防治棉花枯萎病的农药包括除草剂类、化学类和生物类。除草剂类农药主要是氟乐灵；化学类农药是指杀菌剂和特殊的化学物质；生物类农药是具有防病作用的生物制剂。大量研究结果表明，除草剂可以影响由真菌、细菌、线虫或病毒等引起的植物病害。除草剂对植物病害的影响存在着正负两种截然不同的作用。即使同一种除草剂对同一种植物病害的影响也有差异。氟乐灵等二硝基苯胺类除草剂减轻植物病害的发生，已有许多报道（Buczacki，1973；Grau等，1997；Teasdale等，1979）；而且有研究证明，属于二硝基苯胺类的胺氟灵和胺硝草能减轻棉花枯萎病的发生（Youssef等，1985）。Grinstein等（1984）报道了氟乐灵能抑制棉花枯萎病的发生。但也有报告说，在温室试验中，土壤经氟乐灵处理后增加了感病品种棉花枯萎病的发病率（Youssef等，1982）。这种在同一除草剂与植物病害系统中结果的差异可能是由于所采用的技术、除草剂的剂量与质量、病原菌，土壤类型及作物品种等多种因子对除草剂与植物病害之间相互作用的影响而造成的（Papavizas等，1979）。宋凤鸣等（1990、1992、1993、1994、1995）和张元恩等（1994）就氟乐灵防治棉花枯萎病的效果及其机制做了较系统的研究，取得了具有理论意义和应用价值的研究成果。从枯萎病发病的时间动态看，氟乐灵处理组棉苗枯萎病的株发病率和病指显著低于对照。在接种后的第6天，处理组和对照组棉苗均开始表现枯萎病症状，且株发病率无明显的差异，此后，氟乐灵处理组枯萎病的株发病率增加较缓慢，接种12天后，株发病率增加趋于稳定，而对照组株发病率增加很快，接种后第18天达最高（图7-1）。图7-1 氟乐灵处理后棉苗枯萎病发病的时间动态（宋凤鸣等，1995）从病指看，氟乐灵处理显著降低轮作地苗床和连作地苗床上棉苗枯萎病的发病率及病指，其差异均达到显著或极显著水平（表7-1）。5月10日处理组病害发病率及病指比对照降低80%以上，均高于5月21日的下降率（在40%～60%），可见，氟乐灵处理减轻枯萎病发病的作用随时间推移而下降。连作地苗床和轮作地苗床上枯萎病发生和病指相差不大。来自氟乐灵处理苗床的棉苗移栽到大田后，在现蕾初期枯萎病的发病率和病指均明显低于对照棉苗（表7-2）。处理棉苗枯萎病发病率一般降低65%左右，病指降低65%～75%。从大田枯萎病发病率及病指来看，以连作地苗床棉苗移栽到连作棉田为最重，轮作地苗床棉苗移栽到连作棉田次之，轮作地苗床棉苗移栽到轮作棉田为最低。这也证明了轮作可以减轻棉花枯萎病的发生。苗床类型处理5月10日5月21日发病率（%）病指发病率（%）病指连作地苗床对照7.78±0.803.50±0.5114.67±1.357.45±0.24氟乐灵1.22±0.68**（84.53%）0.45±0.33**（87.14%）8.22±1.78*（43.97%）3.33±0.87**（55.30%）轮作地苗床对照7.33±0.843.14±0.2314.45±1.137.25±0.30氟乐灵1.31±0.29**（83.36%）0.42±0.14（86.62%）6.44±0.68**（55.43%）3.81±0.20**（61.24%）表7-1 氟乐灵处理后对苗床上棉苗枯萎病的抑制作用（宋凤鸣等，1995）苗床类型大田类型处理发病率（%）病指轮作地苗床连作棉田对照6.37±0.593.02±0.71氟乐灵2.15±0.12**（66.25%）1.07±0.16**（64.57%）轮作地苗床轮作棉田对照4.98±0.352.68±0.16氟乐灵1.76±0.35**（64.66%）0.69±0.14**（74.25%）连作地苗床连作棉田对照9.19±4.183.95±0.91氟乐灵3.22±0.61**（64.98%）1.17±0.35**（70.38%）表7-2 氟乐灵播前土壤处理对棉花现蕾期枯萎病发生的影响（宋凤鸣等，1995）张元恩等（1994）也报道了相类似的研究结果（表7-3）。处理病指生长箱中田间小区30天40天50天30天70天对照4954654095氟乐灵处理1520241145除草通1925371043表7-3 二硝基苯胺类除草剂对棉花抗枯萎病的抑制作用由氟乐灵诱导的棉花抗病性增加，不是氟乐灵对枯萎病菌抑制的结果，不是根部分泌物变化的结果，也不是促进益菌生长，拮抗病原菌的结果。因为氟乐灵对菌丝生长、孢子萌发的抑制作用十分有限（表7-4），也不影响枯萎病菌对棉花根部的侵入，而棉花抗枯萎性的提高，是棉花本身抗性机理变化的结果。处理萌发率菌落半径（cm）3h后6h后3天6天9天12天15天菌丝重（g）对照13.7741.893.105.506.727.338.000.63620.64100.6305氟乐灵20.6860.643.405.797.207.968.700.74120.72310.6954表7-4 氟乐灵对枯萎病菌孢子萌发和菌丝生长的影响（张元恩等，1994）氟乐灵对棉花本身抗枯萎病性的机理变化体现在以下7方面（宋凤鸣等，1933，1995）。出苗后周数1周2周3周浙肖棉1号中棉所12浙肖棉1号中棉所12浙肖棉1号中棉所12氟乐灵（μg/g）11.151.41**2.05**1.73**3.08**3.67**51.21*1.45**2.07**1.78**2.82**3.53**101.24*1.49**2.27**1.91**3.08**3.72**对照丙酮0.941.031.241.181.641.75灭菌水0.830.971.031.191.461.70表7-5 氟乐灵播前土壤处理后棉苗植株内木质素含量的变化经氟乐灵播前土壤处理出苗后1～3周，2个供试品种棉苗植株内木质素含量均高于对照，这表明氟乐灵促进了木质素的合成与积累。但在5～10μg/g的氟乐灵处理浓度范围内，木质素含量没有差异。出苗后1～5周内，处理植株与对照植株内木质素含量的差异逐渐增大表明，氟乐灵处理对木质素合成与积累的诱导作用在这一期间是持续的。氟乐灵对抗病品种中棉所12木质素合成与积累的促进作用强于对感病品种浙肖棉1号的作用。出苗后周数1周2周3周浙肖棉1号中棉所12浙肖棉1号中棉所12浙肖棉1号中棉所12氟乐灵处理（μg/g）132*3351**68**82**93**533*3248**74**80**106**1036*3755**76**88**109**对照丙酮223030435460灭菌水212527415061表7-6 氟乐灵播前土壤处理后棉苗植株内苯丙氨酸解氨酶活性的变化氟乐灵处理后，增加了2个供试品种棉苗植株内PAL的活性，说明氟乐灵对棉苗PAL活性具诱导作用，但在不同浓度处理之间，PAL活性差异不明显。在处理出苗后第二周内，2个供试品种棉苗植株内PAL活性的增加大于处理后第三周内的增加，表明氟乐灵对PAL活性的诱导作用发生较早；随着时间的推移，这种诱导作用逐渐减弱。氟乐灵对抗病品种中棉所12 PAL活性的诱导作用大于对感病品种浙肖棉1号PAL活性的诱导作用。但在中棉所12出苗后1周时，处理植株中，PAL活性与对照中的PAL活性没有显著性差异，可能与氟乐灵对中棉所12棉花的诱发作用较迟有关。氟乐灵处理后，2个供试品种棉苗植株内过氧化物酶活性高于对照，表明氟乐灵对过氧化物酶活性具有促进作用，且这种促进作用具有持续性。对抗病品种中棉所12过氧化物酶活性的促进作用，强于对感病品种浙肖棉1号的作用。但在不同浓度处理之间，酶活性的差异不显著。出苗后周数1周2周3周浙肖棉1号中棉所12浙肖棉1号中棉所12浙肖棉1号中棉所12氟乐灵处理（μg/g）160.2**68.563.4*77.4**77.8**90.3**564.9**70.0*68.8**76.8**79.5**93.9**1071.0**69.2*73.6**78.8**92.5**表7-7 氟乐灵播前土壤处理后棉苗植株内过氧化物酶活性的变化出苗后周数1周2周3周浙肖棉1号中棉所12浙肖棉1号中棉所12浙肖棉1号中棉所12对照丙酮52.861.254.663.457.065.8灭菌水53.282.455.064.657.867.0表7-7 氟乐灵播前土壤处理后棉苗植株内过氧化物酶活性的变化（续）-1图7-2显示出，浙肖棉1号过氧化物酶同工酶有5条共同谱带[A（Rf=0.53）、B（0.47）、C（0.40）、D（0.32）和E（0.25）]；中棉所12则有4条共同谱带[A’（0.46）、B’（0.41）、C’（0.35）和D’（0.28）]。氟乐灵处理后，过氧化物酶同工酶组成发生了变化，增加了一些新谱带；且氟乐灵对过氧化物酶同工酶的影响随着处理后时间的推移而不同。在出苗后第一周和第二周，浙肖棉1号增加了F（0.17）、G（0.13）和H（0.05）3条新谱带；在出苗后第三周时又增加了I（0.21）、J（0.07）和K（0.11）3条新谱带。在出苗后第一周，中棉所12增加了E’（0.19）带；第二周又增加了G’（0.15）带；第三周则又增加了F’（0.30）谱带。在不同浓度处理之间，2个供试品种的过氧化物酶同工酶没有差异。图7-2 氟乐灵播前土壤处理后棉苗植株内过氧化物酶同工酶图谱经氟乐灵诱发处理再接种病菌后，棉苗体内维管束组织中类萜烯醛的积累水平明显大于对照组。虽然对照组棉苗在接种后18天时，也有较高水平的类萜烯醛积累量，但在接种后的15天内，其积累水平很低。相反，处理组棉苗在接种后第9天时，就有较高水平的类萜烯醛积累量，而且其积累量呈直线增加，可达到很高的水平，如在18天时类萜烯醛的量占中柱组织的85%（平均4.2级）以上。图7-3 发病棉苗体内类萜烯醛的积累动态棉枯萎病菌侵入棉花植株后，由于棉花自身及外界环境条件的影响，受侵染植株可能不表现症状。因此，外观发病率及严重度可能不完全反映枯萎病菌的实际侵染及在植株内的扩展情况，为此，在棉花收获后进行了剖秆检查，以了解枯萎病菌的实际侵染率及茎秆木质部病变程度。由表7-8可知，氟乐灵处理组中棉株枯萎病发病株率降低，茎秆木质部的病变程度减轻。这可能说明，氟乐灵处理后使棉花植株增强了抵抗枯萎病菌侵入的能力（表现为侵染率的下降），同时，抑制了侵入枯萎病菌在木质部内的生长与扩展（表现为木质部病变程度的下降），从而阻止了病害的进一步发展。此外，氟乐灵处理后对枯萎病发病株率的减少要低于对木质部病变程度的降低，这表明，氟乐灵减轻枯萎病发病主要是通过抑制侵入枯萎病菌在棉株内的生长与扩展而起作用的。品种处理侵染率（%）病指沪棉2011对照75.24±0.9140.69±2.38处理63.19±3.86（16.02）31.73±1.65（22.02）中棉所12对照62.82±0.8326.70±0.62处理45.97±2.27（26.82）17.00±1.10（36.33）表7-8 氟乐灵处理后剖秆检查结果氟乐灵处理组棉苗根部和茎部组织中，枯萎病菌的菌量显著低于对照组相应部位的菌量（图7-4）。接种后第9天起，处理组与对照组之间的菌量差异加大；同时，茎部组织的菌量差异大于根部。从菌量增加的时间动态来看，接种后12天内，根部组织中菌量增加缓慢，但在接种后12～15天增长加快。对照组棉苗茎部组织中，菌量的增加动态与根部相似，在接种后的12～15天增加较快，而处理组棉苗茎部组织中的菌量在接种后的15～18天才有较大的增加。说明处理组茎部菌量增长滞后于对照。综上所述，播前氟乐灵施用后能减轻枯萎病的发生，主要是氟乐灵诱发棉花产生了诱导抗性，这种诱导抗性的机制，主要表观在抵抗病原菌的侵入和对入侵病原菌在棉株体内生长的抑制。氟乐灵是旱地作物棉花的除草剂，主要采用播前混土法施药。宋凤鸣等（1995）推荐施药量每亩用48%乳油65～175ml，视土壤质地和有机质含量而定。氟乐灵处理组在轮作地苗床和连作地苗床的出苗率均高于对照组，其原因是处理组苗前死亡率降低。处理组在连作地苗床上的苗前死苗率比对照组减少79.80%；在轮作地苗床上比对照组减少52.91%（表7-9）。播前施用按推荐氟乐灵施药量对棉花出苗是安全的。图7-4 氟乐灵处理后棉苗体内枯萎病菌菌量的变化动态苗床类型处理出苗率（%）苗前死苗率（%）连作地苗床对照77.90±2.6711.93±2.67氟乐灵84.81±2.632.41±0.11**轮作地苗床对照82.88±1.147.73±1.26氟乐灵86.56±0.45*3.64±0.50**表7-9 氟乐灵播前土壤处理对棉花出苗及苗前死苗的影响（宋凤鸣等，1995）棉花枯萎病系种子与土壤传播的维管束病害，从子叶期至成株期整个生育阶段皆可侵染发病。其化学防治的关键在于药剂的速效与长效。速效即药剂施用后能迅速被吸收，运转至维管束中，并累积达到能抑制、杀死病原菌的有效浓度；长效即药剂具有缓释作用及不易受环境影响而分解、变性的性质。多菌灵等苯并咪唑系列是一类具广谱杀菌活性的内吸杀菌剂，目前已被广泛用于防治多种作物病害，并且已知它们在土壤中不易被分解，存留期至少达数月之久。鉴于此类药剂用于大田治疗，因棉株对多菌灵等内吸利用率低，而导致防效较差的问题，郭敦成等（1993）依据农药对生物体表穿透的相近相通规律，着意提高多菌灵极性，以增加其对棉根的穿透能力，同时，亦注重新配方的土壤稳定性研究，使新配方对棉花枯萎病的控制既具有速效又具有长效。经几年试验研究，研制出以多菌灵为主体，以调整其油水分配系数为目的，添加水杨酸、冰醋酸等助剂复混而成的新型杀菌剂治萎灵，除了具有原多菌灵的广谱杀菌特性外，还具有速效、高效、长效和促进棉花生长的特点。对棉花枯萎病菌的毒力是多菌灵的16.5倍（表7-10），施药后10天即可见效。治疗效果为82.3%（对照多菌灵的治疗效果为56.2%），有效控制期可达60～80天（表7-11，表7-12）。药剂菌丝生长抑制率（%）5.0002.50012500.6250.313（mg/kg）EC50（mg/kg）增效倍数多菌灵60.6243.2242.4942.0029.671.6810—多菌灵+助剂Ⅰ100.00100.0056.7248.3647.010.64531.91多菌灵+助剂Ⅱ100.0065.1861.1946.2710.510.78391.39多菌灵+助剂Ⅰ+助剂Ⅱ82.0576.9275.2767.0358.610.107316.53表7-10 助剂对多菌灵的增效作用试验地点稀释倍数调查天数（天）（距离药期）用药前/后病指对照区用药区治疗效果（%）备注湖北石首230250.00/7.620.00/0.6092.1350.00/14.880.00/2.2684.8无病土育苗移栽棉湖北石首250105.15/25.399.12/16.1081.4205.15/31.999.12/14.5690.7305.15/38.949.12/19.6883.1直播棉湖北鄂州2002037.5/41.6737.5/12.9286.38537.5/28.7537.5/1.6794.2直播棉湖北鄂州200200.00/11.000.00/4.3860.6850.00/2.670.00/0.1694.0直播棉湖北枝江300100.00/5.580.00/0.5073.1300.00/4.080.00/0.1589.0450.00/2.570.00/0.0697.5移栽棉湖北松滋300203.50/8.751.25/1.5086.7直播棉山东聊城3001065.5/68.0061.5/32.5051.54562.5/48.0061.5/3.0095.8直播棉安徽望江300208.44/30.303.20/9.7068.0408.44/39.403.20/4.7075.8678.44/12.503.20/2.0084.0直播棉安徽怀宁3002030.0/55.0040.0/18.5074.73030.0/64.0040.0/10.0088.3直播棉表7-11 各试验点治萎灵对棉枯萎病的治疗效果总汇病株级别用药后第35天用药后第63天处理区病情对照区病情治疗效果处理区病情对照区病情治疗效果Ⅰ级病株11.2521.2547.061.256.2580.00Ⅱ级病株31.2540.0021.888.7517.5050.00Ⅲ级病株59.2068.7513.8934.2150.0031.58表7-12 治萎灵对不同级别病株的治疗效果（%）治萎灵商品制剂为12.5%液剂，属低毒（由同济医科大学测定，1989）、高效、内吸性农药，具有保护与治疗作用，使用方便，可用作拌种、苗床泼浇和大田灌根及药钵育苗。以灌根对枯萎病的防治效果最好。但为节约成本、稳定效果，似宜采用环环把关的系统施药法：即对移栽棉采用药钵法育苗或拌种加苗床法泼浇（或定根水施药）再加大田挑治或普治；对直播棉采用拌种（定苗施药）加挑治或普治。为省药与安全起见，拌种浓度宜为0.8%（占用种量），灌根与泼浇以200～300倍稀释液为宜。在发病率不超过5%、病株级别不超过Ⅰ级时用药为宜。市场上用于防治枯萎病的商品农药品种较多，不同农药品种防治效果不尽相同（表7-13、表7-14），此外，不同用药方法，防治效果也不一样，因此，对不同农药防治效果的鉴别与方法值得研究。潘劲松等（2000）在实验室对市场上12个防治枯萎病的杀菌剂进行毒力测定，以EC50值作为抑制枯萎病菌生长的指标，值越小，抑菌效果越好，反之，则差。结果是多菌灵（沪产）0.77、多菌灵（杜邦产）0.96、恶霉灵1.14、甲基托布津6.28、喷克7.16、稳长一号11.62、代森锰锌16.65、腈菌唑18.28、菌毒清19.34、敌克松23.58、五氯硝基苯32.13、络氨铜52.20。这表明，在常规杀菌剂中，以多菌灵对棉花枯萎病病原菌毒力作用最强。处理施药前病指药后7天药后14天病指病指减退率（%）防效（%）病指病指减退率（%）防效（%）91%克萎星SP700倍液6.336.67-5.3713.415.3914.8551.0832%克菌EC2000倍液11.1712.00-7.4311.7312.28-9.9436.8330%菌无菌EC2000倍液13.5011.6713.5628.9712.666.2246.1250%枯黄萎灵WP800倍液11.8312.17-2.8715.477.1536.5665.2725%使百克EC1500倍液9.008.5024.6322.406.5527.2258.181.5%菌立灭EW1200倍液12.839.677.8338.0711.2412.3949.6650%枯萎绝WP600倍液8.507.83-21.7024.315.3337.2964.02清水（CK）9.1711.1615.96-74.05表7-13 7种农药对棉花枯萎病的防治效果（黄学军等，2002）处理（g/667m2）施药前病指第一次施药后7天调查第二次施药后7天调查病指防效（%）病指防效（%）32%乙蒜酮乳油13.312.17.1291.493.332%乙蒜酮乳油17.38.94.5550.199.532%乙蒜酮乳油20.07.34.6540.199.520%粉锈宁乳油13.35.74.8523.284.5清水（CK）5.010.0—21.0—表7-14 32%乙蒜酮乳油防治棉花枯萎病试验结果（李凤瑞等，2005）在对商品农药防治效果筛选方法方面，单文荣等（2001）通过滤纸条的抑菌法和离体组织抑菌法有机结合对市售农药及有选择性的组织进行药性测定和预选，找出了一些对棉花枯萎病菌防治有效的药剂和组配。试验除了注重筛选对病菌杀抑作用好的药剂，还注重筛选对病菌并无明显的杀抑作用，但通过寄主组织后却能较好地抑制病菌扩展的药剂，同时，也注重筛选有上下传导作用的药剂，并认为药剂复配后对棉花枯萎病杀抑效果更佳。具体方法如下。①针对市售药剂单筛时，方法如下：将配制的孢子悬浮液（10/10显微镜下观察约有50个孢子）均匀滴入改良PDA平板培养基上，使用经不同药剂不同剂量处理后的滤纸条（长约2.5cm，宽约0.4cm）分别进行抑菌测定，将各培养皿置28℃恒温箱培养3～5天后，与对照相比，判断各不同药剂不同剂量下的抑菌效果。②针对市售药剂有选择性两两组配筛选时，方法如下：将孢子悬浮液均匀滴入改良PDA平板培养基上，各药剂按不同剂量配制成药液，分别用滤纸条浸过不同药液，按一定组配分别十字交叉放入培养基上，置28℃恒温箱培养，根据滤纸条交叉处产生的抑菌状况进行定性分析，判断出增效、相加、拮抗、独立、相互拮抗、拮增作用的组配。①针对市售药剂单筛时，方法如下：将配制的孢子悬液（10/10显微镜下观察有50个左右孢子）倒入改良PDA平板培养基上，使用经不同药剂不同剂量处理后的离体组织分别进行抑菌，置28℃恒温箱培养3～5天后，与对照相比，判断各不同药剂不同剂量下的抑菌效果。②针对市售药剂有选择性两两组配筛选时，方法如下：将孢子悬液均匀倒入改良PDA平板培养基上，各药剂按一定剂量和组配两两配制成药液，分别处理离体组织，将药剂处理过的离体组织分别放入培养基上，设清水（对照），待7～10天后，观察各两两组配通过离体组织对枯萎病的抑制等情况。选择几种抑制效果较优良的组配，对水培离体组织进行先接菌后施药，与对照相比，观察效果。①滤纸条抑菌试验。药剂学单筛记载方法：5级：抑菌半径大于0.5cm；4级：抑菌半径在0.3～0.5cm；3级：抑菌半径在0.1～0.3cm；2级：抑菌半径在0.1cm以下；1级：几乎无抑菌现象，但在滤纸条周围菌落有减菌等现象；0级：同于对照。②离体组织抑菌试验记载方法：5级：抑菌圈半径0.5cm以上，离体组织上不着菌；4级：抑菌圈半径0.1～0.5cm，离体组织上不着菌；3级：抑菌圈半径0.1cm以内，离体组织上没有明显可见的菌丝；2级：离体组织上微见菌丝，不见抑菌圈；1级：离体组织上长满菌丝，但不如对照发达；0级：同于对照，布满菌丝且发达。一般说来，防治棉花枯萎病的用药方法有浸种法、浇灌法（浇根）、茎叶喷雾法和茎部注射法（待棉苗一片真叶完全展开时，用微量注射器每株注射20μl，注射部位为茎近地面1cm处）。目前，生产上以茎叶喷雾法为主要方法。刘峰等（2005）比较了这4种方法后指出，注射法防效最高，喷雾法、药液浇灌法、浸种法防效较差。注射法对棉苗产生一定伤害，但根据诱导抗病理论，伤害本身也是一种诱导方式，因此，诱导抗病和药剂的联合作用可能是该法防效较高的原因。多菌灵水杨酸浸种、浇灌和注射对枯萎病防治均有一定防效，而喷雾防效较低，表明该药剂可以由根吸收和向上输导。氟硅唑注射和喷雾防效高于多菌灵水杨酸，浇灌和浸种则均没有明显效果，可能是由于其向下输导作用强于向上输导作用所致。而敌菌丹尽管没有内吸活性，但其注射和喷雾防效也高于具有内吸活性多菌灵水杨酸，其作用机制有待明确（表7-15）。处理浓度（μg/ml）注射茎叶喷雾病株率（%）病指防效（%）病株率（%）病指防效（%）敌菌丹10009.763.0572.2712.03.3357.36菌毒清150025.717.1435.0925.48.33-6.66氟硅唑100013.794.3160.8214.464.2245.97多菌灵水杨酸100019.355.6548.6421.056.5815.75清水对照—36.011.0—18.757.81—表7-15 药剂注射和喷雾防治棉花枯萎病效果二氧化氯ClO2是目前国际上公认的第四代氧化型杀菌消毒剂，具有高效、广谱、快速、安全、无毒副作用等突出优点，被世界卫生组织（WHO）和世界粮农组织（FAO）列为A1级产品，其杀菌消毒原理是凭自身强氧化性，对微生物（如真菌、细菌、病毒等）的细胞壁有很好的吸附性和透过性、可有效地氧化细胞内的酶，迅速控制微生物蛋白质的合成，达到杀菌消毒的目的，而动植物的酶系统主要存在于细胞的细胞器中，加上动植物自身保护系统，从而可基本保证不会受ClO2的伤害。但由于ClO2在国内应用研究起步较晚，目前，国内外其应用范围大多都局限于医疗、水质处理、漂白、食品工业、防腐保鲜等领域，而在农业应用方面，国外的报道很少，在我国农业种植方面的应用基本处于空白阶段。王化明等（2003）根据二氧化氯本身具有高效、广谱、无毒、无有害残留等特点，凭自身的强氧化性，通过破坏病原菌蛋白质结构而起到杀灭菌毒作用，结合棉花枯萎病的发病情况，经田间试验表明，其防治枯萎病效果好于多菌灵和甲基托布津（表7-16）。从表7-16中可以看出，在所有试验药剂中，以80mg/kg的ClO2溶液防治棉花枯萎效果最佳，其应用后调查统计其平均发病株率只有2.7%，其次是40mg/kg和120mg/kg的ClO2溶液，其平均发病株率分别为8.2%和10.3%，而200mg/kg和10mg/kg的ClO2溶液防效较差，且200mg/kg处理已出现叶子烧焦等药害，多菌灵、甲基托布津的平均发病株率明显高于80mg/kg的ClO2溶液处理。由此可见，用1%～2%棉花专用添加剂的80mg/kg的ClO2溶液比多菌灵、甲基托布津对棉花枯萎病的病原菌有更强的杀灭及更好的对病害起到防治作用。在随后的追踪调查中还发现，和清水（对照）试验相比，40mg/kg、80mg/kg、120mg/kg ClO2等处理后，棉花的黄萎病也大大减少，棉花成铃多，且纤维质量都比没用的有所提高，说明对棉花品质有所改善，对黄萎病防治也有很好的作用。处理（mg/kg）清水（对照）ClO2104080120200600倍液多菌灵750倍液甲基托布津3次重复的平均发病株率（%）51.342.78.22.710.117.619.316.2表7-16 几种药剂防治棉花枯萎病田间试验结果由于棉花枯萎病的病原菌为害棉株的维管束，目前，世界各国防治棉花枯萎病的主要措施是选育和推广抗病品种以及采取一些农业措施，至今尚缺乏高效的防治药剂。农抗120是一种广谱内吸型抗真菌病害的农用抗生素生物杀菌剂，对白粉病、枯萎病、炭疽病等多种作物病害具有较好防效。它与多种化学杀菌剂混配具有增效作用，但存在着施药量大，成本偏高的不足。农抗120与多菌灵均为内吸性杀菌剂，开发两者混配的新型农药，在生产上防治棉花枯萎病，不仅具有生物农药的环保无公害特点，而且能延缓化学农药多菌灵的抗性发展，显著提高防效。韩新才等（2008）在室内进行农抗120与多菌灵不同的配比混剂对棉花枯萎病菌联合毒力测定和增效作用研究。结果表明（表7-17），农抗120对棉花枯萎病菌的抑菌浓度区间为285.7～666.7 mg/L。多菌灵对棉花枯萎病菌的抑菌浓度区间为333.3～1000mg/L。农抗120 EC50值为407.4mg/L，小于多菌灵EC50值574.5mg/L表明，农抗120对棉花枯萎病菌的毒力大于多菌灵。农抗120与多菌灵不同配比混剂，其EC50值为223.5～230.9mg/L，小于农抗120单剂EC50值407.4mg/L和多菌灵单剂EC50值574.5mg/L表明，两者混配其联合毒力远大于两个单剂。农抗120与多菌灵1∶1、1∶2、2∶1比例混配其增效系数（SR）分别为2.13，2.19，1.99，均大于1.5，表现为显著的增效作用。其中，配比为1∶2时，SR值最大，为2.19，而配比增加为2∶1时，SR值下降为1.99，说明农抗120与多菌灵以1∶2比例混配，为具有最佳增效作用的混配比例。农抗120对植物病原菌的作用机理是抑制孢子萌发，导致菌丝畸变和原生质体凝聚等（朱薇玲等，2006），具有保护和治疗作用。多菌灵的作用方式是干扰菌丝体有丝分裂中纺锤体的形成，影响细胞分裂（黄伯俊等，2004）。两者混配对棉花枯萎病菌具有显著的增效作用，其增效机理及田间试验需进一步研究。处理毒力回归方程rEC50（mg/L）EC（th）50（mg/L）SR农抗120y=-14.1326+7.3331x0.9789407.4——多菌灵y=-3.3149+3.0133x0.9839574.5——农+多（1∶1）y=-8.8202+5.8892x0.9890223.5476.12.13农+多（1∶2）y=-12.5832+7.4457x0.9893230.9505.72.19农+多（2∶1）y=-9.1611+6.0229x0.9813226.5450.71.99表7-17 不同配比农抗120与多菌灵混剂对棉花枯萎病菌的抑制毒力及增效作用农抗（SO24）是由链霉菌YBO24（StreptomycesYBO24）产生的、对多种植物病原菌，如棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）、禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）、苹果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、小麦赤霉病菌（Fusarium grimiaearum）、棉花枯萎病菌（Fusarium turcicum）等有较强抑制作用的一种新型生物农药。现在已经完成其产生菌的选育、发酵工艺和分离纯化工艺等方面的基础研究工作。为加快该农抗的研制和推广应用，文才艺等（2007）研究以禾谷丝核菌和棉花枯萎病菌为指示菌，对农抗SO24的作用机理进行了初步探索。研究结果指出，SO24对禾谷丝核菌和棉花枯萎病菌菌丝生长有抑制作用。处理2天后，菌丝体逐渐皱缩，菌丝变得稀疏易分开；8天后，处理菌丝均全部溶解，而对照组菌丝生长正常。SO24对禾谷丝核菌和棉花枯萎病菌菌丝形态结构的影响（图7-5、图7-6），处理24h后，菌丝形态无明显变化；处理2～7天后，部分菌丝细胞内含物减少，液泡变大，形成大小不等的空泡，透光度降低，且空泡越来越多，越来越大；处理8天后，菌丝体溶解、断裂，液泡消失，原生质外渗明显；对照菌丝体则粗细均匀且表面光滑，原生质正常，液泡清晰可见。由此可见，SO24对禾谷丝核病菌和棉花枯萎病菌菌丝有明显的破坏作用。不同浓度SO24对禾谷丝核菌生长的抑制强度不同，用20%的SO24处理时，禾谷丝核菌菌丝全部溶解，培养8天后未见生长；用10%的SO24处理时，仅部分溶解，而未处理对照组的菌丝生长良好。进一步用生物测定法研究其抑菌能力的结果表明，在PDA平板上各浓度间的抑制率差异明显（表7-18），随浓度的增大，SO24对禾谷丝核菌的抑制作用增强，当浓度为20%时，抑制率可达81%说明，SO24对禾谷丝核菌有较强的抑制作用，但作为生物农药开发和应用，还有待于进一步提高发酵效价和优化分离纯化工艺。为了进一步明确其抑制作用机理，分别将10%和20%SO24处理8天后的禾谷丝核菌丝在无菌条件下用无菌水冲洗后接种于PDA平板上，28℃条件下培养，结果发现，表观上已经溶解的菌丝在解除SO24的作用后仍能正常生长。由此可见，SO24对禾谷丝核菌菌丝生长的作用表现为抑制，而不是杀死。这一结果与目前已报道农用抗生素如井冈霉素对病原菌的作用方式类似。项目CKSO24浓度（%）51020直径（mm）4836239抑制率（%）0255281表7-18 不同浓度的SO24发酵液对禾谷丝核菌菌丝生长的抑制率试验结果还表明，SO24对棉花枯萎病菌孢子萌发有明显的抑制作用。对照组棉花枯萎病菌孢子萌发正常，48h后萌发率达到97.5%；而SO24处理后，孢子萌发率显著降低，并且处理时间越长、SO24浓度越高，孢子萌发率的降低越显著。20%的SO24处理48h后，孢子萌发率为零，即20%发酵液能完全抑制孢子的萌发。由此可见，SO24对病原菌孢子萌发具有持续的抑制作用。图7-5 SO24对棉花枯萎病菌菌丝形态结构的影响图7-6 SO24对禾谷丝核菌菌丝形态结构的影响随着化学农药在使用中产生的一系列公害问题被发现，如环境污染、杀伤天敌、破坏生态平衡、3R（Residue，Resistance，Resurgence）等问题，已引起人们的普遍关注。因此，开发高效、低毒、低残留的新型无公害农药，逐渐成为植物病害防治的重要途径。昆虫、病原菌与植物经过几亿年的共同进化，植物体内形成了多种能有效抗御有害生物侵袭的机制，包括植物的形态、行为以及体内产生的次生代谢物质。植物是生物活性化合物的天然宝库，其产生的次生代谢产物超过40万种，其中，大多数化学物质如萜烯类、生物碱、类黄酮、甾体、酚类、独特的氨基酸和多糖等均具有杀虫或抗菌活性。从植物体内的次生物质中寻找能抑制有害生物的有效成分，人工直接提取应用或明确有效成分结构后人工合成制作农药，已成为无公害农药的开发热点之一。苍耳（Xanthium sibiricumPart）系菊科苍耳属植物，在山东省分布很广泛，是一种常见的田间杂草。果实苍耳子是常用中药，是中医临床上散热、解疮毒、通鼻窍、痹症的要药。苍耳子还有消炎、镇痛、抗病毒、抗细菌的药理作用。苍耳叶提取的挥发油对某些真菌具有抑制作用。在农业上可用来防治菜青虫等农业害虫。苍耳对一些植物病原真菌有较强的抑制作用。而苍耳虽有抑菌活性，但未见对苍耳的抑菌作用详细、深入的报道。为此，刘林等（2003）对苍耳中抑菌物质的提取溶剂及活性部位进行了初步筛选。结果表明，苍耳中含有较强的抑菌活性成分，具有明显的开发研究价值。其中，苍耳全株和苍耳叶的乙醚、丙酮提取液抑菌作用较强（表7-19）。乙醚和丙酮是比较适合的提取溶剂，可以从苍耳中较有效地提取抑菌活性成分；苍耳中抑菌活性最高的部位是苍耳叶，苍耳根的抑菌活性也较好。苍耳提取液是一种混合物，其中，某些成分可能会对某些病菌具有促进生长作用。若对提取液进一步分离纯化，可能会得到只对病菌具有抑制作用的化学物质，且抑菌作用会在很大程度上提高。供试菌种乙醚丙酮石油醚全株根果实茎叶全株根果实茎叶全株根果实茎叶棉花枯萎病菌抑制率（%）79.243.236.236.083.676.858.927.939.688.458.032.441.019.042.3苹果腐烂病菌抑制率（%）100.089.347.561.9100100.079.714.091.310090.583.036.820.241.1葡萄白腐病菌抑制率（%）100.075.320.842.0100100.085.426.016.710090.869.814.619.465.4构巢曲霉抑制率（%）—59.041.113.175.3—64.029.833.286.9—59.021.57.251.8表7-19 苍耳根、茎、叶提取液对4种病菌的抑制作用芹菜（ApiumL.）为伞形花科（Umbeliferae）一年生或多年生草本植物。它约有20个种，分布于全世界温带地区，而中国仅有2个种，分别为旱芹（Apium graveilensL.又叫药芹或香芹）和细叶旱芹（Apium leptophyllum），其中，旱芹为模式种。芹菜含有丰富的胡萝卜素、维生素及挥发性芳香成分，并具有极好的药用功能，还有一定的抑菌杀虫活性。Sipaiiiene等（2003）发现，芹菜叶提取物对大肠杆菌（E.coli）等6种菌具有高度的抑制作用。Afek等（1995）亦曾发现，旱芹的诱导产物对灰葡萄孢（Botrytis cingrea）、链格孢（Alternaria alternate）有较高活性。Oussalah等（2006）研究报道，旱芹精油能抑制引起肉类腐烂的Pseudomonas putida菌株。刘福光等（2009）对11种伞形科植物粗提物进行了农用抑菌活性的初步筛选试验，结果发现，旱芹粗提物有很好的抑菌活性。Monir等（2001）研究发现，旱芹种子中的3-正丁基4，5-二氢内酯（3-N-butyl-4，5-dihydrophthalide）在12.5μg/ml和5μg/ml浓度下，对线虫P.redivivus和C.elegans杀灭率可达100%；研究中还发现，此化合物对埃及伊蚊（ Aedesaegypt）也有较好的杀灭作用。金阳等（2006、2008）研究发现，芹菜中莰酮类化合物对小菜蛾等害虫有很好的防治作用，并对此类物质进行了合成。魏立强等（2001）在前人研究的基础上，进一步进行盆栽活体试验，研究旱芹粗提物对棉花枯萎病的抑制作用。结果表明，旱芹粗提物灌根对棉花枯萎病的抑制作用，在一定浓度下随浓度的增加而增加，病指随浓度的增加而减小。在浓度为10μg/ml时，病指为11.07，防治效果达到77.71%，明显高于对照药剂的相对防效27.77%（表7-20）。处理浓度（μg/ml）病指防治效果（%）旱芹粗提物2011.1877.491011.0777.71517.7564.262.521.6254.461.2525.00CK49.66—表7-20 旱芹粗提物灌根对盆栽棉花枯萎病的防效蒿属植物含有许多单萜及倍半萜化合物，生理活性成分种类较多，经常被应用于传统医学实践，加之植物原料来源丰富，所以，蒿属植物正受到越来越多的注意。郭艳等（2009）在试验条件下，采用菌丝生长速率测定法，以棉花枯萎病菌为供试菌，对茵陈、黄蒿、艾蒿3种蒿属植物提取物的抗菌活性进行了研究。结果表明，供试3种蒿属植物提取物对棉花枯萎病菌具有较好的抗菌活性，其中，尤以艾蒿提取物的抗菌活性强而稳定，48～96h对上述枯萎病菌的菌丝抑制率均达80%以上（表7-21）；丙酮提取物的抗菌活性强于乙醇提取物，前者的EC50为1.4785mg/L，后者的为3.2090mg/L。间歇振荡法、超声波法、冷浸法提取物对供试菌的72h菌丝抑制率分别为84.34%、84.56%和88.70%，可见，同种溶剂不同提取方法所得提取物抗菌活性基本一致。供试植物对棉花枯萎病菌的抑制率（%）48h72h96h茵陈（Artemisiacapilaris）71.0863.1151.81黄蒿（A.annual.）77.1161.7224.7艾蒿（A.argyi）83.7388.780.19表7-21 不同蒿属植物提取物对枯萎病菌的抗菌活性植物精油作为易挥发的小分子物质，结构简单且生物活性多样，在有害生物控制的应用方面，具有低毒、高效、环保、选择性高等优点，吸引了研究人员的广泛关注。八角茴香（Illicillm verumHook.f.）是木兰科八角属植物，对八角茴香精油的研究主要集中在化学成分及其在医药及食品等方面的应用，在农业病虫害防治方面的研究尚未见文献报道。刘志希等（2010）以棉花枯萎病菌为靶标菌，用八角茴香精油为植物材料，通过水蒸气蒸馏法制备精油，在利用GC-MS分析其化学组成的基础上，柱层析分离纯化了精油的主要化学成分——反式茴香醚，最后通过比较八角茴香精油与反式茴香醚对棉花枯萎病菌菌丝生长抑制作用。由图7-7可知，棉花枯萎病菌菌丝在带药培养基中的生长受八角茴香精油及其主要成分的抑制，并表现出明显的量效关系。在供试浓度高于1.00μl/ml时，菌丝生长抑制率大于93.3%；在浓度低于0.50μl/ml时，菌丝生长抑制率小于30.0%；抑制中浓度（EC50）为0.50～1.00μl/ml。在相同测试浓度下，该精油与其主成分反式茴香醚的抑制活性接近，精油的活性略高，这表明反式茴香醚是八角茴香精油中的主要抗真菌活性成分（含量高达94.57%），其他组分可能起协同增效作用。从已知抗菌活性成分反式茴香醚的结构看，丙烯基苯的结构单元可能是抗菌活性的毒性基团，Moliszewska等（2003）的研究证实，具有丙烯基苯结构单元的天然产物，如α-细辛醚，β-细辛醚，丁香酚，3，4-二甲氧基-丙稀苯等对水稻纹枯病菌、灰葡萄孢菌、小麦镰刀菌等植物病原真菌在一定浓度下表现出较强的抑菌活性。因此，对丙烯基苯类衍生物的合成、抗植物病原真菌活性及其构效关系的研究，意义重大。图7-7 八角茴香精油及反式茴香醚对棉花枯萎病菌的抗菌活性辣椒为茄科植物辣椒（Capsicum frultescenceL.）的果实。辣椒果实中的主要药用成分是辣椒碱，它是一种极度辛辣的香草酰胺类生物碱，为辣椒果实中辛辣的主要化学成分，具有抗菌杀虫的药理作用，主要分布在辣椒籽及果皮内表细胞之中。研究表明，辣椒粗提液有较好的杀菌效果。茶皂素是从茶子饼中提取的一种皂苷类物质，在茶子饼中的含量为10%～14%。具有皂苷的一般通性，味苦，辛辣。茶皂素在农药上可用作杀虫剂、杀菌剂和农药助剂。一是利用茶皂素本身杀虫、灭菌功能产生农药作用；二是利用茶皂素良好乳化、扩散、湿润等性能作农药助剂。因此，可用其配制成生物农药，此生物农药对人畜、农作物无害，且耐雨水冲刷。关于辣椒碱对病原菌的抑菌活性所见报道不多。李芳等（2011）用该实验室研制的植物源农药5%辣椒碱·茶皂素微乳剂对棉花枯萎病防治进行了初步的研究。结果指出，5%辣椒碱·茶皂素微乳剂对棉花枯萎病菌菌丝生长有显著的抑制作用，并且随着质量浓度的增加抑制作用增强（表7-22）。当其质量浓度低于5mg/ml时，抑菌圈直径与对照间无显著差异；当其质量浓度达12.5mg/ml时，抑菌圈直径与对照间有显著差异。将高浓度试剂处理后完全不生长的菌饼转移到PDA培养基平板上培养后，菌体能够生长表明，5%辣椒碱·茶皂素微乳剂对棉花枯萎病菌起抑制菌丝生长的作用，但并未将菌丝杀死。对培养后的菌丝悬浮液镜检，与空白对照相比，药剂处理后的菌丝出现以下变化：①菌丝短，分枝较少，粗细不均。②菌丝形成膈膜明显弯曲、多、长短不一、分布不规则。③菌丝内含物变稀、变少、分布不均匀。茶皂素作为一种优良的表面活性剂，与辣椒碱混用后，对抑制棉花枯萎病菌丝的生长有增效作用。辣椒碱和茶皂素及两者的混剂对菌丝有明显的抑制作用，但只是抑制生长，而不是杀死，这与辣椒碱是内吸性杀菌剂的性质是一致的。至于辣椒碱与茶皂素的混剂对抗性菌株的作用特性和活体作用效果如何，尚待进一步研究。质量浓度（mg/L）5%辣椒碱·茶皂素微乳剂抑菌率（%）5%辣椒碱抑菌率（%）茶皂素抑菌率（%）5.031.5061.653.986.2538.0264.5610.0712.561.3767.2010.0325.067.2469.489.4750.080.6772.289.42表7-22 5%辣椒碱·茶皂素微乳剂抑菌试验结果

对已栽好的树苗要及时定干。一般在栽完后进行，也有的在栽植前就剪截定干。定干高度要根据苗木大小和砧木类型确定，一级苗定干高度要高些，小弱苗定干高度要低些，剪口都要选在饱满芽以上。乔化苹果苗定干高度一般为80～100厘米，矮化苗为60～80厘米。定干高度均包括15～20厘米长的整形带。对于特殊栽植方式苗木的定干高度，可视具体情况而定。在北方干旱寒冷、风沙大的地方，最好定干后套塑料袋防止抽条。栽后浇水保墒是确保苗木成活的关键。我国北方地区春季干旱，一定要及时浇水。在定植前要淹透定植穴，定植后随即要浇定植水。苹果定植水一般不宜过大，春季浇水大影响地温，不利于缓苗。定植水后数天，当小苗发出新叶，表面根系开始恢复生长，苗已缓转时，要浇一次大水，称之为缓苗水。植株缓苗后，根系进入快速生长期，这时根际缺水将直接影响根的发生、生长，因此及时补水是必要的。幼树枝叶少，土壤水分的散失主要是土壤蒸发掉的。覆膜可有效防止水分蒸发，在干旱和半干旱地区，最好在浇两三遍水后覆盖黑地膜，这样既可保墒，又能增加地温，对于提高苗木成活率、缩短缓苗期和加快生长等都有非常显著的作用。覆盖黑地膜还能抑制杂草生长。通常在树带或树盘内覆盖地膜，覆膜时要注意先整地、耙平，捡出石块或树枝，使树干周围地面稍隆起。然后平铺地膜，边缘用土压严。注意在树干周围堆个小土堆，压住穿孔处，以免膜下高温蒸汽灼伤树干皮层，导致死树。春季发芽以后，要认真检查苗木的成活情况，对于死亡的苗木要查清原因，及时补栽。当年补栽，一般是利用田间假植的备用苗，在当年雨季的阴天采取枝条带叶、根系带土团，边挖边进行补栽，也可以在当年晚秋或来年发芽前进行补栽。补栽的苗木，其砧穗组合应与死株的相同，树龄一致，以保持园相整齐。由于我国北方地区冬季寒冷，早春常有霜冻，空气干燥且风沙大，而苹果幼树的抗寒性差，容易发生冻害和抽条现象，所以应搞好冬季防寒工作。秋栽幼树最好埋入土中，视当地气候条件确定埋土厚度，通常为10～20厘米，第二年春天萌芽前出土。北方寒冷干燥的地区，如黄土高原、河北北部和北京，经常发生苹果幼树抽条现象。对于新种幼苗可以套上塑料袋，既能防止抽条，也能促进枝叶的生长。当新枝长到5～10厘米长时，要及时解膜，先在上部开口，过2～3天再全部撤掉。在易抽条地区要对苹果幼树保护2～3年，幼树入冬前在树干上缠一层地膜是最好的防抽条措施，也可以捆包一些稻草，春季再解掉，或在树干基部培土，以保护根颈，来年再将土撤掉，或培月牙埂等。入冬前灌一次冻水，可减少幼树抽条，同时要增加磷肥、钾肥的施用量，提高树体的营养水平。夏季摘心也可防止抽条。苹果幼树根系浅，杂草的生长会严重影响根系对养分和水分的吸收，所以对幼树要及时中耕除草。当缓苗水下渗后，人员能够进地时，就可以进行中耕。可以在果园悬挂杀虫灯诱杀金龟子。此外，为防止金龟子和象鼻虫等为害，还可在苗干中上部套一个窄长塑料袋，将袋子下面扎严，上端露出小孔，或扎些小孔，以防高温灼伤幼叶，为害过去后，脱除塑料袋。夏季、秋季还要注意防治蚜虫、卷叶虫、白粉病和早期落叶病。如发现病毒病株，应及时拔除并烧毁。果园土壤管理方法，也称土壤管理制度。是指果树行间、行内地面土壤耕作或其他管理措施。下面重点介绍有关的基本方法。1.生草的作用果园生草，就是在果园内全园或只在行间带状种植对苹果生产有益的植物的土壤管理制度。生草制是现代果园最好的土壤管理模式，也是生产高品质苹果的关键性技术之一，特别是进行有机生产的果园必须进行生草栽培。除特别干旱的地区外，我国大部分苹果园都应该大力提倡。在干旱、半干旱地区不宜选用深根性的草种，可选用三叶草、黑麦等草种。生草法的主要作用有以下几个方面。（1）增加土壤的有机质，提高土壤肥力 土壤有机质含量是土壤肥力的核心，我国土壤有机质含量一般为0.6%～0.8%，远低于国际上生产高档果品对土壤有机质的要求（3%～5%），这也是我国果实品质差的一个主要原因。据研究，一个中等产量的苹果园，每年需要消耗有机质24吨/公顷，而1/3带状生草的果园就可以满足这种消耗，并有一定的积累。种植白三叶当年就可收获鲜草15吨/公顷，第二年可收获37.5吨/公顷，紫花苜蓿每年可收获鲜草45～50吨/公顷。另外，生草的根系枯死后也可以提供大量的有机物质，连续种植多年可显著提高果园有机质含量。（2）改良土壤的结构 土壤有机质含量的增加和草根的生长，有利于促进土壤团粒结构的形成。研究表明，苹果园生草后，土壤的团粒结构可以增加18%～25%，同时还可以增加土壤的孔隙度和毛细管的数量。（3）改善果园小气候 生草可以调节果园气温，增加空气湿度。同时能调节土壤温度，有利于果树根系生长，如冬季清耕园冻土层（北京）最厚达40厘米，而生草园只有20厘米；果园生草冬天地温可增加1～3℃，早春根系活动提前15～30天；夏季可使地表温度下降5～7℃，这对夏季高温地区的果园有重要意义。（4）改善果园的生态平衡 生草果园害虫天敌的种群多，数量大，可增强天敌控制病虫害发生的能力，减少人工控制病虫害的劳力和物力投入，减少农药对果园环境的污染，创造生产安全果品的良好条件。（5）减少水土流失 生草果园能很好地覆盖地面，可以保墒蓄水，减少地面冲刷。有研究表明，生草后土壤表土含水量可增加15%～31%，土壤流失量减少86%，对山坡地果园尤其明显。（6）节省人力物力 生草管理省工高效，尤其是夏季，生草园可有较多的劳力投入到树体管理和花果管理上。2.果园生草方法果园生草可分为自然生草和人工生草两种。自然生草是指果园自然长出的各种杂草不锄，通过自然相互竞争和连续刈割，最后剩下几种适于当地自然条件的草种，实现果园生草的目的。但其改良土壤的效果较差，通常10年时间有机质含量才提高1%左右。另外，自然生草还会滋生有害杂草；有的草根过深，在水肥条件差的地区会存在与果树争水争肥的现象。人工生草是人为种植有利于土壤改良、增加土壤肥力的专用草类，如白三叶、红三叶、紫花苜蓿、紫云叶、黑麦草、毛叶苕子、草木樨、黄豆和豆科类牧草等。在园边、路旁、沟堤和渠边，可选种草木樨、紫穗槐和田菁等；在低洼盐碱地区，应选田菁和柽麻耐盐植物等；山冈旱薄地，可选草木樨和紫穗槐等抗干旱瘠薄的植物。进行畜牧养殖的果园可用部分草喂养牲畜和家禽，实行“过腹回田”，既可获得畜产品，又加速养分的转化，更有利于果树吸收利用，一举多得。平原地区种草一般选在早春和秋季进行。种草时，既可单一播种，也可混播。可采用黑麦草与三叶草混播，黑麦草与毛苕子混播等方式。幼苗期及时清除杂草，是生草能否成功的保证，同时注意对生草施肥浇水。当草长到30厘米高以上、大部分开花时，即应将其刈割覆盖树盘，留茬高度为5～10厘米，一年可刈割3～5次。每次刈割后，借雨趁墒每亩撒施尿素5千克（有机果园要在夏季撒施腐熟好的有机肥300～500千克）。生草3～5年后，草开始老化，应及时翻压，重新播种。结合施用有机肥进行深翻改土是进行土壤改良的有效方法，大量施入有机肥可以迅速地改良土壤，同时为土壤提供肥料。改土不能简单地等同于施肥，改土的主要目的是增加土壤有机质，改善土壤结构和理化性状，所用材料主要是经过腐熟的有机肥料，可根据土壤情况调节配方；施肥主要是为土壤提供营养元素，可用有机肥也可用化肥，一般也不用深翻。深翻方法有扩穴深翻、隔行深翻和全园深翻等。苹果园深翻改土最好在秋季，采收后就可以进行，一般和秋施基肥相结合，最好一次将基肥施足。每次用腐熟堆肥3000～5000千克/亩，农家肥4000～6000千克/亩，或商用有机肥500～1000千克/亩。为改土施肥的施肥量比正常施肥量高1倍以上，改土时应注意将有机肥和表土混合均匀后施入，施肥部位在树冠投影范围内。沟深60厘米，沟宽60～80厘米，挖沟时表土、里土分开堆放，可先在沟中填入有机物（如树叶、秸秆、杂草等），再把各种肥料撒在表土上，经搅拌均匀后全部回填（最好能先回填2/3，接着浇上配好的微生物营养液，然后再回填1/3）并做成垄状，施基肥后在施肥沟内灌一次透水。间作通常在苹果幼树期进行，幼年期果树，树冠矮小，可以利用行间间作，种植大豆、甘薯、西瓜、花生和马铃薯等一些矮秆作物。对于成年果树，因其行距宽、结果初期时间长，可以与一些生理习性相近的树种或蔬菜进行间作。果园间作的原则是，间作物与果树没有相同的病虫害；苹果树是喜光作物，间作作物不能对树体有所遮蔽；种植间作作物，应留足树盘，新定植幼树的树盘应在1平方米以上。以后随着树冠的增大，行间间作面积应逐步减小。间作的果园最好间作绿肥。绿肥作物根系强大，茎叶茂盛，特别是豆科绿肥的根瘤菌有固氮作用，刈割后能增加土壤有机质和以氮素为主的多种营养元素，显著改良土壤，提高肥力。种植绿肥，还可覆盖地面，抑制杂草，调节土温，有利于根系的活动。在山地种植绿肥，可减少水土冲刷，保持水土；在沙地则可防风固沙，对盐碱地有防止返碱、降低土壤盐分的作用。间种绿肥的种类，有紫花苜蓿、紫穗槐、草木樨、田菁、毛叶苕子、绿豆、荆条和胡枝子等。覆盖制是利用塑料薄膜、作物秸秆、杂草、糠壳、锯末和沙砾等材料，覆盖在土壤表面的一种土壤管理方法。覆盖可以抑制杂草生长，增加土壤有机质，减少水土流失和水分蒸发。1.秸秆覆盖果园可用麦秸、豆秸、玉米秸或谷糠，也可用杂草等取之方便的植物材料，覆盖全园或带状、树盘状覆盖，秸秆覆盖在我国应用较广。秸秆覆盖可以起到春季保墒的作用，也可以增加土壤有机质含量，提高土壤肥力。但秸秆覆盖费料、费工，只宜在劳动力多、秸秆材料丰富又方便覆盖的地区实施。2.薄膜保墒覆盖常用的薄膜材料是0.02毫米厚的聚氯乙烯塑料膜，白色或无色透明，管理好可用2年，一般只用1年。薄膜保墒覆盖可有效抑制土壤水分蒸发，尤其在春、夏季节，保墒效果非常好，胜过2～4次灌溉。北方地区，3～5月份土壤蒸发量为500～750毫米，薄膜覆盖可以减少水分蒸发40%～70%，还可提高早春地温、抑制杂草生长。3.沙、石覆盖我国西北地区，如河西走廊的农田，包括果园有用沙、石覆盖的传统。其目的主要是保墒，也有使土壤积温增加的效果，这在干旱和半干旱地区及年积温低的地区是非常有意义的。苹果是多年生植物，进行沙、石覆盖比农作物覆盖更有优势，但其缺点是前期人力投入大。沙、石覆盖，可分为长期覆盖和短期覆盖两种类型。长期覆盖，先在幼树树冠下小面积覆盖，后逐渐扩大面积，至带状覆盖或全园覆盖，覆盖厚度为10～20毫米，施肥时可挪动石块，施肥后恢复原覆盖状。短期覆盖，主要在土壤蒸发量最大、降雨最少的季节覆盖，厚度相同。免耕法或免耕制，即果园全园或只一部分地面（另一部分生草或覆盖）用化学除草剂除草，不耕作或很少耕作（故又称零耕法或最少耕作法）。免耕法果园的土壤结构性能好，无“犁底层”，适于果树根系生长发育；同时有利于清园作业，果树病虫潜藏的死枝、枯叶、病虫果和纸袋等一次清除，效率高。用除草剂防除杂草，可结合灌溉、地面追肥或喷施农药进行，劳动强度大大降低。其缺点是，土壤有机质逐年减少，土壤肥力降低；所使用的除草剂会破坏土壤结构，杀死土壤中的微生物和小动物，破坏了果园的生态平衡。有机生产的苹果园不能采用免耕法。清耕制是在果树行间、行内经常中耕，保持果园地面无杂草和土壤表层疏松的土壤管理方法。清耕的优点是干旱季节可保墒；春季中耕提高土温，疏松土壤，有利于土壤微生物活动，促进根系吸收养分；同时可以防除杂草，减少杂草与果树的水分与养分竞争。清耕制的缺点较多：破坏土壤结构，造成土肥易流失，表层以下有一个坚硬的“犁底层”，影响通气和渗水；长期清耕，土壤有机质含量下降较快，对人工施肥，特别是对有机肥的依赖性大；清耕条件下，果树害虫天敌少，虽然清耕果园通风透光好，但不是最佳的生态环境；清耕管理劳力投入多，劳动强度大。我国过去一直提倡清耕制，目前大部分苹果园也都实行清耕制，但综合而言，这种方法并不值得提倡。苹果树作为多年生的深根性作物，树体有贮藏养分的能力，因此，施肥既要考虑当年树体的需要和贮藏营养的需要，也要考虑对翌年产生的影响。苹果树在生长发育过程中，不同的年龄时期和生长季节，表现出对营养元素一定的选择性吸收规律。主要有以下几方面。应根据果树不同发育阶段营养特点确定主施肥料种类。幼果期和初果期以促进树体生长和骨架建立为目的，应以氮肥为主，磷肥、钾肥为辅。盛果期树养分需求量最大，养分的主要作用是维持树体健壮生长，保证产量，提高果实品质，维持结果年限。此期氮肥施用量要适宜，磷肥、钾肥需求量增大。衰老期树磷肥、钾肥要适量，相应加大氮肥用量，以维持树体不衰，并满足一定产量和树体更新的要求。春季果树萌芽、展叶、开花、坐果、幼果发育和新梢生长连续进行。主要消耗上年树体贮藏养分，养分供求矛盾突出，应以氮肥为主、磷肥为辅补充一定的养分。仲夏期间营养生长与生殖生长同期进行，果树物候期发生重叠，出现养分分配与供求矛盾，是苹果树的一个重要的营养临界期，此期追肥应注意氮、磷、钾的平衡关系，增加磷肥、钾肥用量。初秋果实继续发育，花芽持续分化，中熟苹果亦开始着色，此时追肥应以磷肥、钾肥为主，以氮肥为辅，这次追肥将有利于果实后期发育，花芽充实饱满和果实品质的提高。秋施基肥，有利于根系伤口愈合和提高树体贮藏养分。在秋季施基肥。基肥以农家有机肥为主。基肥施用量占全年施肥量的70%。在生长季进行追肥。如萌芽期、开花前和新梢旺长期，坐果及果实膨大期，果实成熟期及新梢停长期等时期均可追肥。依据树体状况，每年以追肥1～3次为宜。幼树每株施纯氮60克、磷（五氧化二磷）30克、钾（氧化钾）50克。初果期每株施纯氮300克、磷（五氧化二磷）150克、钾（氧化钾）250克。盛果期树每生产50千克果实，施用纯氮0.35千克、磷0.16千克、钾0.35千克、农家肥100千克。施基肥，可采取条沟施肥、放射沟施肥和全园撒施浅锄等方式进行。追肥，可采取树盘施肥、穴施水肥和叶面喷肥等方式进行。1.条沟施肥在果树行间、树冠外缘挖施肥条沟，条沟宽30厘米、深25～30厘米，施肥后将沟填平。这种方式适宜密植果园，便于机械化作业（图4-1）。2.放射沟施肥在距树干60厘米左右处，挖5～8条放射状施肥沟，施肥沟里窄外宽，外宽20～30厘米，里浅外深，外深15～30厘米。这种方式适宜给稀植大树施肥时采用（图4-2）。图4-1 条沟施肥图4-2 放射沟施肥3.穴施水肥这种方式的施肥灌水穴，直径为20厘米左右，深度30厘米，中间置入一个草把。依据每株树树体大小，在树冠下挖3～8个穴。在每穴中用氮肥、磷肥和有机肥按1：2：50的比例配成的混合肥，回填在草把外围，踏实，略低于地面。每次灌水5～10升，并用地膜覆盖（图4-3）。通过肥水的渗透浸润，完成对苹果树的浇水与施肥。4.叶面追肥叶面追肥，是通过对苹果叶片、枝干喷施肥液，完成对苹果树的追肥。苹果树叶片追肥的肥液适宜浓度见表4-1。图4-3 穴施水肥加覆膜种类浓度（%）时期效果尿素0.2～0.3开花至采果前提高产果率，促进生长发育硫酸铵0.1～0.2同上同上过磷酸钙1.0～3.0（浸出液）新梢停止生长有利于花芽分化，提高果实质量草木灰2.0～3.0（浸出液）生理落果后，采果前同上氯化钾0.3～0.5同上同上硫酸钾0.3～0.5同上同上磷酸二氢钾0.3～0.5同上同上硫酸锌3～5萌芽前3～4周防治小叶病0.2～0.3发芽后硼酸0.1～0.3盛花期提高产果率硼砂0.2～0.55～6月份防治缩果病加适量生石灰柠檬酸铁0.05～0.1生长季节防治黄叶病表4-1 苹果树根外追肥的肥液适宜浓度施肥的原则一是以提高土壤有机质含量为中心（土壤有机质含量应达到1.5%以上），重施有机肥；二是有机肥与无机肥相结合，按照控氮、稳磷、增钾的原则，科学、适时、适量追施化肥；三是重视微量元素的补充。1.无公害果园施用有机肥的作用（1）促进土壤团粒结构的形成 果园施入有机肥后，在微生物的作用下，可转化为有机质，进一步形成一种特殊的黑色黏团状物质——腐殖质。腐殖质可与土粒结合在一起，使分散的土粒相互胶结起来，从而形成大大小小的团粒，即我们常说的“团粒结构”。土壤团粒结构的形成，可以增强土壤的保肥保水能力，从而收到以肥调水、以肥蓄水和以肥节水的良好效果。这一点在旱塬地区尤显重要。（2）供给果树多种养料 有机肥营养成分全，含有果树生长发育所需的多种营养元素。有机质在转化过程中除形成腐殖质外，另一途径则是矿化过程。矿化过程能把有机质中果树不能吸收利用的各种养料变为可给态养料，如将氮、磷、钾、钙、镁、硫、铁、硼、锌等释放出来，供果树吸收。这便是养料的释放过程。而有机质变为腐殖质则是养料的积累过程。积累在土壤中的腐殖质，在一定的条件下，又可以经过缓慢分解而释放出养分，供果树吸收利用。因此，施用有机肥，不仅能在较短时期内供给果树养分，又能在较长时间持续发挥作用，从而满足果树对多种营养元素的需要。（3）促进微生物活动 有机质是土壤微生物活动不可缺少的能源。因而，施入有机肥有利于土壤微生物繁殖，并增强其活性，进而促进有机物分解，丰富土壤养分。（4）有助于克服缺素症，提高光合效能 有机质分解过程中可产生有机酸及二氧化碳。有机酸能改变土壤的pH值，提高难溶性矿化物的溶解度，这对克服缺素症十分有利；而二氧化碳逸出土壤后则有助于提高果树的光合效能。（5）健壮树势，增强抗性，减少化肥、农药用量，提高品质和产量 果园施入有机肥后，由于改善了土壤结构，丰富了土壤中养分含量，进而促进了果树的吸收和利用，树体生长健壮。这样既提高了果实品质和产量，又大大增强了树体抗御不良环境条件和病虫害的能力。这对减少果园的化肥、农药用量，减少环境和果品污染，保持生态平衡，生产无公害果品具有十分重要的作用。2.可利用的有机肥种类粪尿类包括人粪尿、畜粪尿、禽粪尿、蚕沙（蚕粪）等。这类肥料均为有机质含量丰富，氮、磷、钾等元素全面的完全肥料。（1）厩肥类 是指家畜粪尿和垫圈材料（土）混合堆制而成的肥料。主要包括大家畜厩肥，猪、羊圈肥等。这类肥料有机质含量较为丰富，并含有氮、磷、钾等多种营养元素。（2）堆肥 是以作物秸秆、杂草、落叶等为主要原料进行堆制，利用微生物的活动使之腐解而成。也属营养成分全、有机质含量丰富的完全肥料。（3）饼肥类 是油料作物榨油后剩下的残渣，例如，菜籽饼、棉籽饼、大豆饼、芝麻饼、花生饼等。这类肥料是有机质含量极为丰富并富含氮、磷、钾等多种营养元素的优质肥料。（4）秸秆类 作物秸秆如麦秸、玉米秆、甘薯蔓、豆蔓、花生蔓等以及杂草、树枝、落叶等。这类肥料有机质含量丰富，营养成分全面。（5）杂肥类 主要包括垃圾、炕土肥、草皮土、屠宰场的废弃物等。这类肥料也含有一定数量的有机质和多种养分，均可广泛收集利用。上述肥料可根据实际情况选择使用。3.果园养猪、鸡广辟肥源，大力发展果园养猪，实现果、畜并举，是解决果园有机肥、提高经济效益的有效途径。陕西白水、澄城等县果农已在果园养猪方面积累了成功的经验。其具体做法是：将猪舍建在果园，猪圈内铺成水泥地面，外侧建一积粪池，粪便排入池内，根据需要随时灌施，极为方便。这样，每头猪每年可满足亩果园有机肥的需求量；同时，又大大减少了化肥用量。果园养鸡是开辟有机肥源的又一重要途径。为满足有机肥的需求量，养鸡数量以每亩果园20～30只为宜。采用放养的方法。鸡排出的粪便直接为果园增加了有机肥，培肥地力效果非常显著。同时，鸡又是害虫的天敌，不但能捕捉地面的昆虫，还能刨土啄食成虫、幼虫、蛹和卵块，起到生物防治害虫的作用。果园喷药期间，应将鸡群笼养几天，然后再放入果园。如果将果园养殖与沼气设施配套，就能更好地供给果树高质量的有机肥，充分发挥其经济效益和生态效益（参考本章第三节“高效沼气生态果园模式”）。4.无公害果园有机肥施用量施用有机肥应以肥足量饱为原则，并注意混施适量氮素肥料。根据这一原则，现将施肥量按单位面积总量列表于后，具体应用时可根据不同的栽植密度按每亩施肥总量平均分配于各单株（表4-2）。表4-2中施用有机肥的种类可根据当地实际情况选择其中一类。未列入表内的有机肥如堆肥、杂肥类，可参照厩肥施用量酌增。5.施肥时间及方法有机肥应以施基肥方式于秋季果实采收后尽早施入。施肥方法可采用环沟法、条沟法或放射状沟施法。生草果园以放射状沟施法为宜。无公害果园若能按前述要求施用有机肥，就可以不施用化肥。如果未能做到年年施用有机肥或有机肥施用量不足时，还应在生长期追施化肥2～3次。值得注意的是，生长期追肥务必克服以往盲目地施用化肥或偏施氮肥的现象，必须依据果树生长发育对肥料需求的特点，及时而适量追肥，尤其要重视氮、磷、钾的合理搭配，做到按配方追肥。关于氮、磷、钾的配比问题，因各地土壤条件不同，差异很大。根据大量的研究成果，幼树氮、磷比一般应达2：1；结果期树氮、磷、钾比，黄土高原地区为1：1：1；渤海湾地区及黄河故道地区为2：1：2。现以黄土高原地区为例，提出生长期追肥的时期及单位面积上的适宜追肥量。树龄（年）有机肥种类亩施肥量（千克）速效氮纯氮亩施用量（千克）幼树期（1～3）厩肥、绿肥、秸秆类1500～3000粪尿类1000～1500饼肥150～2005.0～10.0初果期（4～5）厩肥、绿肥、秸秆类3000～4500粪尿类1500～2500饼肥250～35010.0～12.5盛果期（6年以上）厩肥、绿肥、秸秆类4500～7500粪尿类3000～4500饼肥450～60012.5～25.0表4-2 无公害果园有机肥施用量值得注意的是，萌芽前追肥以氮为主，花芽分化期以磷为主，果实膨大期以钾为主。同类肥除表4-3中所列之外，还可选用其他种类，但其用量应根据各自的有效成分参考表中用量酌情增减，使其达到表中的施肥量标准。苹果树的具体灌溉时期，是由两个因素决定的。一是苹果生长发育中需水的关键时期；二是天气干旱、土壤含水量较低，不利于苹果生长发育的时期。苹果生长发育中的需水时期：萌芽开花期，新梢旺长期（需水临界期），果实膨大期，采果后的秋季生长时期。土壤相对含水量保持在60%～80%，有益于果树根系对水分及营养的吸收。若含水量低于60%，特别是恰逢果树生长发育关键需水期，就应该及时灌水。土壤相对含水量低于40%时，为轻度干旱，低于20%则为严重干旱。在苹果树栽培过程中，要避免干旱现象的发生。应根据土壤水分状况，土壤性质，同时也要根据果树大小、栽植密度以及生育期需水特点，综合确定灌水量。其计算公式为：漫灌成年果园。每亩需水30～60吨。采用节水灌溉技术，可节省用水1/2～2/3。漫灌节水的灌溉方式，有沟灌、滴灌、移动灌溉和穴施水肥等。如图4-4，沿树冠外侧开沟，并在株间连通。沟深20厘米，宽30厘米。沟中起出的土可加在沟边起垄。沟灌水流不宜太快，以保证水分的渗入时间。图4-4 沟灌利用管道将加压的水通过滴头，一滴滴地均匀缓慢地渗入果树根部附近的土壤，使根际土壤经常保持在适宜水分状况的一种先进节水技术。目前，一些简易移动式滴灌系统，由水泵及配套塑料软管组成的滴灌装置已广泛应用。其具体的组成如图4-5所示。图4-5 滴灌系统示意图固定式喷灌设备因投资多而应用较少。移动式喷灌在坡地等不平整土地果园上使用，具有省水、省工等优点。在密植平地果园，现在发展的一种软管移动式微喷系统，很有推广前景。移动式喷灌系统，一般由水源、水泵、干管、支管、竖管和喷头组成（图4-6）。图4-6 喷灌系统示意图

生产实践业已证明，应用抗病品种是枯萎病综合防治技术体系中的核心技术，也是防治枯萎病最经济、有效的技术途径。据1984年的全国棉花枯、黄萎病综合防治研究协作组的统计，全国种植棉花面积约8800余万亩，而黄、枯萎病的发病面积近2200万亩，占调查面积的31.3%，年损失皮棉75万～100万t，折合人民币2亿～3亿元。可是推广了以种植抗病品种为中心的综合防治技术以后，枯萎病的发病率压低到5%以下，挽回了皮棉损失。同时，由于节省了农药等开支，极大地降低防治费用，杜绝了人畜中毒事故和环境污染，保护了棉田生态环境，取得了显著的经济、生态、社会效益。而抗枯萎病育种的成效取决于对病原菌与寄主（棉花）的互作关系和枯萎病抗性遗传规律的认识，抗源的获取以及科学的育种方法。了解病原菌与寄主（棉花）之间的交互作用，是选育抗棉花枯萎病品种的重要理论依据之一。这里包括两方面内容：一是垂直抗性与水平抗性；二是基因对基因假说。这一理论观点由Van Der Plank（1963）提出。寄主对某些病原生理小种具有免疫或高抗性，可是对另一些生理小种则是高度感染的。表明了同一寄主品种对同一病原菌的不同生理小种具有“专化”反应，寄主品种的抗病力与病原菌小种致病力间有特异的相互作用。它通常受单基因或几个主效基因所控制。杂交后代一般按孟德尔定律分离。这类抗性的遗传行为简单，抗、感差别明显。在一般情况下，抗病对感病为显性，易于识别，常被育种家所重视。垂直抗性多表现为过敏性反应。它能把病原菌局限在侵染点和具有抗定殖的作用；同时，由于它能抵抗某些对它不能致病的小种，因而在发病初期，它有减少接种体数量的作用。但这类抗病性常会随病原菌生理小种的变化而丧失。如果在大面积生产上，单一地推广具有该类抗性的品种时，容易导致侵染它的生理小种上升为优势小种而被感染淘汰。这在小麦条锈病和稻瘟病抗病品种大面积连年推广种植上已有惨重教训。要保持其抗性的稳定，必须是寄主为异质群体，或寄主群体在时、空分布上呈不连续性，否则，抗性难以持久稳定。在遗传上，小种专一化抗病性通常表现为单基因性状，这种抗病性对感病性往往是显性的。一个单基因能抵抗病原的一个小种或多个小种。在垂直抗病性中，寄主是垂直抗性的差别，而病原菌致病性的差别则是毒性差异。亦可称为非专化抗病性（non-specific resistance）。水平抗性指寄主品种对各个病原生理小种的抗病反应，大体上接近于同一水平，它对病原菌的不同小种没有“特异”反应或“专化”反应，几乎在同一水平线上。它的作用主要表现在能阻止病原菌侵入寄主后的进一步扩展和定植，表现为潜育期较长，病斑小而少，病原菌繁殖体的数量相对较少。因而病害发展的速度较缓慢，程度较轻。在农业生产中，人们长期利用水平抗性，但因其抗、感症状表现不如垂直抗性明显，鉴别较难，过去在抗病育种中往往忽视了具有水平抗性的品种。由于它对病原菌生理小种不形成定向选择的压力，因而不致引起生理小种的变化，也不会导致品种抗性的丧失。所以，在抗病育种中，人们越来越重视具有一定水平抗性品种的选育。现阶段，我国已经推广种植的抗枯萎病品种，几乎多属于此类型，故能比较长期地、并在不同生态地域均保持着较高的抗病性，如川52-128。自Van Der Plank（1963）提出垂直抗性与水平抗性概念以后，也存在着不同看法。如Wolfe（1972）认为寄主的抗病性从感病到免疫是一个连续的统一体，病原菌的致病性，从无致病力到强致病力，也是一个连续的统一体。寄主和病原物的相互作用，可有各种各样的表现形式。Arnold等（1968）认为垂直抗性和水平抗性并没有根本的区别，只不过是总抗病性系统中的特殊情况。Zadoks等（1977）则认为，在垂直抗性和水平抗性的情况下，寄主的抗病力和病原菌的致病力间都有相互的特异作用。在与农作物病害的斗争中，有80%以上是靠抗病品种来防治或减轻其为害的。但实践表明，抗病品种在生产上应用若干年后，常会丧失抗病性。为了克服品种抗病性过早丧失，有些学者提出持久抗病性（durable resistance）或稳定抗病性（stable resistance）的概念。这是指适于某种病害发生流行的环境条件下，某一个抗病品种在大面积生产上推广多年后，抗病性仍较长期保持而不丧失，当然不意味着永久不变异。这一理论观点由Flor（1974）提出。病原物与寄主植物的关系，即现在所提的互作关系，就是在一定条件下，植物发病过程中寄主和病原物相互作用，由一系列的生理、生化和遗传调控过程而决定病症表现的类型。Flor（1947）曾以亚麻锈病（Melampsora lini）为代表进行研究寄主和病原物之间的相互关系认为，寄主中有一个调节抗病性的基因，而病菌中也有一个相应的基因调节病菌的致病性。如寄主有2个或3个基因决定抗病性，于是病菌中也有2个或3个相应的决定无毒性的基因。基因组合表示寄主的抗病性表达需要寄主中决定抗病性的基因和病菌中决定无毒性的基因互作，即寄主的抗病性不亲和性是病菌和寄主特异性互作的结果。由此抗病性被认为是主动过程，而寄主的感病性则是由于缺乏抗病基因或病菌缺乏无毒基因而表现出的被动显症。此论点认为，寄主与病原菌长期共存于自然界，实际上正因为寄主存在着抗性基因，才能使其世代延续，而不被病原菌所毁灭。所以，物种间的抗性或不同程度的抗性，是长期自然选择和人工选择的结果。棉花抗枯萎病育种的基本程序包括4个环节：①发现和创造变异；②稳定和选择变异；③鉴定和比较变异；④保持变异。所有环节都是围绕着变异进行的。棉花的性状变异可分为两种：一种是可遗传变异，即这种变异性状可以传递给以后的世代；另一种是不可遗传变异，即这种变异性状只在当代表现，不能传递给以后的世代。可遗传变异又可区分成两种类型：一类是有益性状变异，即符合育种目标的遗传性状变异，也叫符合人类栽培利用目标，能够提高经济利用价值的变异；另一类是有害性状变异，即不符合育种目标的遗传性状变异，是同人类经济利用的目标方向相反的变异。育种所需要的仅仅是可遗传的有益的性状变异。棉花育种的任务是将现有推广品种还不具有的而生产上又迫切需要的一些新的经济或农艺性状引入新品种中，或将尽可能多的有益的经济或农艺性状集中到一个新品种中。育种的创新意义即在此。这些有益的经济或农艺性状，须是可遗传的有益的性状变异，这是育种的前提。如果没有这些变异，就不会有育种。这些有益的变异可能存在于现有品种或过时品种群体中，但更多地存在于极为丰富的种质资源中，拥有大量丰富的种质资源材料是棉花育种的基础。因此，卓有成效的育种一般需要形成一个丰富的种质资源库，育种家们深入细致地研究这些种质资源，从中寻找、发现和发掘与育种目标相符的新的性状变异。如局限在已有材料中，则很难发现符合育种目标的性状变异。棉花育种可利用的变异主要来自两种途径：一是自然变异；二是人为变异。自然变异的引发，大多数是由于天然杂交，但也有少数来自偶然的某种外力或个别棉株自身某些不明原因诱发的自然突变。人为变异主要是通过有目的的人工杂交，但也可利用物理化学等手段，或自然界其他条件进行人工诱变。从广义上讲，将非棉花及其近缘植物或其他生物的某些性状，运用特殊技术手段引入棉花中，也属于人为变异的范畴。棉花是常异花授粉作物，存在一定的异交率。异交率的高低取决于传粉媒介——昆虫的种类和种群的大小。田间的传粉媒介多，棉花的天然异交率就高，容易引发较多具有变异性状的变异株，就提供了育成具有优良性状新品种的机会。这是棉花系统选择取得成功的原因。但随着棉花生产的发展，棉花害虫种类日趋繁多，为害程度日益严重，种植棉花不得不频繁地采用杀虫药剂。在防治害虫的同时，也杀死了棉田传粉媒介，大大减少了棉花异交的机会，从而降低了性状变异几率、包括优异性状变异和优异株出现的频率。这也许是多年来单纯依靠系统选择难以育成有突破性新品种的主要原因。棉花群体中也常会出现个别的自然突变体。这主要是由于染色体畸变或某些基因位点突变而产生的变异性状。其中，有有利的，也伴有不利的经济性状变异。但发生这类突变的几率一般很低，且以质量性状为多。人为变异主要是通过人工杂交，引起基因交换、重组而发生新的性状变异。从本质上讲，这是天然异交的延伸和扩大，弥补了自然杂交几率日益低下的现状。它比之自然杂交的优点是：一能有目的地选择性状变异的方向；二能主动掌握性状变异的频率。但它的不足之处：一是不能确保有较高的成功率；二是仅限于在现有种质基因库范围内引发变异。所以，必须加强种质资源的收集、扩大和研究等基础工作，并进行较大量的杂交。人为变异的另一途径是通过物理或化学等手段诱发新的性状变异。其优点可超越现有的棉花种质基因库，创造出新的性状变异；但缺点是：①难于诱发有利经济性状的变异，而更多的属于不利经济性状；②诱变的频率低。因此，棉花育种利用这类性状变异的难度较大。应用生物技术，导入外源DNA，是定向诱发棉花产生新的性状变异的现代高新技术。优点是使常规人工杂交所不能跨越的亲缘障碍成为可能，在棉花染色体上不仅可导入与棉花非一个属、科、目的植物DNA，甚至可导入节肢动物等其他动物的基因。如报道的培育手感柔软胜似棉花的转兔角蛋白基因棉花。外源DNA导入，是创造变异的一种技术手段，是育种过程中的一个环节，在创造变异后的大量工作，仍需按常规育种环节进行。随着中国宇航技术的发展，已多次运用太空卫星，搭载棉花种子，通过太空失重、宇宙线照射、温度和时律的变化等因素引发基因变异。但其变异方向与遗传性正在进一步研究中。不管是自然变异或人为变异，其中，有符合育种目标需要的变异，也有不符合育种目标的变异。一般是在发现有利变异的同时，也可能相伴产生一些不利变异。这种变异，有的只是表现型的，其遗传性尚未稳定，还不能作为育种目标性状固定下来。所以，在发现或创造变异之后，育种的第二个环节就是稳定和选择变异。稳定变异是为了保证变异的有效选择，是选择变异的前提。稳定变异的主要手段是加代。随着世代的增加，杂合体变异性状得到分离和表现型变异性状得到纯合，使所有的变异，不管是有利的还是不利的，其遗传性相对稳定下来。棉花经济性状的遗传率高低不一。一般地，遗传率高的性状，如单基因控制的质量性状，低世代时就能达到相对稳定；遗传率低的性状，如多基因控制的数量性状，只有在较高世代时才能达到相对稳定。变异性状只有达到相对稳定，不再出现明显分离时，选择才有效。不同变异性状选择的最适宜世代并不一样。为了增进加代速度，缩短育种年限，在我国，利用18°N上下的海南岛南端冬季气温较高，又是旱季的有利条件，进行秋播、冬长、春收。这样，棉花就能在一年内完成两个世代周期。但海南岛与大陆棉区的气候、生态等条件差别很大，一般在海南加代期间不进行选择，但也有加代选择成功的例证。有条件的也可在当地，冬季利用大型可控温室进行少量材料的加代。随着生物技术的发展，可利用单倍体培养技术，将变异性状的染色体加倍，或克隆复制变异株的体细胞，经组织培养，形成再生植株，获得较为稳定的变异材料。选择变异是贯穿新品种选育始终的重要环节。棉花育种的创造性，主要是通过选择来实现。对已相对稳定的性状变异材料，紧接着就是一系列的选择过程。选择变异，既是技术，也是艺术。要紧紧瞄准育种目标，运用科学的试验方法和测试手段，层层筛选，尤其要依赖于育种家的丰富经验和高超的业务素质。要重视田间选择、室内选择和生长前期选择，更要重视生长后期和多方位的反复选择。要自始至终贯彻精益求精、优中选优的原则，在众多的个体中，不遗漏一株优异的变异株，也不滥竽充数多留一株劣变株，以保证育成高质量的新品种。根据确定的育种目标，选择已经相对稳定的变异后，需根据留优汰劣的原则，通过科学的鉴定和比较，才能确认某些优异变异性状成为育成新品种的属性，这是选择的继续。鉴定是在特定条件下，对某一变异性状进行有效性的直接鉴别和确认。例如，抗枯萎病性、抗黄萎病性、抗棉铃虫性、抗棉蚜性、抗旱性等。抗枯、黄萎病性鉴定，原则上是在人工接种、发病均匀的病圃中进行，也可在重发病区选择发病均匀的自然病圃中进行。抗虫性鉴定需在人工隔离环境中接种一定量的害虫数。抗旱性鉴定需设置遮雨和防止地下水浸入等设施。有些性状也可利用生物、理化反应法进行间接鉴定，但最后仍需进行直接鉴定。鉴定时要求设置抗性和感性两个对照，还需要多点、多年或多次重复，尽量减少误差，以避免年份和环境引发的影响干扰。纤维品质测定，是确保棉花新品种纤维品质必不可少的鉴定内容。利用HVI系列测试仪器，由于每份测试样本量小，要求用随机法抽取皮棉样本，以增加样本的代表性。育种材料的比较这一程序既重要，也繁复。随着育种进程，对照育种目标，全面考虑丰产性和有关经济、农艺性状的要求，从初级到高级，进行比较试验和鉴定，并根据结果进行逐级淘汰。对保留的材料要求要高，必须重视性状的综合表现；淘汰材料要慎重。过去的育种实践中，从原来因疏忽被淘汰的材料中，后来又选育出较突出的新品种的育种事例也有。棉花育种材料的比较，一般从株行试验，到株系试验、品系试验、区域试验和生产试验，逐级进行。从株系试验开始进行有重复的比较试验；从区域试验开始进行多点、多年有重复的比较试验。优良变异性状的稳定是相对的，而得到的稳定性状发生再变异则是绝对的。再变异的方向不能确定，往往是优变的几率较少，而劣变的几率更多。这就是品种的退化。棉花良种退化是困扰棉花生产的一大难题。常常是一个良种推广不久就发生退化，削弱了良种的作用。所以，重视和切实采取有效技术，保持育种目标所要求的变异性状，就显得十分重要。这就是良种繁育。良种繁育的任务是保持住优良品种的种性、纯度，即保证良种的品种品质。纯度是指品种纯度，并非遗传纯度。从农业生产的实际需要出发，并不要求品种在遗传上的纯化。品种本来就是一个遗传复合体，诸多性状不需要、也不可能达到遗传上100%的纯度。但必须保证主要经济性状表现型的相对一致性和稳定性。要达到这一目的，在技术上必须最大限度地避免育成的新品种发生生物学混杂和机械混杂。因为混杂的发生，必然会导致主要经济性状的退化。棉花品种的退化，往往会出现绒长变短、衣分下降、纤维变粗、铃重变轻、营养生长过旺等非人们植棉所企求的性状。在棉花进化过程中，存在着两种选择的激烈竞争。一是自然选择，另一是人为选择。自然选择的方向是按照有利于棉花物种自身的生存和繁衍更多的后代进行的。人为选择的方向是按照人们植棉所企求的经济性状进行的。两者虽有共同点，而在经济性状方面多数是反方向的。若竞争结果是前者超过后者，即出现“退化”现象。所以，“退化”是人们从植棉目的的角度给予的评价。但从棉花物种发展的角度评价，这种“退化”恰恰正是棉种自身需要的“进化”。生物学混杂和机械混杂给人们认为的“退化”创造了条件。所以，只有一方面尽量限制生物学混杂和机械混杂的机会，另一方面当人为的选择压超过自然选择压时，才能保持种性，即保持住育种目标所企求的变异性状相对稳定，不发生劣变，不发生“退化”。这就是良种繁育的功能。棉花对枯萎病抗性的遗传，国内外的研究报道较多，但结论不完全一致，多数认为，抗枯萎病性是由多基因控制的。Fahmy（1927）用免疫品种与感病品种杂交，F1是免疫的，F2分离出75%的免疫株、15%的耐病株和 10%的感病株。免疫株可固定不再分离，说明它是纯合的；耐病类型可再分离出免疫株、耐病株和感病株3种类型都有；而感病株一般在苗期便死去。他在以后的试验中，Fl、F2也出现类似情况。而在海岛棉中，他认为，是由一个显性基因和几个微效基因所决定的。Kelkar等（1947）也指出，海岛棉的抗枯萎病性是由1个显性基因和1个到多个修饰基因所控制的。在亚洲棉中，他发现了2个互补显性抗病基因和第三个具有抑制作用的基因。Jones等（1957）在用具有半半棉血统的珂字棉100GA与德字棉425的研究表明，在枯萎病和肾形线虫并存的情况下，其抗性由2～3个基因控制。Smith等（1960）认为，陆地棉对枯萎病的抗性是受一个主效显性基因和一些修饰基因所控制；而海岛棉的抗性是受2个具有加性效应的显性基因控制。Jobes（1961）以抗病的德字棉425、珂字棉100GA与感病的半半棉杂交，F2、F3群体中，抗、耐、感病植株数量呈连续变异，故认为是数量性状遗传，其抗病性是由2～3个基因所控制。Kappelman （1971）用P1、P2、F1、F2、BC1F1、BC2F2 6个世代在6种不同条件进行试验后指出，在42个试验中，有34个的抗枯萎病性的加性效应是显著的，有2个的显性效应是显著的，有8个的上位性效应是显著的。在这10个非加性效应为显著的实例中，除1个外，加性效应也是显著的。所以，他认为，对他所研究的材料而言，加性基因效应最能说明棉花枯萎病抗性的遗传。Aibeles（1978）也认为，棉花对枯萎病抗性遗传的基因作用，加性效应大于显性效应。Singh等（1988）在亚洲棉的完全双列杂交后代研究中认为，抗病性是显性，而且一般配合力方差大于特殊配合力方差，说明对抗性遗传的基因作用，也是以加性效应为主。但Rird （1973）认为，棉花对枯萎病的抗性属于显性基因效应。Megahed等（1984）在不同类型海岛棉的双列杂交中发现，对枯萎病抗性表现明显的杂种优势，说明基因效应是非加性的。在F1和F2中，一般配合力和特殊配合力都显著，但特殊配合力比一般配合力更强，说明其遗传的基因效应是非加性的显性效应，抗性受微效多基因所制约。Campagnaco（1971）认为，大多数杂交组合的抗枯萎病性是单基因的不完全显性遗传，F2可分离出抗病和感病类型。但是，有的研究结果认为，棉枯萎病抗性是显性单基因遗传的。Netzer （1985）用陆地棉与海岛棉杂交也认为，棉花枯萎病抗性是一个显性基因控制的。冯纯大等（1996）报道，16个抗×感组合的F2代抗、感植株出现3∶1分离比例，亦证实抗枯萎病性受一对基因控制。20世纪70年代，陕西省棉花研究所、原北京农业大学（现中国农业大学）、江苏南通地区农业科学研究所等从大量杂交后代的分析中认为，杂种后代对枯萎病的抗性，与亲本的抗性水平密切相关。在感×感组合中，后代的抗性差；双亲抗性中等或在抗×感组合中，后代多为耐病；在抗×耐或抗×抗组合中，后代的抗性强等。并从育种实践中，总结出一些抗枯萎病性遗传的趋势。据王远等（1980）研究，陆地棉抗枯萎病受显性基因控制，双亲之一具有抗枯萎病性，其后代则表现抗病，因此，采用耐病、丰产、优质品种作母本，高抗枯萎病品种作父本，以培育优质、丰产、抗病品种。校百才（1985、1988、1992）多年采用不同组合的试验表明，抗枯萎病性的一般配合力方差大于特殊配合力方差，说明抗枯萎病性的遗传中，加性效应是主要的。其狭义遗传率分别为42.6%、19.5%和46.5%；广义遗传率127121分别为72.5%、35.2%和76.98%。李俊兰（1987）用4个抗病×感病的陆地棉组合后代分析后表明，各组合抗病性遗传中的加性成分达到了极显著水平；有一个组合的显性效应及加性×加性、显性×显性上位效应和另一组合的加性×加性上位效应也达到了显著水平。各组合的广义遗传率127121平均为66.32%。王振山等（1989）在抗×感、抗×耐和抗×抗等类型组合的P1、P2、F1、F2、B1和B2各世代的平均数分析中指出，所有组合的抗枯萎病性的加性效应均达显著水平；但也还存在显性和上位效应，如在抗×感组合中，抗病性的加性效应、显性效应、加性×显性上位效应都有作用；而在抗×耐组合中，主要是加性和显性效应。并认为抗枯萎病性是受多基因控制的。张凤鑫等（1990）用44个品种做试验的结果表明，陆地棉抗枯萎病的广义遗传率为86.7%，属遗传率高的性状。张金发等（1994）在发病严重而均匀的田间病圃中，对4个抗病品种和4个感病品种的8个亲本及其28个Fl（无反交）进行抗枯萎病性鉴定发现，亲本的抗性水平与其配合力效应、显性作用大小是基本一致的，以苏棉3号、中棉所12和鄂62-1的抗性最高，配合力最好，显性作用最大，是较好的抗病亲本。Hayman-Jinks法分析表明，抗病性为部分显性，以加性效应占优势，显性效应较小，无上位性。广义和狭义遗传率均很高，分别为91%和83%，至少有一组显性抗病基因控制棉花枯萎病抗性的遗传。校百才（1985、1988、1992）多年采用不同组合的试验表明，抗枯萎病性的一般配合力方差大于特殊配合力方差，说明抗枯萎病性的遗传中，加性效应是主要的。其狭义遗传率分别为42.6%、19.5%和46.5%；广义遗传率127121分别为72.5%、35.2%和76.98%。李俊兰（1987）用4个抗病×感病的陆地棉组合后代分析后表明，各组合抗病性遗传中的加性成分达到了极显著水平；有一个组合的显性效应及加性×加性、显性×显性上位效应和另一组合的加性×加性上位效应也达到了显著水平。各组合的广义遗传率127121平均为66.32%。王振山等（1989）在抗×感、抗×耐和抗×抗等类型组合的P1、P2、F1、F2、B1和B2各世代的平均数分析中指出，所有组合的抗枯萎病性的加性效应均达显著水平；但也还存在显性和上位效应，如在抗×感组合中，抗病性的加性效应、显性效应、加性×显性上位效应都有作用；而在抗×耐组合中，主要是加性和显性效应。并认为抗枯萎病性是受多基因控制的。张凤鑫等（1990）用44个品种做试验的结果表明，陆地棉抗枯萎病的广义遗传率为86.7%，属遗传率高的性状。张金发等（1994）在发病严重而均匀的田间病圃中，对4个抗病品种和4个感病品种的8个亲本及其28个Fl（无反交）进行抗枯萎病性鉴定发现，亲本的抗性水平与其配合力效应、显性作用大小是基本一致的，以苏棉3号、中棉所12和鄂62-1的抗性最高，配合力最好，显性作用最大，是较好的抗病亲本。Hayman-Jinks法分析表明，抗病性为部分显性，以加性效应占优势，显性效应较小，无上位性。广义和狭义遗传率均很高，分别为91%和83%，至少有一组显性抗病基因控制棉花枯萎病抗性的遗传。校百才（1985、1988、1992）多年采用不同组合的试验表明，抗枯萎病性的一般配合力方差大于特殊配合力方差，说明抗枯萎病性的遗传中，加性效应是主要的。其狭义遗传率分别为42.6%、19.5%和46.5%；广义遗传率127121分别为72.5%、35.2%和76.98%。李俊兰（1987）用4个抗病×感病的陆地棉组合后代分析后表明，各组合抗病性遗传中的加性成分达到了极显著水平；有一个组合的显性效应及加性×加性、显性×显性上位效应和另一组合的加性×加性上位效应也达到了显著水平。各组合的广义遗传率127121平均为66.32%。王振山等（1989）在抗×感、抗×耐和抗×抗等类型组合的P1、P2、F1、F2、B1和B2各世代的平均数分析中指出，所有组合的抗枯萎病性的加性效应均达显著水平；但也还存在显性和上位效应，如在抗×感组合中，抗病性的加性效应、显性效应、加性×显性上位效应都有作用；而在抗×耐组合中，主要是加性和显性效应。并认为抗枯萎病性是受多基因控制的。张凤鑫等（1990）用44个品种做试验的结果表明，陆地棉抗枯萎病的广义遗传率为86.7%，属遗传率高的性状。张金发等（1994）在发病严重而均匀的田间病圃中，对4个抗病品种和4个感病品种的8个亲本及其28个Fl（无反交）进行抗枯萎病性鉴定发现，亲本的抗性水平与其配合力效应、显性作用大小是基本一致的，以苏棉3号、中棉所12和鄂62-1的抗性最高，配合力最好，显性作用最大，是较好的抗病亲本。Hayman-Jinks法分析表明，抗病性为部分显性，以加性效应占优势，显性效应较小，无上位性。广义和狭义遗传率均很高，分别为91%和83%，至少有一组显性抗病基因控制棉花枯萎病抗性的遗传。对棉花枯萎病抗性的遗传研究，以前多采用Griffing的配合力模型及其分析方法估算配合力效应，再用Hayman（1954）的双列分析方法估算遗传方差分量和遗传率。由于这是两个不同的遗传模型和分析方法，对一组资料分析的结果可能不尽相同，对多世代材料也不能同时进行综合分析。为此，韩祥铭等（2001）采用朱军（1997）提出的混合线性模型ADM遗传模型和ADAA遗传模型估算遗传方差和遗传率并对估算的参数进行显著性检验，从而可对亲本和组合的遗传表现进行评估。结果表明，棉花枯萎病抗性遗传，加性方差占表现型方差的49.9%，显性方差占表现型方差的13.1%，母体方差占表现型方差的0.8%，母体效应很小，主要是加性效应和显性效应，显性和环境的互作效应占表现型方差的27.0%，差异极显著，表明显性效应易受环境因素影响。广义遗传率为63.0%，狭义遗传率为49.9%，棉花枯萎病抗性遗传以加性效应为主，遗传率较高，在重病地连续选择抗病株，有利于提高枯萎病抗性。由于不同试验所用材料、鉴定方法和技术的不同，加之棉花受多种枯萎病菌生理小种侵染，抗病基因对病菌不同生理小种的抗性不同，不同的生理小种要有不同的抗病基因，不同的生态环境，有不同的生理小种。在自然生态条件下，枯萎病菌多种生理小种可能同时存在，这样就造成了棉花枯萎病抗性遗传研究结果的多样性。但多数研究结果表明，枯萎病抗性遗传以加性效应为主。育种实践也证明，在发病均匀的重病地，连续选抗病株能选育成抗病品种。因此，进行枯萎病抗性遗传研究，对棉花育种工作有指导意义。棉花对枯萎病抗性与对其他病害抗性的关系，赵俊兴等（1991）对多个品种，通过线性相关分析指出，棉花品种对枯萎病和黄萎病的抗性为高度正相关，也说明品种对两种病害的抗性间有显著的相关关系，这证实选育兼抗枯、黄萎病品种的可能性。马存等（1992）的鉴定指出，抗枯萎病的陆地棉品种，也能抗苗病。Shepherd（1986）报道，棉花枯萎病的发病率与根结线虫的产卵量呈高度正相关（r=0.73**），并指出，具有抗根结线虫基因的棉株，其根际或根部所渗出的物质，可特意地诱导对枯萎病菌有抑制作用的微生物，因而表现出抗病性。关于抗枯萎病性与其他农艺性状间的相关关系，也有不同的试验结果。Patel等（1950）认为，新百万棉（NewMillion Dollar）品种的抗枯萎病性，似与不利的农艺性状相连锁，Sappenfield （1963）报道，棉花品种对枯萎病的抗性与皮棉产量呈负相关等。由此认为，抗病品种的农艺性状较差。中国在选育、推广抗枯萎病品种的初期，也有类似的观点，但后来的试验和实践证明，这种现象不是普遍规律。马存（1985）的研究指出，无论在中水肥或高水肥条件下，枯萎病越重，对皮棉产量和多数纤维品质的损失越大。在中水肥条件下，枯萎病病指每增加1，皮棉产量的损失0.94%。李俊蓝（1987）的试验也指出，枯萎病的病级与籽棉产量、皮棉产量、单株结铃数、铃重、纤维断裂长度间的r依次为-0.3285，-0.2990，-0.2991，-0.2441和-0.046，即发病越重，产量和纤维强度越低。周雁声等（1985）用参加全国抗病区试的品种资料进行分析，研究结果显示，枯萎病的病株率与铃重、衣指、籽棉产量、皮棉产量、纤维强力呈极显著的负相关，病指与单株结铃数、衣指、籽棉产量、皮棉产量、纤维强力也呈显著的负相关，说明品种的抗病性越差，对产量和纤维品质的损失越大。另外，从20世纪80年代以来在黄河流域进行生产试验的品种进行分析表明，抗病的中棉所12比感病的鲁棉1号、冀棉8号的产量和品质都要好，证明抗枯萎病性和农艺性状间并不存在遗传上的负相关。高永成等（1985）用感病的原徐州142（病株率44.0%，病指35.9）和经过4年在病地连续选择的抗病徐州142（病株率3.9%，病指2.9）于1979年在无病地上进行了农艺性状的比较，抗病的徐州142比感病的徐州142农艺性状略有提高，如皮棉每亩增产2.75kg，衣分提高0.5个百分点，纤维强力提高0.09g，主体长度增加0.19mm。因而他们也认为，抗枯萎病性与农艺性状间并不存在遗传上的负相关。种质资源或称遗传资源，是指决定各种遗传性状的基因资源。棉花种质资源包括推广品种、过时品种、引进品种、突变体材料、野生种和陆地棉种系，以及棉属近缘植物。是进行棉花品种遗传改良的物质基础，也是研究棉属遗传、起源、进化和分类的基本材料。因此，广泛、持续收集、保存、研究和利用种质资源，是棉花遗传育种研究领域中的一项基础性工作。抗原是抗病育种的决定因素，而种质资源则是棉花抗枯萎病育种中抗原的来源地。我国在20世纪50年代就开始收集棉花品种和种质，并进行抗枯萎病性鉴定。1952～1953年四川省棉花枯萎病防治研究工作组收集了珂字棉8个品系及福字棉6号、鸡脚德字棉、狄胜棉、赖德福阿金等陆地棉品种（系）共33个，海岛棉品种C3173、苏-2198 两个，中棉种质有遂宁土棉、威远土棉等21个，进行抗枯萎病性鉴定。海岛棉中，苏-2198表现耐病、C3173高度感病，发病率为100%，病指79.5；中棉中，抗性最好的是仁寿紫花、盐亭小白花、三台子花、仪陇小白花、余姚小树花、彰德土棉、遂宁28-507-47、威远土棉、宾川土棉，而玉溪中棉在田间未受棉枯萎病感染，表现高度抗枯萎病性；陆地棉发病高，但发病程度差异大，发病率为90%～100%，病情指数为59.3～71.5。20世纪70年代，我国的抗病育种发展较快，对棉花品种资源的收集、抗性鉴定更加重视。1976年，陕西省农业科学院植物保护研究所采用陕西泾阳菌系，第一次对中国2238个棉花品种资源进行了苗期抗枯萎病性鉴定，结果是，无症状免疫类型22个，占总数的0.98%；高抗类型137个，占6.12%；感病类型1724个，占77.03%；其余为耐病类型355个，占15.96%。陆地棉中，表现抗性强的品种有川52-128、川57-681、陕棉4号、陕棉401、陕棉9号、川62-200、川抗病洞庭棉、晋68-389、晋68-400、云112-3、86-1号、陕棉8号、陕棉10号、咸73-74和咸73-145。中棉的抗枯萎病性强、抗源丰富，经反复试验证明，赤木黑种、赤木白种、法库白子、中棉所6号的抗枯萎病性强而稳定。1975～1979年连续8批鉴定了中国棉花品种资源共3710个。根据病指划分为不同抗病性反应型，属免疫类型（无症状）的23个，占总数的0.62%；属高抗类型的164个，占4.42%；属抗病类型的187个，占5.04%；属耐病类型的351个，占9.46%，属感病类型的2385个，占80.46%。从不同棉种相比较，其中，以中棉抗病性较强，陆地棉次之，海岛棉、木棉抗病性最弱（表5-1）。中棉、陆地棉、木棉和海岛棉的平均病指分别为5.34、34.29、76.4和76.85。棉种名称供试品种（系）免疫高抗抗病耐病感病病指0病指0.1～10病指10.1～25病指25.1～50病指50.1～100个数%个数%个数%个数%个数%陆地棉3102130.42993.191374.422608.38259383.58海岛棉27841.4427498.57中棉308103.256521.104715.268627.9210032.47木棉1715.881694.11草棉5360.00240.00合计3710230.621644.421875.043519.46298580.41表5-1 不同棉种对枯萎病苗期抗性鉴定1993年，陕西省农业科学院植物保护研究所又对348个亚洲棉（即中棉）品种进行抗枯萎病苗期抗性鉴定，病指为1～25的有288个，占82.8%；病指为25.1～50.0的有34个，占9.8%；病指为50.1～100.0的为26个，占7.4%。其中，简中1号、浙江余姚黄蒂大部等抗性强。52-128和57-681是中国育成的第一批高抗枯萎病抗原种质。四川省棉枯萎病工作组自1952年在发病90%以上的大榆区紫云乡105亩（667m2）左右的德字531棉田中，初选抗病单株916株，1953年经病圃鉴定筛选出抗病性强的11个系，经反复比较鉴定筛选，1956年培育出高抗枯萎病品种52-128。1957年全省换种岱字棉15后，利用新品种农艺经济性状好的优点，又在三台、射洪县种植的岱字棉15号重病田中，选取剖秆未见病状的单株1015株；仍采用病圃筛选的方法，于1963年再次选育出高抗枯萎病的品种57-681。这两个抗源品种经试验鉴定，具有抗病性强、抗病力稳定、抗性适应广的特点。20世纪60年代中期至90年代中期，在四川省棉枯萎病协作组人工病圃中，52-128病指稳定在3.6～22.6，平均11.2，比感病对照种减轻77.8%；57-681病指2.0～3.1，平均2.3，比感病对照种减轻91.2%。1970～1982年，以52-128、57-681多代自交材料种植于人工接菌病圃和零星病地，连续3年自交仍种植于同一条件下的抗性鉴定表明，虽经长期种植，两个抗源品种的抗性一直保持很强，未出现衰退现象，即使在零星病地种植3年，抗性与人工病圃无明显差异。1981年选用有代表性的生理型Ⅰ号川F5（四川射洪县）、陕F9（陕西高陵县）、生理型Ⅱ号浙F2（浙江慈溪县）、冀F8（河北峦城县）、生理型Ⅲ号新Fl（新疆吐鲁番县）等不同生理型菌系对52-128、37-681及抗、感杂交组合后代作病菌与寄主互作关系的抗性鉴定表明，52-128、57-681对我国棉枯萎病菌3大生理型中的5个菌系间致病力分化性互作不显著。1972～1973年和1979～1980年，全国棉枯萎病生理型试验结果表明，52-128对18个省、市、自治区不同地区的129个棉枯萎病菌系中，属高抗类型的有12个，抗病类型72个，耐偏抗类型36个，合计120个，占参试菌系的93%，只有9个强致病菌系对52-128呈感病类型。这两个抗源品种育成后，于60年代初被陕西、山西等省引进试种，表现出抗性强、稳定性好，从而用作抗原进行杂交转育或取材，育出陕4号、陕401、晋68-420、运安1号等，分别在四川、陕西、河南等棉病区种植，防病增产效果良好。1972年后是我国抗病育种取得较大发展的时期，河南、江苏、云南、陕西、山东、浙江、河北、山西、湖南和江西等省先后引进52-128、57-681用作抗原进行杂交转育或系统选择，培育出21个抗枯萎病品种（系），分别在全国10个省推广种植，防病增产效果显著。据《全国农作物审定品种名录》（2005）、《中国棉花品种及其系谱》（1996）、《中国棉花品种系谱图》（2000）资料分析，以及中国农业科学院棉花研究所等50余家育种单位利用这两个抗原的应用证明统计，全国利用抗原52-128、57-681育成棉花抗病品种128个。在不同转育代次育成的抗病品种中，集中来源于第二代至第五代的有121个，占94.5%；被利用作母本、父本育成的品种分别各占有54.7%和31.3%（表5-2、表5-3）。利用52-128抗原品种作抗原，通过杂交或系统选育的抗病品种，在各地方推广应用都表现抗性良好（表5-4）。省份育种单位（个）80年代90年代2000～2004年总计河北765112山西33429辽宁244江苏9112720浙江111安徽1516江西111山东31427河南9812222湖北49211湖南21124四川5511319陕西29211新疆111合计503569128表5-2 不同时期不同地区利用抗原52-128、57-681育成的审定品种数抗原用途一代二代三代四代五代六代总计母本（♀）11029191170父本（♂）46917440系统选育15542118合计6214340171128表5-3 抗原种质52-128、57-681不同转育代次育成的品种数项目四川湖北新疆江苏云南山西陕西辽宁上海山东河南河北北京浙江甘肃安徽湖南江西合计供试菌系179985111466777552911129抗性反应高抗01600000020100020012抗病861327114546422151072耐病71043432110232110136感病2121000000100101009表5-4 52-128对不同地区菌系的抗性反应抗原种质在育种上应用成败的关键，一是抗原抗性稳定性。抗性稳定而持久的抗原，转育利用的抗性不易衰失，能持久保持利用；二是抗原种质的遗传效应，这是转育利用的基础；三是抗原种质经济性状的遗传效应，这对利用价值影响极大。针对这三个关键问题，叶鹏盛等（2007）对52-128和57-681的抗性遗传做了研究。结果证明，这两个抗原的抗性长期稳定（表5-5，表5-6），且抗性遗传效应好、遗传率高（表5-7），其他不良性状在杂种后代中的遗传不显著（表5-8），为我国利用两个抗原的抗性，选育抗病品种奠定了良好的基础。供试品种种植1年种植2年种植3年种植4年病圃无病地病圃无病地病圃无病地病圃无病地521284.504.504.503.502.752.750.752.75576816.003.507.254.502.252.251.253.25川73274.008.009.008.003.503.502.507.25川4149.005.755.758.001.001.001.250.75达棉1号30.7556.7523.556.7535.0035.0017.2536.50显著性（t值）0.53240.62710.06431.1214表5-5 在病圃和无病地筛选后抗原的病情指数世代52128×达棉1号57681×达棉1号达棉1号×52128达棉1号×57681病圃无病地病圃无病地病圃无病地病圃无病地显著性（t）F135.0019.2541.0024.5018.5023.7521.7524.502.5687F231.2519.2519.2524.5012.7517.2518.7516.252.3072F310.2519.7515.5025.507.7520.258.0025.508.6017**F42.0013.751.2524.508.7521.759.7520.509.0275**表5-6 在病圃和无病地筛选后抗原不同杂交后代的病指抗源及组合平均病指F1F2中亲值相对优势（%）广义遗传率（%）狭义遗传率（%）52128×达棉1号29.5039.2539.75-25.7968.952.157681×达棉1号25.5034.0040.50-37.0473.156.77329×达棉1号29.0037.2541.25-29.7070.548.2川414×达棉1号29.7539.7542.00-29.1767.443.6达棉1号×5212835.2535.0039.75-11.3272.953.7达棉1号×5768134.5034.5040.50-14.8175.452.4达棉1号×732737.0038.2541.25-10.3072.353.4达棉1号×川41437.2541.7542.00-11.3169.246.5521284.00576815.50川73277.00川4148.50达棉1号75.50表5-7 抗原种质52-128、57-681的抗性遗传效应抗源及组合株高（cm）单株铃（个）衣分（%）F1F2中亲值F1F2F1相对优势（%）F1F2中亲值F1F2F1相对优势（%）F1F2中亲值F1F2F1相对优势（%）52128×达棉1号99.3100.188.491.012.319.717.317.017.915.836.137.236.737.8-1.6表5-8 抗原种质52-128、57-681的主要经济性状的遗传表现抗源及组合株高（cm）单株铃（个）衣分（%）F1F2中亲值F1F2F1相对优势（%）F1F2中亲值F1F2F1相对优势（%）F1F2中亲值F1F2F1相对优势（%）57681×达棉1号93.897.685.186.010.221.018.916.118.930.438.438.337.538.8-2.4川7329×达棉1号86.790.083.483.83.823.220.320.119.715.440.340.239.840.31.3川414×达棉1号85.189.782.784.82.919.418.919.818.8-2.039.840.140.340.3-1.2达棉1号×5212898.996.388.491.011.923.218.817.217.952.837.839.636.737.8-3.0达棉1号×5768187.188.885.186.09.424.621.216.118.934.938.938.337.538.83.7达棉1号×732785.287.683.483.82.323.722.620.119.717.940.941.239.840.32.8达棉1号×川41490.385.182.784.89.221.719.819.818.89.640.140.040.340.3-0.4表5-8 抗原种质52-128、57-681的主要经济性状的遗传表现（续）-1磷作为植物生长发育的必需营养元素之一，不仅是植物体内许多重要化合物的组分，而且还以多种途径参与植物体内各种代谢过程，在人类赖以生存的生态系统中，起着不可替代的作用。植物吸收磷的主要形式是，它们在土壤溶液中的浓度很低，一般只有1.5μmol/L。因此，磷容易被土壤固定，在土壤溶液中的移动性很差。大多农业土壤因长期施用磷肥已成为潜在的磷库，磷肥效应与土壤有效磷含量呈负相关，磷酸盐的化学性质使其成为作物难以利用的固定态磷，造成土壤磷的“遗传学缺乏”而非“土种类之间和同一植物的不同品种之间的磷素营养利用效率存在差异”。陆文龙等（1999）研究表明，营养高效基因型是指在缺磷条件下，能够利用自身根系分泌的有机酸活化土壤中难溶性磷，协调生长代谢，维持正常的生长发育过程，最终形成较高产量的基因型。由于植物对磷素的利用能力具有模糊性，耐低磷基因型和非耐低磷基因型的表现特征是连续的，没有明显的界限，磷素的影响不仅表现在相对干物重上，而且与植株的地上部鲜重、叶绿素含量、总叶面积等性状也相关。王士杰等（2009）首次在确立的筛选指标基础上，从88个棉花抗枯、黄萎病品种中筛选出25个耐低磷基因型品种（包括中棉所9号、中棉所15、中棉所21、中6331、86-1、豫棉1号、豫棉8号、豫棉22、冀棉7号、冀棉20、冀合3028、鲁无401、鲁棉14号、陕棉11、苏棉12、徐261、泗棉3号、川棉109、绵阳83-21、辽棉12、皖棉11、GK1、Stoneville 603、Deltapine 61和渤棉抗4）和3个耐低磷极端基因型品种（中棉所21、中99和陕棉11）。这些品种可以作为培育耐低磷胁迫的棉花抗病品种以及开展棉花耐低磷QTL定位与克隆等研究的重要资源。鉴于新疆长绒棉枯萎病迅速蔓延，给长绒棉生产带来巨大威胁，生产上迫切需要长绒棉抗病品种来减轻枯萎病的为害。在长绒棉现有的品种和品系中很难找到抗源。为此，武刚等（2006）利用抗枯萎病的陆地棉品种作种间杂交选育，经病圃多年筛选、鉴定出4个高抗枯萎病，而纤维品质达到长绒棉标准的新种质。生育期143天，绒长36.5mm，比强度31.8cN/tex，马克隆值3.7，单铃重2.4g，衣分31.8%，皮棉产量85.7 kg/667m2，病指6.38，表现为高抗。生育期146天，绒长36.5 mm，比强度37.0cN/tex，马克隆值3.3，单铃重2.5g，衣分32.8%，皮棉产量90.6 kg/667m2，病指3.87，表现为高抗。生育期148天，绒长36.6 mm，比强度30.4cN/tex，马克隆值3.7，单铃重2.5g，衣分32.3%，皮棉产量82.3 kg/667m2，病指3.18，表现为高抗。生育期147天，绒长37.3 mm，比强度33.0cN/tex，马克隆值3.7，单铃重2.3g，衣分29.4%，皮棉产量78.6 kg/667m2，病指1.36，表现为高抗。刘泽辉等（2008）对上述4份新种质在进一步杂交转育研究后认为，所选育的新品系同抗病新种质的抗病性没有明显差异，年度间抗病性差异小，说明抗病性呈显性性状、能稳定遗传。这为今后长绒棉抗枯萎病育种提供了很好的抗源材料，为棉花产业发展奠定了基础。但同时也指出，长绒棉抗枯萎病新种质在田间长势旺、抗病性强，但铃重偏低，产量不太理想。此外，这些高抗枯萎病新品系种植在多年陆地棉黄萎病很重的棉田，偶尔发现一两株有黄萎病病症的棉株，也许是杂交后代具有一定的陆地棉基因。因此，新种质抗性基因遗传特性、抗性生理生化方面的研究以及产量的提高等还有待进一步加强。在制定抗病品种育种目标时，既要求选育的品种具有抗病性，同时又要丰产和纤维品质优良，即除抗病性外，其他性状应与当地推广的非抗病丰产品种要求相似。事实上，一个耐病而丰产优质的品种往往比高抗而低产劣质的品种更有实用价值。进行抗病育种时，要注意不仅培育只对某一种病害的某一生理小种具有特异性抗性的品种，而且要培育多抗（水平抗性）品种，因为具有特异性抗性品种在出现新的菌株和生理小种时，抗性即消失。棉田单一的枯、黄萎病区较少，多为混生病区，因此，培育具有兼抗特性的品种，在制定抗病育种目标时也应加以考虑。在自然界棉花群体中，个体间总是存在着微小或明显的性状差异，包括株形结构、结铃性状、抗逆性差异等。由于棉花的遗传背景比较复杂，在外界环境条件影响下，常表现出多样的变异。这些变异既有遗传性状决定的变异，也有受环境影响产生的差异。系统育种的关键，即是发现变异，如在感病株的群体中选择抗病变异株，继而优中选优，严格鉴定。系统选育方法能在抗病育种中取得一定效果的原因在于：①棉花是常异花授粉作物，由于经常的天然杂交，增加了遗传基础的复杂性。一个棉花品种，一般人们较重视的一些农艺性状和经济性状是相对一致的，而人们没有注意的或缺少一定条件暂时未表现的性状（如在无病地的棉花抗性），个体间存在差异，有时差异可能很大。如能为棉花创造一定的条件（如发病条件），就可使个体间抗病性差异表现出来。重病地提供了筛选的条件，因此，一次选择可能选出抗病的个体。②棉花对枯萎病的抗性遗传是由基因所控制，当一个品种处于一种复杂群体状态时，这些抗病基因可能分别存在于不同个体上。在经过一次抗性选择的基础上，由于天然杂交，杂合体抗性基因分离重组，必然会产生抗性基因积累，连续选择便有可能把具有多个抗性基因累加效应的个体选择出来，从而进一步提高了抗性。③根据Vidhyasekaran（1988）“几乎所有植物都存有抵御微生物入侵的防卫机制”的论断，寓意着植物的抗性是固有存在着的。从抗性的性质来看，植物的抗病机制包括预存性被动机制，以及被病菌侵染后激发产生的主动防卫机制。在主动抗病性中，有两套基因先后起作用，即抗病基因和防卫反应基因。抗病基因产物对病菌无毒基因产物有识别作用，从而可诱导防卫基因表达，产生一系列防卫机制，所以，抗病基因产物有识别作用。抗病基因是一种效应分子（抗病蛋白），本身无杀菌作用，真正起作用的是通过防卫机制产生的物质，在形态和生理生化上的许多改变，这些抗病变化包括，植物保护素的合成、细胞壁修饰（愈伤组织、木质素和酚类化合物在壁上沉积）、富含羟脯氨酸糖蛋白的积累、蛋白酶抑制剂和能抵御病原物细胞壁的水解酶（角质酶和葡萄糖酶）的产生。所以，在植物抗病性反应中包括两个阶段。第一阶段为决定阶段，通过病菌无毒基因产物和寄主抗病基因产物相互识别决定寄主抗病性表达；第二阶段是表达阶段，即上述一系列的防卫反应。在病菌的激发下，寄主内的抗病物质得到启动，表现出病株率显著下降，抗病性明显上升。而抗病性的识别机制与病原菌的无毒基因产物识别有一个过程，因而抗病性在连续选择中得以表现与提高。在中国棉花抗病育种史上，系统育种是20世纪80年代前所采用的主要育种方法。据1974年统计，全国育成的148个品种中，67.6%的品种是采用系统育种法育成的。70年代所育成的48个品种中，也有26个是采用系统育种法育成的。川52-128和川57-681是我国棉枯萎病的主要抗原，两者都是在重病田上经连续选择而育成的。川52-128选自古老的栽培品种德字531，川57-681选自岱字棉15，86-1来自陕65-141，陕3563、川73-27、鲁抗一号均选自陕4。中棉所3号选自乌干达3号。系谱选择法是系统育种中最常用的方法，它不仅用于从自然变异选择的系统育种，也应用于杂交、化学和物理方法诱变等人工方法产生的变异群体。在自然变异和人工创造的变异群体中选择单株或单铃种成株行或铃行，每株行或铃行为一个家系或“系统”，由于“系统”间差异比个体间差异大，故先选择优良系统，而后在当选系统内继续选株或选铃，种成下一代株行或铃行。选择连续进行数代，等系统内植株性状已趋一致时，选留符合育种目标的系统，按系统收获。翌年升入设有重复的鉴定圃比较产量，通过一年或多年、一地点或多地点产量比较，鉴定出产量高并具有育种目标要求的品质和抗性的系统繁殖成为品种。系统育种方法简便，收效快，是棉花育种的主要方法之一。但该法也有一定的局限性，表现在：①系统育种的效果主要决定于某品种群体的遗传变异性；而其遗传变异性，表现在天然杂交，基因突变及剩余变异等天然变异。一般地说，这种天然变异几率不会太高，而符合育种目标所要求的有利变异率更低，因而选择效率不高。②应用连续单株选择育成为品种是由一个单株繁衍而成的群体，其遗传基础较窄；对环境条件的适应力差，改进提高的潜力有限。前苏联育种家1978年的试验指出，由21个优良株系组成的品种C-4539群体，经一次选择后，其产量比未经选择的原始群体提高10.5%；而经4次选择的后代产量，虽比未经选择的原始群体提高了4.2%，但比一次选择的后代，降低了6.7%。用8个株系试验的结果表明，经一次选择的后代，其产量仅为未经选择的原始群体的96.7%～99.2%；经4次选择的后代，其产量比原始群体降低17.5%～2.1%。浙江省农业科学院（1974）从岱字棉15号选出浙棉1号，从浙棉1号中又选出协作2号，在协作2号中选出10个株系，其中，只有1个株系的产量超过了对照，增产的幅度较小，抗逆性也差。20世纪60～70年代江苏省徐州地区农业科学研究所在斯字棉2B中，实行优中选优，连续选出了4个丰产性较好的新品种，但这些品种的纤维品质都没有获得明显改进，如徐州1818和徐州142的纤维品质均不理想。为了提高系统育种的效果，可采用下述方法加以改进。①有重复的株行（系）试验。现代的育种方法应能保持和控制遗传变异，即能使育种家容易判明育种材料的遗传变异和由环境条件引起的非遗传变异；而且一个群体对选择的潜在反应的利用决定于所应用的技术方法的有效性。假如所应用的方法不是很敏感的，那么，大多数的遗传变异不仅不能被发现，而且会由于同质性的增加而丧失。由于一个单株后代的种子数量少，故对其后代进行试验鉴定时，增加重复次数比扩大小区面积更能充分利用有限的种子和提高选择的可靠性。②混系法。在改良品种时，为了保持其遗传可塑性，可按一定标准将若干个在形态上基本相似而又不完全相同的家系，合并成为混系品种，其效果比单一家系品种较好。用系统育种方法选育抗病品种，须注意以下一些问题：①整个试验从选择单株到品比试验，自始至终都应在发病均匀的重病地上或人工病圃上进行。以便在表现抗性程度的基础上比较株系间的丰产性和纤维品质。②以当地推广的品种作对照。③除进行一般生育期调查外，应在苗期、现蕾后、结铃盛期以及收获前（劈秆）等不同时期进行发病情况调查。④株行试验可侧重观察抗性，参考结铃性和其他农艺性状的表现。品系预备试验和品种比较试验，则应在表现抗性的基础上注意丰产性和纤维品质。表现较突出的材料可提前进行多点试验，同时进行纤维品质的鉴定，以加速育种进程。⑤已育成的品种在推广和良种繁育过程中，需要继续对抗性进行鉴定和提高。否则一个品种，在同一病区长期种植，由于品种本身抗性组成的变异，以及病原菌的适应性，这一品种的抗性将会有逐渐减弱的趋势。这一方法由高永成等（1995，1996）提出。应用这一方法，徐州地区农业科学研究所、中国农业科学院棉花研究所等单位，从国外新引进的原来感病品种，于5年时间内，改造成抗病品种获得成功。如从1979年开始试验，徐州地区农业科学研究所培育的徐州142、中国农业科学院棉花研究所培育的中棉所7号及西北农业大学培育的西农3195等原来都是高产感病品种，经过5年左右的病床病圃连续群体选择法，徐州142病床枯萎病病株率由原来的97.4%降低为8.5%，岱字棉16病床枯萎病病株率由原来的91.6%降低为8.5%，中棉所7号由原来的99.9%降低为11.3%，西农3195由原来的95.9%降低为7.5%。当选材料，不但由原来感病的转变为抗病的，并且由于连续群体选择，不仅仅着眼于抗性，同时兼顾产量、产量因素及品质性状的同步提高，因而，能将原来的感病品种有效地转变为抗病而综合优良性状的新品种。高永成等（1995）和张云青等（1997）对这一方法作了理论上的分析，认为：①棉花作为枯萎病病原菌的寄主确有在变异的生存条件下，即病茵连续侵入并增大压力条件下，逐渐而又明显地改变自身遗传性以适应新的环境能力。生物的适应变异现象确实存在。同时，棉花寄主确有通过后天获得性遗传累加作用，逐年逐代增强抗性。最终由原感病品种经强化成为高抗品种。没有适应性的变异和后天获得性遗传的累加相互作用，抗性增进不可能，这是抗性提高和定向培育的根本认识之所在。②原感病品种对毒素处理反应迟钝，出现萎蔫现象时间晚，但萎蔫指数高。抗性转化年代愈久、抗性愈高的品种对毒素处理反应愈敏感，出现萎蔫时间也愈早，但萎蔫指数愈低，甚至出现恢复现象。电镜解剖观察到原感病品种导管褐变时间晚，对毒素处理反应迟钝。导管褐变后出现保护性物质——侵填体少，比率小。增进抗性后，导管的褐变现象出现时间，随强化年限增加愈来愈早，褐变后保护性侵填物愈多，比率也愈高。病理学研究结果表明，抗性转化过程即寄主对病菌入侵的反应敏感度和迅速产生保护物质能力，即免疫功能逐年逐代加强的过程。③原感病品种过氧化物酶活性与多酚氧化酶活性高，而抗坏血酸氧化酶活性极低（0值）。定向培育年限愈长，抗性愈高的品种过氧化物酶活性和多酚氧化酶活性愈低，而抗坏血酸氧化酶活性愈高，表明感病品种和抗病品种的生化代谢型确有差别。前两种酶及活性与感病性有关，后一种酶及活性与抗病性有关。抗性转化的实质即代谢型的转化。④育成的抗病品种与感病品种棉籽粉用SDS电泳法进行蛋白质分析表明，感病型品种β组分色谱带量少色淡，抗病品种β组分带量多色深。β组分蛋白质估计为球蛋白。说明抗性转化过程中棉株生化代谢型转化，会影响到种子生化代谢型的变异，这是棉花抗性品种与感病品种生化物质成分的差异。种子球蛋白用SDS-PAGE法分析发现感病的岱字棉16种子球蛋白由10种分子量不等的蛋白质组成，而岱字棉16则由8种蛋白质组成，前者含有较多高分子量蛋白，后者含较多低分子量蛋白，表明抗性增进过程中，种子形成高分子量球蛋白质合成减少、低分子量球蛋白合成增多。抗性定向培育法的关键技术为：①培育的对象应是需要注入和强化抗性的农艺性状优良品种；②注重培育病床、病圃，强化菌种分离与培养；③病床、病圃发病高峰期，强化对棉苗（株）的选择、严格淘汰；④纤维品质测定、淘汰与选择；⑤经3～5年严格筛选，同时，择优进入继续强化抗性的良繁体制。为探讨定向培育法通过病圃加压筛选获得的抗病品种（系）提高抗枯萎病性的病理学机制，吕学莲等（2008）以病圃定向筛选抗枯萎病大幅度提高的棉花材料和原感病品种为对象，研究接种枯萎病菌后抗、感材料的病理学变化。结果表明，两者在宏观病理学方面存在差异，感病品种接种7天开始显症，25天严重发病，整株维管束变色；抗病材料生长健康或只有轻微症状，维管束变色部位仅局限在子叶节以下。在细胞和组织病理学方面，两者也存在差异，侵入前期，抗病材料被侵入细胞中，有细胞壁加厚现象；侵入中期，病菌可通过表皮层侵入感病品种的薄壁组织，但只能到达抗病材料的皮层组织中；侵入后期，抗病材料中，出现大量寄主细胞的降解物质或分泌物将菌丝包围，阻止病菌进一步扩展。抗病材料的抗侵入和抗扩展能力均较感病品种大幅度增强。杂交育种是指用基因型不同的品种（系）作亲本，通过有性杂交获得杂种，继而在杂种后代中进行选择，培育成符合生产发展需要的新品种的方法。在杂交育种中，通过人工有性杂交，可将不同亲本的优良基因组合在Fl的杂种个体中，由于这时的基因型是杂合体，Fl个体自交所形成的F2及其后代因基因分离重组而产生各种变异类型，即出现具有不同性状组合的变异个体，再经选择，自交纯化，就有可能获得综合性状优良一致的新品种（系）或超越双亲的新类型。经此法培育的品种属纯系品种类型。杂交育种是当前国内外作物育种中，应用最广、成效最大的育种方法，是现代作物育种最基本的方法。作物产量、品质、抗性等性状之间，常有负相关现象，已有许多研究者讨论过这一问题，并提出打破或缓解这种负相关的方法。Weikaivan等（1995）提出关于作物性状负相关的见解认为，这是育种上一个极为复杂的问题，比以往人们所提到的应给予更多的重视。据Donald等（1996）认为，许多与生长发育有关的性状都是相互联系的，稳定地保持正或负的相关关系。由于相互联系的性状之间的负相关，阻碍了育种的进展。认为不利性状的联系有3个主要来源，遗传连锁、一因多效，以及一定环境影响下的性状间的相互联系和补偿作用。由于遗传连锁的负相关势必延缓育种进程，但是，只要有充分大的杂交分离群体，并确切地鉴定重组型，遗传连锁是可以打破的。遗传连锁一旦打破，重组型将成为既持久又有利的遗传连锁了。与此相反，由于一因多效的负相关，既不受遗传也不受环境因子改变的影响，比较难以打破。由于环境导致互补而产生的性状间的负相关也难以打破。主要是与产量有关的性状，相互联系形成一个体系。在这个系统内，一个或多个性状必须在表现程度上有所递减，另一性状的表现程度才能有所提高。相互联系的性状应该看成一个有常数容量的生物学体系，选择的目的应该达到一个协调式的理想型，要达到这一体系中多数性状的每一个都能达到理想的水平。使这一体系能作为一个整体达到最大限度的功能，而不是去追逐极端的看起来似乎是最理想的每一个单一性状的水平。在理想的但负联系的性状之间的选择必须进行调和，使这一生物学体系的功能作为一个整体达到最大限度的作用，而不是选择个别性的极端水平。根据这一概念，不顾其他性状只选择单一性状是不合适的。一个符合育种目标的栽培品种应具有这样的基因型，即其体系成员（相互联系的性状）的比例能最好地适应于该品种所生长的环境。另外，必须具有有些独立性状，如对某种特殊病虫害的抗性，因为这种性状的基因较少牵涉到产量因素的负联系中去。通过何种育种方法才能有效地打破这种遗传上负的关联性，获得理想的重组体，育成符合育种目标要求的综合性状优良的新品种，这是国内外棉花遗传育种家一直在努力研究的课题。棉花育种大多采用杂交育种法，显然已取得了显著的成效，但这种方法存在显而易见的缺陷。首先是杂交次数少，不利于有利基因通过交换达到重组，不利于基因加性效应的积累，极大地限制了理想个体出现的几率；其次是难以打破皮棉产量与纤维品质、产量与抗病性性状遗传上的负相关性，难以选择出综合性状优良的个体。针对这些突出问题，国内外棉花育种家试验过多种育种方法。主要有：这个体系是张凤鑫（1987）等研制成功的。育种上不能把各种有益性状集合在一个基因型中，这是由于存在性状间的不利关系，这种关系来自连锁，或“多因一效”，或“一因多效”，但主要是连锁的作用。要从根本上解决这一问题，只有通过遗传信息序列的广泛重组才能改变其连锁状态。把育种群体作为一个动态基因库来处理，通过多个亲本多次的相互交配（含分裂交配）及随时根据需要输入新种质，通过遗传的高度杂合化，打破原有亲本的遗传系统，促成遗传信息序列的广泛重组；打破遗传连锁，释放出潜在有益变异，再按育种目标施以相应的（病、虫、逆境、产量、品质）选择压力，干涉遗传信息序列的分支方向，并通过不断的轮回选择，聚合大量有利基因及其重组体。如此，不但可在一个育种周期内基本实现其综合育种目标，而且，随其杂种库的丰富、改进、演化，可不断创造出新品种。张凤鑫等应用该体系进行育种验证，结果表明，该体系是行之有效的，一是抗性进展快，枯萎病病指较亲本均值降低90%左右，黄萎病病指降低59%，苗病死苗率降低80%，一部分材料还兼抗棉蚜、棉红铃虫、棉铃虫，如杂种优势利用新材料高柱头系102-1，高抗枯萎病，抗黄萎病、抗棉蚜、棉铃虫，高抗红铃虫。二是铃重、单铃子数、衣指、籽指、衣分、单铃皮棉重、2.5%跨距长度、比强度、马克隆值的遗传变异分别扩大2～3倍。抗性与皮棉产量的遗传关系得到改善，产量与苗病死苗率、枯萎病、黄萎病的病指遗传相关系数分别为rg=-0.5，-0.54，-0.13。纤维比强度与苗病死苗率、枯萎病、黄萎病病指的遗传相关系数分别为rg=-0.49、-0.29、-0.28；皮棉产量与纤维2.5%跨距长度、比强度、马克隆值的遗传相关系数分别为rg=+0.45、+0.36、+0.02。高衣分与高比强度的重组率提高到20%以上。皮棉产量与比强度的遗传相关系数由亲本间rg=-0.8变为-0.12。与杂交系谱法比较，相同亲本的入选后代，新体系入选后代的皮棉产量较常规法高12%，比强度高0.6%；第二轮选择则比常规法皮棉增产率达53.7%，比强度高11.3%。研究者利用该体系已育成一批优良新品种，其中，川碚2号曾推广75万亩，创造了166kg/亩的皮棉高产纪录。利用这些新品种还育成了洞A×B023-11、473A×川碚2号、101-l×川碚2号等杂优势新组合，创造了175.4kg/亩的高产纪录。育成的杂种优势利用新材料高柱头系101-1、102-1，同时抗耐枯萎病、黄萎病、棉蚜、棉红铃虫、棉铃虫，育种成效显著。该体系由马家璋等（1987）建立。其指导思想是，通过混交，打破育种性状间的不利遗传负相关；通过混选获得优良基因的重组体。其主要步骤是，以育成的遗传基础丰富的选系为共同亲本，同时与几个各具特色的目标性状亲本杂交。Fl代海南省异地加代。F2代种植在育种基地枯、黄萎病的重病土上；淘汰抗性差的不良组合；保留组合进一步淘汰劣变个体后混收其种子。F3代海南异地种植，进行不去雄的群内混交。每株收摘1～2个混交铃，混合留种，完成一轮混交——混选。按同样方法去完成第二、第三轮的混交—混选。各轮混交群体开放授粉1～2代，然后从群体中选拔优良个体，系统地进行家系鉴定和选择，决选出新品种。该体系的遗传改良效果也是比较好的，表现在：①显著提高产量、早熟性、2.5%跨距长度的平均数。枯、黄萎病的病指保持在高抗和抗的水平；②扩大遗传变异幅度；③改善性状间关系，加强了产量与铃数、铃重间正相关，降低株铃数与铃重、籽指与衣分率之间负相关，皮棉产量与纤维比强度的遗传相关系数由-0.397变为+0.494，株铃数与比强度相关系数由-0.901变为+0.71，衣分与马克隆值相关系数由+0.34变为-0.411，早熟性与皮棉产量相关系数由-0.282变为+0.797。马家璋等采用该体系育成兼抗品种中棉所23。山西省农业科学院棉花研究所采用这一方法也育成了晋棉11。该体系由潘家驹等（1990）建立。修饰回交（modificd backcross）就是回交后代选系间的彼此再杂交，可以培育棉花多系品种。在棉花抗病育种中，通过回交产生若干同质系，然后将各同质系按一定要求混合组成多系品种。通过修饰回交研究，将杂种品系间杂交与回交结合，综合两者特点，回交纯合快，缩短育种年限，后代只聚合回交亲本基因型，选择容易成功。其程序是：选用一个丰产品种作为轮回亲本（A），以优质品种（B）、抗病品种（C）为授予亲本，以品种A分别与品种B、C杂交，其后代分别以A作为轮回亲本回交，分别从回交后代中选拔优系，然后进行不同回交选系的杂交。其程序模式如图5-1所示。通过1980～1990年两轮试验结果表明，修饰回交法对削弱丰产与抗病、抗病与纤维比强度之间的负相关程度有一定效果。第一轮试验中，皮棉产量和病指的相关系数由原来的-0.51转变为-0.21。在第二轮试验中，无论抗病株率与皮棉产量或病指与皮棉产量的直线回归分析，4个修饰回交系均表现出以正效应方向偏离回归线。通过修饰回交使抗病株率与纤维比强度之间的相关系数由-0.4779变为-0.1183，病指与纤维比强度之间的相关系数由-0.5185变为-0.1933。图5-1 修饰回交体系MAR（Multi Adversity Resistance，多抗逆性）体系是Bird等（1980）通过研究种子状况、抗细菌性角斑病和抗性基因之间的遗传关系（图5-2）后提出来的。图5-2 MAR体系中抗病基因与其他性状基因之间的遗传关系从图5-2中可得知：①抗细菌性角斑病与枯萎病（根结线虫病复合体）之间有很强的相关关系；②抗细菌性角斑病与黄萎病、根腐病以及种皮抗霉菌之间的相关关系较小，但显著；③抗枯萎病（根结线虫病复合体）与黄萎病、根腐病之间也存在一定的相关性；④在低温（13～18℃）条件下，降低发芽速度与抗黄萎病、苗期病害有关；⑤种皮抗霉菌的特性与产量、早熟性之间有高度相关；⑥小种子与在低温下发芽快、易感黄萎病密切有关。根据以上研究结果，MAR体系育种方法的关键是：种皮抗霉菌，种子在13.3℃下处理8天后的发芽状况，以及子叶期对多种不同角斑病生理小种的抗性性状的选择。通过对这3种性状的选择，达到改良抗病性、提高产量和提早成熟的目的。具体的技术要点如下。①根据育种目标，选用具有抗性、高产和纤维品质好以及成熟早的材料用作杂交亲本，配制复式杂交组合。例如，品种SP21S是选自杂交组合（SP21F×SP33F）F1×（SP21V×SP37V）F1。②单株选择开始于复式杂交组合的F1代。当选单株的种子经硫酸脱绒，洗净，再用10%氢氧化钠溶液浸数秒钟，洗净后在41℃温度下烘干，以后置于常温下2周时间。③脱绒后的种子放入盛有1.5%洋菜培养基的培养皿内，每皿25粒。培养皿不加盖，让种子与培养基暴露在空气中，以自然的方式感染真菌孢子，主要是镰刀霉和交链孢霉。最后用带有小孔的塑料纸把培养皿封上，放进13.3℃的人工生长箱内历时8天。8天后检查种皮表面抗霉菌和发芽情况。当选种子的标准是：种子表面不带霉菌，且刚露白（胚根仅伸出种皮1mm左右）。由于不同材料抗种皮霉菌和种子发芽的能力有差异，因而在实际掌握这两个标准时，应尽可能选择种皮表面不带霉菌或少带霉菌，胚根伸出种皮尽可能短的种子。④当选种子在温室中播于用立枯病和猝倒病原菌接种过的土壤中，5天后检查发病情况。正常苗保留，感病苗淘汰。⑤当选的正常苗再用4种不同生理小种的细菌角斑病菌混合液在子叶背面中部接种，10天后检查发病情况。免疫的苗（接种伤口处不发黑或没有向附近健康组织蔓延）保留，其余的淘汰。同时，检查每个幼苗的下胚轴部分（茎与土面交界处），感病发黑的淘汰。⑥当选的幼苗即为MAR选系，把它移入较大的盆中，直至每株最后能结2～3个棉铃。这样产生的种子，供大田鉴定和选择之用。以上程序从F1代开始一直使用到F5或F6代产生品系为止。这一育种方法把作物品种、微生物群体、生态环境、病原物四者之间相互联系起来，这较只考虑作物、病原、环境三者的关系有了很大提高。有关主要病害的抗性遗传趋势研究已经肯定，对枯萎病，其F1代的抗性均倾向于抗性亲本。因此，抗感亲本的杂交，F1代至少可达到耐病水平；抗×抗的杂交，F1代的抗性将不存在任何问题。因此，生产抗性杂交种不存在技术上的障碍，利用杂种优势同样是一条抗枯萎病育种的有效途径。棉花杂种优势早在1894年，Mell首次描述了陆地棉与海岛棉种间杂交的杂种优势表现。1907年，Balls也报道了陆地棉与埃及棉种间杂种一代，在株高、早熟性、绒长和籽指等性状的优势现象。此后，世界各产棉国对棉花杂种优势利用进行了大量的试验研究。我国棉花杂种优势研究始于20世纪20年代。冯泽芳等（1923）研究并发现了亚洲棉品种间的杂种优势。奚元龄（1936）研究证明，亚洲棉不同生态型的品种间杂种一代的植株高度、衣指、单铃籽棉重、单铃种子重及纤维长度等性状都表现有显著或微弱的杂种优势。1947年，杜春培等以鸿系265-5与斯字棉2B杂交，开创我国陆地棉品种间杂种优势利用研究之先河。研究结果认为，杂种一代的多数性状有明显的优势，绒长、衣分和单铃重介于双亲之间，生育期偏向早熟亲本。50～60年代的研究工作以陆地棉与海岛棉种间杂种优势利用为主。70年代以后转入陆地棉品种间的杂种优势利用研究，直到20世纪90年代，棉花杂种优势利用才得到迅速发展。1990年中国杂交棉占全国棉田面积的0.3%，而后，基本呈直线上升趋势，到1999年全国杂交棉占全国棉田面积的10.8%。目前，我国杂交棉的面积仅次于印度，居世界第二位；从国内主要农作物杂交种的种植面积看，棉花仅次于玉米、水稻和油菜，列居第四位。大量的研究结果业已表明，不同亲本之间杂交，其F1所表现的优势有很大差异，就竞争优势的变幅而言，从强优势、无显著优势到负向优势。因此，有了优良的亲本，并不等于就有了优良的F1，双亲性状的搭配、互补以及性状的显隐性和遗传传递力等都影响F1的表现，因而，有必要研究亲本选配规律，以便有效地利用杂种优势。（1）研究亲子关系对于利用F1杂种优势的育种工作，由于双亲杂交直接决定了F1表现的好坏，没有后代的分离选择过程。所以，亲子相关研究至关重要。亲子关系的分析方法，一般是利用亲子数据进行相关分析，通过相关系数的大小及其显著性程度来判断亲子关系的密切程度，进而指导亲本选配。（2）研究亲本间遗传差异亲本选配是否合理与杂交亲本间的遗传差异有着密切的关系。如何衡量亲本间的遗传差异，通常认为，地理来源差异大的品种反映在形态、生态、生理和发育性状上的差异也大，也许可以用亲本地理上距离的远近代表它们的遗传差异的大小。但进一步研究表明，亲本的地理分布与其遗传差异并无直接联系。由于一个符合育种目标要求的组合（F1）往往是许多优良性状的综合结果。因此，在亲本选配时必须考虑多个性状，不能只局限于单一性状。而采用多元统计方法获得的遗传距离就可衡量亲本多个数量性状的综合遗传差异。（3）配合力分析配合力是在选育玉米自交系的工作中引出的概念，是指一个自交系与另外的自交系或品种杂交后，杂种一代的产量表现。表现高产的为高配合力，表现低产的为低配合力。目前，配合力的概念已引伸到其他作物的杂种优势利用和杂交育种中。配合力和杂种优势有密切联系，但两者含意并不完全相同。配合力专指杂种一代的经济性状，主要是指产量高低和品质优劣；杂种优势系指杂种在经济性状、生物学性状等方面超越其亲本的现象。因此，利用杂种优势时，既要注意亲本配合力的高低，又要注意它们的杂种在有利性状方面优势的强弱。配合力有一般配合力（GCA）和特殊配合力（SCA）两种。一般配合力是指一个被测系（自交系、不育系、恢复系等）与一个遗传基础复杂的群体品种（系）杂交后，产量与品质等经济性状表现的能力，或这个被测系与许多其他系杂交后，F1的产量与品质等经济性状的平均值；特殊配合力是指一个被测系与另一个特定的系杂交后，产量与品质等经济性状的表现的能力。因此，可以说，被测系的许多特殊配合力的平均值，就是一般配合力。在杂种优势利用的实践中，选配一般配合力高的品种（系）作杂交亲本，有可能获得高产与优质杂种，减少选配杂交组合的盲目性。所以，一般配合力高的品种（系）是选育高产优质杂种的基础。在棉花上，测定配合力用得最多的方法是双列杂交法，这一方法不仅有理论基础，而且，可同时测定一般配合力和特殊配合力。（4）外源基因及异常种质的利用所谓外源基因，指人工构建的或非棉属的其他物种的基因，目前主要是指转Bt等抗虫基因；所谓异常种质是指一般陆地棉品种不存在的一些质量性状种质，目前所涉及的主要是无腺体（即低酚棉）、无蜜腺、鸡脚叶、超鸡脚叶、芽黄及黄花粉等性状的种质。实际上，Bt等抗虫基因表达的也是一种异常质量性状。在20世纪90年代以前的20多年中，中国育成的陆地棉品种间杂交棉共13个，当时不存在外源基因参与的可能，也没有异常种质的亲本组成的杂交棉，杂交棉的杂种优势并不十分显著。在20世纪90年代的10年中，育成了23个杂交棉，其中，有转Bt基因抗虫棉为亲本的杂交棉15个，有异常种质即无腺体、鸡脚叶、芽黄、黄花粉等异常性状的种质参与的杂交棉5个（其中，3个同时具有Bt基因）。这些杂交棉优势明显，生产应用效果良好。据此，汪若海、李秀兰（2001）提出，Bt等外源基因及某些异常种质，很可能对杂交棉的杂种优势形成有着特殊的作用。鉴于外源基因及异常种质形成超常优势的现状，他们就杂交棉亲本选配原则提出了双亲遗传差异要“大同小异”的新观点。大同指双亲遗传基础基本相近，综合性状都较优良。小异指某项性状、某些遗传物质或某个遗传位点上确有明显差异。由此会形成显著的杂种优势；如果双亲间遗传基础“雷同无异”，相当于亲缘相近的品种（系）间杂交，常无优势可言；反之，双亲间的遗传是“大异小同”，则相似于种间杂交，变异大而很难获得可利用的优势。棉花杂种优势利用途径，实际上就是指杂交制种的方法。尽管杂交制种的方法各不相同，但去雄和授粉是任何杂交制种方法所共有的环节。根据去雄方式的不同，目前，杂种优势利用的途径主要分为人工去雄授粉法、雄性不育系（包括核雄性不育，即一系两用法和核质互作雄性不育，即三系法）、标记性状利用和花器官变异体利用。目前，生产上应用的杂交棉以人工去雄授粉法为主，占95%以上的杂交棉面积，其次是核雄性不育系的利用。（1）人工去雄授粉法人工去雄授粉法制种的最大优点就是父母本选配不受限制，配制组合自由，它的缺点是制种全部需要人工操作，工作强度大，种子生产成本高。为了提高制种效率，有关单位做了大量的制种方法研究。湖南澧县研究了冷藏花粉不去雄授粉法，原北京农业大学（现中国农业大学）研究了不去雄强制授粉法，江西省棉花所研究了麦秸套管授粉法，湖北南梓县研究了花冠直套法，河南研究了全株去雄法等，在一定程度上提高了制种效率。但降低制种成本问题仍然没有完全解决。（2）核雄性不育材料的一系两用法这种方法又称稳定系自交繁殖制种法。四川省农业科学院经济作物研究所采用这一方法先后选育出的组合有川杂1号、川杂3号、川杂4号、川杂6号等。采用一系两用法，需拔除50%以上的可育株，制种成本仍然较高，其不育系的不育性逐步失去稳定性，达不到1∶1的分离比率；加上不育材料的综合性状已大大落后于现有生产品种，在抗性上难以达到抗病水平；不育基因对杂种生产能力有负效作用等原因，该途径的利用已受到限制。国内外棉花杂种优势利用均存在制种成本高、优势不很强的共同困难，制种成本居高不下的原因除人工去雄外，各种雄性不育材料的制种环节多也是一个重要原因。核不育材料由于未能解决保持问题，制种过程中必须拔除可育株。核不育两用系仍然要通过系内可育与不育株的授粉来保存。利用核质互作不育材料时，转育恢复基因和育性强化基因周期长，使选拔优势组合大受限制，加大了研制成本。因此，在杂种优势利用上，研究新的技术途径，尤其是生物技术的应用，势在必行。随着分子生物学、植物病理学及基因工程技术的迅猛发展，运用基因工程手段提高植物的抗病性，为抗病育种开辟了一条崭新途径。分子育种目前主要包括分子标记辅助育种、转抗病基因育种和分子设计育种3部分内容。分子标记辅助选择（molecular marker-assisted selection，MAS）主要是指基于分子标记和作图技术，利用与目标性状紧密连锁的DNA分子标记对目标性状进行间接选择，以在更短代数内就能够对目标基因的转移进行准确而稳定的选择，聚合多种目标性状特别是对选择隐性基因控制的优良农艺性状十分有利，结合加代技术就可以大大缩短育种年限，缩小育种群体，提高育种效率，聚合选育出抗病、优质、高产的品种。目前，通常采用的分子标记技术主要有RFLP、RAPD、AFLP、SSR等。国内外一些学者正致力于棉花抗性基因分子标记的研究。一方面通过寻找与抗病基因紧密连锁的分子标记，能够直接或间接地定位抗病基因；另一方面用与抗病基因紧密连锁的分子标记，能够把多个基因聚合在同一个品种中，从而实现抗原积累，提高抗病品种的使用年限，并能把抗性与棉花的其他重要农艺性状结合起来，为分子标记辅助育种提供有力的工具，从而大大缩短育种年限。陈勋基等（2008）以高抗枯萎病的陆地棉品系（Gossypium hirsutumL.）98134和海岛棉（Gossypitum barbadenceL.）感病品种新海14号为亲本，构建98134×新海14的F2和F2∶3分离群体。运用SSR标记构建连锁图谱，用复合区间作图法对F2∶3家系的病指进行基因组QTL扫描，共检测到4个与棉花枯萎病相关QTL效应，分别位于3、15、23和26连锁群上。经标记值分析，该QTL能解释高值亲本的增效作用，分别解释F2∶3家系变异的12.4%、20.96%、4.7%和11.9%。虽然研究中的遗传图谱位点较少，密度不大，但是由于其作图群体是陆海杂交群体，所筛选出来的标记均在两个亲本间差异较大。构建群体所用的亲本为新疆棉区主栽品种，它们除了在抗病性状方面有差异外，其纤维品质性状具有互补性，试验所用作图群体的F2∶3株行，在均匀的枯萎病重病试验田种植，整个生育期内，进行了多次的病指统计鉴定，试验数据可靠，重复性好，对枯萎病QTL的定位比较可靠。研究结果为分子标记辅助选择抗枯萎病棉花育种提供了重要的理论依据。目前，国内外用于棉花转抗病基因育种的基因主要有两类：一类为病程相关蛋白（PR protein）基因，包括各种来源的几丁质酶基因（Chi）等；另一类为各种植物源的抗菌蛋白基因，已报道和利用的有萝卜抗真菌蛋白（AFP）、天麻抗菌蛋白（Afp-1）、商陆抗菌蛋白基因（Afp-2）等。在方法上，主要采用农杆菌介导法和花粉管通道法来获得转基因抗病的优良植株即育种材料，然后经过常规的杂交育种或者系统选育，最终培育出优良的棉花新品种。天麻抗真菌蛋白（gastrodia antifungal pratein，简称GAFP）是从我国传统中药天麻（Gastrodia elataBl.）中分离得到的一种具有广谱抗真菌活性的蛋白质，它对许多植物真菌病的致病菌离体具有很强的抑制作用。危晓薇等（2007）报道，将所获得的转gafp基因的陆地棉经Southern点杂交，证实得到了2株高抗枯萎病的转基因植株。其后代经过进一步的抗病性筛选、PCR鉴定、选育和扩繁，发现转基因陆地棉后代具有稳定的、较强抗枯萎病能力。从7月20日枯萎病发病高峰期调查枯萎病圃抗病性鉴定结果看（表5-9），对照军棉1号的枯萎病发病程度重，枯萎病病指54.59，受体对照新B-1的枯萎病病指为42.87。同时，对鉴定结果进行了校正并计算了各个株系的抗效来客观评价各株系的抗枯萎病水平，T3代5个转基因株系中，3个株系HB0204、HB0240和HB0254的枯萎病相对病指分别为8.14、9.03和5.18，均在5.1～10.0，抗效在80.1～90.0，为抗枯萎病类型，其余2个HB0208和HB0260相对病指均在10.1～20.0，抗效在60.1～80.0，为耐枯萎病类型。而陆地棉对照新B-1为感枯萎病类型。从转基因陆地棉后代株系与受体品种的抗效比较结果来看（表5-10），转基因陆地棉株系枯萎病抗效比受体品种的提高均在27.94%以上，其中，HB0254枯萎病抗效提高最为明显，为46.66%，说明转天麻抗真菌蛋白基因（gafp）的陆地棉后代具有较强的抗枯萎病能力。2003年，在库车试验站继续进行抗枯萎病鉴定试验，有8份转基因后代株系材料抗病性达到“抗”以上（当年10月28日进行的剖秆病指小于10）（表5-11）。株系发病率（%）病指相对病指抗效抗病类型HB020427.088.858.1483.79RHB020845.4513.6412.5575.01THB024032.919.819.0382.03RHB025412.505.635.1889.69RHB026018.7513.2812.2275.67T军棉1号（CK）86.9954.5950.000.00S新B1（CK）67.9742.8739.4421.47S表5-9 转基因陆地棉后代株系抗枯萎病鉴定结果株系HB0204HB0208HB0240HB0254HB0260枯萎病抗效提高（%）43.0831.9839.0046.6632.64表5-10 转基因陆地棉后代株系与受体品种的抗效比较编号总株数发病株数（剖秆10月28日）0级1级2级3级4级发病株率（%）病指0305421410400028.67.1030546139400030.87.70305521411300021.45.4030556149500035.78.90305571612400025.06.30305621210200016.74.20306011511400026.76.70306432200000.00.1表5-11 2003年枯萎病圃转基因抗病材料发病情况调查（10月28日）目前，研究较多的是以拟南芥为模式植物的系统获得抗性SAR（system acquired resistance），当植物受到病原菌侵染后局部的HR（hypersensitive resistance）会产生一类信号分子，这种信号分子能诱发整个植株的防卫基因表达，从而使植物对更多的病原菌产生抵制作用（王忠华等，2004）。而SNCl（suppressor of nprl-1，constitution 1）基因在植物的系统获得性抗性（SAR）发生中，起着重要的作用，它是从拟南芥中克隆出的，以水杨酸为信号传导的负调控子，有着组成型的高水平PR基因表达，具有广谱抗病性，此基因编码NB-LRR（nucletide-binding-leucine-rich repeats）蛋白（Li等，2001；Zhang等，2003）。将SNCI序列在NCBI上Blast，极少部分序列与已知的棉花序列相似，但功能不同。由于该基因尚未在其他植物中进行遗传转化。因此，雷江荣等（2010）以陆地棉中棉所35和军棉1号的茎尖为外植体，利用农杆菌介导法将含有拟南芥抗病基因SNCl（suppressor ofnprl-1，constitutive 1）转入棉花。对外植体培养时期、农杆菌侵染时间和共培养时间进行改良，试验结果表明，在外植体培养1天，菌液侵染20min，并且共培养保持在2天能够获得较高的遗传转化效率。PCR以及RT-PCR对再生植株T0代和T1代棉花的检测结果表明，SNC1基因已经整合到棉花的基因组中并得到表达。利用浸根法，对T1代转基因棉花接种棉花枯萎病菌强致病力菌株（Fusarium oxysporumf.sp.vasinfectum），与对照比较，T1代转基因棉花的枯萎病抗性明显提高（表5-12）。该项试验所选择的新疆棉花枯萎病菌是致病力较强的菌株，它对感病品种“军棉1号”的致病率为66.7%。采用培养钵伤根法，接种到转SNC1基因的T1代植株，转SNC1基因的棉花品种发病率较非转基因品种均有明显的降低。说明转化外源SNC1基因的棉株对棉花枯萎病具有一定的抗病性。但这仅是对T1代植株的室内接菌结果，仍须种植于大田病圃中，继续进行剖根鉴定。品种总株数第1天第6天第11天第16天第21天病株数发病率（%）病株数发病率（%）病株数发病率（%）病株数发病率（%）病株数发病率（%）转基因军棉1号128001612.52821.93225.04837.5转基因中棉所35153001711.12315.03422.23422.2军棉1号对照150003322.08456.010066.710066.7中棉所35对照150001510.04530.06040.07550.0表5-12 接菌后棉株培养钵伤根法接菌发病率统计利用分子生物学技术揭示抗性提高材料中相对于原感病品种中差异表达的基因，为后续克隆这些抗病相关基因和研究定向筛选抗病性提高的分子机制奠定了良好基础。Liang等（1995）发明的mRNA差异显示（mRNA differential display）技术是一种快速、简便、灵敏的能直接鉴定和克隆差异表达基因的方法。近年来，此方法已被广泛地运用到真核生物基因差异表达的研究中。吕学莲等（2008）以天九63棉花品种和其经过病圃定向筛选2年、3年分别对枯萎病菌7号生理小种表现高感、耐病和抗病的材料为研究对象，利用差异显示PCR技术对接种枯萎病菌前后的抗、感材料中差异表达的基因进行了初步研究，结果共得到62个差异条带。进一步通过反向Northern杂交验证，发现其中有8个是抗病诱导增强的阳性条带。经克隆、测序和同源性比对分析，结果表明，除14-3片段没有找到同源性外，其余的差异条带都可以找到同源性较高的序列。其中，10-5和22-11与盐胁迫下松科植物的抗菌素cDNA同源性达到100%，22-6达到96%，22-2与缺氮条件下松科植物cDNA的同源性为100%，推断其与植保素类物质的调控和生成相关；13-10与陆地棉纤维的cDNA同源性为100%，蛋白质序列比对发现它编码磷酸氧化酶相关的维生素类物质，推断其参与抗病相关酶类的合成途径；差异条带6-3与棉花根茎部幼嫩组织和纤维的cDNA同源性为99%，与陆地棉胚珠cDNA同源性为98%；10-7与假定的衰老相关蛋白mRNS同源性为98%。作物分子设计育种最初由荷兰科学家Peleman（2003）提出，其目的是通过各种技术的集成与整合，在育种家的田间试验之前，对育种程序中的各种因素进行模拟、筛选和优化，确立目标基因型、提出最佳的亲本选配和后代选择策略、提高育种过程中的预见性。分子设计育种一般包括以下步骤：①找到育种目标性状的基因/QTL或其紧密连锁标记；②利用QTL位置、遗传效应、QTL之间的互作、QTL与环境之间的互作等信息，模拟和预测各种可能基因型组合的表现型，从中选择符合特定育种目标的基因型；③进行目标基因型的途径分析，制定育种方案；④根据制定的育种方案进行育种，在此过程中，合理应用分子标记育种、转基因育种和传统育种技术，实现预期目标。由此看来，可把分子设计育种看成分子育种的高级形式。全基因组选择技术，也可认为是分子设计育种的组成部分。近20年来，随着分子生物学和基因组学等新兴学科的飞速发展，使育种家对基因型进行直接选择成为可能，作物分子育种因此应运而生。分子育种就是把表现型和基因型选择结合起来的一种作物遗传改良理论和方法体系，可实现基因的直接选择和有效聚合，大幅度提高育种效率，缩短育种年限，在提高产量、改善品质、增强抗性等方面已显示出巨大潜力，成为现代作物育种的主要方向。

SNP （单核苷酸多态性） 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的 DNA 序列多态性，包含单个碱基的转换、颠换等。InDel是指插入/缺失 （Insertion/Deletion） 基因组中小片段的插入和缺失序列，个体重测序中特指1～50 bp 的小片段插入和缺失。在生物的进化进程中，生物全基因组水平上积累了大量的微小变异，主要包括SNP 和InDel。这些微小变异的变异程度决定了物种之间在表型和生理结构等方面的差异，为新物种的形成提供了最原始的动力，是物种多样性的本质体现。SNP 标记是基因组DNA序列中分布最广泛的一类标记，植物基因组中平均每数百bp就存在着一个SNP （Huang et al.，2010；Qi et al.，2013）。InDel标记也是一种重要的遗传标记，已被广泛应用于图位克隆、基因定位、动植物遗传多样性的鉴定、分子标记辅助育种等领域（Jander et al.，2002；Schnabel et al.，2005；王岩等，2009；王明军等，2010）。随着高通量测序技术的快速发展，利用全基因组重测序（whole genome re-sequencing，WGR） 技术结合混合分组分析法（bulked segregate analysis，BSA） 可高效检测出通过双亲杂交建立的后代群体中导致表型变异的 QTL和突变位点 （Abe et al.，2012；Takagi et al.，2013），并且可以识别大量的 SNP 和 InDel 位点，从而进行SNP 及InDel标记的开发，获得基因区间的SNP 及InDel标记。本研究利用WGR技术及 BSA法相结合，获取与抗炭疽菌叶枯病基因相关的SNP 和InDel位点，并通过对△ （SNP-index） 图谱分析，快速锁定抗病区域，再通过ANNOVAR软件分析，提取注释信息，筛选出候选的抗病基因。并利用实时荧光定量 PCR （qRT-PCR） 技术对候选基因经过炭疽叶枯病病原菌侵染后的不同时间段基因表达量的变化进行分析，寻找响应炭疽叶枯病病原菌侵染的抗病相关基因并对其进行详细的功能分析，以期揭示苹果抗炭疽菌叶枯病的分子机制。用于全基因组重测序的材料为 ‘金冠’ ‘富士’ 及第三章中经过抗病鉴定的 ‘金冠’ב富士’ 的 F1 代群体中极端抗炭疽菌叶枯病的20个单株和极端感炭疽菌叶枯病的20 个单株。取其嫩叶3～5 片，液氮速冻，置于-70℃冰箱保存，用于提取DNA。用于qRT-PCR 分析的材料为 ‘富士’ 和 ‘金冠’ 带嫩叶的一年生健壮新梢各30 枝，用于室内人工离体接种。接种方法同第二章，分别于接种后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h七个时间点采集叶片，液氮速冻后，用于提取RNA，检测基因表达。参考Doyle和Doyle （1987） 及 Cullings （1992） 提取基因组DNA的CTAB法，并加以改进，详见第三章。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的纯度和完整性。条带单一、清晰明亮、无降解、无污染的DNA样品作为合格样品用于后续研究。运用NanoPhotometer ? 分光光度计 （IMPLEN，CA，USA） 对DNA的纯度进行检测。DNA经过 Qubit ? DNA Assay Kit in Qubit ? 2.0 Flu-rometer （Life Technologies，CA，USA） 进行浓度的精确定量。将DNA浓度调整为100 ng/μl。苹果嫩叶总RNA的提取方法如下。（1） 将500 μl裂解液RLT Buffer、50 μl PLANTaid、5 μl β-巯基乙醇，依次加入灭菌的1.5 ml离心管中，混匀，待用。（2） 将冻存于-70℃下的苹果嫩叶0.2 g置于预冷的研钵中，加少量液氮快速研磨成细粉状后转入上述待用的的离心管内 （样品容易褐化，动作要迅速，并保证液氮挥发完全）。（3） 56℃温育5～10 min，期间不断剧烈震荡混匀，以保证充分裂解。（4） 12000 r/min 离心10 min，将离心管缓慢从离心机中取出，将上清液转到新离心管中 （吸取上清液时一定要缓慢，尽量不要吸到底部沉淀）。（5） 较精确估计上清液体积，加入 0.5 倍体积的无水乙醇，盖盖，上下颠倒混匀，此时可能会出现沉淀，但是不影响提取的过程。（6） 将混合物 （每次上样应小于800 μl，可分两次加入） 加入吸附柱中，12000 r/min离心60 s，弃废液。（7） 在吸附柱中加700 μl去蛋白液 RW1，室温下放置5 min （可稍延长时间，去除吸附柱上的蛋白污染），12000 r/min 离心30 s，弃废液。（8） 在吸附柱中加入 500 μl 漂洗液 RW （加过无水乙醇），12000 r/min离心 30 s，弃废液。再加入 500 μl 漂洗液 RW，重复1遍。（9） 将吸附柱放回空收集管中，12000 r/min空离心2 min，尽量除去吸附柱中残留的漂洗液。（10） 将吸附柱放入一个 RNase free 离心管中，在吸附膜上加40 μl RNase-free water （最好事先在 70～90℃中水浴加热），室温放置2 min，12000 r/min 离心1 min，如需RNA浓度较高，可重复离心1次。（11） 取4 μl RNA加入6×RNA Loading Buffer，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取的质量与纯度，并估测提取浓度。（12） 将检测质量好的RNA放入-70℃下保存备用。参照 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time） 试剂盒 （TaKaRa）。具体操作步骤如下 （全程冰上操作）。（1） 基因组 DNA 的去除。在 0.2 ml 灭菌的离心管中依次加入1 μg 总 RNA，2 μl 5×gDNA Eraser Buffer，1 μl gDNA Eraser，用RNase-Free水补足10 μl，42℃，2 min （或者室温5 min）；4℃。（2） 反转录反应。在0.2 ml灭菌的离心管中依次加入10 μl步骤1的反应液，1 μl PrimerScript RT Enzyme Mix I，1 μl RT Primer Mix，4 μl 5×PrimerScript Buffer 2 （for Real Time），用 RNase Free 水补足20 μl。37℃，15 min；85℃，5 s；4℃。（3） 质量检测。用 β-actin 基因的引物对反转录的 cDNA 进行PCR扩增，并用1%的琼脂糖电泳检测，选取质量好的样品在-20℃下保存备用。将 ‘金冠’ב富士’ 的F1 代群体中选取出的 20 个极端抗病的单株和20个极端感病的单株DNA等量混合构建成两个表型池。检验合格的4 份 DNA 样品每份取1.5 μg进行基因文库的构建。通过Covaris破碎机将DNA样品随机打断成长度为350 bp的片段。采用TruSeq Library Construction Kit 进行建库，严格使用说明书推荐的试剂和耗材。DNA 片段经末端修复、加 ployA 尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。构建好的文库通过 illumina HiSeqTM PE150进行测序 （附图4-1）。文库构建完成后，先使用 Qubit 2.0 进行初步定量，稀释文库至1 ng/μl，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段 （insert size） 进行检测，符合预期后，使用Q-PCR 方法对文库的有效浓度进行准确定量 （文库有效浓度＞2 nM），以保证文库质量。4个文库检验合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行 Illumina HiSeq TM PE 150 测序。围绕350 bp的片段进行双末端 125 bp 测序。表型差异的两个亲本测序深度为10 X，抗感池测序深度为20 X。信息分析的主要步骤如下 （附图4-2）。步骤一：对下机得到的原始测序数据 （Raw data） 进行质控得到有效测序数据 （Clean data）。步骤二：将Clean data比对到参考基因组上。步骤三：根据比对结果，进行 SNP、InDel 的检测，分析 SNP、InDel的分布情况并进行注释。步骤四：对子代SNP 频率差异进行分析。步骤五：根据分析结果对目标性状区域进行定位。步骤六：确定候选基因。测序得到的原始测序序列 （Sequenced Reads或者 raw reads），里面含有带接头的、低质量的 reads。为了保证信息分析质量，必须对raw reads过滤，得到有效测序序列 （clean reads），后续分析都基于clean reads。数据处理的步骤如下。一是去除带接头 （adapter） 的reads pair。二是当单端测序read中含有的N的含量超过该条read长度比例的10%时，需要去除此对paired reads。三是当单端测序read中含有的低质量 （Q≤5） 碱基数超过该条read长度比例的 50%时，需要去除此对paired reads。有效测序数据通过 BWA （http：//bio-bwa.sourceforge.net/） 软件 （Li and Durbin，2009） 与 ‘金冠’ 苹果的基因组 （ https：//www.rosaceae.org/data/download） 进行比对，确定reads在基因组上的位置。比对结果使用 SAMTOOLS （ http：//samtools.sourceforge.net/）软件进行SNP-calling （Li and Durbin，2009），发掘 reads 与参考序列以及 reads 之间的 SNP 位点，利用 SAMtools 软件中的 “rmdup” 指令去除序列文件中的重复。人们采用GATK3.3软件 （McKenna et al.，2010） 的UnifiedGeno-typer模块进行多个样本 SNP 和 InDel的检测，使用 VariantFiltration进行过滤，SNP 的过滤参数为：cluster Window Size 4，filter Expression“QD＜4.0 ‖ FS＞60.0 ‖ MQ＜40.0”，G filter “GQ＜20”。InDel的过滤参数为：cluster Window Size 4，filter Expression “QD＜4.0 ‖ FS＞200.0 ‖ ReadPosRankSum＜-20.0 ‖ InbreedingCoeff＜-0.8”。利用ANNOVAR软件 （Wang et al.，2010） 对 SNP 和 InDel 检测结果进行注释。SNP 频率的统计：SNP 频率是指所检测到的总的SNP 数与参考基因组序列的总长度的比值，是衡量一个物种变异程度和多态性的指标。转换颠换率的统计：分别统计发生转换和颠换的SNP 数目。子代 SNP 的频率 （Takagi et al.，2013），即 SNP-index，是与SNP 位点的测序深度相关的参数，是指某个位点含有 SNP 的 reads数与测到该位点的总 reads数的比值。以参考基因组作为参照，分析计算两个子代在每个 SNP 位点的 SNP-index。SNP-index计算方法如附图4-3所示。若该参数为0，则代表所有测到的reads都来自作为参考基因组的亲本，即 ‘金冠’。参数为1则代表所有的reads都来自另一个亲本，即 ‘富士’。参数为0.5，代表此混池中的 SNP 来自两个亲本的频率一致。为减少测序错误和比对错误造成的影响，对计算出 SNP-index后的亲本多态性位点进行过滤，过滤标准如下。（1） 两个子代中 SNP-index 都小于0.3，并且 SNP 深度都小于7的位点，过滤掉。（2） 一个子代SNP-index缺失的位点，过滤掉。计算△ （SNP-index），即两个子代 SNP-index 作差：△ （SNP-index）=SNP-index2 （极端抗病性状）-SNP-index1 （极端感病性状）。为直观反映△ （SNP-index） 在染色体上的分布情况，对其在染色体上的分布进行作图。默认选择1 Mb 为窗口，1 kb 为步长。进行1000次置换检验，选取95%置信水平作为筛选的阈值。为了不忽略掉微效QTL的影响，在全基因组范围内挑选两个子代在SNP-index差异显著的SNP 位点，即挑选子代2 （极端抗病性状） SNP-index大于0.7，且子代1 （极端感病性状） SNP-index小于0.3的位点，并与亲本 ‘富士’ 为纯合及亲本 ‘金冠’ 为杂合的位点取交集，做为候选的基因位点。提取ANNOVAR的注释结果，优先挑选使基因获得终止密码子的变异 （stop loss） 或者使基因失去终止密码子的变异 （stop gain） 或者非同义突变 （missense） 或可变剪接的位点（Splicing） 所在的基因作为候选基因。从网站 https：//www.rosaceae.org/gb/gbrowse/malus_x_domestica/下载候选基因的 mRNA，从基因编码区核苷酸序列的近3’端位置设计引物，PCR产物长度在150～250 bp，引物序列见表4-1，内参基因为β-actin基因。荧光定量 PCR 在罗氏 LightCycler 480 系统上进行，反应体系配制按 SYBR Green PCR Master Mix 说明书进行操作，具体如下：10.0 μl SYBR Premix Ex Taq Ⅱ （2×），0.8 μl正反向引物，2.0 μl cDNA，去离子水补足20 μl。反应程序为95℃ 预变性5 min，95℃ 10 s变性，55℃ 10 s退火，72℃ 10 s延伸，扩增45 个循环。循环结束后进行熔解曲线分析：95℃ 15 s，60℃ 20 s，然后缓慢升温至95℃。基因的相对表达量用公式：F=2-ΔΔCt，ΔΔCt=（待测组目的基因 Ct值-待测组内参基因 Ct值）-（对照组目的基因 Ct值-对照组内参基因Ct值）。Illumina HiSeqTM PE150 测序平台，四个样本共产生 47.115 G的测序原始数据 （Raw data），通过对原始数据中的接头序列，低质量碱基以及未测出的碱基 （用 N 表示） 进行过滤后，得到有效数据 （Clean data） 46.974 G，各样本的 Raw data 在 7774.247～17017.174 Mb，Clean date 在7751.990～16969.215 Mb，过滤后获得的有效数据比率在99.64%～99.72%，碱基错配率低于0.05%。测序质量 Q20 ≥ 95.08%、Q30 ≥ 88.97%，GC 含量在 39.04%～39.16%。这表明所有样本的数据量充足，测序质量很高，GC 分布正常，建库测序成功，保证了后续数据分析的准确性 （表4-1）。样本原始数据/bp有效数据/bp有效率/%错误率/%Q20/%Q30/%GC含量/%富士7774246500775199010099.710.0395.4389.6339.16金冠7900566600787192650099.640.0395.5589.8839.05BR（基因抗池）170171739001696921590099.720.0395.4489.6239.04BS（基因感池）144234894001438116750099.710.0495.0888.9739.15表4-1 测序数据质量概况将四个样品的有效数据与已经发布的金冠苹果参考基因组序列（https：//www.rosaceae.org/data） 进行比对，计算出比对到参考基因组 （参考基因组大小为609314018 bp） 上的 reads条数、测序深度及碱基覆盖率。结果表明，四个样品的比对率均在87%以上，两个亲本的测序深度达到15×以上，抗感池样品的测序深度达到 30×以上。在参考基因组中至少有1个碱基覆盖的位点占基因组的比例达到95%以上，至少有 4 个碱基覆盖的位点占基因组的比例 “富士” 为88.3%，“金冠” 为91.26%，其他两样品达到96%以上。这进一步的说明，本试验测序的数据质量很高，可用于后续的变异检测及相关分析 （表4-2）。样本比对到reference上的reads条数①有效测序数据的reads总条数比对率/%②平均测序深度/x③参考基因组中至少有1个碱基覆盖的位点占基因组的百分比/%参考基因组至少有4个碱基覆盖的位点占基因组的百分比/%富士455966535167993488.2315.9595.9588.3金冠459536665247951087.5615.6798.0991.26BR（基因抗池）10045340711312810688.834.4298.896.67BS（基因感池）8962925610163794888.1830.8898.7896.44表4-2 测序深度及覆盖度统计通过全基因组重测序技术共获得3399950个 SNP 位点，苹果参考基因组总长度为 609314018 bp，据此计算出 SNP 出现的频率为3399950/609314018=0.56%。转换 （T/C、C/T） 和颠换 （T/G、T/A、C/A、C/G） 发生频率 （附图 4-4） 的统计结果显示，T/C 和C/T转换发生的频率分别为 32.5%和 34.1%，T/G、T/A、C/A和C/G颠换发生的频率分别为 9.2%、9.4%、9.4%、5.4%。转换/颠换率为2.0。利用测序获得的有效数据，比对苹果参考基因组序列，经 ANN-OVAR软件分析共得到 SNP 位点 3399950个，InDel 位点 573040个，SNP 位点位于内含子上的465317个，位于外显子上的436309个，其中同义变异 210404个，非同义变异 220539个，InDel 位点位于内含子上的 108996个，位于外显子上的 19957个，其中插入或缺失3 或 3 的整数倍的碱基，不改变蛋白质的编码框的有 6928个。这表明绝大部分变异位于非编码区，或不会导致基因编码的改变，这有利于维持植物体正常的生长发育，保证品种特性的稳定遗传 （表4-3）。类别SNP数量基因上游184156获得终止密码子4837失去终止密码子529外显子同义变异210404非同义变220539内含子465317剪接位点2196基因下游177312基因上游/基因下游12750基因间区2105122转换2265734颠换1134216转换/颠换/%1.997合计3399950表4-3 SNP及InDel检测及注释类别InDel数量基因上游51816获得终止密码子376失去终止密码子68Frameshiftdeletion①7330外显子Frameshiftinsertion5255Non-frameshiftdeletion②3843Non-frameshiftinsertion3085内含子108996剪接位点598基因下游44305基因上游/基因下游3896基因间区342800插入262868缺失310172合计573040表4-3 SNP及InDel检测及注释（续）-1△ （SNP-index）=SNP-index B （极端抗病性状）-SNP-index A （极端感病性状）。进行1000次置换检验，选取95%置信水平作为筛选的阈值。一般情况下，在苹果 F1 群体中，由于每个位点的碱基均来源于双亲中的一个，所以在基因组中大部分区域的 SNP-index都在0.5附近。如果某个SNP 位点与抗性相关，那么在该处的 SNP-index就会显著偏离0.5，△ （SNP-index） 就会显著大于此处的阈值。从抗感池中△SNP-index值在染色体上的分布可以看出，在第15 条染色体2～5 Mb区间内△SNP-index值显著的大于阈值，预示着该区域内可能存在着与抗炭疽菌叶枯病基因相关的位点 （附图4-5）。这与第三章SSR标记所确定的抗性基因所在的区域吻合。在全基因组范围内挑选在两个子代池中 SNP-index 差异显著的SNP 位点，即挑选在抗池中 SNP-index 大于 0.7，在感池中 SNP-index小于0.3，△ （SNP-index） 大于 0.5 的 SNP 位点，并与亲本‘富士’ 为纯合，亲本 ‘金冠’ 为杂合的位点取交集，共得到258 个候选的多态性标记位点 （表4-4）。这258 个 SNP 位点中位于基因上游1 kb的19个，基因下游1 kb 的12 个，位于基因上游1 kb 区域，同时也在另一基因的下游1 kb区域的2 个，位于基因间区的173 个。位于外显子上非同义变异的13 个，同义变异7 个，位于内含子上的31个。其中位于第15条染色体上的有123 个，占整个候选 SNP 位点的47.7%。类别SNP数量基因上游19获得终止密码子0失去终止密码子0外显子同义变异7非同义变13内含子31剪接位点1基因下游12基因上游/基因下游2基因间区173转换161颠换97转换/颠换/%1.659合计258表4-4 候选多态性标记位点的注释提取ANNOVAR的注释结果，优先挑选能引起基因获得终止密码子、失去终止密码子的变异，或者非同义突变，或者可变剪接的位点所在的基因作为候选基因。经筛选后得到33 个 SNP 位点及所对应的29个候选基因 （表4-5）。这些SNP 位点中发生转换的 （G/A、C/T、T/C、A/G） 共 16 个，占 48.5%，发生颠换的 （G/C、C/G、G/T、A/C、A/T、T/G、T/A、C/A） 共17 个占51.5%，其中有21 个位于第15条染色体上。基因ID类型染色体SNP位点参考基因组碱基型Ref突变碱基型AltMDP0000294705nonsynonymous24029182TCMDP0000311597upstream26560007TCMDP0000335197upstream238255166CTMDP0000481284nonsynonymous511687941TCMDP0000266783nonsynonymous516570950ACMDP0000223383upstream814935907CTMDP0000203531upstream918259400TGMDP0000265695upstream919790733GAMDP0000224187nonsynonymous1034991229ATMDP0000226279upstream1123158805AGMDP0000480608upstream123704417TGMDP0000504610upstream1229472316TCMDP0000292279upstream151396770CTMDP0000686092nonsynonymous153955717AGMDP0000686092nonsynonymous153955724AGMDP0000686092nonsynonymous153955738TAMDP0000205432nonsynonymous154094431TAMDP0000120033upstream154236293AGMDP0000864010nonsynonymous154257246GAMDP0000945764nonsynonymous154336468CAMDP0000149107splicing154970310CTMDP0000609131upstream156771435CAMDP0000169753upstream157074724ACMDP0000296372upstream157704309CT表4-5 候选基因ID基因ID类型染色体SNP位点参考基因组碱基型Ref突变碱基型AltMDP0000199827upstream157710714TAMDP0000194508nonsynonymous157757532GAMDP0000320004upstream158084422ATMDP0000320004upstream158084636TCMDP0000320004upstream158084637ACMDP0000148808upstream158365795GTMDP0000133266upstream1533862275AGMDP0000157213nonsynonymous1549031042CGMDP0000169687nonsynonymous1552444208TC表4-5 候选基因ID（续）-1结合 SSR标记定位及全基因组重测序中对△ （SNP-index） 值分析的结果，从这29 个候选基因中筛选出位于第15 条染色体3.9～4.9 Mb距离内的5个基因 MDP0000686092、 MDP0000205432、MDP0000120033、 MDP0000864010、 MDP0000945764 做为抗炭疽菌叶枯病的最终候选基因。通过对5个候选基因进行 GO 功能富集分析发现，5 个候选基因中有3个功能未知。基因 MDP0000120033 具有核酸绑定功能，锌离子结合分子功能，参与 RNA 剪切生物过程，调节基因产物的表达。蛋白结构上具有CCHC型结构域的锌指结构，是丝氨酸精氨酸富集剪接因子。进一步同源比对该基因为 SR基因家族 RSZ亚家族基因，与拟南芥AtRSZ21蛋白的序列一致性达到60%，与花生AdRSZ21蛋白的序列一致性达到79%。基因 MDP0000864010 具有辅酶绑定功能，蛋白结构上具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 （磷酸盐） NAD （P） 绑定区域，属于NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族，进一步的同源性比对，该蛋白与鼠李糖生物合成酶 1 （rhamnose biosynthetic enzyme 1，RHM1） 有较高同源性 （表 4-6）。候选基因编码的氨基酸序列见附录五。基因ID基因功能注释MDP0000686092功能未知蛋白MDP0000205432功能未知蛋白质。MDP0000120033核酸绑定功能，锌离子结合分子功能，参与RNA剪切生物过程，调节基因产物的表达。具有锌指结构，CCHC型结构域，丝氨酸精氨酸富集剪接因子。MDP0000864010辅酶绑定功能，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸盐）NAD（P）绑定区域，NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族，可能与鼠李糖生物合成酶1有关。MDP0000945764功能未知蛋白表4-6 抗炭疽菌叶枯病候选基因的功能注释利用TMHMM2.0软件对候选基因进行跨膜结构分析，基因MDP0000686092和MDP0000120033具有跨膜结构。基因MDP0000686092具有1个跨膜区，基因MDP0000120033具有3个跨膜区，位置分别在153～172、187～209、214～236的区域内（附图4-6）。引物名称引物序列MDP0000686092基因荧光定量PCR引物P1-FP1-RF：5′-CAGGCTGGAGCGAAGTTTA-3′R：5′-CCTTTCTGTGATGGCATTGTT-3′MDP0000205432基因荧光定量PCR引物P2-FP2-RF：5′-GAAAAGCCAGCACCAGAAAC-3′R：5′-CGTATTCGTGGGGTTATAGAGC-3′MDP0000120033基因荧光定量PCR引物P3-FP3-RF：5′-TCTGGGAATGCTGCTAAAACTC-3′R：5′-GCAGGGCAGTAGTGAAGCAC-3′MDP0000864010基因荧光定量PCR引物P4-FP4-RF：5′-CGTGACCAATCGCCTAATA-3′R：5′-GGACGTGAGTGCCGTAGAC-3表4-7 荧光定量PCR引物引物名称引物序列MDP0000945764基因荧光定量PCR引物P5-FP5-RF：5′-TTTGCCAGCCTGTCAGAAGT-3′R：5′-AGTTGTAGAGGGAGGAGGAAGA-3′β-actin基因荧光定量PCR引物P6-FP6-RF：5′-CACTGCTTCTATGACTGGTTTTGA-3′R：5′-CTGGCATATACTCTGGAGGCTT-3′表4-7 荧光定量PCR引物（续）-1对接种炭疽菌叶枯病病菌后 0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h的 ‘富士’ 和 ‘金冠’ 枝条进行采样，提取 RNA，反转录成cDNA后，对5个候选基因的表达进行实时荧光定量分析。结果显示，5个基因均不同程度响应病原菌侵染 （附图4-7、 表4-7）。除了基因MDP0000864010在 ‘富士’ 叶片中的表达量表现为下调外，其余 4个基因均为上调表达。在 ‘富士’ 叶片中，基因 MDP0000205432、MDP0000120033和MDP0000945764 的表达量在接种后 24 h 均达到最高值，48 h降到最低值，然后又缓慢提高。在 ‘金冠’ 叶片中的表现不同于 ‘富士’，三个基因表达量的最高值出现在36 h，但最低值同样出现在48 h，这说明在这3个基因在抗病植株中对病原菌的应答要早于感病植株。尽管基因 MDP0000686092 和 MDP0000945764 在‘富士’ 和 ‘金冠’ 叶片中也均表现为上调表达，但是在 ‘金冠’ 叶片中的表达变化更为显著，基因 MDP0000945764 在 ‘金冠’ 叶片中的表达量达到最高值时为接种前的60 倍，而在 ‘富士’ 中的提高量为接种前的10倍。以上结果说明，5个候选基因均受炭疽菌叶枯病病菌的诱导，是苹果炭疽菌叶枯病抗病相关基因。SNP 标记的开发主要依赖于含有大量测序序列的数据库。通过全基因组测序，不仅可以获得大量的 SNP 标记，还可以了解到 SNP 标记在整个基因组中的分布情况，有利于我们进一步了解不同物种的生物学特性，以及利用标记进行不同需求的生物学研究。在葡萄的基因组测序中发现，SNP 位点的密度高达7%（Jaillon et al.，2007）；2010发表的金冠苹果全基因组序列中，SNP 标记的频率约为 4.4 kD/SM，即227 bp/SNP （Velasco et al.，2010）；梨的全基因组序列中共检测到3402159个 SNP 位点，约占基因组序列的 1.02%（Wu et al.，2013）；柑橘中得到的 SNP 位点数量为106 万个 （Xu et al.，2013）。对于有参基因组，通过全基因组重测序手段进行大量 SNP 标记开发，也是研究不同品种间差异的有效途径之一。通过对6 个玉米自交系的进行全基因组重测序，在非重复序列区域内共获得了 1272134个SNP 标记 （Lai et al.，2010）；对葡萄的230个基因片段重测序，数据统计结果显示，每64 个碱基中就存在着一个 SNP 位点 （Lijavetzky et al.，2007）；在水稻中，水稻籼稻恢复系 7302R 通过全基因组重测序，检测到307627个SNP 位点，其中有30239个位于mRNA序列中（Li et al.，2012b）；通过对苹果品种 ‘金冠’ 和 ‘红玉’ 进行全基因组重测序，在 ‘金冠’ 中得到了 2222816个 SNP 位点，在 ‘红玉’中得到了 4950346 个 SNP 位点，密度分别为 293 bp/SNP 和210 bp/SNP （孙瑞，2015）。SNP 变异从理论上来看主要包括转换、缺失、颠换和插入四种形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2∶1。并且SNP 在CG序列上出现的最为频繁，而且多是 C 转换为 T，主要原因为CG中的胞嘧啶常被甲基化，而后自发脱氨基形成胸腺嘧啶 T （Johnson and Told，2000；Mullikin et al.，2000）。从本实验中对 SNP转换/颠换频率统计结果来看，转换/颠换比为2.0，发生转换的频率为66.6%，发生颠换的频率为 33.4%，C/T 转换发生的频率最高为34.1%。这与前人研究的结论相符。通过重测序技术可以获得海量SNP 标记，利用这些标记构建高密度遗传连锁图谱为不同群体的进化分析，不同性状基因的遗传定位，分子标记辅助育种等提供有效信息。‘M.27’בM.116’ 的高密度遗传图谱是由306个SSR标记和2272个 SNP 标记组成，图谱密度达到了每 0.5 cM 一个标记 （Antanaviciute et al.，2012）。Khan 等（2012） 利用2875个分子标记构建了苹果的整合遗传图谱，其中包含了2033个 SNP 标记和 843 个 SSR 标记，总长为 1991.38 cM。Clark等 （2014） 利用3个不同的F1 杂交群体和SNP 芯片分型技术构建了包含1091个 SNP 标记的苹果品种 ‘Honeycrisp’ 的整合遗传图谱，标记间的平均距离为1.36 cM。基于高通量基因组重测序技术能够更加准确、全面的对测序物种进行全基因组水平上的位点进行评估，可以精确的完成单核苷酸多态性位点的检测，分子标记的开发，遗传图谱的构建，不同群体间的进化分析，与表型变异相关基因的挖掘以及快速定位等等。本研究通过运用全基因组重测序的方法对有着明显抗感性状分离的 ‘金冠’ 和 ‘富士’ 及其由 F1 代极端表型个体组成的抗感池进行全基因组范围内的遗传变异检测，共筛选得到 SNP位点3399950个，InDel位点573040个。通过对△SNP-index图谱的分析发现，在第15条染色体的2～5 Mb的区间内，△SNP-index显著的大于阈值，存在着明显的连锁不平衡，意味着该区域可能存在着抗炭疽菌叶枯病基因位点。这一结果与SSR标记所定位的抗炭疽菌叶枯病基因位点位置相吻合。SNP 广泛分布于基因组DNA中，且数量巨大。因为任何碱基均有可能发生变异，因此SNP 既有可能出现在基因的编码区，也有可能在基因的非编码区，或者两个基因之间的序列上。总的来说，位于基因内编码区的SNP 比较少，且该部分的 SNP 有可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此位于编码区 SNP 的研究更受关注。本试验对可能引起基因获得终止密码子、失去终止密码子、非同义突变、可变剪接的变异位点进行重点筛选，将其所在的基因作为候选基因。通过筛选共得到33个候选SNP 位点和29个候选基因。结合第三章SSR标记对炭疽叶枯病抗性基因的定位，最终锁定了 5 个候选基因： MDP0000686092、 MDP0000205432、 MDP0000120033、 MDP0000864010、MDP0000945764。锌指结构是一类在很多蛋白中存在的具有指状结构的模体，是具有识别特定碱基序列的一种转录因子结构。锌指的典型功能是作为互作的组件与核酸、蛋白质和小分子等多种物质相结合，参与多种细胞过程，如DNA的复制与修复、RNA 转录与翻译、物质代谢与信号转导、细胞的增殖与凋亡等 （Krishna et al，2003）。可变剪切 （Alternative splicing，AS） 是重要的转录后调控机制，在动物中对其在不同的生理以及病程条件下的可变剪切的调控作用研究的较多 （Garcia-Blanco et al.，2004；Nilsen and Graveley，2010）。据报道在拟南芥中超过 42%的外显子基因存在可变剪切现象（Filichkin et al.，2010）。在植物可变剪切数据库中有很大比例的 AS参与逆境响应基因的表达，这进一步强调了可变剪切在逆境响应中的重要作用 （Wang and Brendel，2006；Duque，2011）。在生物胁迫中，有许多试验证明AS参与植物的抵抗和防御机制。例如，在一些 R 基因中如番茄的N 基因，拟南芥的SNC1、 RPS4基因，发现可变剪切的存在 （Dinesh-Kumar and Baker，2000；Zhang and Gassmann，2003）。SR蛋白，丝氨酸/精氨酸富集剪切蛋白 （serine/arginine-rich proteins，SR protein） 是RNA绑定蛋白家族中功能和结构高度保守的一类因子，参与可变剪切过程。例如， AtSR30在高盐碱以及过氧逆境中被上调表达 （Tanabe et al.，2007）。SR在不同的环境条件下的表达量的差异说明了SR蛋白在逆境响应中的调控作用。基因MDP0000120033具有核酸绑定，锌离子结合分子功能，参与 RNA 剪切生物过程，调节基因产物的表达。具有CCHC型锌指结构和丝氨酸/精氨酸富集剪接因子，属于SR 基因家族 RSZ 亚家族基因。丝裂原活化蛋白激酶 MPK6 和MPK3在植物的防御反应中起着重要作用，而拟南芥基因 AtRSZ21 在体外试验中被发现能够被MPK6/MPK3磷酸化 （Feilner et al.，2005），这就意味着 AtRSZ21 也可能参与了植物的防御应答。Kumar 和 Kirti （2012） 报道了花生的一个属于 SR 亚家族基因 RSZ 蛋白基因AdRSZ21，在植物的超敏反应和抗逆反应中起着重要的作用。NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族是真菌病原体镰刀菌致病机制中的一个关键酶 （Srivastava et al.，2014）。细胞壁是植物细胞进行正常的生命活动不可缺少的重要组成部分。其不但在维持细胞形态、细胞间黏结、细胞壁的强度和调控细胞伸长等方面起着重要的作用，还参与了细胞的分化、抗病、细胞识别及信号传导等一系列生理、生化过程。细胞壁主要成分包含纤维素、半纤维素、果胶和少量的结构蛋白等。基因MDP0000864010属于依赖差向异构酶/脱氢酶家族，并且与鼠李糖合成酶Ⅰ （ RHMⅠ） 有较高的同源性。可能参与合成鼠李糖，而鼠李糖是细胞壁果胶多聚糖的重要组分之一。所以该候选基因有可能在细胞的组成层面增加个体的抗性。基因的相对表达量分析也表明，五个基因都不同程度的响应了病菌的诱导，是与抗炭疽菌叶枯病相关的候选基因。但是其参与抗病的机理和途径仍不清楚，深入的研究将继续展开。

植物病原菌的生物控制是最有前景也是比较实际的一种方法，众多的微生物已被证实具有生防效果（Massarty等，2006）。目前，棉花枯萎病的生防因子比较多，主要有微生物的利用和棉花枯萎病抑菌土的形成。应用拮抗微生物防治棉花枯萎病是比较有前景的防治方法。目前，用于防治棉花枯萎病的微生物主要包括真菌和细菌等。能够对棉花枯萎病产生拮抗作用的真菌较多，主要是木霉，包括哈茨木霉菌、绿色木霉菌等主要种类。此外，还有青霉菌、黏帚菌、曲霉菌以及非致病性尖孢镰刀菌等，也可作为防治棉花枯萎病的拮抗真菌。木霉（Trichodermaspp.）是土壤中广泛存在且有生防作用的一类真菌，对多种植物病原菌都有很强的拮抗作用，是自然界中普遍存在并有丰富资源的拮抗微生物。早在1932年，Weindling首次发现木霉菌对植物病原真菌有拮抗作用，据不完全资料，木霉对18个属29种病原真菌表现拮抗作用，在农业上应用木霉菌防治土传病害已有许多成功的报道。1999年，Sivan等对哈茨木霉防治棉花枯萎病的机制进行了研究认为，营养竞争作用是哈茨木霉减少枯萎病菌群体的机制之一。涉及的营养基质有葡萄糖和天门冬酰胺。在非根际土壤中，哈茨木霉不能减少枯萎病菌的数量。Ordentlich等（1991）试验结果表明，在平板对峙试验中，木霉菌株T-68和Gh-2生长迅速，其菌落能够扩展到棉花枯萎菌菌落中，并寄生在枯萎菌菌丝上。另一个木霉菌T-35（哈茨木霉）不能扩展到枯萎菌菌落中去，但温室盆栽试验表明，这3株木霉菌均能显著地防治棉花枯萎病。Silva-Hanlin等（1997）测试了5种木霉（Trichoderma polysporum、T.koningii、T.pseudokoningii、T.viride和T.harzianum）对棉花枯萎菌的作用。结果表明，供试的5种木霉菌均具有不同程度抑菌效果，其中，T.polysporum抑菌效果最强，其抑菌机理主要是导致菌丝内液泡增加和细胞质壁分离。而T.harzianum则是通过菌丝缠绕在棉花枯萎菌的菌丝上，并能够穿透病原菌菌丝。T.pseudokoningii也表现出穿透枯萎菌的能力。T.polysporum和T.viride还能够强烈地抑制病原菌分生孢子的萌发。温室生测试验中，T.harzianum、T.koningii和T.viride能够显著减轻棉苗枯萎病的为害。高智谋等（2007）利用平板对峙法和杯碟法测定了从安徽萧县枯萎病田土壤中分离、鉴定获得的哈茨木霉TH-1菌株对棉花枯萎病菌的拮抗作用。结果表明，哈茨木霉TH-1菌株与病菌对峙培养、以及在培养基中加入TH-1菌株孢子悬浮液，对供试棉花枯萎病菌有较好的抑制效果。平板对峙培养2天后，哈茨木霉TH-1菌株和供试病原菌沿接种点连线方向的生长均受到对方的抑制，但前者对后者的抑制作用更为明显。表8-1是培养3天和4天后各供试病原菌单独培养和与TH-1菌株对峙培养沿接种点连线方向的生长距离测定结果。从表8-1可知，TH-1菌株对各供试病菌菌株均有显著的抑制效应，抑制效应大小，菌株间有一定差异。对峙培养4天后，枯萎病菌WWKW1-1、WJKW2-4和XXKW5-1的菌落被哈茨木霉TH-1包围，菌落背面颜色由紫色变为橘黄色，并不再生长，两菌落间形成对抗局面。其后，TH-1可继续向前生长，并部分覆盖于枯萎病菌菌落之上，但最终不能完全覆盖枯萎病菌。说明在对峙培养中，哈茨木霉TH-1菌株的营养和空间竞争能力优于供试病原菌。培养5天后，哈茨木霉TH-1菌株各浓度处理对所有供试菌株的菌丝生长均有显著的抑制作用，且总体来说，抑菌率随TH-1菌株菌液量的增加而呈现递增的趋势。其中，2.50ml的处理对各供试病菌均完全抑制；1.00ml的处理对WWKW1-1、WJKW2-4和XXKW5-1菌株的抑制率分别为70.71%、37.80%和72.96%，培养5天后还观察到枯萎病菌WWKW1-1、WJKW2-4和XXKW5-1的菌落被哈茨木霉TH-1包围，菌落边缘颜色变褐，并不再生长，而TH-1可继续扩展，但最终不能完全覆盖枯萎病菌。在玻片对峙培养最初12h，哈茨木霉TH-1和枯萎病菌XXKW5-1的菌丝均独立生长，显微镜下观察不到相互作用；24h后于两菌株菌丝交接处，显微镜下可观察到TH-1菌丝与枯萎病菌XXKW5-1菌丝缠绕和平行生长，并产生附着胞结构与病菌菌丝附着；还观察到枯萎病菌XXKW5-3受到TH-1菌丝寄生而发生裂解现象。这表明，哈茨木霉TH-1对枯萎病菌XXKW5-1进行了重寄生。供试菌株培养3天后生长距离培养4天后生长距离对峙培养（cm）单独培养（cm）抑制率（%）对峙培养（cm）单独培养（cm）抑制率（%）WWKW111.432.6445.831.503.2854.27WJKW241.272.0838.941.302.4346.50XXKW511.432.7147.231.533.2953.50表8-1 平板对峙培养哈茨木霉TH-1菌株对棉花枯萎病菌生长的抑制作用对棉花枯萎病具拮抗作用的真菌，不仅可从棉田土壤中分离获得，而且也从蘑菇培养料废料和某些昆虫体内分离获得。张军华等（2009）从蘑菇培养料废料中，分离筛选出10株生防真菌。通过室内抑菌试验筛选出生防效果显著的7个菌株：TH、TP、TV、T1-5、TK、T1-1和T2-2（表8-2）。温室盆栽防病试验采用生防菌PD液的处理和采用生防菌棉籽壳制剂的处理，在温室灭菌土中（接种病菌）的相对防病效果分别为87.2%和90.6%，并且稳定性好。大田防病效果测定表明，棉籽壳生防菌剂明显降低了棉花枯萎病的病情，增产效果显著。当生防菌剂施入土壤后，就暂时打破了棉花根际原有的微生态平衡，成了这一微生态群的优势种群，对枯萎病菌发生拮抗作用，并与病原菌争夺营养物质和生存空间，阻隔了病原菌与棉花幼根接触；另外，棉籽壳的后发酵释放热量还可提高地温1.0～1.5℃，促幼苗早发，或在其他方面影响病原菌的生长和蔓延，使棉花枯萎病发病率降低或推迟。但这种被打破了的微生态平衡，有倾向于恢复正常的趋势。随着时间的推移，生防菌的种群优势逐渐削弱，棉花根际的微生态恢复常态，在土壤中普遍存在枯萎病菌的情况下，棉株罹病率可能会增加，但这种显著降低和推迟棉枯萎病田间病情的效能是非常可贵的，因为造成棉花产量损失的主要因素是前期发病，发病越迟对产量的影响越小。编号拮抗菌株R值菌株来源采集地TLTrichodermalongibrachiatum0.6802a棉籽壳平菇培养料东昌府THTrichodermaharzianum0.3980bc棉籽壳平菇培养料东昌府TVT.viride0.4151bc棉籽壳平菇培养料莘县TCT.citrinoviride0.6763a棉籽壳平菇培养料冠县TKT.koningi0.4827b棉籽壳平菇培养料莘县TPT.pseudokoningi0.3827c棉籽壳平菇培养料东昌府T1-1T.sp0.4527b木屑香菇培养料冠县T2-2T.sp0.5927a木屑香菇培养料冠县T1-5Trichodermaspp0.4127bc玉米芯平菇培养料莘县PPeniciliumsp.0.7027a玉米芯平菇培养料莘县CK1—表8-2 蘑菇培养料分离所得拮抗菌对棉花枯萎病菌抑菌效果金龟子绿僵菌是一种广谱性的昆虫病原真菌，其寄主范围广泛，能够侵染多种农业害虫，人类利用它防治害虫的历史已愈百年，但国内外有关虫生真菌对棉花枯萎病菌的生防效果鲜见报道。齐永霞等（2010）采用平板对峙培养法和杯碟法测定了金龟子绿僵菌对棉花枯萎病菌的拮抗作用。结果表明，金龟子绿僵菌Ma10、Ma27和Ma55菌株与棉花枯萎病菌WWKW、WJKW和SZKW菌株对峙培养以及在培养基中加入金龟子绿僵菌Ma55菌株的分生孢子悬浮液，对供试棉花枯萎病菌菌丝生长均有较好的抑制作用。平板对峙培养4天后，金龟子绿僵菌菌株和供试棉花枯萎病菌菌株沿接种点连线方向的菌丝生长均受到对方的抑制，但前者对后者的抑制作用更为明显。由图8-1可以看出，绿僵菌Ma55与棉花枯萎病菌WJKW在对峙培养处形成明显的隔离带。液体振荡培养不同时间获得的金龟子绿僵菌Ma55发酵液对棉花枯萎病菌WJKW、WWKW和SZKW的菌丝生长、分生孢子产生量及分生孢子萌发均具有一定的抑制作用（表8-3）。其中，液体振荡培养20天获得的Ma55发酵液对棉花枯萎病菌WJKW、WWKW和SZKW的菌丝生长抑制率分别达到59.86%、56.99%和57.09%，对棉花枯萎病菌WJKW、WWKW和SZKW的分生孢子产生量和分生孢子萌发率具有显著的抑制作用（表8-4、表8-5）。上述结果说明，金龟子绿僵菌Ma55对供试棉花枯萎病菌的抑制作用主要是通过营养竞争、空间竞争及抗生作用来实现的。图8-1 金龟子绿僵菌Ma55与棉花枯萎病菌WJKW的对峙培养（4天）发酵液培养时间（天）抑制率（%）WJKWWWKWSZKW74.20±0.563.96±0.093.35±0.161025.60±0.9223.37±0.6223.38±0.501228.77±0.5226.93±0.5527.10±0.501436.23±0.4534.17±0.6734.54±0.471637.57±0.5136.04±0.4735.89±0.522059.86±1.3856.99±0.6057.09±0.66表8-3 金龟子绿僵菌Ma55发酵液对棉花枯萎病菌菌丝生长的影响发酵液培养时间（天）棉花枯萎病菌分生孢子产生量（×106）（cfu/ml）WJKWWWKWSZKW0（CK）8.90±0.039.13±0.049.21±0.0378.74±0.078.93±0.029.01±0.03107.51±0.047.90±0.028.04±0.02127.03±0.027.28±0.047.51±0.03146.20±0.026.41±0.036.64±0.04165.39±0.025.56±0.045.84±0.04203.14±0.043.37±0.043.91±0.05表8-4 金龟子绿僵菌Ma55发酵液对棉花枯萎病菌分生孢子产生量的影响发酵液培养时间（天）棉花枯萎病菌分生孢子萌发率（%）WJKWWWKWSZKW0（CK）65.89±0.1563.89±0.1162.07±0.94758.94±0.0857.82±0.1858.88±0.461049.83±0.0647.54±0.3648.48±0.501239.94±0.0738.49±0.3039.71±0.571434.54±0.0630.25±0.0633.37±0.671624.21±0.0722.77±0.2023.89±0.262011.66±0.2910.67±0.0913.00±.12表8-5 金龟子绿僵菌Ma55发酵液对棉花枯萎病菌分生孢子萌发率的影响绿僵菌素是金龟子绿僵菌分泌的一种次生代谢物质，具有明显的杀虫活性。自从1961年Kodaira在培养金龟子绿僵菌的滤液中首次发现绿僵菌素以来，科学工作者对绿僵菌素开展了广泛的研究，但国内研究较少。1985年，Hino等从绿僵菌属中分离出苦马豆素，发现苦马豆素是一种很有潜力的免疫调节剂。金龟子绿僵菌Ma55发酵液对棉花枯萎病菌的菌丝生长、分生孢子产生量及分生孢子萌发具有较好的抑制作用，与绿僵菌素和苦马豆素的产生是否有关系尚待进一步研究。总之，金龟子绿僵菌是一种重要的昆虫病原真菌。昆虫病原真菌在代谢类型上十分复杂，能产生多种生理功能特异的生物活性物质。这种代谢产物的多样性，为人类开发新的生物防治制剂、药品及在其他领域的利用提供了重要的途径。来自昆虫的病原真菌球孢白僵菌（Beauveria bassiana），具有分布和寄主范围广、环境安全、易大量培养等优点，已在农林害虫生物防治中发挥着重要作用，迄今已有不少应用该昆虫病原真菌防治植物病害的成功报道（Renwick等，1991；Flor等，1993；Kapongo等，2008；Onley等，2008；Clark，2005）。这些结果表明，该菌有潜力成为具有防虫和防病双重功效的生防因子。张胜利等（2011）体外测定了8株球孢白僵菌[菌株RCEF0013、4452和0383分别分离自马尾松行书虫（Dendrolimus punctatus）、光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）和松墨天牛（Monochamus alternatus），产地分别为安徽霍邱、蚌埠和日本；1151、2901和2909均分离自安徽宣城的松林土壤；3051分离自安徽滁州琅琊山的阔叶林土壤；3108分离自福建武夷山的阔叶林土壤]对棉花枯萎病菌的拮抗作用。平板对峙培养时，枯萎病菌的生长均受到明显抑制（表8-6）。不同含孢量的球孢白僵菌对枯萎病菌的抑制效果不同，且抑制率与孢子浓度呈显著的线性关系；在接种量为6×107个孢子/ml时，抑制率达到90%以上。球孢白僵菌代谢液对枯萎病病原菌也表现出抑菌作用，并且抑制率与代谢液浓度呈显著的线性关系（表8-7）。综上所述，球孢白僵菌对枯萎病的拮抗作用的机制主要涉及营养和空间竞争以及抗生作用，其中，抗生作用对拮抗作用的贡献更大。对抗生性代谢液的初步分析发现，醇沉后的上清液冻干粉经4种有机溶剂浸提后，无明显的抑菌作用；而向培养基中添加球孢白僵菌多糖和蛋白粗提物均能显著抑制两种镰孢菌的菌丝生长。因此，抑菌活性物质主要是大分子的多糖和蛋白。菌株培养3天培养5天生长距离（cm）抑制率（%）生长距离（cm）抑制率（%）038318.54±0.16cdBC20.5519.02±0.16bB44.83445218.05±0.47dC22.6518.55±0.41bB46.29115118.63±0.17cdBC20.1819.11±0.21bB44.58310818.35±0.26cdBC21.3518.79±0.45bB45.39001318.44±0.36cdBC21.0017.94±0.12bB45.14290919.36±0.31bcBC17.0619.33±0.34bB42.41290119.20±0.16bcBC17.7419.33±0.32bB42.88305119.69±0.48bB15.6219.97±0.32bB41.41CK23.34±0.20aA—33.61±3.39aA—表8-6 8株白僵菌平板对峙培养对棉花枯萎病菌生长的抑制作用发酵液（ml）3天抑制率（%）5天抑制率（%）2.538.8244.04233.8141.481.534.2035.76123.5728.080.514.1119.83表8-7 白僵菌菌株4452的发酵滤液对棉花枯萎病菌生长的影响目前，已报道的用来防治棉花枯萎病的拮抗细菌主要有假单胞菌[恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、荧光假单胞菌（P.fluorescens）和产碱假单胞菌（P. alcaligenes）]、芽孢菌[短小芽胞杆菌（Bacillus pulniLus）、枯草芽胞杆菌（B.subtilis）和蜡质芽胞杆菌（B.cereus）]、天牛金杆菌（Aureobacterium saperdne）、茜草叶杆菌（ Phyllohactgrium rubiaceurum）、茄伯克霍尔德氏菌（ BurkholcEeria solanacearum）和放线菌（Actinomycesspp.）等。内生细菌是指能在健康植物的组织内定殖，在一定的条件下与植物体建立和谐互惠，互相制约关系的一类微生物。实际上50多年以前就已有关于植物体内存在内生细菌而不引起植物病症的报道。人们不断地从植物的根、叶、茎和种子上分离并鉴定出多种植物内生细菌，目前，已从近30多种植物中分离到了近60个属的内生细菌。研究发现，内生细菌寄生在植物的组织内部，其代谢产物不仅对植物本身有各种各样的影响，而且对其他病原生物也有各种不同的作用。内生细菌在植物组织内有足够的碳源、氮源，并且受到植物组织的保护，所以，比暴露于恶劣环境的附生菌和腐生菌更具有稳定的生存环境，易于发挥作用，因此，内生细菌作为生防因子的研究越来越受人们的广泛重视，成为国内外生物防治的又一热点。棉花植株的内生细菌由许多不同的种群组成。由于棉花各种组织具有不同的生理及营养环境，从而制约着共生的细菌的种类。但一种植物中往往以某一两种细菌为主要种群。鲁素云等（1989）于1979～1984年，先后从北京、河北等7省市棉花枯萎病田采集无病株和轻病株，以及无病田的健株4000余株，其中，包括生产用抗病和感病品种10余个，在我国首次进行了维管中主要微生物类群分析。结果表明，棉株维管中除了定殖引致萎蔫病的病原真菌之外，还有大量的非病原真菌和细菌。维管真菌是以镰刀菌（Fusariumspp.）为主的半知菌，细菌有芽胞杆菌（Bacillusspp.）、黄单胞杆菌（Xanthomonasspp.）和欧氏杆菌（Erwiniaspp.）为主要成员。不同品种间，其维管组织中的主要真菌和细菌类群大体相似。这种相似性可能与导管中的营养贫瘠和氧气稀薄等条件有关。导管通常被视为植物体的“沙漠地区”，一些对营养要求不高而有耐性的真菌和细菌可能易于在此定殖下来。Misaghi等（1990）从两个栽培品种DP41和DP61的胚根、根、茎、蕾、铃等器官中分离到欧氏杆菌、芽胞杆菌、棒杆菌及黄单孢菌等内生细菌种群，其中，欧氏杆菌为其优势菌种。他对其中6种主要的内生细菌进行了抗生素突变体回接及再分离的研究，其优势种欧氏杆菌（Erwiniasp.）的重分离率分别达69%（DP41）和51%（DP61），而芽胞杆菌（Bacillussp.）则为12%，其他几种依次减少，与最初分离率呈正比，这些回接的内生细菌在这两个栽培种中不引起任何病害症状。罗明等（2004）对不同品种和不同种植地区的健康棉花植株组织中内生细菌进行分离，共得到102个菌株。经鉴定分属于芽胞杆菌属（Bacillussp.）、黄单胞菌属（Xanthomonassp.）、假单胞菌属（Pseudomonassp.）、欧文氏菌属（Erwiniasp.）及短小杆菌属（Curtobacteriurnsp.），其中，芽胞杆菌的分离频率最高，为优势种群（表8-8）。李春宏等（2009）对枯萎病菌具有拮抗的内生细菌进行了分子鉴定，16S rDNA分子序列分析显示，44个拮抗枯萎病的内生菌株包括了两个门（变形杆菌门、拟杆菌门）8个属，优势种群为肠杆菌属（Enterobacter）和泛菌属（Pantoea）。肠杆菌属具有最多的拮抗内生菌株，共18株，存在于所有棉花品种之中。与已报道的菌株16S rDNA序列同源性在97%上有11株，S04、HA01、HB04、C04、C03、C09与已报道的菌株16S rDNA序列同源性相似性分别为91.9%、94.0%、95.5%、96.1%、96.7%和96.9%。泛菌属是除肠杆菌属外具有最多的拮抗内生菌株，共15株，与已报道的菌株16s rDNA序列同源性都在97%以上，其中，11株与Pantoea agglomerans同源性在97.4%～100.0%，在泛菌属中出现频率最高。欧文氏菌属（Erwiniasp.）共6株，都与Erwinia sp.CU208同源，但与已报道的菌株相似度除S03为99.5%，其余10个菌株在97%以下，可能是新的种（属）。除了以上出现频率较高的菌以外，还分离到稳杆菌属（Empedobactersp.）、根瘤菌属（Rhizobiamsp.）、沙雷氏菌属（Serratiasp.）、埃希氏菌属（Escherichiasp.）和克雷伯氏菌属（Klebsiellasp.）各1个菌株，都与已报道的菌株16S rDNA序列相似度高于97%以上。以上的结果分析表明，从棉花中分离到的内生细菌的种类基本相似，但其中的优势种群则有所不同。这可能与棉株不同的生长环境有较大关系。鲁素芸等（1989）研究认为，维管组织的内生菌种群和含量与地理环境及理化环境均有较密切关系。属名菌落形态革兰氏染色反应芽孢接触酶氧化酶需氧性测定芽胞杆菌属（Bacilus）圆形或不规则形，灰白，灰色或乳白色直杆状，成对或链状排列+有，椭圆、卵圆、圆形或柱状阳性阳性或阴性好氧或兼性厌氧欧文氏菌属（Erwinia）白色，凸起液状，中心呈稠密凝絮状或呈规则中心环直杆状，单生，成对有时成链—无阳性阴性兼性厌氧假单胞菌属（Pseudomonas）直或微弯中性培养基上蓝色—无阳性阳性或阴性好氧黄单胞菌属（Xanthomonas）黄色直杆菌，多单生—无阳性弱阳或阴性好氧短小杆菌属（Curtobacte-rium）光滑，凸起，常黄色到橙色幼龄培养物中细胞呈小短及不规则杆菌，老培养物变成类球类+无阳性阳性或阴性好氧表8-8 内生细菌属的主要特征内生细菌可以随棉花植株的生长而繁殖运转。在棉株生长的各个不同阶段，其中的细菌群体的数量有较大变化，通常内生细菌种群数量从种子开始萌发就开始上升，至花期达最高，此后，则趋于平稳或降低。鲁素芸等（1989）报道，棉花内生细菌数量和组成，随棉株生长发育而变化，从幼芽期开始急剧上升，直到结铃期达到高峰，吐絮开始后又略有下降。Mclnroy等（1991）对大田中棉株内生细菌在整个生长季节种群密度的变化进行了较详细研究，结果表明，在种子萌发时，种群密度为每克组织含1×103个菌，到成株期上升为1×105～1×106个，但到成熟期却降为1×103个，从棉桃中几乎回收不到菌，这与其他作物如玉米（成熟期1×1010）有很大的不同。这可能与不同的植物种类成熟期各器官的生活状态有关。Mclnroy等（1990）对棉花内生细菌的来源及其动态影响因素进行了探讨。他们将棉花和玉米种子分别种植在：①琼脂（种子表面未消毒）及②未灭菌的土钵（种子表面消毒）中，萌发6天后检测苗中的内生细菌数量发现：在①中每克棉花组织中含1×105个菌，而②中每克组织中仅有1×102个菌，在玉米中所得到的结果则与棉花正好相反，即①中菌量少于1×102个/g而②中则达1×106个/g，由此说明内生细菌可以是植物种子内带菌（如棉花中），并随植株生长而繁衍；也可以来自土壤（如玉米中），从植物根部进入植物其他器官。罗明等（2004）对内生细菌数量测定表明，棉花种子、根、茎、叶柄、叶片等组织内均存在大量的内生细菌。不同品种、组织及种植地，内生细菌的数量不同。各组织中内生细菌的种群密度的分布特点是，种子中最多，其次为根，再次为茎，叶片、花蕾，叶柄中最少（表8-9）。李春宏等（2009）研究了棉花内生菌的数量动态。结果表明：①棉花不同器官的内生细菌数量不同。根中内生细菌数量波动的幅度在lg 4.88～6.79cfu/g-fw，总均值lg 5.59cfu/g-fw；茎和叶波动的幅度在lg 2.597～5.00 cfu/g-fw和lg 2.39～4.60 cfu/g-fw，总均值分别为lg 3.79，3.70cfu/g-fw。根中内生细菌的数量显著高于茎和叶片，这种趋势表现在6个棉花品种取样的不同生育期。②棉花不同生育期的内生细菌数量不同。在根中，苗期内生细菌数量波动的幅度在lg 4.88～5.55 cfu/g-fw，均值lg 5.25 cfu/g-fw；开花期数量波动的幅度在lg 4.72～6.19 cfu/g-fw，均值lg 5.32cfu/g-fw；吐絮期数量波动的幅度在lg 5.24～6.79 cfu/g-fw，均值lg 5.98 cfu/g-fw。除了亚7113开花期的内生细菌数量低于苗期外，棉花根中苗期的内生细菌数量低于开花期与吐絮期。在茎中，苗期内生细菌数量波动的幅度在lg 3.29～4.50 cfu/g-fw，均值lg 3.88 cfu/g-fw；开花期数量波动的幅度在lg 2.97～5.00 cfu/g-fw，均值lg 3.74 cfu/g-fw；吐絮期数量波动的幅度在lg 3.04～4.55 cfu/g-fw，均值lg 3.76 cfu/g-fw。在叶中，苗期内生细菌数量波动的幅度在lg 2.93～4.13 cfu/g-fw，均值lg 3.71 cfu/g-fw；开花期数量波动的幅度在lg 2.47～4.60 cfu/g-fw，均值lg 3.59 cfu/g-fw；吐絮期数量波动的幅度在lg 2.39～4.57 cfu/g-fw，均值lg 3.74 cfu/g-fw。棉花不同生育期茎、叶中的内生细菌数量波动不一，趋势性不明显。③棉花不同品种间的内生细菌数量不同。在根中，虽同一品种内不同生育期间的内生细菌数量存在显著差异，但6个棉花品种根中，内生细菌总体数量的平均值在lg 5.52～5.58 cfu/g-fw，品种之间的差异并不显著。在茎、叶中，棉花不同品种间的内生细菌数量呈现一定程度的差异，茎中内生细菌数量以草7005为最高（lg 4.62 cfu/g-fw）和海岛20次之（lg 4.24 cfu/g-fw），显著高于其他品种；叶中内生细菌数量以常抗棉为最高（lg 4.17 cfu/g-fw），与亚7113、海岛16、苏棉16差异不显著，显著高于草棉（lg 3.30 cfu/g-fw）和海岛20（lg 2.96 cfu/g-fw）。生育期地点品种根茎叶片叶柄蕾苗期鄯善五家渠农大试验田高抗5号7.0×1042.6×103120×104新陆早10号2.4×1030.2×1031.8×103新陆早13号1.0×10410×104150×104草棉15×10410×104金科18号1.5×1041.3×1030.1×103新海18号100×1041.6×1030.2×103石彩6号990×1040.21×108990×104中棉36号210×1043.1×1043.8×103新陆早8号120×1041.4×1037.0×104表8-9 不同棉花品种不同时期内生细菌的数量（cfu/g鲜重）生育期地点品种根茎叶片叶柄蕾温室运早2543.0×1041.2×103180×104新海160.8×1043.0×1030.5×103142100×1046.9×1030.4×104蕾期鄯善农大试验田高抗5号4.0×104300×1043.0×1041.0×1046.9×104草棉3.5×1042.0×1041.4×1041.2×10419×104金科18号1.9×1042.5×1045.1×1039.1×1031.1×104新海18号0.5×1042.0×1042.1×1042.4×10437×104表8-9 不同棉花品种不同时期内生细菌的数量（cfu/g鲜重）（续）-1内生细菌作为植物微生态系统的组成成分，相对于腐生（附生）细菌、PGPR等生防因子，内生菌更具竞争力，更有利于生防作用的发挥。Chen等（1995）从棉株体内分离到170个细菌菌株，其中，49株已知对棉花枯萎病菌有防治作用，经针刺接种到棉花幼茎上，10天后棉花茎部接种枯萎菌小孢子，12天后枯萎病症状开始出现，利用0～Ⅳ级发病情况计算供试的内生菌对棉花枯萎病的抑制作用。结果显示，其中，6株内生菌在试验中都减轻了棉花枯萎病的发病程度。经鉴定，这6株菌是天牛金杆菌（Aureobacterium saperdae）、短小芽胞杆菌 （Bacillus pumilus）、茜草叶杆菌（Phyllobacterium rubiacearum）、2株恶臭假单胞菌 （Pseudomonas putida）和茄伯克霍尔德氏菌（Burkholderia solanacearum）。定殖试验表明，这些内生菌可以在棉株体内存活28天。通过测定其中5株内生菌在棉株茎内的运动能力，发现有2株在14天后可以进行有限的移动，但不超过5cm。有些内生菌在施用后的短期内还能增殖。罗明等（2004）从87个棉花内生菌的分离菌株中，筛选出对棉花枯萎病菌有体外拮抗活性的菌株22个，占菌株总数的25%，其中，有些菌株表现出较强的抑菌活性，具有作为生防菌的潜能（表8-10）。李春宏等（2009）根据内生细菌的颜色、形态、大小从6个棉花品种的根、茎、叶中，分别分离537个、417个、352个菌株共1306个。平板对峙鉴定，显示根、茎、叶中显著拮抗（抑菌半径大于2mm）枯萎病菌的菌株分别为170个、32个、15个，累计拮抗枯萎病菌株数为217个。根中拮抗菌株比例为31.66%；茎中拮抗枯萎病菌株比例为7.67%；叶中拮抗菌株比例为4.26%。以上结果表明，根中拮抗内生细菌远高于茎和叶。研究筛选出的拮抗菌的生防效果如何，尚需测定其在棉花植株体内的定植力、持久性及回接后对棉花生长的影响、防病效果的田间试验等加以证实，为进一步开发应用这一生防菌资源，防治棉花病害提供科学依据。菌株抑菌圈半径（mm）菌株抑菌圈半径（mm）0074.00435.00165.70466.00174.00474.50214.50512.00233.70555.00243.50565.50252.50575.00303.50615.80314.00620375.20635.00385.00674.00424.0表8-10 内生细菌对枯萎病菌抑菌作用的测定苦豆子（Sophora alopecuroides）别名草本槐、苦豆根，为豆科多年生耐盐旱生草本植物。苦豆子含有多种单体生物碱，并具有抗癌、提高免疫力等活性。它由于能与根瘤菌共生固氮而含有丰富的蛋白质，具有较高的饲用价值。苦豆子的内生细菌由于长期存在于苦豆子内，与苦豆子建立了和谐的关系，有可能产生与苦豆子产生的相同或相似的生物碱，或者与苦豆子植物较高的抗逆能力有关，因此，系统研究苦豆子内生细菌对于合理开发苦豆子资源具有重要的意义。龚明福等（2006、2009）对新疆塔里木盆地不同地区、月份的苦豆子根、茎、叶、种子、根瘤等组织进行内生细菌分离，共得到550株内生细菌，苦豆子在不同地区、同一地区不同月份、不同组织部位内生细菌数量和种类均存在较大的差异，苦豆子内生细菌资源非常丰富。通过对550株苦豆子内生细菌进行皿内涂布、对峙培养和胞外分泌物拮抗性试验，筛选到大量的拮抗性苦豆子内生细菌资源。内生拮抗细菌胞外分泌物对棉花枯萎病菌的抑菌活性存在明显差异，其中，抑菌距离在5mm以下21株，5.1～10mm 23株，10.1～15mm 8株，15.1～20mm 4株，最大值19.3mm。这些内生细菌不是以单一的方式对棉花枯萎病菌产生拮抗作用，因为在皿内涂布、对峙培养和胞外分泌物的拮抗性试验中，同一菌株对棉花枯萎病菌拮抗能力大小表现不完全一致。在皿内涂布和对峙培养中，拮抗能力强的菌株，其胞外分泌物对棉花枯萎病菌的拮抗能力不一定很强，甚至表现为无明显拮抗作用。相反，胞外分泌物拮抗性强的菌株在皿内涂布和对峙培养中，拮抗能力并不一定表现很强。不过内生细菌的拮抗性在皿内涂布和对峙培养中表现比较一致。由此可以推测，苦豆子内生细菌对棉花枯萎病菌的拮抗作用通过两种以上的方式来实现，一种方式是通过营养竞争，内生细菌通过其快速繁殖吸收利用培养基中的营养物质，导致棉花枯萎病菌菌丝因营养缺乏而生长不良；另一种方式是内生细菌在生长过程中，产生某些对棉花枯萎病菌菌丝有毒害作用的物质，导致菌丝不能良好生长。定殖到棉花中的苦豆子内生细菌是否仍具有对棉花枯萎病菌的拮抗作用，苦豆子内生细菌能否用作生物农药在棉花生产中广泛应用，为解决这些问题，正在进行苦豆子内生细菌在棉花中的定殖试验和田间防效试验。根据菌落特征，10h菌龄的鞭毛染色结果，20h菌龄的菌体形态、大小及革兰氏染色反应，48h菌龄的芽孢染色和72h菌龄的荚膜染色结果，参照东秀珠（2001）的方法进行分类鉴定，具有较强拮抗活性的56株内生细菌分别属于气芽胞杆菌属（Aerobacillussp.）、气单胞菌属（Aeromonasssp.）和芽胞杆菌属（Bacillussp.）、黄单孢杆菌属（Xanthomonassp.）、假单胞杆菌属（Pseudomonarssp.）和土壤杆菌属（Agrobacteriumsp.）（表8-11）。序号分类特征菌株数1气芽孢杆菌属菌体杆状，1.75μm×0.554μm；革兰氏阳性；有芽孢，芽孢囊棒状；侧生鞭毛；无荚膜；菌苔白色，半透明72气单胞菌属菌体杆状，1.83μm×0.73μm；革兰氏阳性；鞭毛偏单生；无芽孢；无荚膜；菌苔浅黄色，透明8表8-11 56株苦豆子内生细菌的分类鉴定（龚福明等，2009）序号分类特征菌株数3芽孢杆菌属菌体杆状，1.51μm×0.55μm；革兰氏阳性；有芽孢，芽孢囊棒状；周生鞭毛；无荚膜；菌苔浅黄色，透明254黄单孢杆菌属菌体杆状，1.53μm×0.43μm；革兰氏阳性；鞭毛偏单生；无芽孢；无荚膜；菌苔浅黄色，透明55假单孢杆菌属菌体杆状，1.16μm×0.48μm；革兰氏阳性；鞭毛偏单生；无芽孢；无荚膜；菌苔白色，透明56土壤杆菌属菌体杆状，2.55μm×0.75μm；革兰氏阳性；周生鞭毛；无芽孢；无荚膜；菌苔白色，透明6表8-11 56株苦豆子内生细菌的分类鉴定（龚福明等，2009）（续）-1中国野生甘草分布广泛，主要分布于新疆维吾尔自治区、内蒙古自治区、甘肃、宁夏回族自治区、青海、陕西，河北、西藏自治区也有少量分布。新疆的塔里木河流域是我国甘草蕴藏量、产量最高的地区，有大面积的野生甘草群落。甘草具有很多药用价值，对植物病原真菌也具有一定的拮抗性，甘草内生细菌长期与甘草和谐共存，可能也具有对植物病原真菌的拮抗活性。龚明福等（2007）研究了甘草内生细菌对棉花枯萎病菌的拮抗性，以期筛选出对棉花枯萎病具有生物防治作用的内生细菌，用于生物农药的生产。研究表明，从新疆阿拉尔地区采集野生甘草进行内生细菌分离，共分离得到125份分离物，内生细菌在各个组织部位中的分布是不同的，从根、茎、叶、种子和根瘤中分离得到的内生细菌数分别为35、25、30、15和20。对分离得到的125份内生细菌分离物进行皿内拮抗性试验，结果表明，有31株甘草内生细菌对棉花枯萎病菌表现出明显的拮抗活性，菌落直径1.00～2.86cm，相对抑菌率51.7%～84.7%。这些菌株能否在棉花中定殖，以及在棉花中定殖以后是否仍具有拮抗活性，还有待于进一步研究。根据菌落特征，10h菌龄的鞭毛染色结果，20h菌龄的菌体形态、大小及革兰氏染色反应，48h菌龄的芽孢染色和72h菌龄的荚膜染色结果，参照东秀珠（2001）的方法进行分类鉴定，具有较强拮抗活性的31株内生细菌分别属于气芽胞杆菌属（Aerobacillussp.）、气单胞菌属（Aeromonassp.）、芽胞杆菌属（Bacillussp.）、黄单孢杆菌属（Xanthomonassp.）、假单胞杆菌属（Pseudomonassp.）和土壤杆菌属（Agrobacteriumsp.）（表8-12）。序号分类特征菌株数1气芽孢杆菌属菌体杆状，1.75μm×0.554μm；革兰氏阳性；有芽孢，芽孢囊棒状；侧生鞭毛；无荚膜；菌苔白色，半透明22气单胞菌属菌体杆状，1.83μm×0.73μm；革兰氏阳性；鞭毛偏单生；无芽孢；无荚膜；菌苔浅黄色，透明33芽孢杆菌属菌体杆状，1.51μm×0.55μm；革兰氏阳性；有芽孢，芽孢囊棒状；周生鞭毛；无荚膜；菌苔浅黄色，透明104黄单孢杆菌属菌体杆状，1.53μm×0.43μm；革兰氏阳性；鞭毛偏单生；无芽孢；无荚膜；菌苔浅黄色，透明55假单胞杆菌属菌体杆状，1.16μm×0.48μm；革兰氏阳性；鞭毛偏单生；无芽孢；无荚膜；菌苔白色，透明56土壤杆菌属菌体杆状，2.55μm×0.75μm；革兰氏阳性；周生鞭毛；无芽孢；无荚膜；菌苔白色，透明6表8-12 31株苷草内生细菌分类鉴定结果（龚明福等，2007）包括棉花在内的植物内生细菌种类丰富，开发利用内生细菌作为生物农药的潜力很大。但是关于它对整个生态及人类身体健康影响的报道较少。在防治病害方面，多数生防制剂的防效还不能令人满意，内生细菌的应用潜力还没有完全开发出来。从整体上看，利用内生细菌防治病害存在以下问题：①内生细菌的分离方法尚待改进和完善。内生细菌的分离过程中，灭菌过轻或过重都会影响植物内生细菌调查的准确性，前者会扩大植物内生细菌的生物多样性，而后者会导致内生细菌的丢失；②内生生防细菌的筛选通常是先在实验室的平板对峙培养上进行的，具有很大的局限性，除了拮抗、寄生等作用方式外，许多通过其他方式起作用的菌株不能被筛选到；③内生生防细菌在筛选过程中，往往是采用一种病原菌作为筛选目标，造成生防菌防效单一，综合防病效果差；④内生细菌依赖环境性强，室内试验结果与室外防效不一致；⑤内生细菌作为生防因子，必须考虑其致病性。针对以上问题，必须解决消毒剂的选择与使用问题；在筛选生防菌过程中，采用多种病原菌作为筛选目标，变单一菌剂的使用为多菌配合使用，提高防效和实现防病的广谱性，并降低对环境的依赖性；另外，对土壤中内生细菌的生态学进行更多的研究，使环境和操作更有利于生防细菌作用的发挥；在内生细菌的应用上，必须检测其对人畜和植物的安全性问题。内生细菌在防治棉花病害的应用上虽然面临许多问题，但作为生防菌株，依然具有广阔的前景。在植物根围区系中存在着大量的微生物，许多微生物及其代谢产物能够抑制植物病原菌的生长发育，因此，从土壤中筛选植物病原菌的拮抗菌，反施于土壤，人为增加有益微生物类群，限制有害微生物生长而进行的生物防治，既可减少化学农药可能带来的环境污染，又解决了抗病棉品种筛选周期长，抗病单一的缺点，被国内外学者广泛研究。芽胞杆菌（Bacillusspp.）是自然界广泛存在的一类细菌，可以产生杆菌肽、环脂、氨基酸类、核酸类和类噬菌体颗粒等多种抗菌物质，在植物病害生物防治中被广泛应用。王少杰（1991）报道了利用对棉花祜萎病菌有拮抗作用的两株荧光假单胞杆菌和两株产芽孢细菌在田间防治棉花枯萎病的试验。结果表明，两株荧光假单胞杆菌的防治效果较好，在苗期的防治效果为73.14%～73.63%，在开花期的防治效果为74.73%～49.73%，棉花增产率分别为15.79%和12.03%。两株产芽孢细菌在苗期和开花期的防治效果分别为62.25%～75.61%和23.98%～55.16%，棉花增产率分别为-0.18%和+4.88%。Zhang（1995）利用枯草芽胞杆菌处理棉种后发现，该菌也能在棉苗根部定殖，并随根的生长而扩展，从而导致枯萎菌在根部的定殖量减少，降低了棉花枯萎病的发生。袁红霞等（1998）报道了两株芽胞杆菌对棉花枯萎病的防治效果为分别36.4%和54.0%。Gamliel等（1993）利用恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、荧光假单胞菌（P.fluorescens）和产碱假单胞菌（P.alcaligenes）蘸根处理棉苗，并将棉苗移栽到经过日晒处理的土壤中，可以减轻棉花枯萎病的为害，同时，还能够促进棉苗的生长。研究表明，施用的拮抗假单胞菌可以有效地阻止枯萎病菌在棉花根部的定殖，从而起到防治病害的作用。芽胞杆菌是一类需氧或兼性厌氧、G+（目前也发现有G-的），在一定条件下能产生抗逆性内生孢子的化能异养菌。其抗菌谱广泛，对多种病原真菌、细菌均有较强的抑制作用。从土贝母和腊肠等中药和发酵食品中，筛选出对棉花枯萎病菌有广谱拮抗作用的芽胞杆菌29株，其中，有12株菌产抗菌蛋白。有5株抑菌活性较强：H110、H184、H216、B316和B382。经初步鉴定，H110和H184为枯草芽胞杆菌，H216、B316和B382为地衣芽胞杆菌。5株菌的蛋白粗提液对热稳定，对蛋白酶K、胰蛋白酶均不敏感，但H184、H216的蛋白粗提液对胃蛋白酶部分敏感（齐东梅等，2005）。对棉花枯萎病菌有强烈抑制作用的芽胞杆菌菌株B110分离自中药白豆蔻，根据其形态特征和生理生化特征初步鉴定为枯草芽胞杆菌，其蛋白粗提液经SephadexTMG-75后得到两个峰，其中，峰a有较强抑菌活性，命名为B110-a，峰b基本无活性；SDS-PAGE分析结果显示，B110-a主要由两种蛋白组成，含量较高的分子量为50kD，含量较低的分子量为29kD（梁启美等，2005）。利用划线法和杯碟法，曹君等（2005）研究了枯草芽胞杆菌BS菌株和哈茨木霉TH-1菌株对棉花枯萎病菌的拮抗作用。结果表明，枯草芽胞杆菌BS菌株及其代谢液对棉花枯萎病菌均有抑制作用，抑菌率均在70%以上。说明BS菌株对枯萎病菌的作用机制主要通过营养竞争方式，抑菌物质产生的作用相对较小。芽胞杆菌Bl5对棉花枯萎病菌具有较强的抑制作用，抑菌圈达30mm。其抗菌谱广，拮抗性能稳定，拮抗作用主要源于其代谢产生的拮抗物质。B15营养要求简单，繁殖迅速，在含黄豆粉培养基中，48h即全部生成芽孢，易于扩大培养。在试验所用多种培养基上，包括PDA均能产生拮抗物质，拮抗物质的产生与生长同时进行，这使得B15能在不同的营养环境中及时发挥拮抗作用。不同温度土壤中放置30天，菌株存活率最高可达55.5%，表明其抗逆性较强。综上所述，芽胞杆菌B15是一株极具开发潜力的生防菌株（朱薇玲等，2006）。但作为有实际应用意义的生防菌，还需从生产、储运、经济、田间应用等方面做进一步研究。王娜等（2007）筛选到的5株拮抗细菌均为革兰氏阳性细菌，挑选其中抗性最强的S6进行研究，经过16S rDNA鉴定，S6为枯草芽胞杆菌。S6生长迅速，2h即能达到生长对数期。同时，S6生长温度范围比较广，在15～50℃均能良好生长，棉花枯萎病发病一般需要在24～28℃，在这个温度内S6能正常生长。一般情况下，枯草芽胞杆菌在pH值7左右时生长良好，pH值低于6或者高于8时生长受到显著抑制，而S6在pH值为5时能良好生长。S6对盐的耐受能力达到10%。因此，S6能良好、迅速生长，快速地占领生存空间，抢占营养，从而有利于抑制其他病原微生物的生长。拮抗细菌对枯萎病的抗菌效率一般在20%～30%，达到50%以上的即为高效拮抗细菌。S6对棉花黄萎病的拮抗效率达到53.1%，对棉花枯萎病的拮抗效率达到55.2%，因此，S6作为生防菌应用的潜能是很高的。S6具有一定的开发利用价值，但是，其在植株上的定殖、生物防治效果、抗菌成分分析、高效基因工程菌的构建和发酵工艺等方面需要研究。缪礼鸿等（2008）从植物根际土壤中，筛选到3株对大豆根腐病、棉花枯萎病、小麦赤霉病等多种作物真菌病害有较强拮抗性的芽胞杆菌菌株Bacillus sp.920，Bacillus sp.930和Bacillus sp.932。用琼脂块法分别测定了它们对11种植物病原真菌的抗菌谱、发酵液的抑菌活性大小及其热稳定性，并对发酵液中的抑菌活性物质进行了初步提取。结果表明，920和932菌株为广谱性抗真菌菌株（表8-13）；930菌株仅表现出对稻瘟病菌具有较强的拮抗性。Bacillus sp.920发酵液中的抑菌活性物质可被酸沉淀，并具有较好的热稳定性。棉花盆栽试验结果表明，接种芽胞杆菌920菌剂可使棉花枯萎病引起的棉苗死亡率由15%降至3.7%，发芽率比对照提高了10%。病原真菌920菌株930菌株932菌株大豆根腐病菌+++—+++棉花枯萎病菌+++—+++油菜核盘病菌+++++++小麦赤霉病菌+++—+++水稻恶苗病菌+++—++小麦全蚀病菌++++—小麦根腐病菌+++++++玉米小斑病菌++++++++水稻稻瘟病菌++++++++++水稻纹枯病菌+++—++柑橘黑腐病菌++++++++表8-13 3株芽胞杆菌的抗菌谱及抑菌强度测定结果枯草芽胞杆菌对棉花枯萎病菌的拮抗作用试验结果表明，首先，枯草芽孢菌杆对棉花枯萎病菌菌丝生长有明显的抑制作用。在平板对峙培养中，培养第一天时菌落平均直径为1.1 cm，菌丝向上向外有少许蓬松生长，并且出现明显的抑菌圈，抑菌效果为23.6%。在第三天和第五天时，菌落平均直径分别为1.54 cm和1.46 cm，芽胞杆菌越过抑菌带向菌饼处扩展，菌丝有少许向外生长，气生菌丝消失，菌丝稀薄。抑菌效果分别为54.4%和73.9%。培养至第七天时，菌丝不再向外生长，菌丝非常稀薄，由干燥逐渐变为油状，颜色由白色逐渐变为无色。对照菌丝生长蓬松，菌落厚实，此时已长满皿，抑菌效果为88.8%。其次，枯草芽胞杆菌在培养前期生长速度很快，有很强的占位效应，说明与棉花枯萎病菌存在空间和营养的竞争。显微镜检结果发现，枯萎菌的菌丝相较于正常的菌丝会发生变异，菌丝颜色变褐色、膨大、断裂，消融、释放原生质等物质。说明枯草芽胞杆菌对棉花枯萎病菌的拮抗机制可能还与其分泌的抑菌物质有关，其作用方式和作用机制均有待于进一步研究（但红侠等，2010）。APS是一种由蜡状芽胞杆菌产生的新型抗真菌环状多肽。刘建国等（1999）研究表明，APS具有广谱抗菌性，其对棉花枯萎病等多种病原真菌及黑曲霉的孢子萌发具有强烈的抑制作用（表8-14），最小的MIC达2.5μg/ml，对真菌的生长亦具有强烈的抑制作用。随着APS处理浓度的增加，菌丝生长速度明显降低，甚至为零。扫描电镜观察表明，经APS处理后，菌丝发生顶端膨大、分支缩短等异常形态学变化。植物病原真菌处理浓度（μg/ml）菌落直径（mm）抑菌率（%）菌丝生长速度（mm/h）48h72h48h72h48h72h棉花枯萎病菌CK34.543.50.720.60棉花枯萎病菌2514.919.056.955.80.310.26棉花枯萎病菌756.86.880.780.30.140.09棉花枯萎病菌1505.05.085.588.40.100.07小麦赤霉病菌CK33.744.00.700.61小麦赤霉病菌2511.312.066.572.70.240.17小麦赤霉病菌756.06.082.286.40.130.08表8-14 APS对病原真菌菌丝生长的影响植物病原真菌处理浓度（μg/ml）菌落直径（mm）抑菌率（%）菌丝生长速度（mm/h）48h72h48h72h48h72h小麦赤霉病菌1505.55.583.687.50.110.07水稻稻瘟病菌CK32.064.00.670.89水稻稻瘟病菌2510.512.068.781.40.220.14水稻稻瘟病菌756.06.081.290.60.130.08水稻稻瘟病菌1506.06.081.290.60.130.08表8-14 APS对病原真菌菌丝生长的影响（续）-1关于枯草芽胞杆菌对植物病原菌的作用方式，有人认为，是病菌孢子萌发受到抑制，也有报道是菌丝顶端的畸形。孔建等（1998）将枯草芽胞杆菌B-903菌株液体培养72h后，将培养滤液高温灭菌，以不同比例将培养滤液加入镰刀菌孢子悬浮液中，置于扫描电镜和光学显微镜下定时观察。结果表明，镰刀菌孢子悬浮液培养12h后，无菌水处理的病菌孢子均已萌发形成细长菌丝，培养至18h菌丝生长正常，长而均匀，有分枝，培养至48h菌丝未见异常。但经B-903滤液处理的镰刀菌，培养12h后在光学显微镜下观察，孢子尚有部分未萌动，孢子短粗变形，已萌动的芽管出现扭曲状，但多数孢子随后仍能发育成菌丝。上述异常现象随B-903滤液处理浓度增高而加剧。将镰刀菌孢子悬浮液培养15h在扫描电镜下观察，经B-903滤液处理的菌丝端部和中部的细胞开始明显膨胀呈球状，球状细胞的细胞壁皱缩干瘪，分析应是内含物外泄后所致。小孢子端部亦膨大形成远大于自身的球状结构，并看到内含物外泄的现象。经B-903滤液处理18h在光学显微镜下看到，所有的菌丝细胞均出现畸形。细胞呈圆形或椭圆形，以致整个菌丝由丝状变为捻珠状，此时透过细胞壁，其细胞内含物清晰可见。然而至28h，球状细胞进一步膨大，胞内物质减少，细胞透明度增加，并且菌丝开始有断裂现象。36h后观察，串珠状菌丝已纷纷断裂成片段，5～7个球体细胞连成一串，细胞内含物消失，变成空胞，镜下看去类似一串串的肥皂泡。至48h，细胞之间相互离解，菌丝体完全崩溃，最终这些单个的圆形空胞也逐渐瓦解消融。试验中观察到，不同浓度的B-903滤液处理，病菌孢子和菌丝的畸变过程是类似的，而高浓度的处理会使整个过程缩短，症状亦更明显。由此认为，枯草芽胞杆菌对植物病原菌的抑制怍用主要依赖于其生活过程中产生于体外的某种抗高温的代谢产物，即抗菌物质，它可使病菌孢子和菌丝畸形，细胞崩解，内含物外泄，从而使病菌丧失对植物的侵染能力，在许多枯草芽胞杆菌防治病害的试验中，多数方法是将大量培养的活菌接种于表面或植物根际土壤中，其防治效果可能亦得益于该菌在土壤中产生的抗菌物质，而非微生物之间对生态位的占领竞争。事实上，在大量培养枯草芽胞杆菌时，当单位容积中的菌体细胞达到一定数量或培养时间超过21h，大部分该菌细胞即开始自融，起防病作用的还是培养液中的代谢物，因此，从抗菌素的角度来研究枯草芽胞杆菌的开发利用，可能更有价值。利用木霉菌属、芽孢菌属和假单胞杆菌作为生防制剂防治棉花病害已经取得进展。张克诚等（2002）利用一株从小麦根际筛选的链霉菌属（Streptomycesspp.）拮抗菌株S-5拌土或拌种，不仅防治棉花苗期病害效果明显，对棉花生长中后期的枯、黄萎病也取得了较好的防病效果。用链霉菌菌剂拌种，对棉花苗期病害的防病效果为65.5%，比多菌灵的防效高出25.5个百分点。田间防治枯、黄萎病效果，不同施用量，链霉菌S-5对枯、黄萎病的防病效果差别明显。使用2.5kg/667m2拌种，对枯萎病防病效果为81.8%；对黄萎病防病效果为100%。这为进一步开展以链霉菌作为生防制剂的棉花病害生物防治研究奠定了基础。利用拮抗微生物防冶土传病害，是建立在作为生防制剂的微生物能否在植物根际定殖的基础上的。然而，拮抗微生物在根际定殖受到许多环境因素如土壤pH值、矿质营养、含水量、土著微生物的种类，以及植物种类、植物不同生育期等的影响。因此，有必要进一步了解在根际微生态中拮抗微生物与土著微生物包括病原微生物的相互作用及其对植物的影响。具体来讲，需有明确链霉菌S-5抑制土传病害，促进植物生长的作用机制，在弄清生防菌作用机理的基础上，改进应用技术，提高生物防治效果。防治效果的稳定性是土传病害生物防治中最关键的问题，也是决定一种生防微生物能否在生产上推广应用的前提。为提高链霉菌S-5菌株生防效果的稳定性，可以采用与S-5菌株相容的其他根际微生物如木霉属、杆菌属的菌株混合使用的方法来改进，因此，还需要进一步研究链霉菌S-5与植物改进其他微生物间的互作关系。植物病害抑菌土（Pathogen suppressive soil）是指在土壤中有某种病原菌存在下，种植感病植物，由该病原菌引起的病害的发生、发展受到抑制的土壤。抑菌土的形成须具备两个条件：一是土壤中存在足够以致病的病原菌的量；二是同时种植感病品种，而植株不发病，或发病很少。从抑菌土的发现到21世纪初，对抑菌土的研究已有100多年的历史。马存等（2007）将抑菌土的研究历程划分为4个阶段。第一阶段：从19世纪末至20世纪20年代，主要是对不同类型土壤病害发生情况的研究报道，是抑菌土研究的初创时期。研究结果只是相继证实了这种现象，均未涉及土壤中是否含有致病菌，以及病原菌含量上的差别。第二阶段：从20年代末到50年代末，Menzies（1959）提出抑菌土概念为止。抑菌土的概念已初步显现。第三阶段：从60年代起至70年代末，由于抑菌土概念的提出以及对环境保护的重视，使植物病理学家对非化学方法保护农作物抵御各种病害的侵袭日益重视，使抑菌土的抑菌机理研究逐步深入，以期从中发现病害防治的新途径。第四阶段：从70年代开始至今，抑菌土的本质得到初步揭示，对其机制的研究逐渐从单一集中于生物因子的主导作用，发展为生物因子和非生物因子共同作用的结果。对抑菌土的研究已成为植物病害生物防治的一项重要内容。棉花枯萎病重病田或枯萎病圃，连续种植抗病品种多年后，再种植感病品种则发病显著降低，称做病圃衰退。徐富有（1985）认为，抗枯萎病品种连作3年后土壤内枯萎菌致病力显著减弱。张卓敏等（1980）和吴传德（1985）认为，土壤内枯萎菌量随抗病品种连作年限增加而减少，致病力也有随连作年限增加而降低的趋势。中国农业科学院植物保护研究所河南新乡县王屯基点，1972年在发病率接近100%，死苗率80%的枯萎病绝产田块建立枯萎病圃，1973年开始种植抗病品种，到1976年再种植感病品种岱字棉15、发病率降低到35.4%，病指22.3，该病圃在1982年、1983年、1985年曾3次用带病棉柴及人工培养的枯萎菌接种，但感病品种的发病率无显著提高。Baker等（1974）和Cook（1981）认为，具有抑制病害发展的土壤称为抑菌土（Suppressive soil），无抑菌作用的土壤称为导菌土（Conductive soil）。马存等（1992）于1987～1988年两年进行盆栽试验结果表明，86-1根围土（抗病品种86-1连作10年以上田块的棉株5cm内土壤）枯萎病平均发病率37.3%，病指19.5，与对照（无植棉史的果园土或种植1～2年感病棉花品种的土壤）相比，抑菌效果达60.5%。86-1田间土（抗病品种86-1连作10年以上田块土壤）枯萎病平均发病率48.3%，病指29.4，抑菌效果39.9%。枯萎病圃土（作为棉花育种抗病性鉴定病圃连作棉花10年以上病圃土壤）平均发病率55.3%，病指27.2，抑菌效果43.9%。感病品种棉田土发病率72.8%，病指66.9，无抑菌效果。对照果园土平均发病率70.1%，病指48.7（表8-15）。以上结果表明，86-1根围土、86-1田间土、枯萎病圃土对枯萎病菌均有显著的抑菌效果，86-1根围土抑菌效果最强，比病圃土效果高27.4%。感病品种棉田土和果园土对枯萎病菌无抑菌效果。土样发病率（%）病指抑菌效果（%）861根围土37.319.560.5861田间土48.329.439.9枯萎病圃55.327.243.9感病品种田72.866.9—果园土（CK）70.148.7—861根围灭菌72.455.6—861根围+果园（1∶1）55.237.324.1表8-15 不同土样对枯萎病菌抑菌效果比较（盆栽）李长兴等（1996）报道的盆栽试验结果指出，种植抗病品种10年以上的重枯萎病圃再种感病品种（辽棉6号），发病率为80.2%，病指为47.8；多年没有种植过棉花的小麦田土发病率为92.2%，病指为65.0。种植抗病品种10年以上的重枯萎病圃显著比多年没种植过棉花的小麦田土（对照）发病率、病指低，分别低12.02%和17.21%（表8-16）。处理项目枯萎病发病率（%）病指抑菌效果（%）抑菌土（10年）80.247.826.5抑菌土（5年）93.258.69.9抑菌土（高压灭菌）86.158.210.4小麦田土（CK）92.165.0—表8-16 盆栽试验的抑菌效果河南新乡田间小区试验结果，86-1连作10年田枯萎病平均发病率9.8%，病指4.4，与对照果园田比较，抑菌效果达85.8%。连作10年以上枯萎病圃，平均发病率17.1%，病指6.8，抑菌效果75.2%。对照果园田平均发病率57.l%，病指28.8（表8-17）。在辽宁辽阳试验结果，连作10年枯萎病圃枯萎病发病率39.0%，病指19.3，对照菜园土发病率75.9%，病指44.1，抑菌效果平均56.2%（表8-18）；连作5年的枯萎病发病率66.7%，病指37.8，抑菌效果17.6%。发病率和病指比连作10年病圃分别高27.7%和18.5%，而抑菌效果低36.6%。还可看到未接菌小区连作10年和5年病圃田，枯萎病指分别为8.1和14.1，这说明病圃连作年限愈长，病圃衰退愈明显，而对枯萎病菌抑菌效果也就愈显著。河南新乡、辽宁辽阳两地田间小区试验结果基本一致均证明，连续种植抗病品种多年后的棉田，或连作多年的枯萎病圃，对枯萎病菌均有抑制作用，存在抑菌土。田块处理枯萎病发病率（%）病指抑菌效果（%）861连作田接菌9.84.485.8未接1.00.3—枯萎病圃田接菌17.16.8—未接1.90.676.2果园田（CK）接菌57.128.8—未接0.00.0—表8-17 田间小区对枯萎病菌抑菌效果比较（河南新乡）（马存等，1992）田块接菌情况发病率（%）病指抑菌效果（%）连作10年病圃田接菌39.019.356.2不接菌15.58.1—果园田（CK）接菌76.944.1—不接菌0.00.0—连作5年病圃田接菌66.737.817.6不接菌28.514.1—果园田（CK）接菌71.045.9—不接菌0.00.0—表8-18 不同田间小区对枯萎病菌抑菌效果比较（辽宁辽阳）（马存等，1992）杨之为等（1995）按不同年限的土样分别接入1%土样的棉枯萎病菌麦粒沙培养物，当种植感病品种冀棉11时，从苗期病情看，连作3年、6年、8年、9年、11年和15年土样的发病率依次为66.67%、55.6%、42.8%、33.3%、11.7%和3.3%，松林土（CK）发病率为85.7%（表8-19）。抗病品种岱字棉16连作6年的土样发病率为CK的64.8%，连作11年、15年的土样发病率仅为CK的13.6%和3.8%。将高压灭菌土样再接入等量病菌培养物，测定其土样致病力，可以看出（表8-19），当抗病品种连作少于8年时，土壤中抑病因子大多被降解，棉苗发病率81%～92%；但连作9年以上则发病率在33.3%～63.3%，低于重病田，说明经高压灭菌的土样中仍可能存在少量抑病因素。土样来源原土样灭菌土样发病率（%）病指发病率（%）病指松林土85.771.466.354.5重病田土40.020.085.771.4连作3年66.733.381.863.6连作6年55.630.6——连作8年42.817.691.668.7连作9年33.330.533.316.7连作11年11.75.963.650.0连作15年3.30.0156.640.0表8-19 不同土样接菌后的抑病效果（接菌量1%）形成抑菌土的因子主要有生物因子和非生物因子，不同抑菌土起作用的因子各有不同。在生物因子中，主要是土壤中的微生物。非生物因子是指土壤的矿物质含量、土壤的酸碱性、土壤质地、土壤颗粒结构等物理和化学性质。国际上有研究认为，土壤微生物种群结构的改变，尤其是一些拮抗微生物的增加，是形成棉花枯萎病田抑菌土的主要生物因子。杨之为等（1995）和王汝贤等（1998）从棉花根系分泌物对棉花枯萎病的影响和连作抗枯萎病品种棉田微生物数量变化做了系统研究后认为，棉花抗病品种连作田土壤中，棉枯萎菌数量的减少，是土壤致病力下降的主要原因，而造成棉枯萎菌数量减少的主要原因，则是土壤中的有益放线菌、细菌增长导致棉花抗病品种根系分泌物中的抑菌物质对病菌抑制的结果。土壤有益微生物增长的原因：一是棉花抗病品种根系分泌物为这些有益菌提供了良好的生活条件；二是可能因棉花枯萎菌数量的减少，有益菌减少了竞争对手，使其有了扩大繁殖的机会，这一切变化又均与棉花抗病品种连作分不开。抗病品种连作3年，土壤带菌量约为重病田土样菌量的43%，连作6年为重病田土样菌量的57%；连作8年的土样带菌量降低幅度较大，为重病田的23%；连作10年以上的土壤中，棉枯萎病菌很少（表8-20）。在不同连作年限的抑菌土中种植感病品种冀棉11，重病田的棉苗发病率为31.25%；抗病品种连作3年的棉苗发病率为12.5%；连作6年的发病率为9.09%；连作9年以上的除连作11年发病率4.55%外，其他基本不发病。这表明，随着抗病品种连作年数的增长，土壤中，棉枯萎病菌的数量和致病性逐年降低，说明棉枯萎病抑菌土的形成是抑病因子逐渐积累的过程。土样来源土样带菌量（个/克土）发病率（%）病指松林土（CK）000重病田土217631.7514.06连作3年114712.509.38连作6年12369.094.56连作8年5008.304.00连作9年5800连作10年1000连作11年1484.564.56连作15年000表8-20 不同棉田土样致病力比较（杨之为等，1995）马存等（1992）在盆栽土样内枯萎菌菌量测定结果表明，86-1根围土，每皿平均有菌落22.5个（每克土样内有菌落4500个），比对照果园土减少56.7%。86-1田间土每皿有菌落21.4个（每克土有4250个），比果园土减少59.2%。枯萎病圃土每皿有菌落32.2个（每克土有6440个），比果园土减少52.9%。对照果园土每皿有菌落52个（每克土有10400个）。田间小区内枯萎菌菌落，86-1田间土、枯萎病圃土每皿有菌落分别为138个（每克土有2760个）和1486个（每克土有2920个），分别比菜园土减少51.4%和48.6%。菜园土每皿有菌落284个（每克土有5580个）。从上述结果清楚的看到，在相同接菌量情况下，种植一季感病棉花品种后，3个抑菌土土样内，枯萎病菌菌量比对照菜园土减少48.6%～59.2%，说明抑菌土对接入土壤内的枯萎病菌有极显著的抑制作用，因而枯萎病发病率显著降低，达到控制枯萎病为害的效果。王汝贤等（1998）从棉花抗病品种连作3年、6年、8年、9年、10年的土样中分离出3830个真菌菌落，其主要类群归入11个真菌属。随着棉花抗病品种连作年限的增长，土壤中，真菌和放线菌的种类和数量逐渐增加（表8-21、表8-22）。对棉枯萎病菌抑制性较强的种类有：细黄链霉菌（Streptomyces microflavus）、球孢链霉菌黄色变种（S.globisp var.llavus）和紫链霉菌淡红变种（S.wolaceus）。供试土样中，分离到的3315个细菌菌落按菌落特征可分为9个类型，其中，Ⅲ型和Ⅳ型对棉枯萎菌有较强的抑菌作用，初步鉴定为枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis和B.sp.，它们在连作年限较长的土样中出现的频率较高，但土样中细菌的总数量与棉花抗病品种连作的年份成反相关（表8-23）。供试土样中分离出3种主要线虫，其中，螺旋线虫、滑刃线虫和真滑刃线虫的数量也随抗病棉花连作时间的延长而增加（表8-24）。菌类连作年限10年9年8年6年3年菌落数百分率（%）菌落数百分率（%）菌落数百分率（%）菌落数百分率（%）菌落数百分率（%）脊霉菌属9.448.48.455.36.550.010.163.99.659.3曲霉菌属6.131.43.523.03.829.23.220.34.729.0链格孢属0.84.10.74.60.64.60.31.90.53.1毛壳属0.21.00.95.90.32.31.59.50.21.2园酵母属0.31.50.10.70.32.30000黑粘座孢霉属0.10.5000.21.50.10.60.10.5瓶粳脊霉属00000.10.80.21.300毛霉属000.10.70.21.50.10.600木霉属00000.10.8000.21.2粘帚霉属000.10.70.21.50000镰孢属0.52.60.32.00.21.50.10.60.31.9其他2.010.51.27.20.54.00.31.70.83.8平均每皿菌落总数19.415.313.015.916.2种类数1812141110表8-21 棉花不同连作年限土样中真菌类群比较（平均每皿菌落数）菌类连作年限10年9年8年6年3年菌落数菌落数菌落数菌落数菌落数纤维螺旋链霉菌5456341325产二素链霉菌482323813天冬素紫色链霉菌3725281110球孢链霉菌黄色变种2118141110土味链霉菌48173紫色链霉菌01000球孢链霉菌01000表8-22 不同连作年限土样中放线菌数量的变化（个）菌类连作年限10年9年8年6年3年菌落数菌落数菌落数菌落数菌落数细黄链霉菌00300绿色产孢链霉菌00200其他6127116合计1701391126167群落数11101197菌落数（皿）28.323.218.710.211.2抑制性菌落数3.53.33.21.81.7表8-22 不同连作年限土样中放线菌数量的变化（个）（续）-1菌类连作年限10年9年8年6年3年菌落数菌落数菌落数菌落数菌落数Ⅰ2254596151Ⅱ2925465781Ⅲ25012109Ⅳ00013Ⅴ004130Ⅵ16213Ⅶ011000Ⅷ024000Ⅸ002800菌落数45665菌落数（皿）77120151142153抑制性菌落数25401089表8-23 不同连作年限土样中细菌的类群及数量（个）土样螺旋线虫滑刃线虫真滑刃线虫垫刃线虫短体线虫其他合计连作9年16271230058连作6年2014851250连作4年1410028连作2年0110002表8-24 不同连作年限土样中线虫数量的变化（个）李长兴等（1996）连续3年对4类型土壤采土，在不同棉花生育期采土分离结果，10年以上的枯萎病圃中，细菌、青霉、曲霉、放线菌的数量显著比未植棉土壤和小麦田土壤多，有芽孢细菌比未植棉土多1.13倍，无芽孢多1.69倍；真菌中，青霉多0.76倍、曲霉多1.11倍；放线菌多0.86倍（表8-25）。并且在放线菌对棉花枯萎病菌拮抗作用测定中，筛选出2株具有拮抗作用的菌株。这表明生物抑菌因子的存在，种植抗病品种多年的重枯萎病田根围土或根际土中，有可能筛选到拮抗作用强的抗生菌。土样类型真菌（×103个/克土）细菌（×104个/克土）青霉曲霉木霉有芽孢无芽孢放线菌（×104个/克土）抑菌土（10年）105.869.70.768.3285.8255.8抑菌土（5年）100.360.5047.7204.9221.1小麦田土63.321.2046.3149.6109.9未植过棉土67.830.8041.298.2141.3表8-25 不同类型土样菌量对病菌小孢子萌发、厚垣孢子产生数量的测定结果表明（表8-26），不同连作年限土样浸出液对病菌小孢子萌发的影响没有显著差异；对厚垣孢子的形成却有一定影响：连作6年以下每视野（16×10）平均17～18.8个厚垣孢子，9年有13.3个厚垣孢子，连作15年仅有4.9个厚垣孢子，说明随抗病品种种植年限的增长，厚垣孢子的形成数量逐渐减少，由此推测土壤中，有抑制厚垣孢子形成的物质，该物质随年限的增长而逐渐增多。土样来源病菌小孢子萌发率（%）病菌厚垣孢子的形成数量（个/视野）ⅠⅡⅢⅣ显著水平*松林土（CK）81.120.224.311.818.8a重病田土70.720.514.217.817.5a连作6年70.720.718.517.318.8a连作9年63.915.017.87.213.3ab连作11年—11.27.012.810.3ab连作15年84.63.37.83.74.9b表8-26 不同土样浸出液对棉枯萎菌的影响（杨之为等，1995）总之，对棉花枯萎病抑菌土的研究，为枯萎病等多种病害开辟了生物防治途径，利用抑菌土或筛选抑菌生物因子防治植物病害，随着研究的不断深入和技术方法的逐步完善，将可能取得较大的经济效益和社会效益。尽管棉花枯萎病的生物防治研究工作已历时数十年，但至今未形成商品化制剂。究其原因，马存等（2007）认为，是由于对许多问题还缺乏研究，许多困难有待解决。与整个生物防治普遍存在的问题一样，在这些问题与困难解决之前，生物防治尚难以作为常规手段用于棉花枯萎病的治理。这些问题主要包括：一是生态学障碍。从实验室向大田阶段的过渡往往遭到失败，其中，生态障碍是主要原因；二是防治对象单一。生物防治研究仅仅针对其中一种或几种病害，往往不被工业化生产所接受；三是缺乏适合工业化生产的扩繁技术。在实验室内可以不计成本培养所需生防制剂，但在商业化生产上则要考虑经济效益，与规模化生产有关的大量培养技术则有待提高；四是缺乏准确可靠的筛选技术与筛选标准。目前，生防菌的筛选技术和标准仍然是沿用传统的平板对峙法和在平板上对病原菌的拮抗能力，其预见性较差，如果结合生防菌的其他特性，如定殖能力的测定，则有望筛选到更有潜力的菌株；五是缺乏规范化的菌剂制备技术。有关生防菌剂制剂化和规范化的配套研究相对缺乏，无法将有效的生防菌开发成规范的产品；六是缺乏配套的生防菌田间施用技术。植病生防的研究目的是防治田间植物病害，其田间施用技术选择的适当与否，决定着该菌剂的有效性。针对上述棉花枯萎菌生防菌所存在的问题，结合工业化生产需要，认为生防菌株应具有如下特点：①生长速度快，产孢量大。②作用谱广泛。③作用机制多样性。④可在棉花根际大量定殖。⑤能作用于棉花内部的枯萎病菌。⑥不受土壤抑菌作用的干扰。⑦休眠孢子有较强的耐干燥能力。⑧对棉花生长有促进作用。⑨要有合适的生防菌剂剂型及相应的施用方法。虽然目前没有登记注册的防治棉花枯萎菌的生防菌，但已有防治其他作物枯萎病的生防制剂商品。例如，意大利S.I.A.P.A公司登记的利用非致病性尖孢镰刀菌作为生防菌的产品Biofox C，可防治由尖孢镰刀菌引起康乃馨和番茄等病害；由法国Matural Plant Protection公司注册的同类产品Fusaclean，可防治由尖孢镰刀菌所引起的芦笋、康乃馨和番茄等作物病害。说明应用生防手段防治棉花枯萎病前景乐观。随着棉花枯萎病生防菌在菌株人工改良技术、生防菌剂生产条件以及生防菌剂型的多方面研究，生物防治棉花枯萎病有可能在近期取得一些突破。