杨树水泡溃疡病（Botryosphaeria dothidea）是为害杨树的重要病害，影响植株生长甚至导致死亡，近年来随着杨树栽植面积的快速增大，杨树水泡溃疡病发病益显严重。杨树水泡溃疡病（ Botryosphaeria dothidea）害标本由本实验室保存。分离材料取自山东省泰安市区和市郊绿化或用材杨树，将带杨树水泡溃疡病病斑的组织用常规稀释方法[1]，分离内生细菌。PE0704的菌体能够抑制杨树水泡溃疡病病菌的孢子萌发，并引起萌发孢子的芽管畸变、其菌丝畸形。

苹果是我国种植面积最大的水果，目前全国苹果种植面积达190万hm2以上，产量达2110万t，居世界前列[1]。近几年来，苹果腐烂病在我国尤其是冀北地区，连续多年中偏重到大发生，已成为对苹果生产影响最大的病害，严重制约着我国苹果产业的健康发展。苹果腐烂病又称串皮湿、臭皮病、烂皮病，是一种发生范围广、为害程度重、损失极大的苹果树病害，全国各苹果产地均有发生，尤其是近10多年来在全国各地蔓延较迅速。苹果腐烂病的病原物是苹果黑腐皮壳，属子囊菌亚门真菌。苹果腐烂病菌是一种寄生性很弱的兼性寄生菌，具杀生寄生性。健身栽培是目前生产无公害苹果最有效、最根本、最安全、最经济的手段，也是防治苹果腐烂病的最重要手段。

培育抗病品种是一种经济有效的手段，成为解决苹果炭疽菌叶枯病的首选。引物序列如表3-1中所示，因为这两个标记已被报道位于苹果15号连锁群上 （Liebhard et al.，2002），所以将苹果炭疽菌叶枯病抗性基因 （命名为Rgls） 位点定位于15号连锁群上。根据苹果基因组 CH01d08 和 CH05g05 标记之间的核苷酸序列，自行设计了276对SSR引物。据统计，大约有163426个 SSR 位点公布在苹果17条染色体上 （关玲等，2011）。这有可能是由于当前的苹果基因组重叠群序列产生装配错误，也有可能是苹果基因组中染色体结构的变异造成的。

1.利用柑橘溃疡病菌细胞悬浮液免疫BALB/c小鼠，免疫后小鼠抗血清效价为2500倍左右。提取小鼠脾细胞mRNA，构建的单链抗体文库重链DNA大小为350bp左右，轻链为650bp左右，经linker（Gly3Ser）4连接后单链抗体DNA大小为1.2kb左右。将单链抗体文库DNA克隆到大肠杆菌JM109中，随机挑选了9个克隆子测序表明，9条单链抗体序列都是开放阅读框，其重链分别属于VH1、VH2、VH3基因家簇，轻链属于VKⅠ、VKⅢ、VKⅣ亚基因家簇。每个单链抗体的互补决定区（CDRs）都为不同的CDR，其中氨基酸序列变化多样，说明构建的单链抗体文库多样性好，适合于进一步进行单链抗体的筛选。2.采用核糖体展示技术对构建单链抗体文库进行了进化和富集。结果显示第一轮核糖体展示后回收的mRNA量非常少，分光光度计已测不出其浓度，反转录RCR后，扩增得到的条带非常弱，说明在原始未筛选的抗体文库中，能与柑橘溃疡病菌O-特异性脂多糖作用的单链抗体数量较少。经过三轮筛选后，得到的mRNA量逐渐增多，经RT-PCR后，产生了比较亮的扩增条带。说明在核糖体展示过程中，抗原阳性的单链抗体得到了富集。3.将未经过核糖体展示的原始单链抗体文库DNA和经过三轮展示的单链抗体文库DNA与噬菌体表达载体pCANTAB5E相连接后，转入大肠杆菌TG1中小量表达，表达后用间接ELISA测定单链抗体与抗原的结合活性。结果表明：从未经过筛选的原始单链抗体文库中随机挑取的60个克隆子表达产物与柑橘溃疡病菌O-特异性脂多糖几乎没有结合能力；而从经过三轮展示后的单链抗体文库中挑取的60个克隆子中有30%与柑橘溃疡病菌O-特异性脂多糖有较好的结合能力。从三轮展示后的单链抗体文库中共挑取了180个克隆子，用间接ELISA法初筛到60株抗原阳性的单链抗体；然后用生物分子相互作用技术（biosensor，biacore）对筛选的抗原阳性的单链抗体进行了复筛，筛选了3株高亲和力的单链抗体（GX13、GX44和GX95）以用于下一步的表达鉴定。4.将筛选的高亲和力抗原阳性的克隆子从大肠杆菌TG1中转入高表达菌株HB2151中进行可溶性表达。单链抗体表达后，其表达产物主要集中于细胞周质提取物中，具有抗体活性。将浓缩的周质提取物进行SDS-PAGE电泳，显示在32 kDa处有一蛋白条带产生。将表达产物纯化后进行SDS-PAGE电泳显示，在32 kDa处有单一蛋白条带产生。为了进一步验证表达的蛋白即目的蛋白，将表达产物进行了Western blot 杂交，结果显示，与纯化后的电泳结果一致，在32 kDa处有单一的条带产生，说明表达纯化的蛋白即目的蛋白。5.将筛选的抗原阳性单链抗体进行了特性研究。单链抗体（GX95、GX44、GX13）特异性强、亲和力高。其与柑橘溃疡病菌近源种Xanthomonas oryzae pv.oryzae（Xooc）；Xanthomonas campestris pv.campestri（Xcc）；Xanthomonas oryzae pv.oryzicola（Xoc）；及从柑橘叶片上分离的10种腐生黄单孢菌及Bacillus subtilis；E.coli 都没有交叉反应。Biacore 分析其亲和力表明，单链抗体GX95、GX44和GX13的亲和常数分别为1.98×1010 M-1、1.89×1010 M-1、3.43×1010 M-1。6.对筛选的单链抗体进行了测序。用DNAplot 软件分析单链抗体序列。结果表明：单链抗体 GX44 和GX13重链分别属于VH1基因家簇，GX95 重链属于VH3基因家簇；GX44和GX13轻链属于Vk IV亚基因家簇，GX95轻链属于Vk III亚基因家簇。用Vector NTI软件对筛选的单链抗体的序列同源性进行了分析，表明GX44 和GX13重链有89.67%的同源性，GX95和GX13具有92.53%的同源性。

4个杂交组合的F1 单株进行了苹果炭疽菌叶枯病的抗性鉴定，以期揭示苹果炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，为发掘与抗性基因紧密连锁的分子标记，开展苹果抗炭疽菌叶枯病分子育种奠定基础。这充分显示不同品种 （系） 对苹果炭疽菌叶枯病的抗性差异明显，遗传性对苹果炭疽菌叶枯病的抗性起着主导作用，同时也证实了上述品种 （系） 可以作为苹果炭疽叶枯病遗传规律研究的典型材料。在 ‘金冠’ב富士’ 组合的F1 代群体中，共调查了207株，其中抗病株为 93 株，感病株为 114 株，经适合性检验， x20.05=1.07 （ P＞0.05）；在 ‘富士’ב嘎拉’ב富士’ 杂交后代群体中，共调查了262 株，出现了4株抗病单株，经适合性检验， P值为0.12，大于0.05，无显著性差异，符合0∶1 的理论比值，表明该杂交后代抗病对感病呈隐性单基因遗传综合上述研究结果，可以确定苹果对炭疽菌叶枯病的抗性由隐性单基因控制。

苹果至今已有2000多年的栽培历史。苹果外观艳丽，营养丰富、供应期长、耐储藏，又有较广泛的加工用途，能满足人们对果品的多种需求。根系分布受砧木和土壤理化性状的影响。苹果根系一年有3次生长高峰。土壤含水量达到田间持水量的60%～80%最适合苹果根系生长。苹果的芽按性质分为叶芽、花芽两种。苹果的花芽为混合芽。叶芽萌发要求的平均温度为10℃左右。苹果是异花授粉植物，大部分品种自花不能结实。苹果一般有4次落花落果。第一次在末花期，称为落花。原因是未能受精的花。适宜的温度范围是年平均气温9～14℃,年平均温度在7.5～14℃的地区，都可以栽培苹果。苹果需要土壤深厚，排水良好，含丰富有机质，微酸性到微碱。适宜的pH值为5.7～7.5。苹果对土壤适应性较强，要求土层深厚、肥沃、富含有机质、排水良好的微酸性至中性地块建园。苹果植地选好后，在建园时，要重视修建排灌水沟，使到旱天有水可灌，雨季涝能排。

20世纪90年代初期，受苹果“比较效益高”的利益驱动，我国一些苹果非优生区也在大面积盲目地发展苹果，从而导致全国苹果面积迅猛增长。例如，陕西省现有苹果总面积为42万公顷，其中优生区面积30.7万公顷，占全省苹果面积的73%，适宜区面积6.2万公顷，占全省苹果面积的15%，非适宜区和次适宜区仍有苹果面积5万公顷，占全省苹果面积的12%树势中庸，结果早，丰产性强。红富士 系日本品种。果实于10月下旬至11月初成熟，短圆形，单果重200～250克。成熟时果皮底色绿黄色，果面有条红和片红两种着色系（图2-11，图2-12）。但成活后枝条比较抗风，不易劈枝，牢固性较强。图2-18 劈接削接穗将接穗的下端削成楔形斜面，即削成两侧相等的双斜面，但要使其形成外厚内薄而呈楔形，斜面长度3～4厘米。采用皮下接或劈接法嫁接2个接穗，即1个长接穗（长度为1米左右），再配1个短接穗（长度为40～50厘米），再将两个接穗靠接，以便于接口愈合及增加牢固性（图2-22）。