玉米中许多基因表达导致植株非正常的形态和颜色变化，玉米大多基因是隐性遗传，只有少数基因为显性遗传。如果某些基因变异，常常会导致玉米植株或局部组织器官发生性状改变而受到为害。诸如某些基因变异，限制植株体内叶绿素合成，导致植株白化，或植株叶片产生白色、黄色条纹、斑驳等复杂多样的症状。在玉米生产上，常见的遗传性病害有：花叶病、斑点病、枯斑病、条纹病、黄色条斑病、黄化苗、白化苗、轮纹斑病、多穗症、雄穗结实症等10余种症状（图2-76至图2-91）。有些叶斑和花叶症状与真菌、病毒所致的病害症状相似，有些和除草剂药害的症状易于混淆。如美国自交系C103和Mo17表现的遗传性花叶症状，与病毒侵染所致的花叶症状极为相似，在诊断上应特别注意。一般来说，遗传病害症状多见于育种圃或亲本繁殖田中，生产田杂交种上偶尔可见。对于此类病害的预防，应注重种子纯度，加强品种资源的选择和纯化，以减少遗传性病害的发生。图2-76 遗传性花叶病叶片症状图2-77 遗传性花叶病植株症状图2-78 遗传性斑点病症状图2-79 遗传性斑点病（左：病叶）图2-80 遗传性枯斑病症状图2-81 遗传性条纹病症状（均匀条纹）图2-82 遗传性条纹病症状图2-83 遗传性黄色条斑病症状图2-84 遗传性黄化苗（田间症状）图2-85 遗传性黄化苗（左）图2-86 遗传性白化苗症状图2-87 遗传性轮纹斑病田间受害状图2-88 遗传性轮纹斑病植株图2-89 遗传性轮纹斑病叶片症状图2-90 遗传性多穗症图2-91 遗传性雄穗结实症

高分辨熔解曲线 （High Resolution Melting，HRM） 分析技术是近年来国际上兴起的一种最新的应用于基因突变检测和 SNP 分析的方法。因为所用的荧光染料只能嵌入并结合到双链 DNA 上，因此利用实时 PCR 技术，就能通过实时检测双链DNA 熔解过程中荧光信号值的变化，将 PCR 产物中存在的差异以不同形状熔解曲线的方式直观地展示出来，并且可以借助于专业的分析软件对测试群体实现基于不同形状熔解曲线的基因分型或归类 （殷豪等，2011）。高分辨熔解 （HRM） 曲线分析技术具有三个突出的优势：一是高通量、高灵敏度、高特异性、低成本且不受检测位点的限制；二是操作简单、快捷、节省时间成本；三是闭管操作，无污染且 DNA 不受损伤，熔解分析后还可以进行凝胶电泳或测序分析。在 LightCycler ? 480分析仪上一次可以完成96个或348个样本的分析，从反应开始到数据生成仅需要90～120 min。目前HRM技术在果树的种质鉴别和基因分型研究中已有应用。吴波等 （2012） 引入高分辨率熔解曲线分型技术对柑橘进行SNP 分型；Ganopoulos等 （2013） 利用 HRM 技术对9个甜樱桃基因上的 SNP 位点进行分析，成功的实现了对21 个甜樱桃品种的鉴别，准确率达到 99.9%；Distefano 等 （2013） 第一次将HRM技术应用于对柑橘品种 SNP 及 InDel的检测，并利用21 个 SNP标记实现了对柑橘不同品种的区别。分子标记辅助选择育种 （marker assisted selection，MAS） 作为一种高效的现代分子育种技术，已被广泛应用于作物品种选育和遗传改良。它是利用与目标基因紧密连锁的分子标记，来鉴定不同个体的基因型，从而进行辅助选择育种。与通过表现型间接对基因型进行选择的传统育种方法相比，MAS具有更大的信息量，能有效结合基因型与表型鉴定结果，更加高效和准确，避免选育过程中的盲目性和不可预测性，能够将育种时间从传统的十几年缩短到几年时间，从而显著提高育种效率。分子标记对目标性状鉴定的准确性是影响分子标记辅助选择效率的一个重要条件。本试验利用HRM分析技术对上一章节所开发的SNP 和InDel标记进行筛选和验证，以获得与抗炭疽菌叶枯病基因 R gls位点紧密连锁的SNP 及InDel标记，对抗病基因进行精细定位，缩小抗性基因位点的区域范围，为基因克隆提供数据。同时利用筛选出的4 个与 R gls基因位点紧密连锁的分子标记对50 个苹果栽培品种和品系进行准确性鉴定，以验证分子标记的可靠性。选择青岛农业大学苹果试验基地 （山东省胶州市） 2009 年种植的，经过人工离体接种鉴定的 ‘金冠’ב富士’ 的F1 杂交群体207株实生树为材料用于验证 SNP、InDel标记及进行抗炭疽菌叶枯病基因的精细定位。所用群体与第三章SSR标记的开发与遗传定位为同一群体。选择该试验基地栽培的 50 个田间栽培品种和品系做为试材，经人工离体接种鉴定并提取DNA，用于分子标记准确性的验证。同第三章。用于引物设计的SNP 和 InDel位点来源于第四章中所筛选出的位于第15条染色体上3.9～4.9 Mb候选区域的18 个 SNP 位点和30 个InDel位点。从网站 https：//www.rosaceae.org/gb/gbrowse/malus_x_domestica/下载位于SNP 和InDel位点上游150 bp和下游150 bp距离内的contig 序列用于引物设计。引物设计的主要参数为：产物大小60～150 bp；引物退火温度 （Tm） 在 55～65℃，且上、下游引物 Tm相差不大于 2℃；引物 GC （%） 含量为 45%～55%，引物大小在60～160 bp。引物序列 （附表 5-1）。所有引物由生工生物工程 （上海） 股份有限公司合成。PCR扩增和高通量熔解曲线分析在 LightCycler ? 480Ⅱ荧光定量PCR 仪 （Roche） 上进行。反应试剂来自 LightCycler ? 480 High Reso-lution Melting Master试剂盒。反应体系为15 μl，内含10 ng/μl的基因组 DNA 1.0 μl，1×Master Mix 7.5 μl，2.0 mmol/L MgCl2 1.5 μl，左右引物为 0.2 μmol/L各0.5 μl。PCR扩增程序为95℃预变性10min，然后按95℃变性10min，55℃退火15s，72℃延伸10s的程序进行45个循环。在PCR循环结束后，立即对扩增产物进行HRM检测，程序为：95℃1min，40℃1min，65℃1s，在65℃升温至95℃的过程中，以25次/℃的频率收集荧光信息，最后降温至40℃。高分辨率熔解曲线分析用LightCycler?480的Gene Scanning软件（1.5version）进行。用18对 SNP 及30对InDel引物在亲本和抗感基因池中筛选，将出现不同分型的引物在分离群体上进行验证，以确定该标记是否与目的基因连锁。将筛选的多态性标记在重组个体上的基因型表现与重组个体的抗病表型进行统一分析，对抗炭疽菌叶枯病基因 R gls位点进行精细定位，缩小抗性基因位点的范围。为后续的候选基因筛选及图位克隆提供准确的信息。将进一步缩小的R gls位点区域内的基因进行统计并进行同源比对和GO功能富集分析，以筛选该区段内可能与抗病相关的候选基因。SSR标记的PCR产物利用3.5%的琼脂糖凝胶电泳进行标记基因型鉴定。SNP 和InDel标记利用HRM技术进行基因分型鉴定。通过对设计的引物进行 BSA 筛选，获得了与 Rgls基因位点连锁的6个SNP 及5个 InDel标记，分别为 SNP3955、SNP4236、SNP4257、SNP4299、SNP4336、SNP4432 和InDel4199、InDel4227、InDel4254、InDel4305、InDel4334。在6个SNP 位点中有A/G、G/A、T/C和C/G四种变换形式，其中发生A/G转换的占50.0%，发生G/A转换，T/C转换，C/G颠换的各占16.7%（表5-1）。引物名称引物序列序列长度参考碱基突变碱基位置SNP3955R：CCCTTAAAAGCCATGGAAGAGF：GTTCTGCATAAAAACCTCGCA133AGchr15∶3，955，630-3，955，763SNP4236R：GCTTATCATAAAAAGCAAGACCACF：ATCATATAATTGTGTAATTTAGTAGAACA114AGchr15∶4，236，220-4，236，353SNP4257R：GGAGTCATAAGCCACAACGAGF：TCAGCTTTGAAGCATCCAATT145GAchr15∶4，257，141-4，257，286SNP4299R：GGTTATACATAGAGGCACTTAGAGCF：GCACAAAACTTAGATCAAAGATGAG135TCchr15∶4，299，179-4，299，314表5-1 SNP、InDel引物筛选引物名称引物序列序列长度参考碱基突变碱基位置SNP4336R：AGTTCGTTCTTTTCCGTTGCTF：GCGGTCCTGATTCAGGTACAG133CGchr15∶4，336，382-4，336，515SNP4432R：CGAGGAGCAAACGATAGTCAGF：ATTGGTCTCCGAATTAGAAGTCC137AGchr15∶4，432，529-4，432，666indel4199R：ATTGTGAAACCTTGATTGGGF：GAGATTATCCTTATTTTGTGGG156AAAGchr15∶4，198，916-4，199，072indel4227R：AGCGTTGCTATGCTTCTAATGF：AAGATGGAAATGGTATGTGAT81TTCchr15∶4，227，569-4，227，650indel4254R：ATAAAGTCACTTCTAGCACAAATAF：CGAAAAACGCTTTACTTAGG119GGCchr15∶4，254，896-4，255，015indel4305R：GTAAACTCATTAAATTATGCTTGF：TGCTTTACTCCGATTCTTC134CCCAchr15∶4，305，342-4，305，476indel4334R：ATACTATGAGGTGAAGGATTTAAF：GTATCTTCTACATTATCTTTCGTG115TTAchr15∶4，334，597-4，334，712表5-1 SNP、InDel引物筛选（续）-1将获得的11个标记在207 株 F1 群体上检验其与抗炭疽菌叶枯病基因的连锁情况，结果表明，这11 个标记的扩增子熔解曲线形状明显不同，可据此区分抗病型和感病型植株 （附图5-1）。将从全基因组重测序中筛选出并经群体验证的与 R gls位点紧密连锁6个SNP 及4个InDel标记 （InDel4305标记在染色体上的物理位置与遗传位置不符，未用于精细定位分析），加上1 个 SSR标记，共11个标记与重组个体基因型及表型进行分析。结果显示，InDel4227、SNP4236和InDel4254标记与基因Rgls位点共分离，没有重组个体。标记InDel4199有一个重组个体 S29 和标记 SNP4257 有两个重组个体R16和R31，这三个关键的重组个体将基因 Rgls位点定位于 InDel4199和SNP4257 两标记之间，物理距离由 500kb 缩小为 58kb （附图5-2）。按照基因位置信息从蔷薇科基因组网站 GDR下载基因组15 号染色体4.1～4.3 Mb内基因45个。通过perl脚本整理基因组GFF文件，BLAST同源比对NR数据库，选取最优比对结果。获得目的区段内的45个基因，其中5 个基因功能未知，2 个为转录因子，另外40 个基因均有明确的注释信息 （表5-2）。序号MDP号码同源基因1MDP0000180944生长素诱导蛋白15A2MDP0000205434非病原性诱导蛋白3MDP0000148158生长素诱导蛋白15A4MDP0000177664蛋白酶体beta亚基5MDP0000177665转录共抑制因子LEUNIG6MDP0000215349转录共抑制因子LEUNIG7MDP0000664885抗烟草花叶病毒蛋白N8MDP0000877582抗烟草花叶病毒蛋白N9MDP0000200748转录因子10MDP0000481972抗烟草花叶病毒蛋白N11MDP0000481973抗烟草花叶病毒蛋白N12MDP0000381897转录因子13MDP0000297052抗烟草花叶病毒蛋白N14MDP0000700563黄瓜素15MDP0000242744阳离子运输调控蛋白216MDP0000551192阳离子运输调控蛋白217MDP0000242745转录因子18MDP0000153007来自转座子TNT1-94的反转录病毒Pol多肽蛋白19MDP0000130036未知功能转录因子20MDP0000199184未知功能转录因子21MDP0000489432三角状五肽链重复包含蛋白22MDP0000318360类LRR丝氨酸/苏氨酸受体蛋白激酶23MDP0000247898类LRR丝氨酸/苏氨酸受体蛋白激酶表5-2 区段内基因同源比对结果序号MDP号码同源基因24MDP0000811774核糖核酸酶H2亚基B25MDP0000309446未知功能线粒体蛋白26MDP0000272143单尿苷绑定蛋白1B；与mRNA3’-UTR绑定27MDP0000871880脱水响应蛋白RD2228MDP0000272145酪蛋白激酶Idelta小体29MDP0000167752结构域包含蛋白3430MDP0000167753核糖核酸酶H2亚基B31MDP0000596125核细胞溶解酶TIA-1小体32MDP0000201427拓扑异构酶I33MDP0000149447脱水响应蛋白RD2234MDP0000596128酪蛋白激酶Ideta小体35MDP0000201428UDP-糖转运蛋白36MDP0000201429环核苷酸离子通道蛋白1437MDP0000255274环核苷酸离子通道蛋白1438MDP0000120033丝氨酸精氨酸富集剪接因子。39MDP00001695343-酮脂酰-CoA合酶640MDP0000203647细胞分裂素-O-葡糖基转移酶341MDP0000864010鼠李糖生物合成酶142MDP0000279973肌氨酸氧化酶43MDP0000178030未知蛋白44MDP0000289536肌氨酸氧化酶45MDP0000272940转录因子WRKY11表5-2 区段内基因同源比对结果（续）-1为了对基因功能做进一步分析，提取区段内基因的 GO （gene on-tology） 信息，采用基因功能GO分类网站WEBGO （ http：//wego.ge-nomics.org.cn/cgi-bin/wego/index.pl） 进行基因分类。结果显示，这40个基因在细胞组成上涉及到4 个 GO 分类，包括细胞、细胞组分、细胞器组成以及大分子复合体的组成；在分子功能方面，该区段内基因涉及到电子传递、转运蛋白、水解、绑定、催化以及物质传递6 个GO分类；在生物过程方面，该区段内基因涉及到免疫过程、生物调控过程、细胞过程、色素沉着过程、程序性死亡过程、代谢过程、响应刺激过程、定位以及定位确立9个生物过程 （附图5-3）。经离体接种鉴定，50 个作为分子标记准确性鉴定材料的品种（系） 中有33 个抗病品种 （系） 和17 个感病品种 （系）。从与抗炭疽菌叶枯病基因紧密连锁的分子标记中挑选出4 个有代表性意义的分子标记SSR标记S0405127，S0304673，SNP 标记 SNP4236，InDel标记InDel4254作为鉴定标记。其中SSR标记 S0405127 与基因 Rgls位点的遗传距离为 0.5cM，S0304673 的遗传距离为 0.9 cM （见第三章），标记SNP4236和 InDel4254与目的基因共分离。鉴定结果显示，SSR标记 S0405127，S0304673，SNP 标记 SNP4236，InDel 标记 In-Del4254 鉴定抗感品种 （系） 的准确率分别为 90.0%，94.0%，98.0%，96.0%。在基因型与表型鉴定结果中，不相符的个数分别为5个，3个，1个，2 个。这 4 个分子标记鉴定结果的准确率均达到90%以上，可以应用于田间栽培品种、品系、种质资源以及杂种后代幼苗对炭疽菌叶枯病抗性的鉴定 （表5-3）。序号品种/系表型S0405127S0304673SNP4236InDel42541海棠RRSRR2斗南RRRRR3福丽RRRRR4福艳RRRRR5红勋1号RRRRS6华帅RRRRR7鲁加1号RRRRR8鲁加2号SSSSS9鲁加4号RRRRR10鲁加6号RRRRR11旭RRRRR12早杂1号RRRRR13威赛克旭RRRRR14五月金RRRRR15早翠绿RRRRR表5-3 四个分子标记对苹果栽培品种和品系的抗病性的鉴定结果序号品种/系表型S0405127S0304673SNP4236InDel425416国光RRRRR17霞光RRRSS18烟富1RRRRR19福早红SSSSS20嘎拉SSSSS21金冠SSSSS22秦冠SSSSS23华硕RSRRR24瑞丹SSSSS25乙女RRRRR26王林RSRRR27青农红SSSRR28秦冠SSSSS29瑞红SSSSS30赛金RSRRR31红肉1号RRRRR32双阳红SSSSS33望山红RRRRR34新红星RRRRR35青冠RRRRR36弘前富士RRRRR37富士RRRRR387C-102RRRRR39N2SSSSS40PinavaRRRRR417C-35SRRSS4295-161RRRRR4395-231RRRRR4495-232SSSSS4595-32RRRRR4695-93RRRRR477C-104SSSSS487C-105SSSSS497C-106SRRSS507C-107SSSSS表5-3 四个分子标记对苹果栽培品种和品系的抗病性的鉴定结果（续）-1精细定位通常采用的方法是侧翼分子标记法，对于有参基因组植物来说，就是根据对目的基因的初步定位结果，选择位于目的基因两侧的分子标记之间的碱基，用于设计合适的分子标记。筛选出的与目的基因连锁的分子标记，通过鉴定更大的群体来确定发生交换的重组单株，最终找到与目的基因紧密连锁的分子标记，从而实现对目的基因的精细定位。精细定位是图位克隆策略中重要的一步，可以通过开发新的分子标记，整合原来已有的遗传图谱来进行图谱加密，以实现对目的基因的精细定位。本研究利用全基因组重测序技术开发出的 SNP 及 InDel标记，结合Rgls基因初步定位结果，选出在 Rgls基因两侧的 SSR 标记 S0304673和S0405127之间的SNP 和InDel标记，通过HRM曲线分析技术对18个SNP 位点和30 个 InDel位点进行了分析，筛选出6 个 SNP 及5 个InDel标记与Rgls基因位点紧密连锁。并选择其中的10 个标记用于Rgls基因位点的精细定位。标记InDel4227、SNP4236和 InDel4254表现出与R gls基因位点共分离。由于所用群体规模的限制，所以筛选出的SNP 及InDel标记仍无法对R gls基因位点进行真正意义上的精细定位。由于现有的金冠苹果基因组数据库中可能存在组装错误，所以在对定位区域内的基因进行分析中，扩大 R gls基因位点区域。对苹果第15条染色体4.1～4.3 Mb距离内的基因进行统计分析，结果表明在该区段存在40个有功能注释的基因，涉及到细胞组成方面，分子功能方面，生物过程方面共18个GO分类。在细胞组成层面上，参与细胞组成的基因，一般是由主效基因或寡基因控制的质量性状，是个体保持组成性抗性的基础，影响着品种的垂直抗性。在分子功能层面上，植物个体抗性与电子传递、转运蛋白、水解、绑定、催化以及物质传递等生物过程密切相关。例如，植物受到病原菌侵染后，体内会产生并积累一些次生代谢物质，如植保素、酚类、木质素、菇类等化合物，对病原菌产生抵抗作用 （Pirie and Mullins，1976）。植物次生代谢途径尤其是苯丙烷类代谢途径是与植物抗病性密切相关，许多抗菌物质 （包括酚类、类黄酮、绿原酸、酮类等） 的生物合成都是通过这条途径完成的 （RalPhL，1992；Cole R.A，1985）。在生物过程层面上，程序性死亡过程，响应刺激过程以及免疫过程与抗病机制密切相关。细胞程序性死亡 （programmed cell death，PCD） 是细胞死亡的两种基本类型之一，是细胞接受某种信号或受到某些因素刺激后主动发生的由基因调控的死亡过程。植物与病原菌互作过程中发生的过敏性反应 （hypersensitive reaction，HR） 是PCD 的重要表现形式之一，是植物抵抗病原菌入侵的早期重要抗性反应，对植物抗病性有着重要意义。在该区域内存在着4个编码WRKY转录因子的基因MDP0000272940、MDP0000242745、 MDP0000381897、 MDP0000200748 以及5 个 TIR-NB-LRR 家族基因 MDP000066488、 MDP0000877582、 MDP0000481972、MDP0000481973、 MDP0000297052。许多研究结果表明，当植物受到病原菌入侵或植食性昆虫取食植物后，植物体内的一些WRKY 转录因子的表达水平会随之发生改变 （Hui et al.，3003；Zhao et al.，2007）。Huang等 （2002） 研究了一个茄科植物的 WRKY 蛋白 STHP-64，发现其在低温胁迫下表达增强，Rizhsky 等 （2004） 发现拟南芥的 At-WRKY25蛋白与氧化胁迫下胞液抗坏血酸过氧化物酶的表达有关。Li等 （2006） 通过对WRKY70蛋白过表达的转基因植株和变异植株的研究，证明过表达拟南芥 WRKY70 蛋白的转基因植株能提高水杨酸（SA） 介导的抗病性，但降低茉莉酸 （JA） 介导的抗病性。2006 年Ryu等对水稻WRKY 转录因子在不同生物胁迫下的表达量变化进行了研究。结果显示在45 个水稻 WRKY 转录因子中有15 个 WRKY 转录因子可以被稻瘟病病菌 （ Magnaporthe grisea） 诱导表达，其中12个可以同时被水稻白叶枯菌 （ Xanthomonas oryzae Dowson） 诱导表达。在对防御反应相关的信号分子对 WRKY 转录因子的影响的研究中发现OsWRKY10、OsWRKY82和OsWRKY85可以在经过茉莉酸诱导的叶片中表达，OsWRKY45 和 OsWRKY62 可以在经过水杨酸处理的叶片中诱导表达，OsWRKY30 和 OsWRKY82 可以同时被水杨酸和茉莉酸诱导表达，这说明WRKY 转录因子参与了植物的诱导防御反应。抗性基因 （R gene） 编码的蛋白大部分是 NB-LRR 蛋白，不同类别的 NB-LRR蛋白可以直接或间接的识别不同来源的病原菌效应子，从而激发相似的防御反应。这9个基因是人们重点关注的基因。进一步的基因功能研究及苹果与炭疽叶枯菌的分子互作机制研究将围绕着SNP 定位的5个候选基因及该区段内的相关基因展开。随着分子生物学技术的快速发展，特别是以DNA多态性为基础的分子标记技术在苹果育种中的应用，大大提高了目标性状早期选择的效率，缩短了育种周期，加快了新品种选育的速率。Tartarini 等（2000） 报道了利用获得的与抗苹果黑星病的显性单基因Vf紧密连锁的RAP D标记测验了携带该基因个体，淘汰错误率为3%，保留错选率仅为 0.02%。Cheng等 （1996） 利用与控制果色的Thd01基因紧密连锁的RAP D标记，在苹果实生苗发育早期进行了标记筛选，实现了对果色这一特定性状的早期选择，大大减少了人力物力的浪费。苹果柱型性状有利于形成集约高效的现代苹果栽培模式，能够降低生产成本，提高产量。Moriya等 （2012） 所得到的 3个与控制苹果柱型性状Co基因共分离的标记 Mdo.chlO.12、Mdo.chlO.13 和 Mdo.chlO.14，对于柱型苹果杂交育种中对群体材料的早期选择、基因的克隆及转化有着重要意义。王彩虹 （Wang caihong，et al.，2011） 通过SCARs标记和SSR标记对控制梨矮生性状基因 PcDw 进行了基因定位，对梨矮化育种有着重要的意义。随着不同果树基因组测序的完成，在果树方面陆续开展了相关 SNP 芯片研发和利用。Chagne等 （2012） 对27 个苹果品种进行低深度重测序检测并确认全基因组范围的 SNP，开发了苹果 8 K 的 SNP 芯片，可用于苹果幼苗大规模检测，这将会促进标记—位点—性状之间关联性的发现，进一步阐明质量性状的遗传结构特性，推动遗传变异研究。本实验利用四个紧密连锁的分子标记 S0405127、S0304673、SNP4236和 InDel4254对50个田间栽培品种和青岛农业大学选育出的优系进行了抗炭疽菌叶枯病的基因型鉴定，并结合其抗病的表型鉴定对四个标记的准确性进行了分析。结果表明四个标记的准确率分别为90.0%，94.0%，98.0%和96.0%，可以有效的应用于分子标记辅助育种。在第三章的研究结果中，SSR标记S0405127 与基因Rgls位点的遗传距离为0.5cM，而S0304673 的遗传距离为0.9 cM，理论上标记S0405127与抗性基因位点连锁的更紧密，准确性应该更高，而在品种群体验证中，标记 S0304673 鉴定抗感品种 （系） 的准确率为94%，而标记S0405127的准确率为90%。在利用重组个体对基因Rgls位点进行精细定位中，SNP4236 和 InDel4254 标记与目的基因共分离，在品种的群体验证中应该显示100%的准确性，但实际上还是有1～2个表型鉴定与基因型鉴定不符的个体。这种现象存在的原因一是可能由于用于鉴定的品种或品系数量有限，导致了结果的偏离。二是标记S0405127的条带显示为有和无的差异，在电泳时有可能存在读带误差。三是在对做图群体进行表型鉴定中，可能存在表型鉴定误差，导致遗传距离计算的偏差。四是在精细定位中，需要应用更大的群体筛选重组的单株以完成对目标基因的精细定位。而由于实验材料的限制，所用群体规模不是很大，所以可能导致定位结果的误差。这些问题尽管在实验中是不可以避免的，但是在以后进行更精细的遗传定位研究中，以更大规模的群体和更严谨的实验操作来进一步验证，可以减少这些误差的产生，提高遗传作图的精度。

常见的果实贮藏方式，按贮藏原理大体可分为低温贮藏和气调贮藏两大类，其中低温贮藏包括利用自然冷源贮藏的沟藏、窖藏、通风库储运和人工降温的冷库贮藏等；气调贮藏包括气调冷库贮藏、塑料薄膜封闭贮藏等。按储运设施不同可分为简易贮藏、通风库贮藏、冷库贮藏、气调贮藏和其他贮藏方式。(1)简易贮藏。简易贮藏是为调节果品供应期所采用的一类较小规模的贮藏方式，它不能人为地控制储温，而是根据外界温度的变化来调节或维持一定的贮藏温度。这类传统的贮藏方式历史悠久，大多来自民间经验的不断积累和总结。其贮藏场所形式多样，其中以堆藏、沟藏、窖藏颇具代表性。此类方式一般不需要特殊的建筑材料和设备，结构简单，具有利用当地气候条件、因地制宜的特点。由于其贮藏方式主要依靠自然温度的调节作用来维持一定的贮藏环境，故在使用上受到一定程度的限制。尽管如此，由于其简便易行，仍然是目前我国农村普遍采用的主要贮藏方式。①沟(埋)藏。沟藏是将水果堆放在田间挖的沟或坑内，达到一定的厚度时，用土覆盖。沟藏保温性、保湿性较好。在农村，板栗、核桃、山楂等多用此法保藏。苹果等水果也有采用此法贮藏的。由于沟藏受气温的影响很大，初期高温不易控制，贮藏期不便检查，故在使用上受到一定的限制。此法一般适宜于在较温暖地区的晚秋、冬季及早春贮藏，在寒冷地区只做秋冬时的短期贮藏，而在气温较高的地区则不宜使用。②窖藏。窖藏方法很多，有棚窖、窑洞、井窖等。多根据当地自然地理条件的特点建造。窖藏既能利用变化缓慢而稳定的土温，又能利用简单的通风设备来调节窖内的温度和湿度。果品可以随时入窖、出窖，也可较方便、及时地检查贮藏情况。因此，此法在我国南方北方都有较广泛的应用。③棚窖。棚窖是临时性贮藏所，是在地面挖一长方形窖身，窖顶用木料、秸秆、土壤等做棚盖，根据入土深浅可分为半地下式和地下式两类。较温暖地区或地下水位较高处多用半地下式，一般入土深1～1.5m,地上堆土墙高1～1.5m。较寒冷地区多用地下式，即窖身全部在地下，入土深2.5～3m,仅窖顶露出地面。④井窖和窑窖。在地下水位低、土质黏重的地区可修建井窖，井窖的窖身深入地下3～4m,再从井窖向四周挖数个窑洞，窑洞顶呈拱形，井筒口围土做盖，四周挖排水沟，有的在井盖处设通风口。窑窖是在土质坚实的山坡或山丘挖窑洞，窖口设门或挂帘。窖藏在我国农村运用较广。但除棚窖以外的其他窖型一般通风较差，尤其春季土温回升到一定程度时，窖温不能靠通风来降低。(2)简易贮藏的管理。由于简易储运受外界的影响很大，因此，在管理上应根据各种储运形式的特点和性能，结合各地气候条件，土壤条件，果品种类、品种，储期长短，数量多少，质量好坏等予以适当的管理。①场地选择。简易贮藏的地点应选在地势平坦、干燥、土质较黏重、地下水位低、排水良好、交通便利处。②沟、窖的方向。在寒冷地区，可采用南北朝向，以减少冬天的迎风面，使两侧受直射的阳光一致，内部温度较均匀。在冬季不太寒冷的地区，则可采用东西朝向，以增大迎北风面，提高初期的降温效果。在设置阴障或风障时，一般选择东西朝向。③产品的挑选与入储。简易贮藏的果品，一经入储，多数不易进行检查、挑选，如果与有病、伤、烂的混在一起，则会相互污染加重损失。所以，入储前必须严格挑选，凡不适合贮藏的病、虫、伤产品都应及时挑出，不得入储。不同的品种，应分门别类，分开储运，而成熟度不一致的，最好也能分开储运。适期入储在简易储运中十分重要。入储过早，由于较高的气温和地温，果品温度难以降下来，易腐烂变质；入储过晚，则果品在田间易受冻害。具体入储时间，应视各地的具体情况，尤其是应根据气候及各类果品的生物学特性来决定。④温度管理。温度管理的原则是在不受冻害的条件下，迅速达到低温状态，并在整个储运期使这种状态得以稳定地保持。在生产上，这一目的是通过有规律的分层覆盖与通风措施来实现的。通风库是窖藏的发展，主要是在有良好隔热保温性的库房内，设置良好的通风系统，利用昼夜温差，通过导气设备，将库外低温空气导入库内，再将库内的热空气、乙烯等不良气体排出库外，从而保持适宜的储运环境。通风储运库有地下式、半地下式、地上式三种类型。在冬季较温暖地区，则采用半地下式；在温暖地区，采用地下式；在地下水位较高的低洼地区，可采用地上式通风储运库。(1)通风库的建筑形式①小型通风贮藏库。这种库通常以一栋库房为建筑单位，建造时，在库墙的上、下部及库顶分别设置通风设备，使空气对流加快，这时储运效果较好。②二层楼式通风贮藏库。在小型通风库上再建一层库房成二层楼式，可充分利用空间，增加使用面积，又可使下层库顶避免日照，提高保温隔热性能。上层库房一般用来堆放包装容器，或作为临时储运所，果品在下层库房贮藏。③窑洞式通风贮藏库。这种库房一般建成地下式或半地下式。(2)通风库的管理。通风库的一般温、湿度管理与土窑洞类似，库房的消毒可用1%～2%福尔马林或漂白粉喷布，或按每立方米库体5～10g的用量燃烧硫黄熏蒸。也可用臭氧(含量为40mg/m3)，兼有消毒和除异味作用。进行消毒时可将容器、架杆等一并放在库内，密闭24～48h,再通风排尽残药。库墙、库顶等用石灰浆加1%～2%硫酸铜刷白。用5ml/L的仲丁胺熏蒸24～48h后通风12h，也有良好的灭菌效果。非一次性的菜筐、果箱等，应及时洗净，再用漂白粉或2%～5%硫酸铜浸渍，晒干备用。冷库贮藏是指机械制冷贮藏。因此，冷库贮藏需要永久性库房、机械制冷装置和绝缘隔热设备。有这些配套设施，用机械设备制冷后，可实现对果实的低温贮藏。根据所储果实的种类和品种的不同，进行温度调控，从而达到长期贮藏的目的。气调贮藏就是把果实放在一个相对密闭的环境中，同时调节环境中氧气、二氧化碳和氮气等气体成分的比例，并使这一比例稳定在一定范围内的贮藏方法。主要有以下几种形式。(1)气调冷藏库。除具有冷藏库的功能外，还有能降氧的氮气发生器、二氧化碳脱除器等设备，并具有较高的气密性，以维持气调库所需的气体浓度。气调结合冷藏，能抑制果品的呼吸强度，延缓生理性和传染性病害，延长储运保鲜期。同时，还能克服常规冷藏难以克服的许多问题。因此，它被认为是当前国内外现代化的贮藏方法。(2)塑料封闭气调法。塑料封闭气调法是在库内地面挖深、宽各10cm左右的小沟，扫净地面后，将塑料薄膜帐的帐底平铺地面，再将果筐堆成长方形果垛，将大帐扣在果垛上，大帐的下面与帐底四边用土埋入小沟内，并覆土、压实，以防漏气。另一种方法是将塑料薄膜制成袋，将果实装入后扎紧袋口即可。塑料袋可直接堆放于冷库或通风库内，也可将袋放入筐(箱)内，再堆码成垛贮藏。还可将果筐(箱)装入塑料袋内，再扎紧袋口，放入库内贮藏。目前，果品加工制品的种类主要有:果品干制品、果品罐藏制品、蔬菜腌制品、果品糖制品、果品汁制品、果品速冻制品、果酒和果酱酿造等。果品原料的种类即原料的特性决定着加工制品的种类。不同的原料加工成不同的制品，不同的制品需要不同的原料(表23-1)。加工制品种类加工原料特性果品原料种类干制品干物质含量较高，水分含量较低，可食部分多，粗纤维少，风味及色泽好的种类和品种枣、柿子、山楂、龙眼、杏、胡萝卜、马铃薯、辣椒、南瓜、洋葱、姜及大部分的食用菌等罐藏制品、糖制制品、冷冻制品肉厚、可食部分大、耐煮性好、质地紧密、糖酸比适当，色香味好的种类和品种一般大多数的果品均可进行此类加工制品的加工果酱类含有丰富的果胶物质、较高的有机酸含量、风味浓、香气足水果中的山楂、杏、草莓、苹果等，蔬菜类的番茄等果品汁制品、果酒制品汁液丰富，取汁容易，可溶性固形物高，酸度适宜、风味芳香独特，色泽良好及果胶含量少的种类和品种葡萄、柑橘、苹果、梨、菠萝、番茄、黄瓜、芹菜、大蒜、胡萝卜及山楂等表23-1 原料选用加工制品种类加工原料特性果品原料种类腌制品一般应以水分含量低、干物质较多、内质厚、风味独特、粗纤维少为好原料的要求不太严格，优良的腌制原料有芥菜类、根菜类、白菜类、榨菜、黄瓜、茄子、蒜、姜等表23-1 原料选用（续）-1通常将水果的成熟度分为3个阶段，即可采成熟度、加工成熟度和生理成熟度。可采成熟度是指果实充分膨大长成，但风味还未达到顶点。这时采收的果实，适合于贮运，经后熟方可达到加工的要求。加工成熟度是指果实已具备该品种应有的加工特征，又可分为适当成熟与充分成熟。根据加工类别不同而要求成熟度也不同。如制作果汁、果酒，要求原料充分成熟，色泽好，香味浓，酸低糖高，榨汁容易，吨耗率低。若用生的果品，则制品色淡，味酸，不易榨汁，澄清较困难。生理成熟度是指果实质地变软，风味变淡，营养价值降低，一般称这个阶段为过熟。这种果实除了可做果汁和果酱外，一般不适宜加工其他产品。另外，蔬菜收获期也要适时，收获太晚，蔬菜组织疏松，粗纤维增多，水分含量高，可溶性固形物含量下降。收获过早，组织太细嫩，营养物质积累不多，且影响产量。加工原料越新鲜，加工的品质越好，损耗率也越低。因此，从原料采收到加工时间应尽量缩短，这就是加工厂要建在原料基地附近的原因。果品蔬菜多属于易腐农产品，某些原料如葡萄、草莓及番茄等，不耐重压，易破裂，极易被微生物侵染，给以后的消毒杀菌带来困难。这些原料在采收、运输过程中，极易造成机械损伤，若及时进行加工，尚能保证成品的品质，否则这些原料严重腐烂，导致失去加工价值或大量损耗。如蘑菇、芦笋要在采后2～6h内加工；青刀豆、蒜薹不得超过1～2d；大蒜、生姜采后3～5d；甜玉米采后30h，就会迅速老化，含糖量下降近50%，淀粉含量增加，水分也大大下降，影响加工品的质量。而水果如桃采后若不迅速加工，果肉会迅速变软，因此要求在采后1d内进行加工;葡萄、杏、草莓及樱桃等必须在12h内进行加工;柑橘、梨、苹果应在3～7d内进行加工。总之，果品蔬菜要求从采收到加工的时间尽量短，如果必须放置或进行远途运输，则应采用一系列的贮藏措施。以各种新鲜果品蔬菜为原料，制成各种各样的加工制品，虽然不同的加工制品有不同的制作工艺，但在各类果品加工制品中对原料的选剔分级、洗涤、去皮、去心、破碎等处理方法，均有共同之处，可统称为常规处理法。另外，根据加工原料的特性不同和制品的特殊要求不同在制作工艺中通常还采用热烫处理、硬化处理、护色处理等方法。原料进厂后首先要对原料进行分类分级，即要剔除霉烂及病虫害果实，对残、次及机械损伤类原料要分别加工利用。然后再按形态的大小、成熟度及色泽等标准进行分级。原料的合理分级，不仅便于操作，提高生产效率，更为重要的是可以保证提高产品质量，得到均匀一致的产品。目的是洗去果品蔬菜表面附着的灰尘、泥沙和大量的微生物及部分残留的化学农药，保证产品清洁卫生。洗涤用水，除制果脯和腌渍类原料可用硬水外，其他加工原料最好使用经软化后的水。水温一般是常温，有时为增加洗涤效果，可用温热水，但温热水不适宜柔软多汁、成熟度高的原料。原料如有残留农药，还须用化学药剂洗涤。一般常用的化学药剂有0.5%～1.5%盐酸溶液，0.1%高锰酸钾或600mg/kg漂白粉液等。在常温下浸泡数分钟，再用清水洗去化学药剂。洗涤根据各种原料被污染程度、耐压耐摩擦的程度，以及表面形状的不同，采用不同的洗涤方法，有人工洗涤方法和机械洗涤方法。果品去皮是一个细致的工艺操作，其常用方法主要是手工法、半机械法，另外还有碱液法、热力法和真空去皮法、酶制剂去皮法、冷冻去皮法等。(1)手工去皮。手工去皮法应用较广泛，操作简单、细致、彻底，但效率低。(2)半机械去皮。对有一定强度并且外观呈圆形状的原料，大批量的生产常用旋皮机，将待去皮的原料插在能旋转的插轴上，靠近原料的旁边安上一把刀口弯曲的刀，刀柄由弹簧(或手)控制，使刀口紧贴在果体面上，插轴旋转时，刀就从旋转的果体表面上将皮削去。旋皮机的转动有手摇的、足踩的和电动的。去皮效率虽较快，但去皮不完全，还需加以修整，去皮损失率也较高。(3)碱液去皮。将果品在一定浓度和温度的强碱液中处理适当的时间，果皮即被腐蚀，取出后立即用清水冲洗或搓擦，果皮即脱落，并洗去碱液。此法适用于桃、李、杏、梨、苹果等去皮及橘瓣脱囊衣。常用的碱液为氢氧化钠或氢氧化钾溶液，亦可用碳酸钠加石灰的办法制成碱液。(4)热力去皮。果品在高温短时间的作用下，使其表面迅速受热，果皮膨胀破裂,果皮和果肉之间的果胶失去胶凝性，果皮与果肉分开。此法用于桃、杏、枇杷、番茄等薄皮果实的去皮。热去皮要求果实的成熟度要高。(5)冷冻去皮。将果品与冷冻装置的冷冻表面接触片刻，使其外皮冻结于冷冻装置上，当果品离开时，外皮即被剥离。冷冻装置的温度在-28～-23℃,这种方法可用于桃、杏、番茄等去皮。体积较大的果品原料在罐藏、干制、果脯、蜜饯加工及蔬菜腌制时，为加工成适当的形状，需要进行切分，切分的形状则根据原料自身的形态和产品的标准而定。核果类加工前需去核，仁果类需去心。枣、梅等加工蜜饯时为了煮透需划缝、刺孔。罐藏加工时为了保持良好的形状外观，需对果块在装罐前进行修整。热烫处理通常又称为烫漂。除供蔬菜腌制的原料外，供作糖制、干制、罐藏、制汁及冻藏等原料，大多需要进行烫漂处理。所谓烫漂就是已切分的新鲜原料在温度较高的热水、沸水或常压蒸汽中加热处理。一般所用的水温为沸点或接近沸点，个别组织很嫩的蔬菜如菠菜，为了保持其绿色可采用76℃的温度。烫漂时间随原料的种类而异，一般为2～10min。烫漂后必须立即用冷水浸漂，以防止余热持续作用。所谓硬化处理是指一些果品制品，要求具有一定的形态和硬度，而原料本身又较为柔软、难以成形、不耐热处理等，为了增加制品的硬度，常将原料放入石灰、氯化钙等稀溶液中浸泡。因为钙、镁等金属离子，可与原料细胞中的果胶物质生成不溶性的果胶盐类，从而提高制品的硬度和脆性。硬化剂的用量要适当，过少起不到硬化作用；过多则会使产品粗糙，质量低劣。常用的硬化剂有石灰水和氯化钙。一般进行石灰水处理时，其浓度为1%～2%，浸泡1～24h;用氯化钙处理时，其浓度为0.1%～0.5%。经过硬化处理的果品，必须用清水漂洗6～12h。果品原料去皮和切分之后，放置于空气中，很快会变成褐色，这一现象称之为褐变。发生褐变不仅影响外观，也破坏了产品的风味和营养价值，而且是加工品败坏不能食用的标志。一般护色措施均从排除氧气和抑制酶活性两方面着手，主要的处理方法如下。(1)热烫。将去皮切分的原料，迅速用沸水或蒸汽热烫3～5min，从而达到抑制酶的活性，即可防止酶褐变。热烫后取出迅速冷却，热处理的最大缺点是可溶性物质的损失，一般损失10%～30%，蒸汽处理损失较小。(2)食盐水。食盐溶于水中后，能减少水中的溶解氧，从而可抑制氧化酶系统的活性，食盐溶液具有高的渗透压也可使细胞脱水失活。食盐溶液浓度愈高，抑制效果愈好。工序间的短期护色，一般采用1%～2%的食盐溶液即可，浓度过高，会增加脱盐的困难。为了增进护色效果，还可以在其中加入0.1%柠檬酸。食盐溶液护色常在制作水果罐头和果脯中使用。同理，在制作果脯、蜜饯时，为了提高耐煮性，也可用氯化钙溶液浸泡，因为氯化钙既有护色作用，又能增进果肉硬度。(3)酸性溶液。酸性溶液既可降低pH值、降低多酚氧化酶活性，又使氧气的溶解度较小而兼有抗氧化作用，从而抑制氧化酶的活性。而且，大部分有机酸还是果品的天然成分，所以优点甚多。常用的酸有柠檬酸、苹果酸或抗坏血酸等。生产上多采用柠檬酸，浓度在0.5%～1%。(4)亚硫酸溶液。二氧化硫能与有机过氧化物中的氧化合，使其不生成过氧化氢，从而使过氧化酶失去氧化作用。浸泡溶液中二氧化硫含量为1×10-6mg/kg时，能降低褐变率20%，二氧化硫含量为10×10-6mg/kg时，完全不变色。此法对于各种加工原料工序间的护色都适用。(5)抽真空处理。某些果品如苹果、番茄等内部组织较疏松，含空气较多(表23-2)，对加工特别是罐藏或制作果脯不利，需进行抽真空处理，即将原料在一定的介质里置于真空状态下，使内部空气释放出来，代之以糖水或无机盐水等介质的渗入。从而抑制氧化酶的活性，防止酶褐变。常用的介质有糖水、食盐、柠檬酸等。种类含量（%，以体积计）种类含量（%，以体积计）桃3～4梨5～7番茄1.3～4.1苹果12～29杏6～8樱桃0.5～1.9葡萄0.1～0.6草莓10～15表23-2 几种果品组织中的空气含量