同致病力的棉花枯萎病菌7号和3号小种接种棉花，对抗、感品种根部细胞壁氨基酸含量进行分析。结果表明，感病品种在接种7号小种后，根内细胞壁氨基酸含量增加了32.3%，抗病品种增加了4.4%；接种3号小种后抗病品种氨基酸含量下降了14%，感病品种上升了19.8%（图3-14）。感病品种受枯萎菌诱导后细胞壁氨基酸的积累明显高于抗病品种，为枯萎病菌的生长提供了较多的氮源，易与枯萎菌建立寄生关系，这表明细胞壁氨基酸含量与棉花对枯萎病的抗性具有一定的相关性。（3）棉花细胞壁富含羟脯氨基酸糖蛋白含量脯氨酸是一种非常重要的氨基酸，它经过羟化形成的羟基脯氨酸，是细胞壁伸展蛋白的原料。有些研究结果表明，细胞壁富含羟脯氨酸糖蛋白的积累与植物抗病性关系密切（Mayad，1986；Benhamou，1990）。冯洁等（1995）研究结果表明，不同品种间细胞壁富含羟脯氨酸糖蛋白（HRGP）的积累量存在差异，抗病品种细胞壁内HRGP含量明显高于感病品种。棉花叶内的HYP（羟脯氨酸）含量与其他氨基酸相比含量最低，只占总量的1.0%～1.2%。根内细胞壁HYP与其他氨基酸相比含量最高，占氨基酸总量的19.1%～19.6%，是其他氨基酸的2～10倍。根内HYP含量大约是叶内的10倍，这可能是由于根与病原菌直接接触，长期作用进化的结果。根内HYP的高含量对棉花自身抵抗病菌侵染有利。在棉花细胞壁HRGP含量增加及细胞壁木质素沉积与抗枯萎病性的关系上，接种枯萎病菌后根、叶内细胞壁木质素沉积与HYP含量变化规律相似，抗病品种86-1接种7号、3号小种后，细胞壁木质素的累积量均高于感病品种邯14，枯萎菌7号小种诱导后细胞壁的木质化程度比接种3号小种要高（表3-19）。可见，HRGP含量及细胞壁木质化程度与棉花抗枯萎病性呈正相关。图3-14 接种枯萎病菌对棉花根内细胞壁氨基酸含量的影响处理861（抗病）邯14（感病）根叶根叶木质素增长率（%）木质素增长率（%）木质素增长率（%）木质素增长率（%）健株2.882.402.802.477号小种3.5623.62.6811.73.2415.72.673.13号小种3.2613.22.566.73.079.62.553.2表3-19 不同处理对细胞壁木质素沉积的影响至于HRGP在抗病反应中的作用机制主有以下3方面（宋凤鸣，1992）。（1）作为凝集素的作用许多植物凝集素是糖蛋白，其中，有一些就是HRGP。这种具凝集活性的HRGP定位于能与病原菌相互作用的位点，HRGP可能与病原菌相互作用并把病原菌固定在细胞壁中，从而阻止病原菌的侵入或在细胞间的扩散。HRGP还在寄主—病原菌相互作用的专化性识别机制中起到重要作用。（2）作为木质素的沉积位点寄主与病原菌相互作用中，细胞壁在病原菌侵染后的木质化是寄主抗病反应的特性之一。木质素的形成与苯丙氨酸代谢形成的松柏醇有关，松柏醇的脱氢多聚物（DHP）与HRGP结合形成一种对酸稳定的复合物。在初生壁的木质化过程中，由松柏醇产生的甲基化醌与HRGP之间形成共价交错连接，从而导致了木质素在细胞壁中的沉积。（3）作为结构屏障的作用高等植物细胞壁中，HRGP填充在纤维素骨架的间隙中，又与细胞壁的其他成分共价结合形成更为致密、不可穿透的结构屏障。而且，HRGP具有结构性多聚物的功能，从而提高了细胞壁的强度。在侵染穿透过程中，病原物分泌的纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶等都能分解纤维素、半纤维素等细胞壁成分。但这些酶不能分辨HRGP，而且HRGP包围在纤维素和半纤维素的周围，从而把病原物分泌的酶与其底物分开，使纤维素和半纤维素等胞壁物质免受分解。继续保持细胞的正常结构，阻止病原物的侵入。但目前尚没有这方面的直接证据。病原菌的侵染可破坏寄主植物体内活性氧产生与清除之间的动态平衡，引起活性氧（主要是超氧阴离子O-2和过氧化氢H2O2）的积累，同时激活脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）基因的表达，LOX酶活性升高。活性氧和LOX酶通过非酶促和酶促方式直接攻击膜系统中的不饱和脂肪酸，启动膜脂过氧化的发生。活性氧的积累及膜脂过氧化的发生直接与植物的过敏性抗病反应有关，因而被认为是植物抗病防卫反应的组成部分之一。活性氧及膜脂过氧化的产物在植物抗病防卫反应中起的主要作用是：①对入侵病菌的抑制；②诱导植保素合成、细胞壁木质化及富含羟脯氨酸糖蛋白的沉积；③与信号传递有关并激活植物防卫反应相关基因的表达。宋凤鸣等（2001）研究结果表明，未接种枯萎病菌的健康棉苗中，抗病品种中棉所12棉苗的活性氧水平略高于感病品种6037，接种病菌后，棉苗叶片和根茎组织的活性氧水平显著升高，中棉所12的活性氧积累早，积累水平高于6037（表3-20）。健康棉苗的茎与根组织中LOX酶活性，在抗与感病品种间无明显差异，接种枯萎病菌后，2个供试品种棉苗组织中LOX酶活性有明显的升高，但表现不同的变化动态。抗病品种中棉所12接种后茎与根组织中，LOX酶活性快速增加，在接种后5～8天达最高，之后缓慢下降。感病品种6037棉苗接种后茎与根组织中，LOX酶活性增加缓慢，8天后才有较大幅度的增加，而后逐步下降。处理O-2产生速率（μmolO-2/t（gFW·min）H2O2积累（μmolH2O2/gFW）3天7天3天7天中棉所12（抗病）不接枯萎病菌0.320±0.0050.381±0.037103.9±4.486.3±8.8接枯萎病菌0.922±0.0351.086±0.066163.0±3.5159.6±4.56037（感病）不接枯萎病菌0188±0.0010.253±0.00661.5±7.852.9±4.6接枯萎病菌0.336±0.0180.725±0.00685.6±3.1127.5±5.3表3-20 枯萎病菌接种后棉苗茎与根组织中活性氧的积累丙二醛（MDA）是膜脂过氧化产物，未接种枯萎病菌的健康棉苗的茎与根组织中，MDA含量在抗与感病品种间无显著差异，但枯萎病菌接种后，棉苗组织中MDA的含量有明显的增加，抗病品种中棉所12棉苗MDA的含量在接种后3天就明显增加，此后直线上升，而感病品种6037棉苗中MDA的含量在接种后7才开始积累，增加速度相对较慢。接种枯萎病菌后，抗病品种棉株体内膜系统中，不饱和脂肪酸含量下降明显，而感病品种无显著变化。膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）含量上升，膜系统中，不饱和脂肪酸含量下降，表明有膜脂过氧化的发生（宋凤鸣等，2001）。上述这些结果说明，枯萎病菌侵染后棉苗体内活性氧的积累、LOX酶活性的上升以及由此引起的腆脂过氧化，可能在棉苗对枯萎病的抗性中起作用。棉株感枯萎病后显示的病症是由于一系列不正常的生化和生理活动的结果。脂肪酸是细胞质膜的主要组织成分，具有极重要的生物功能，棉花叶片中的脂肪酸主要由两种饱和脂肪酸和3种不饱和脂肪酸所组成。感染枯萎病棉株叶片中亚麻酸含量下降，而油酸和亚油酸含量增加，总的来看是不饱和成分降低，这说明叶片膜脂中脂肪酸的组成分发生了变化、加之其他生理代谢的影响，导致病株呈现皱缩（宋晓轩等，1992）。郭金城等（1990）测定结果指出，子叶中油酸和亚麻酸含量与品种的抗枯萎病性有一定的相关性。品种的抗病性越强，其子叶中油酸含量越高。高抗枯萎病品种52-128子叶中油酸含量比感病品种鄂沙28高16.99%，表明品种的抗病性与子叶中油酸含量呈正相关；而子叶中亚麻酸含量与品种抗病性呈负相关趋势，子叶中亚麻酸含量越低，其品种的抗病性越强。高抗枯萎病品种52-128子叶中亚麻酸的含量比感病鄂沙28低10.55%。枯萎病对棉株光合作用和呼吸作用有明显的影响。丁钟荣等（1988）测定结果表明，无论感病品种还是抗病品种，感病植株的光合作用均显著降低。感病品种的光合强度降低了37.2%，总光合强度降低30.5%；抗病品种的光合强度降低28.5%，总光合强度降低21.3%。说明感病植株生长矮化和产量降低都与光合下降有关。净光合速率表明叶片吸收固定二氧化碳的能力，受叶龄影响较大，反映在主茎叶上即是受不同叶位的影响。健株叶片的净光合速率最大值均出现在第五叶位叶片，而病株叶片则无此规律，这是由于其各叶位叶片发病程度和发病时间的不同所致。相同叶位的主茎叶片的净光合速率，病株均明显低于健株。病株叶片的净光合速率平均比健叶下降了58.7%～62.8%。这表明，病叶的同化二氧化碳能力大为降低。棉株感病后呼吸强度均明显下降，抗病品种下降更甚。抗病品种的病株呼吸强度比健株下降23.7%，而感病品种的病株只比健株下降13.1%。气孔是二氧化碳和水气进出叶片的通道，气孔导度表明气体通过气孔传导的能力，直接影响着气体交换的进程。棉花感染了枯萎病后，各主茎叶位叶片的气孔导度明显降低，病叶的气孔导度分别比健叶的平均降低了64.4%～88.7%。因此，影响叶片水气的交换能力，使蒸腾速率下降，病叶的蒸腾速率分别比健叶减少46.7%～68.2%（宋晓轩等，1992）。丁钟荣等（1988）报道，感枯萎病植株的叶片蒸腾强度、叶水势和细胞汁浓度分别比健株下降22.48%～30.91%、14.75%～11.81%和13.43%～18.11%，而下降幅度蒸腾强度和细胞汁浓度抗病品种明显高于感病品种，叶水势，则反之。Nain （1985）报道，棉株感染枯萎病后，蒸腾作用的强度发生变化，并受到抑制。对离体叶片的蒸腾作用进行测定发现，充分展现症状的叶片其蒸腾强度要比健康叶片低1/2～2/3；同时，叶片中的水分含量也低约1/2。温度是维持正常新陈代谢的重要因素之一。宋晓轩等（1992）测定结果表明，感染枯萎病后，各节位主茎病叶叶片的叶温均高于健叶，最多能高出5.5℃；健叶叶温比其周围环境的气温低2.51～3.13℃，叶温与气温温差较大，而病叶的叶温与气温温差较小，最多相差-1.29～1.24℃，负值说明叶温超过了气温，最高可超出2℃。这种差异与棉株发病程度有直接关系，对病叶外表健康的部分和发病部分的测量，坏死组织部分的温度要比绿色组织部分的温度高。在幼茎和幼铃上也表现了同一规律。在棉株体内糖、氮代谢方面，病株的硝态氮含量显著减少。感病品种硝态氮含量比健株减少1/2；抗病品种减少1/3。感病株可溶性蛋白质含量显著降低（图3-15）。可溶性糖含量感病植株比健株减少一半左右。同样，抗病品种比感病品种高出1/3以上（丁钟荣等，1988）。张海娜等（2011）报道，感病株体内可溶性糖含量高于正常株（图3-16）。表明抗病品种的营养积累要比感病品种优越得多。图3-15 可溶性蛋白质含量的变化（张海娜等，2011）图3-16 可溶性糖含量的变化（张海娜等，2011）已有的研究结果表明，根际微生物和棉际分泌物等生态因素与植物抗病性有密切关系。植物的分泌物主要包括糖、氨基酸、蛋白质、维生素、有机酸、无机离子等。这些分泌物中的某些物质能在抵御病菌侵入中起作用。显然植物的分泌物中存在着某些物质，由于它们的存在使植物体本身具有抗病的潜在活性，这是植物体自身防御作用的机理之一。冯洁等（1991）研究了棉花抗、感品种的病、健株根分泌物中氨基酸及糖分含量的变化及其对枯萎菌孢子萌发的影响。结果表明，抗病品种健株根分泌物中，含有7～8种氨基酸，总量分别为1.40nmol和1.33nmol。感病品种根分泌物中，含有1～4种氨基酸，总量分别为0.43nmol和1.02nmol。接种枯萎菌后，棉花抗、感品种根分泌物中，氨基酸种类均达到17种，抗病品种根分泌物中，氨基酸总量为152.40～160.30nmol。感病品种为216.10～239.98nmol。感病品种根分泌物中氨基酸总量明显高于抗病品种。丙氨酸（Ala）在氨基酸总量中所占的比例最大，其次是谷氨酸 （Glu）和缬氨酸（Val），三者之和在氨基酸总量中所占的比例抗病品种为60%～75%，感病品种为59%～64%。天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）是植物及病原物体内代谢的重要氮化物。感病品种接菌后根分泌物中，这两种氨基酸的含量比抗病品种高，这可能对病原菌利用它们构建体内其他重要化合物是有利的。枯萎菌孢子在抗病健株根分泌物中，萌发率在22.4%～26.3%，接近清水对照，没有刺激孢子萌发的作用，在感病健株根分泌物中，孢子萌发率在34.9%～57.7%，比对照高10.2～33个百分点，说明感病品种健株根分泌物可刺激孢子萌发。接枯萎病菌后，抗、感品种根分泌物均可刺激孢子萌发，萌发率在65.4%～72.0%，比对照高40.7%～47.3%。孢子在不同氨基酸溶液中萌发，在Gly.Ala、Ser、Ghl中，孢子萌发百分率最高（61.0%～74.5%），其次是Asp、Phe，Thr、Pro、Val、Cys萌发率在30.2%～58.4%，也具有刺激孢子萌发的作用，在Arg、Met、Leu中，萌发率接近清水对照（22.6%～27.7%），只有His具有抑制孢子萌发的作用（17.2%）。棉苗健株根分泌物中，总糖含量很低，用薄层层析法检测不到果糖和葡萄糖。接菌后总糖含量与健株相比有大幅度增加，并可检测到果糖和葡萄糖。抗病品种的果糖含量分别为23.70%～25.7%和2.69%～3.02%；而感病品种果糖和葡萄糖的含量分别为25.20%～25.60%和1.82%～1.92%。抗病品种的葡萄糖含量略高于感病品种（冯洁等，1991）。由于棉花根分泌物的成分非常复杂，其作用在土壤中又受其他诸多因素的影响，进一步研究这一问题，对探明枯萎病生态抗性机制是必要的。棉枯萎病菌主要存活于土壤并从根部侵入，根际则是病菌侵入根系的必然通道。而根际微生物是一个极其庞大的群体，其区系各成员对病菌的反应也各不相同，有些表现为抑制作用（包括营养竞争、拮抗、寄生、捕食等），有些表现为促进作用（包括促进萌发，促进生长，协助侵入等），有些则表现关系不大，根际微生物区系的组成不同，对病菌总的反应也就不同。因此，弄清根际微生物的区系组成（包括种类、种数、优势种等），对于抗病机制的研究及生物防治都具有十分重要的理论意义，对于开发土壤微生物资源也有较为重要的作用。李洪连等（1990、1991、1992）对棉花抗、感枯萎病品种根际微生物种类、数量及其抑菌作用进了研究。研究结果指出：①棉花抗、感枯萎病品种根际微生物数量存在着明显差异。抗病品种根际微生物数量显著多于感病品种，其中，又以根际真菌数量更为明显，两类品种之间的差异达到极显著水平，两类品种之内无明显的差异。在根际细菌数量方面，根际放线菌数量，均为抗病品种的数量多于感病品种。这个结果表明，棉花品种对枯萎病的抗性与根际微生物数量之间存在着密切的关系，抗性愈强，根际微生物群体数量愈大（表3-21）。②棉花抗、感枯萎病品种根际真菌区系组成十分复杂，且差异十分明显。抗、感病品种的各类真菌中，以青霉属（Penicillum）、曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）等种数较多。不同的棉花品种其根际真菌属数、种数、种类及优势种均不相同，每个品种都有自己独特的根际真菌区系组成。一般来说，抗病品种根际真菌种数较多，抗病品种86-1和豫棉7号分别共分离出19属35种和14属30种根际真菌，其根际真菌优势种多为曲霉（Aspergillusspp.）、青霉（Penicillumspp）、疣孢漆斑菌（Myrithecium verracaria），而感病品种冀棉7号和河南69分别共分离出14属30种和13属27种根际真菌，其优势种则为粉红粘帚霉（Gliocladium roseum）、双胞镰刀菌（Pusarium dimerum）、黑根霉（Rhizopus nigicans）等。播期品种生育期真菌平均值及差异比较放线菌平均值及差异比较细菌平均值及差异比较春播861（抗病）冀棉7号（抗病）河南69（感病）鲁棉1号（感病）2～3叶期11.886～7叶期28.34现蕾期13.152～3叶期12.566～7叶期23.95现蕾期13.002～3叶期6.036～7叶期6.99现蕾期6.362～3叶期7.496～7叶期5.36现蕾期5.6017.79aA16.50aA6.46bB6.15bB7.6323.3228.846.2813.4412.444.4913.3010.873.7910.367.9619.93aA10.72bB9.55bB7.37bB13.2719.39102.134.2312.8092.022.986.4656.936.0514.2759.2744.93aA36.36abAB22.12cB26.53bcB表3-21 棉花抗、感枯萎病品种根际微生物数量（106个/克土）播期品种生育期真菌平均值及差异比较放线菌平均值及差异比较细菌平均值及差异比较夏播861（抗病）冀棉7号（抗病）河南69（感病）鲁棉1号（感病）2～3叶期22.556～7叶期27.11现蕾期36.392～3叶期18.376～7叶期29.07现蕾期28.172～3叶期10.146～7叶期15.88现蕾期19.842～3叶期8.666～7叶期9.44现蕾期13.7328.68aA25.20aA15.59bB10.61bB13.6914.7016.508.7012.8912.034.146.065.624.944.624.4714.96aA11.21bB5.27cC4.68cC21.7478.45141.658.4751.5998.0612.1537.8590.936.4254.3993.0780.61aA52.71bB46.98bB51.29bB表3-21 棉花抗、感枯萎病品种根际微生物数量（106个/克土）（续）-1棉花抗、感枯萎病品种在相同条件下根际微生物种类和数量明显不同，其原因可能是由抗、感品种根系分泌物和脱落物的不同而导致的。如果根际内微生物数量较多，就会对枯萎病菌的侵入产生较大的抑制作用，使病菌难以侵入，从而使棉株表现为抗病。当然，这种影响除决定于根际微生物的数量外，还与微生物的种类及对枯萎病菌的抑菌作用强弱有关。综上所述，棉花枯萎病的抗病机制是一个非常复杂的问题，涉及的因素众多。如果强调某一方面的作用，难免有一定的局限性。抗病、耐病和感病品种不仅在受到病原物侵入前就存在差异，而且更重要的是染病后抗性与其产生抗性机制的速度和程度的差异。如果将有关联的作用有机地联系起来，开展综合研究，可能更有助于深入地认识棉花对枯萎病的抗病机制。

葡萄酸腐病由多种因子、多种病原引起或造成的。葡萄酸腐病近十年在我国逐渐成为重要的病害之一，很多人把酸腐病与炭疽病或白腐病相混淆，使用防治炭疽病或白腐病的药剂，不但没有防治效果，照样造成果实的腐烂，而且增加了成本，威胁食品安全(容易造成农药残留超标)。根据有关资料，并依据作者近8年的实际监测和试验，详细介绍葡萄酸腐病，为葡萄种植者正确防治提供参考，供同行商榷和批评指正。1999年，在山东省烟台市，作者首次在国内见到酸腐病，并开始收集资料。当时，由于对酸腐病比较陌生，没有足够重视。2000年，开始对葡萄酸腐病进行调查，发现酸腐病在我国的北京、河北、山东、河南、天津等地普遍发生，有些葡萄园损失非常大，达到80%。2004年有几个葡萄园全军覆没。我们对品种间的发病差异情况进行了调查，发现品种间对酸腐病的抗病性有较大差异。酸腐病是后期病害，基本上是果实成熟期的病害。为害最早的时期，是在封穗期之后。酸腐病的症状可以概括为以下几方面。有烂果，即发现有腐烂的果粒；套袋葡萄，如果在果袋的下方有一片深色湿润(习惯称为“尿袋”)，就表明该果穗上有酸腐病；有类似于粉红色的小蝇子(醋蝇，长4毫米左右)出现在烂果穗周围；有醋酸味；正在腐烂的果粒，在烂果内，可以见到灰白色的小蛆；果粒腐烂后，腐烂的汁液流出，会造成汁液经过的地方(果实、果梗、穗轴等)腐烂；果粒腐烂后干枯，干枯的果粒只是果实的果皮和种子(彩图10-1-1至彩图10-1-4)。果实腐烂、降低产量；果实腐烂造成汁液流失，造成无病果粒的含糖量降低；鲜食葡萄受害到一定程度，即使是无病果粒，也不能食用；酿酒葡萄受酸腐病为害后，汁液外流会造成霉菌滋生，干物质含量增高(受害果粒腐烂后，只留下果皮和种子并干枯)，使葡萄失去酿酒价值。首先是有伤口，机械伤(如冰雹、风、蜂、鸟等造成的伤口)或病害(如白粉病、裂果等)造成的伤口；第二是导致果穗周围和果穗内的高湿度；第三，醋蝇的存在。此外，树势弱会加重酸腐病的发生和为害。酸腐病是真菌、细菌和醋蝇联合为害。严格讲，酸腐并不是真正的一次性侵染病害，应属于二次侵染病害。首先是由于伤口的存在，从而成为真菌和细菌的存活和繁殖的初始因素，并且引诱醋蝇来产卵。醋蝇在爬行、产卵的过程中传播细菌。引起酸腐病的真菌是酵母菌。空气中酵母菌普遍存在，并且它的存在被看作对环境非常有益。所以，发生酸腐病的菌源之一“酵母菌”来源不是问题。引起酸腐病的另一病原菌是醋酸菌。酵母把糖转化为乙醇，醋酸细菌把乙醇氧化为乙酸；乙酸的气味引诱醋蝇，醋蝇、蛆在取食过程中接触细菌，在醋蝇和蛆的体内和体外都有细菌存在，从而成为病原细菌的携带者和传播者。醋蝇是酸腐病的传病介体。传播途径包括：外部(表皮)传播，即爬行、产卵过程中传播细菌；内部传播，病菌经过肠道后照样能成活，使醋蝇幼虫取食等活动，具有很强的传播病害的能力。醋蝇属于果蝇属昆虫，据报道，世界上有1000种醋蝇，其中法国有30种，是酸腐病的传播介体。一头雌蝇一天产20粒卵(每头可以产400～900粒卵)；一粒卵在24小时内就能孵化；蛆3天可以变成新一代成虫；由于繁殖速度快，醋蝇对杀虫剂产生抗性的能力非常强，一般一种农药连续使用12个月就会产生很强的抗药性。在我国，作为酸腐病介体醋蝇的种类及它们的生活史还不明确。从国外有关资料上看，首先有伤口，而后醋蝇在伤口处产卵并同时传播细菌，醋蝇卵孵化、幼虫取食同时造成腐烂，之后醋蝇指数性増长，引起病害的流行。品种间的发病差异比较大，说明品种对病害的抗性有明显的差异。美人指受害最为严重，其次为里扎马特、酿酒葡萄(如赤霞珠)、无核白(新疆)、白牛奶(张家口的怀来、涿鹿、宣化)等发生比较严重，红地球、龙眼、粉红亚都蜜等较抗病。不管品种如何，为害严重的果园，损失在30%～80%，甚至全军覆没。品种的混合栽植，尤其是不同成熟期的品种混合种植，能增加酸腐病的发生。据作者观测和分析：酸腐病是成熟期病害，早熟品种的成熟和发病，为晚熟品种醋蝇数量的积累和两种病原菌的菌势创造了条件，从而导致晚熟品种酸腐病的大发生。防治原则：以防病为主，病虫兼治。药剂的筛选原则：①同时能防治真菌、细菌。②能与杀虫剂混合使用。③因为酸腐病是后期病害，必须选择能保证食品安全的药剂。具体防治措施和方法如下。尽量避免在同一果园种植不同成熟期的品种；增加果园的通透性(合理密植、合理叶幕系数等)；合理使用或不使用激素类药物，避免果皮伤害和裂果；避免果穗过紧，造成果粒挤压破裂；合理施用肥料，尤其避免过量使用氮肥；合适的水分管理，避免水分的供应不平衡造成裂果等。早期防治白粉病等病害，减少病害裂果造成的伤口；幼果期使用安全性好的农药，避免果皮过紧或果皮伤害；防控鸟害对果实的伤害等。这些防治措施对酸腐病的防治有积极的意义。成熟期的药剂防治是防治酸腐病的最为重要途径。根据国外的资料和我们近几年的农药筛选，将80%水胆矾石膏WP和杀虫剂配合使用，是目前化学防治酸腐病的推荐办法。转色期前后使用1～3次80%水胆矾石膏WP，10～15天一次。80%水胆矾石膏WP使用400倍液，使用量一般为400～600克制剂/亩(如果注意重点喷洒穗部，200克/亩可以有效控制酸腐病)。杀虫剂的选择：选择低毒、低残留、分解快的杀虫剂，这种杀虫剂要能与水胆矾石膏混合使用，并且1种杀虫剂(化合物)只能使用1次。可以使用的杀虫剂有10%高效氯氰乳油(3000倍液)、50%辛硫磷(1000倍液)、80%或90%敌百虫1000倍液等。发现酸腐病要立即进行紧急处理：剪除病果粒，用80%水胆矾石膏WP 400倍液+10%高效氯氰2000倍液涮病果穗。对于套袋葡萄，处理果穗后套新袋，而后整体果园施用(立即喷)一次触杀性杀菌剂。美国加利福尼亚大学农学院1984年编写出版的《葡萄病虫害综合防治》一书中，就介绍了酸腐病(sour rot)，被划分到次生或二次侵染病害，属于穗部病害(bunch rot)。法国有关资料称酸腐病为acid rot，近十几年在法国已成为重要病虫害之一，如果防治不力，可造成30%～80%的损失。在我国，葡萄酸腐病有进一步发展的趋势，希望引起广大葡萄种植者高度重视。

苹果锈病在冀北地区历年来均属零星发生，但近2年来在部分果园突然开始大发生，其中，2007年部分果园发病株率达到100%、病叶率90%以上，苹果产量和质量急剧下降，经济效益损失接近100%。笔者于2007年对冀北地区苹果主产地的宽城、兴隆、承德等县的苹果园进行了系统调查，发现苹果锈病在该地区普遍发生，给当地苹果生产造成了较大损失。苹果锈病又名赤星病、羊胡子，有的地区俗称黄斑病、长毛病。该病可为害叶片、新梢、果实，叶片先出现橙黄色、油亮的小圆点，后扩展，中央色深，并长出许多小黑点（性孢子器），溢出透明液滴（性孢子液），此后液滴干燥，性孢子变黑，病部组织增厚、肿胀（也就是群众所称的叶子上长了黄疙瘩），病斑多呈纺锤形，以后叶背面或果实病斑四周，逐渐长出黄褐色丛毛状物（锈孢子器，即群众所称的长胡子、长毛毛），内含大量褐色粉末（锈孢子）；果实发病，多在萼洼附近出现橙黄色圆斑，直径10mm左右，后变褐色，病果生长停滞，病部坚硬，多呈畸形。苹果锈病病原菌（Gymnosporangium yamadai Mouabe）称山田胶锈菌或苹果东方胶锈菌，属担子菌亚门真菌。该菌是转主寄生菌，在苹果、梨树上形成性孢子和冬孢子，在桧柏上形成冬孢子，以后萌发产生担孢子[1]。转主寄主主要是桧柏，其次是括高塔柏、新疆圆柏、欧洲刺柏、翠柏、龙柏等[2]。该病每年只侵染1次，病菌以菌丝体在桧柏类植物上越冬，翌年春天在桧柏上形成冬孢子角，冬孢子角内的胶状物质遇雨吸水膨胀，其中的冬孢子产生大量的担孢子。担孢子不能侵染桧柏，而是随气流传到苹果树上，致使苹果树发病，开始在叶片正面出现性孢子器，以后在叶背面出现锈孢子器，产生的锈孢子再随气流传到桧柏上为害、越冬，从而完成一个侵染循环。从苹果锈病的侵染循环可以看出，如果没有桧柏类植物，苹果锈病就不能完成侵染循环，也就不能发生。据有关资料[3]介绍，桧柏类植物上的担孢子传播距离一般为2.5～5km，最远50 km。因此，苹果锈病的发生与否或发生轻重主要决定于周围5 km有无桧柏等转主寄主的存在。该病作为初侵染源的冬孢子角的萌发和冬孢子、锈孢子的侵染都需要适当降雨和相对湿度大于90%的条件。因此，该病的发生轻重和早晚与春季降雨早晚和雨量大小关系密切，降雨早则发病早，雨量大则发病重。据笔者调查，在冀北地区，一般春季4月下旬至5月上中旬降雨量达到15mm以上时，桧柏类植物上的菌瘿开始迅速吸水膨大，形成花瓣状的冬孢子角，冬孢子随即萌发形成担孢子，随气流传播至苹果树染病，一般从5月下旬叶片正面开始出现病斑，6月上旬大量发病，至8月份叶背面开始出现锈孢子器。冀北地区农村历来有翠柏栽植，但一般都长在较偏僻的陡峭山上，距离苹果园较远，而桧柏只是在城镇有少量栽植，即使偶尔有苹果锈病的担孢子飞散传播，数量也相当少。因此，该地区苹果锈病历年均零星发生或不发生，果农对该病也比较陌生。近3年来，各地大搞文明生态村建设，为了绿化和美化农村环境，开始在农村的路边、房前屋后、群众休闲活动广场等地大量栽植桧柏类植物，这些地点一般距离苹果园较近，给苹果锈病完成侵染循环提供了充分的条件，致使这些地区苹果锈病在2007年偏重发生或大发生。据笔者对冀北地区6个距离桧柏不同远近的果园调查，凡是附近栽植桧柏的果园，苹果锈病就发生重，反之则发生轻。一般建在路边距离桧柏近的果园，苹果锈病发生重，建在山坡上距离桧柏相对较远的果园则发生轻，而发生程度与距离桧柏远近呈明显的正相关。从表1可以看出，与桧柏距离50m以内的苹果树，全部感染苹果锈病，病叶达到90%以上，每个病叶上平均有病斑3.7个；与桧柏距离80～120m的苹果树，全部感染苹果锈病，病叶率略有下降，但仍达到70%左右，每个病叶上平均有病斑2.3个；与桧柏距离180～230m的苹果树，全部感染苹果锈病，病叶率为20%左右，每个病叶上平均有病斑1.6个；与桧柏距离500～630m的苹果树，病株率为58.5%，病叶率10%左右，每个病叶上平均有病斑1.15个；与桧柏距离2100～2250m的苹果树，感染率为20%左右，病叶率仅为1.2%，每个病叶上仅有1个病斑；与桧柏距离5100～5200m的苹果树，感染率急剧下降，仅为4.5%，病叶率仅为0.2%，每个病叶上仅有1个病斑。与桧柏距离（m）50以内80～120180～230500～6302100～22505100～5200病株率（%）100.0100.0100.058.519.64.5病叶率（%）91.571.622.610.51.20.2平均百叶病斑数336.2166.736.512.11.20.2表1 苹果锈病的发生程度与距离桧柏的远近关系调查表（2007年6月14日，河北宽城）苹果锈病虽然不是冀北地区果园新发病害，但是由于其具有需转主寄主才能完成侵染循环的特性，发生极少，不如腐烂病、斑点落叶病、轮纹病等常发病害那样清楚，绝大多数果农根本不认识，因此预防意识淡薄，盲目引进了桧柏类植物，而在春季又没有对其进行防范措施，导致了该病的重发生。切断苹果锈病的侵染循环是防治该病最有效的手段，新建果园时，应当远离桧柏、翠柏、龙柏类植物5km以上，对于5km之内已有桧柏等植物的，有条件的建议彻底清除。对于彻底清除5km之内桧柏等植物有难度的果园，必须采取综合措施控制冬孢子萌发。第一，可以在早春苹果萌芽前，剪除桧柏类植物上的菌瘿并集中烧毁或喷药抑制冬孢子萌发；第二，可以喷药清除菌源。应根据天气情况，在苹果萌芽期至幼果拇指大小时，尤其是4月下旬至5月上中旬遇有15mm以上且持续时间较长的降雨时，必须及时在桧柏类植物上及时喷洒波美3度的石硫合剂或三唑酮等药剂，清除越冬病菌；第三，苹果锈病发生重的果园，还应在秋季喷药保护桧柏类植物，防治锈病侵染。对于附近有桧柏类植物的果园，除了清除转主寄主的菌源以外，还应对果树进行树上喷药保护，一般在苹果花芽露红和落花后各施一次药，发病严重的还应在落花后10～15天施第三次药。常用的药剂有：15%三唑酮可湿性粉剂1500～2000倍液、12%烯唑醇可湿性粉剂2000～2500倍液、43%戊唑醇（好力克）悬浮剂3000～4000倍液、25%戊唑醇（富力库）水乳剂1000～2000倍液、25%丙环唑（敌力脱）乳油1000～4000倍液、40%氟硅唑（杜邦福星）乳油8000倍液等。苹果锈病的担孢子可飞散传播5km以上，但由于冀北地区属山区，自然屏障较多，因此，以200m以内传染为害较重，如菌量充足，可使该范围内绝大多数苹果树发病，对产量影响极大，200～500m之间发生程度中等；距离转主寄主5km以上的苹果树虽然也可以发病，但发病率较低，对产量一般不会造成严重损失。切断侵染循环是防治苹果锈病的根本所在，而喷施药剂是防治该病的重要措施。

木霉菌（Trichoderma spp.）广泛存在于土壤及其他基物中，作为生防菌以其生长速度快，产孢量大、作用谱广、作用机制多样、能在植株、土壤中增殖并形成有效群体等诸多优势而备受关注。我们针对蔬菜上常见病害，从土壤中分离、筛选获得对蔬菜病原菌具有较强抑菌活性的绿色木霉菌株Tr9701，通过对其产几丁质酶活性等对其抗病机理进行了初探，同时试验了其在黄瓜叶片、根部的定殖能力，为今后开发可替代某些化学农药的微生物杀菌剂做了基础性工作，现将初步研究结果记述如下。1.1.1 供试菌株 绿色木霉Tr9701（Trichderma viride），由天津市植物保护研究所生防室筛选、鉴定。供试病原菌立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、番茄灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea），由天津市植物保护研究所病害室分离、鉴定。1.2.1 绿色木霉菌制剂几丁质酶检测据Harman等的方法[1]，在胶体几丁质培养基中培养绿色木霉菌，进行产几丁质酶预试验，然后将绿色木霉菌分生孢子液接种到合成诱导液体培养基中诱发几丁质酶产生，以不加胶体几丁质为阳性对照，在28℃，150r/min振荡培养，连续提取培养液制备几丁质酶粗提液。检测采用还原糖法[2]处理，在试管中加入几丁质酶粗提液、10g/L胶态几丁质各1ml，37℃恒温水浴30min，加入DNS10ml，混匀后沸水浴10min，用水冷却至室温，观察颜色变化，以100℃高温灭活处理15min几丁质酶粗提液为对照，试验重复3次。1.2.2 绿色木霉几丁质酶粗提液对病菌的抑菌活性测定 将黄瓜立枯丝核菌、番茄灰葡萄孢霉菌菌丝块转移到平板上，每平皿接种4块，分布于4角，平皿中心放滤纸片并加入100μl几丁质酶粗提液或阳性对照液，重复3次，空白加入等量无菌水，定期观察抑菌圈大小。1.2.3 绿色木霉菌对立枯丝核菌重寄生作用的显微观察 将灭菌赛璐玢膜置于直径90mm的水琼脂培养皿上，在平板两侧各植入经活化培养的绿色木霉和立枯丝核菌菌丝块，25℃下对峙培养，待菌丝接触后置于光学显微镜下观察。1.2.4 绿色木霉菌在黄瓜叶片和根部的定殖 取菜田表层10cm深处土壤，混腐熟的猪粪和蛭石（按3：1：1比例），过筛后，用150倍甲醛液消毒，边喷边混，喷匀后堆起，盖塑料布闷5天，然后晾晒14天，待残药挥发后铺于苗床待用。同时将冰箱保存的绿色木霉菌活化，转接到小麦粉培养基上，在25℃温度下培养7天，培养基上长满菌丝和孢子后，在组织捣碎机中捣碎、过滤，配成绿色木霉菌孢子悬浮液（5×106个孢子/ml）备用。木霉菌叶面定殖：将培养制成的孢子悬浮液用消过毒的手持喷雾器喷雾，均匀喷至黄瓜叶面正反两面，直到叶面上均匀布满一层细微水珠而不流淌为止。喷雾后1h取第一次样，以后每隔一周取一次样，共4次。每次每处理取的叶片剪成0.5cm见方小片，称量取样叶片加入10倍无菌水中振荡（120r/分）15min。取稀释液0.1ml涂布于木霉选择性培养基上，25℃下培养3～4天，5皿重复，计菌落数。以第一次取样所检测到的菌量为接种量，菌量以cfu/g叶表示。木霉菌根际定殖：将培养制成的孢子悬浮液，均匀浇灌至黄瓜根部，直至黄瓜苗根部土壤全部浸润为止。浇灌后1h取第一次样（地下1～2cm处根围土壤），以后每隔3天取一次样，共4次。检查时，分别称取根围土壤1g，加入无菌水20ml中振荡（120rpm）15min。取稀释液0.1ml涂布于木霉选择性培养基上，25℃下培养3～4天，5皿重复，计菌落数。以第一次取样所检测到的菌量为接种量，菌量以cfu/g叶表示。通过预试验，绿色木霉菌Tr9701在胶体几丁质培养基上生长可以形成显著几丁质酶解透明圈，因此进行了绿色木霉菌几丁质酶的诱导试验。诱导条件下几丁质酶粗酶液加入DNS后变为深棕红色，与阳性对照相比有显著差异，说明绿色木霉菌菌株产生几丁质酶，且经诱导处理的绿色木霉菌几丁质酶产生量明显提高，经检测，在培养第5d时达到最大值。绿色木霉菌Tr9701几丁质酶粗提液对立枯丝核菌、灰葡萄孢霉的抑菌活性在平皿接种后2天内，立枯丝核菌、灰葡萄孢霉菌丝生长迅速，但菌丝接近木霉几丁质酶粗提液接种点周围时，生长缓慢，最后停止，从而形成明显抑菌圈。空白对照无抑菌圈，立枯丝核菌菌丝长满平皿，灰葡萄孢霉菌丝长满平皿并形成大量菌核。试验表明，绿色木霉Tr9701的几丁质酶粗提液对立枯丝核菌、灰葡萄孢霉的抑菌圈直径分别为28mm和15mm，比阳性对照的抑菌圈直径大，其差异达到了显著水平。显微观察显示绿色木霉菌对立枯丝核菌具有较强的寄生能力，绿色木霉菌丝与立枯丝核菌菌丝接触后并列生长或缠绕，有时以钩状结构入侵立枯丝核菌菌丝。在接触后期则观察到被寄生的立枯丝核菌菌丝断裂和消解的现象。2.4.1 绿色木霉菌在黄瓜叶面的定殖 绿色木霉菌在叶面上的定殖动态见表1。由结果可知，绿色木霉菌在叶面环境中由于各种条件的影响，第一周内的菌量比初始菌量降低。此后绿色木霉菌适应了叶面环境，菌量逐渐回升，第14天检测菌量为1.02×104cfu/g叶片。21天后菌量持续下降，尤其是第28天菌量降至0.12×104cfu/g叶片。镜检观察绿色木霉菌Tr9701在叶面喷雾后，主要定殖于叶面气孔周围、腺毛基部及叶面凹陷处。这些位点或是分泌物产生处，或是叶面水分分布较多处，能为绿色木霉菌的生长繁殖提供适宜的条件。同时，这些位点也是其他病原菌的竞争位点，通过绿色木霉菌的人工接种，相比病原菌具有种群数量大，出现早的特点。因此，绿色木霉菌对这些位点的抢先占领，不仅有利于本身的生存，而且使黄瓜叶面受到保护，免于病原菌的侵染。重复调查时间1h3天7天14天21天28天11.241.210.941.150.830.1820.960.950.810.920.660.0831.151.080.860.980.790.1441.371.400.951.030.720.10平均1.181.160.891.020.750.12表1 绿色木霉菌孢子在黄瓜叶片上定殖情况（孢子着生量×104个孢子/g）2.4.2 绿色木霉菌在黄瓜根际的定殖 绿色木霉菌在黄瓜根际土壤中定殖结果见表2。由结果可知，第一周内土壤的菌量比初始菌量降低，可能是在根际土壤环境中，由于各种因素的影响，木霉菌受到一定抑制，此后绿色木霉菌适应了土壤环境，菌量逐渐回升，第14天检测菌量为2.64×104cfu/g叶片。21天后菌量持续下降，尤其是第28天菌量降至0.68×104cfu/g叶片。在调查中发现，绿色木霉菌定殖黄瓜根部能力受水分含量和pH值影响明显，水分偏高或偏低都影响绿色木霉菌菌株在黄瓜根部的定殖，pH偏酸性条件下的定殖量明显高于偏碱性条件下的定殖。重复调查时间1h3天7天14天21天28天12.432.371.852.521.090.6422.692.592.032.731.240.7232.362.321.892.611.080.6542.842.561.942.701.110.71平均2.582.461.922.641.130.68表2 绿色木霉菌孢子在黄瓜根部定殖情况（孢子着生量×104个孢子/g）木霉菌腐生性强，适应性广，生长和繁殖快，可迅速利用营养和占据空间，是当前微生物菌剂控制病害的研究热点[3]。本试验结果表明，我们所筛选的绿色木霉菌Tr9701有较强的产几丁质酶活性，且经诱导处理酶产量明显提高，其酶粗提液经试验对立枯丝核菌、灰葡萄孢霉有显著抑制作用，通过诱导产生的木霉几丁质酶在对于抑制病原菌的生长具有重要意义。经显微观察发现，绿色木霉Tr9701对于立枯丝核菌是通过趋向生长、识别、接触缠绕和穿透，寄生于病原真菌之上，对立枯丝核菌具有较强的寄生能力。此现象证明，当绿色木霉菌遇到立枯丝核菌等病原菌时，受到刺激和诱导，产生溶菌酶，抑制立枯丝核菌等的生长，并可降解菌丝。生防菌在植物表面的定殖能力反映了生防菌在植物表面与病原菌竞争空间和营养的能力。本研究表明，绿色木霉菌可以在黄瓜叶面和根部定殖。据Darah（1991）报道，根圈微生物的分布与沿根的可溶性碳的分布距离有关，微生物量的积累有赖于根分泌物的释放，因此添加一定的营养可以促进绿色木霉Tr9701的定殖。本研究进一步证明，绿色木霉Tr9701产几丁质酶、寄生、定殖能力强，是较好的生防材料。当前由于生防微生物控制植物病害具无污染、价格低廉的优点，具有广阔的应用前景。因此对绿色木霉菌Tr9701的发酵工艺、田间应用范围等有待进一步研究。