玉米矮花叶病（Maize Dwarf Mosaic）和玉米粗缩病（Maize Rough Dwarf）是近十几年来为害我国玉米生产的两种主要病毒病害[1]。自20世纪90年代以来，玉米矮花叶病、粗缩病在山西流行严重[1，2，5]，给玉米生产带来很大损失，特别是1994～2000年连续严重发生的玉米矮花叶病和粗缩病，使山西省运城、临汾等地的晚播玉米颗粒无收，夏玉米因病害减产30%以上[2]。1998年全省发病面积45万hm2，占玉米种植面积的52%，全省损失粮食5亿多kg[3]。大面积种植感病品种是病害流行的重要原因。改良山西省常用玉米自交系和杂交种对病毒病的抗性，已成为玉米生产和育种单位急待解决的问题[3，7]。国内外研究表明：不同的玉米自交系和杂交种对玉米病毒病的抗性有明显差异[4]。选育和种植抗病品种是防治玉米矮花叶病和粗缩病最经济有效的措施[3，6，7]。本研究皆在通过田间自然发病初选，人工接种，病圃重复鉴定，筛选出对两种玉米病毒病具有抗性的种质资源。为有效地开展玉米抗病毒病育种提供参考依据。供试玉米种质资源材料共915份，其中常用玉米自交系276份，杂交种及新组合181份，热带改良新选系458份。热带改良新选系由本所种质改良课题组提供，其余的玉米资源由省内有关育种单位和种子公司提供。1.2.1 田间自然发病鉴定初选 田间自然发病鉴定初选：2001年和2002年对全部材料分2年在山西省玉米病毒病发生严重的地区运城、临汾和太谷3个点同时进行。每份材料种植2行，每行50株，行长15m，株行距0.3m×0.65m。以自然发病为主，授粉1～2周后调查病株率，发病率在15%以上的视为不抗病。对这批材料将不进行抗病复选。1.2.2 人工接种重复鉴定复选 2003～2004年，对经过田间初选的抗病材料同时进行矮花叶病人工接种和粗缩病自然重复鉴定。病圃设在山西省农业科学院小麦研究所实验场（临汾市区），历年发病较重的固定地块。供试材料田间顺序排列，每份材料种植2行，每行25株，行长7.5m，株行距0.3m×0.6m。玉米矮花叶病人工接种方法：采用蚜虫接种法，设自交系黄早4（R），Mo17（S）为抗、感对照种。玉米粗缩病重复鉴定方法：采用田间自然接种法，鉴定圃四周全部种植冬麦，利用灰飞虱发生规律，调节玉米播期（5月中旬）使幼苗与成虫羽化高峰期吻合，以达到传毒最佳效果，设自交系沈137（R），478（S）为抗、感对照品种。玉米授粉半个月后调查病情。玉米矮花叶病病株分级标准参照吴全安的方法[11]。即：0级全株无症状；1级，植株上部叶片1%～3%显症，有褪绿斑花叶；2级，植株中部叶片，1%～30%显症，植株略矮；3级，植株严重发病，2/3的叶片呈现花斑条纹，果穗弯小或不结实。病情指数按以下公式计算：依据病情指数划分抗病类型，0～5.0高抗（HR）；5.1～15.0抗病（R）；15.1～30.0中抗（MR）；30.0以上感病（S）。玉米粗缩病病害分级标准参照陈巽珍分级标准[8]，即：0级，健株，全株无症状；1级，比健株矮1/5，雄穗轴稍短；2级，比健株矮1/2，顶部略丛生，果穗长度为健株的1/2；3级，株高为健株的1/3，顶部叶小，上冲，穗小多畸形；4级，苗株死亡或极矮小，顶叶上冲丛生，绝收。病情指数计算公式同前。依据病情指数，划分抗病类型，0～5.0高抗（HR）；5.1～20.0抗（R）；20.1～40.0感（S）；40.1以上高感（HS）。2001～2002年，对915份玉米自交系和杂交种在重病区进了田间自然发病鉴定初选，淘汰了感病材料208份。2002～2004年，对初选的912份材料（自交系537份，杂交种142个），进行了矮花叶病、粗缩病人工接种，病圃重复鉴定。鉴定筛选结果见表1、表2和表3。种质类型Germplasmtype鉴定数量No高抗highResistant抗Resistant感Susceptible高感HighsusceptibleNo%No%No%No%自交系Inbredlines734253.411816.125334.533846.0杂交种Hybrids181168.96938.15832.03821.0合计Total915414.518720.431134.037641.1Table 1 Results of indentification for resistance of maize inbred lines and hybrids to SCMV-MDB种质类型Germplasmtype鉴定数量No高抗highResistant抗Resistant感Susceptible高感HighsusceptibleNo%No%No%No%自交系Inbredlines734334.512917.634547.022730.9杂交种Hybrids1812916.05128.26636.53619.9合计Total915626.817919.641144.926328.7Table 2 Results of indentification for resistance of Maize inbred lines and hybrids to MRDV种质类型Germplasmtype鉴定数量No双高抗双抗DoublehighNoResistant%DoubleNoResistant%自交系Inbredlines73470.967510.2杂交种Hybrids18195.05027.6合计Total915161.7512613.8Table 3 Results of indentification for resistance of Maize inbred lines and hybrids to SCMV-MDB and MRDV表1表明经过人工接病鉴定：筛选出抗矮花叶病自交系118份，占自交系鉴定总数的16.1%，杂交组合69个，占杂交种鉴定总数的38.1%，优良高抗病自交系有25份，占自交系鉴定总数的3.4%，它们是：选9、齐31、93选2、假B734、选78、选7、选141、选127、选301、选145、选151、选250、5081、改84-2、改99-1、改100-1、改113-1、改100-2、改474-1、改418-1、改377、改403、改426、沈137、99-5。表现为高抗病的杂交种有16个，占杂交种鉴定总数的8.9%，它们是：长单39、长单40、忻抗7号、太早单18号、98-1×5081、并单3号、齐319×98-3、并单4号、422×齐35、B734×93选2、H9-21×临京11-2、农大108、忻玉106、忻单108、晋单36、鲁单50。表2结果表明：供鉴定材料中，抗粗缩病自交系有129份，占自交系鉴定总数的17.6%；杂交种50份，占杂交种鉴定总数的27.6%；高抗病自交系有33份，占自交系鉴定总数的4.5%。它们是：选29、选41、选114、选125、选214、齐31、齐35、93选2、假B734、选331、选78、选184、选159、R选3、选50、选59、选2-2、选11-1、选46-2、选121-1、选132-1、选155-1、R10-2、R49-1、选90-3、海选36、改357-1、改474-1、改418、改408、改427、98-2、98-3。高抗病杂交种29个，占杂交种鉴定总数的16.0%，它们是：B734×93选2、422×齐35、并单4号、陕单971、新陕单1号、鉴35、齐31×98-3、并单3号、陕高农5号、临油1号、忻玉106、长单40、屯9902、同单4号、同早5号、春早单3号、运早1号、FL2、晋玉681、早利26、京单958、太早单20、太早单21、早玉2号、早玉4号、LD981、运单14、H9-2×临京11-2、H9-2×临京11-3。通过表3可以看出：被鉴定材料中，对两种病毒病同时都表现为抗病的自交系有75份，占自交系鉴定总数的11.6%，如：选41、选125、选214、齐35、选331选159、选50、选7、选141、选31、选211、选87、选14、选217、选301、选186、选102、选145、选151、选153、选250、改2-2、改11-1、改132-1、改155-1、R49-1、选90-3、海选36、改15-2、改16-2、改29-2、改50-2、改99-1、改100-1、改102-2、改111-2、改113-1、改116-1、改125-1、改134-2、改170-2、改357-1、改474-1、改418、改408、改427、改377、改403、改426、改404、改476、改406、改407、改416、改419-1、改420、改422、改430、改432、改433、改440等。双抗杂交种51个，占杂交种鉴定总数的29.8%，如：陕单971、新陕资1号、鉴35、陕单931、98-1×5081、4-18、临油1号、忻玉106、选66×308-2、忻5344、忻玉105、长单39、屯单9901、屯9902、屯9906、京玉8号、春早单1号、春早3号、太单早18、太单23、太单32、早利26、协玉2号、运单13号、晋玉681、晋玉751、科试7号、沈单10号、早玉3号、早玉2号、并单1号、太早单20、高油115、忻玉9704、忻抗13、LD981、DH3801、强盛17、并单2号、同单36号等。对两种病毒病同时都表现为高抗的材料共16份，占鉴定总数的1.96%，其中双高抗自交系有选29、齐31、93选2、假B734、选78、改474-1、改418，共7份，占自交系鉴定总数的1.1%。双高抗病杂交种有B734×93选2、422×齐35、并单4号、齐31×98-3、并单3号、陕高农5号、长单40号、H9-21×临京11-2、忻玉106，共计9个，占杂交种鉴定总数的5.3%。杂交种抗矮花叶病的比例为38.1%，自交系的为16.1%；杂交种抗粗缩病的比例为28.2%，自交系的为17.6%；杂交种同时抗这两种病毒病的比例为27.6%，自交系的为10.2%；杂交种同时高抗这两种病毒病的比例为5.0%，自交系的为0.96%；通过对杂交种和自交系材料抗病性比较，可以看出杂交种抗病的比例远高于自交系的。从表4看出被鉴定热带亚热带玉米改良自交系中，对两种病毒病同时都表现为抗病的有59份，占热带改良系鉴定总数的12.9%；对两种病毒病同时都表现为高抗的有5份，占热带改良系鉴定总数的1.1%。而国内温带自交系对两种病毒病同时都表现为抗病的有16份，占国内温带自交系鉴定总数的5.8%；对两种病毒病同时都表现为高抗的仅2份，占国内温带自交系鉴定总数的0.7%。从而可以看出热带亚热带玉米改良自交系抗病比例远远大于国内温带系。种质类型Germplasmtype鉴定数量No双高抗双抗DoublehighNoResistant%DoubleNoResistant%自交系Inbredlines73470.967510.2热带改良系Tropicalinbredlines45851.15912.9国内温带系Chinatemperate'sinbredlines27620.7165.8Table 4 Results of indentification for resistance of Tropical and China temperate's inbred lines to SCMV-MDB and MRDV采用蚜虫接种法，重病区病圃自然发病重复鉴定法，4年来，对816份不同类型玉米种质资源进行了玉米矮花叶病、粗缩病的抗病性鉴定。筛选出同时抗两种病毒病的自交材料75份，杂交种51个；双高抗病优良自交系7份；双高抗病杂交种9个；为玉米抗病毒病育种提供了一批抗病材料，为玉米生产上应用抗病品种提供了科学依据。在鉴定材料中双抗病材料所占比例较小，同时高抗两种病毒病的材料所占比例更小，鉴定材料的抗病性与其来源关系密切，不同的种质材料对两种玉米病毒病的抗病性有明显差异，杂交种和杂交组合的抗病性比例明显优于自交系；不同来源自交系的抗病性差异更大。利用热带、亚热带玉米种质改良的新选自交系，抗病比例远远高于没有热带血缘的常规系，这说明热带、亚热带玉米种质资源中有优良的抗病毒病基因，是改良我国温带玉米种质病毒病抗性的很有利用前景的抗源种质。本研究采用的矮花叶病蚜虫接种法，是我国多年来传统接种的方法，虽然由于养蚜、饲毒等工作量较大，但不失为一种可靠性强的接种方法。粗缩病的抗性鉴定方法国内现在一直采用田间自然发病鉴定方法，试验选择了利于病毒病发生的试验环境，把鉴定点设在山西省发病严重的地块进行，并进行了重复鉴定，使鉴定结果有了更强的可靠性。

绿盲蝽Lygocoris lucorum(Meyer-Dur.)，又名花叶虫，属半翅目，盲蝽科。寄主植物多，可为害果树、蔬菜、棉花、苜蓿等多类作物，是棉花上的重要害虫。近年来，随着农业产业结构的调整，葡萄种植面积的扩大，绿盲蝽在葡萄上的为害日益严重，已成为葡萄上的重要害虫之一。绿盲蝽分布广泛，全国各地均普遍发生。国外分布于日本、欧洲、美国等地。绿盲蝽以成、若虫刺吸为害葡萄的幼芽、嫩叶、花蕾和幼果，刺的过程分泌毒汁，吸的过程吸食植物汁液，造成受害部位细胞坏死或畸形生长。葡萄嫩叶被害后，先出现枯死小点，随叶芽伸展，小点变成不规则的多角形孔洞，俗称“破叶疯”(彩图9-1-1)；花蕾受害后即停止发育，枯萎脱落；受害幼果粒初期表面呈现不很明显的黄褐色小斑点，随果粒生长，小斑点逐渐扩大，呈黑色，受害皮下组织发育受阻，渐趋凹陷，严重的受害部位发生龟裂，严重影响葡萄的产量和品质。卵：长约1毫米，黄绿色，长口袋形，卵盖奶黄色，中央凹陷，两端突起，无附属物。若虫：若虫共5龄，初孵时绿色，复眼桃红色。5龄若虫全体鲜绿色，触角淡黄色，端部色渐深，复眼灰色。翅芽尖端蓝色，达腹部第4节(彩图9-1-2、彩图9-1-3)。成虫：体长约5毫米，雌虫稍大，体绿色。复眼黑色突出。触角4节丝状，较短，约为体长2/3，第2节长等于第3、第4节之和，向端部颜色渐深，1节黄绿色，4节黑褐色。前胸背板深绿色，有许多黑色小刻点。小盾片三角形微突，黄绿色，中央具1浅纵纹。前翅膜片半透明暗灰色，余绿色。1年发生3～5代，主要以卵在各种果树树皮内、芽眼间、枯枝断面，棉花枯断枝茎髓内及杂草或浅层土壤中越冬。翌年3—4月越冬卵开始孵化，越冬代卵孵化期较为整齐，4月下旬，葡萄萌芽后即开始为害，5月上中旬展叶盛期为为害盛期，5月中下旬幼果期开始为害果粒，5月下旬后气温渐高，虫口渐少。第1、第2、第3、第4代分别出现在6月上旬、7月中旬、8月中旬、9月中旬，世代重叠现象严重，主要转移到豆类、玉米、蔬菜等作物上为害。9月下旬至10月上旬产卵越冬。成虫飞翔能力强，若虫活泼，白天潜伏，稍受惊动，迅速爬迁，白天不易发现。主要于清晨和傍晚在芽、嫩叶及幼果上刺吸为害。这就是只看到破叶、看不到虫子的原因。成虫寿命较长，30～40天，羽化后6～7天开始产卵，产卵期可持续20～30天，且产卵一般具有趋嫩性，多产于幼芽、嫩叶、花蕾和幼果等组织内，但越冬卵大多产于枯枝、干草等处。绿盲蝽发生与气候条件密切相关，其喜温暖、潮湿环境，高湿条件下，若虫活跃，生长发育快，雨多的年份，发生较重。气温20～30℃、相对湿度80%～90%最易发生为害。近年来5月上中旬气温、湿度条件适合，是造成绿盲蝽发生严重的主要原因之一。绿盲蝽食性杂，但以前只在牧草、棉花上危害严重，近些年随着农业结构的调整，特别是大面积推广种植转基因抗虫棉以来，由于抗虫棉生长前期抗虫性较好，棉田化学农药使用次数减少，有利于绿盲蝽的发生和繁衍，虫源基数逐年增加，使其逐渐成为葡萄、枣树、苹果及蔬菜等多种作物上的重要害虫。葡萄园内或周围种植棉花、牧草、枣树、豆科作物等喜食植物，对其早春食物衔接、养分补充提供了有利条件，有利于其种群发生。绿盲蝽天敌种类较多，卵寄生蜂有点脉缨小蜂、盲蝽黑卵蜂、柄缨小蜂。捕食性天敌有花蝽、草蛉、姬猎蝽、蜘蛛等。自然条件下对其有较强的控制作用。（1）清理越冬场所。在葡萄越冬前（北方埋土防寒前），清除枝蔓上的老粗皮、剪除有卵剪口、枯枝等。（2）及时清除葡萄园周围棉田中的棉柴、棉叶，清除树下及田埂、沟边、路旁的杂草及刮除四周果树的老翘皮，剪除枯枝集中销毁。减少、切断绿盲蝽越冬虫源和早春寄主上的虫源。（3）葡萄生长期间及时清除果园内外杂草，及时进行夏剪和摘心，消灭其中潜伏的若虫和卵。每4公顷果园悬挂1台频振式杀虫灯，利用绿盲蝽成虫的趋光性进行诱杀。（1）统一防治。绿盲蝽具有很强的迁移性，一家一户防治效果不理想，要根据预测预报发动村民统一防治，有条件的乡（镇）、村要成立机防专业队，做到统一时间、统一用药、统一行动。（2）适宜的防治时机。绿盲蝽具有昼伏夜出习性，成虫白天多潜伏于树下，沟旁杂草内，多在夜晚和清晨为害。所以，喷药防治要在傍晚或清晨进行以达到较好的防治效果。（3）注意保护利用天敌。绿盲蝽的自然天敌种类多，在进行化学防治时，要以保护天敌为前提，尽量选用对天敌毒性小的新烟碱类杀虫剂。（4）早春葡萄芽前，全树喷施一遍3波美度的石硫合剂，消灭越冬卵及初孵若虫。越冬卵孵化后，抓住越冬代低龄若虫期，适时进行药剂防治。常用药剂有：吡虫啉、啶虫脒、马拉硫磷、溴氰菊酯、高效氯氢菊酯等。连喷2～3次，间隔7～10天。喷药一定要细致、周到，对树干、地上杂草及行间作物全面喷药，做到树上、树下，喷严、喷全，以达到较好的防治效果。葡萄透翅蛾(Paranthrene regalis Butler)，属鳞翅目，透翅蛾科。主要为害葡萄，也可为害苹果、梨、桃、杏、樱桃等，是葡萄生产上的主要害虫之一。葡萄透翅蛾分布较广，国内广泛分布于辽宁、吉林、内蒙古自治区、河北、天津、山西、河南、山东、江苏、浙江、安徽、陕西及四川等葡萄产区；国外分布于日本、朝鲜。幼虫为害葡萄嫩枝及1～2年生枝蔓，初龄幼虫蛀入嫩梢，蛀食髓部，使嫩梢枯死。幼虫长大后，转到较为粗大的枝蔓中为害，被害部肿大呈瘤状，蛀孔外有褐色粒状虫粪，枝蔓易折断，其上部叶变黄枯萎，果穗枯萎，果实脱落(彩图9-2-1)。轻者树势衰弱，产量和品质下降；重者致使大部枝蔓干枯，甚至全株死亡。成虫：体长18～20毫米，翅展30～36毫米，体蓝黑色至黑褐色，触角黑紫色，头顶、颈部、后胸两侧、下唇须第3节橙黄色。前翅红褐色，前缘、外缘及翅脉黑色，后翅半透明，前后翅缘毛均为紫色。腹部有3条黄色横带，分别在第4、第5节及第6节，以第4节横带最宽，第6节后缘次之，第5节上的最细。雄蛾腹末两侧各有1长毛束。卵：长1.1毫米，椭圆形，略扁平，紫褐色。幼虫：体长25～38毫米，全体略呈圆筒形。头部红褐色，胸腹部淡黄白色，老熟时淡紫红色，全体疏生细毛。前胸盾具倒“八”字纹，胸足淡褐色，围气门片褐色(彩图9-2-2)。蛹：体长约18毫米，红褐色。腹部2～6节背面各有2横列刺，7～8节各有1横列刺。末节腹面亦有1横列刺。1年发生1代，以老熟幼虫在被害枝蔓里越冬。翌年4月下旬至5月上旬幼虫开始活动，在越冬处的枝条里咬一个圆形羽化孔，后吐丝作茧化蛹。蛹期10天左右，5月中旬至6月羽化，一般成虫羽化盛期和葡萄开花盛期相一致。成虫羽化后即可开始交配、产卵，雌雄虫一生只交尾一次。成虫飞翔力强，白天活动。卵多产在直径0.5厘米以上的新梢上，产于叶腋、叶片、果穗、卷须、嫩芽等处，但以叶腋和叶片最多。卵多散产，个别有2～4粒在一处的，1头雌虫一生平均产卵79～91粒，卵期10天。初孵幼虫多从叶柄基部侵入嫩梢，蛀孔处呈紫红色。幼虫蛀入枝蔓后，先向枝蔓先端蛀食，致使蔓梢很快枯死。此后转向枝蔓基部方向蛀食，受害部位呈现膨肿状或形成瘤状突起，受害处上部叶片变黄，果实脱落。幼虫可进行2～3次转移为害，越冬前转移到2年及以上生枝蔓蛀食为害，遇震动或风吹时常造成折断或枝蔓枯死，9—10月以老熟幼虫越冬。随树龄增加株蛀害率加重。因为成虫喜欢在长势旺盛、枝叶茂密的植株上产卵，随树龄增加，主干增粗，枝梢生长旺盛，营养丰富，为害加重。同一品种，不同生育期，受害不同。从萌芽生长期开始为害，以开花期和浆果期受害最重，浆果成熟采收期，为害逐渐减轻。调查发现该虫蛹的寄生蜂有松毛虫黑点瘤姬蜂，幼虫期和蛹期有白僵菌寄生。（1）冬、春季剪除虫枝。修剪时结合冬季修剪，认真剪除虫枝，予以烧毁。春季萌芽期再细心检查，凡枝蔓不萌芽或萌芽后萎缩的，虫枝应及时剪除，以消灭越冬幼虫，降低虫源。（2）生长季节，幼虫孵化蛀入期间，发现节间紫红色的先端嫩梢枯死，或叶片凋萎，或先端叶边缘干枯的枝蔓均为被害枝蔓，及时剪除。7、8月以后，发现有虫粪的较大蛀孔，可用铁丝从蛀孔刺死或钩杀幼虫。（1）药液注射。用注射针筒向幼虫排粪孔内注入80%敌敌畏乳油100倍液或2.5%敌杀死乳油200倍液，然后用湿泥封口。（2）卵孵化高峰喷施化学药剂。种类有：三唑磷、辛硫磷、三氟氯氰菊酯、高效氯氢菊酯等，1年只需施药1次就能消除葡萄透翅蛾的危害。又名远东盔蚧、扁平球坚蚧等。属同翅目，蚧总科，坚蚧科。是果树和林木的重要害虫。主要寄主有桃、杏、苹果、梨、山楂、核桃、葡萄、刺槐、国槐、白蜡、合欢等，其中以葡萄、桃、刺槐受害最重。东方盔蚧在我国分布广泛，主要分布在河北、河南、山东、山西、江苏、青海等葡萄产区。以雌成虫、若虫为害葡萄枝干、叶片和果实(彩图9-3-1、彩图9-3-2)。雌成虫和若虫附着在枝干、叶和果穗上刺吸汁液，并排出大量黏液，招致霉菌寄生，表面呈现烟煤状，严重影响叶片的光合作用，枝条严重受害后枯死，果面被污染，造成树势衰弱，使产量和品质受到严重影响。雌成虫：黄褐色或红褐色，扁椭圆形，体长3.5～6.0毫米，体宽3.5～4.5毫米，体背中央有4纵排断续的凹陷，凹陷内外形成5条隆脊。体背边缘有横列的皱褶排列较规则，腹部末端具臀裂缝。卵：长椭圆形，淡黄白色，长径0.5～0.6毫米，短径0.25毫米，近孵化时呈粉红色，卵上微覆蜡质白粉。若虫：初龄若虫扁椭圆形，长径0.3毫米，淡黄色。触角和足发达，具有一对尾毛。3龄若虫黄褐色，形似雌成虫。越冬2龄若虫体赭褐色，椭圆形，上下较扁平，体外有1层极薄的蜡层，虫体周边锥形刺毛达108条。东方盔蚧在葡萄上每年发生2代，以2龄若虫在枝蔓的裂缝、叶痕处或枝条的阴面越冬。翌年4月葡萄出土后，随着气温升高越冬若虫开始活动，爬至1～2年生枝条或叶上为害。4月上旬虫体开始膨大并蜕皮变为成虫，4月下旬雌虫体背膨大并硬化，5月上旬开始产卵在体下介壳内，5月中旬为产卵盛期，通常孤雌生殖，每雌产卵1400～2700粒，卵期20～30天。5月下旬至6月上旬为若虫孵化盛期，若虫爬到叶片背面固定为害，少数寄生于叶柄。6月中旬蜕皮为2龄若虫并转移到当年生枝蔓、穗轴、果粒上为害，7月上旬羽化为成虫。7月下旬至8月上旬产卵，第2代若虫8月孵化，中旬为盛期，仍先在叶上为害，9月蜕皮为2龄后转移到枝蔓越冬。此虫在红玫瑰、金后、红鸡心、龙眼上发生严重。该虫的捕食性天敌有黑缘红瓢虫、小红点瓢虫等，黑缘红瓢虫是其主要天敌，1头黑缘红瓢虫一生可食2000余头东方盔蚧个体。田间寄生蜂的寄生率一般可达10%。（1）杜绝虫源。注意不要采用带虫接穗，苗木和接穗出苗圃要及时采取处理措施。果园附近防风林，不要栽植刺槐等寄主林木。（2）冬季清园。在葡萄埋土防寒前，清除枝蔓上的老粗皮，减少越冬虫口基数。春季发芽前喷3～5波美度石硫合剂或3%～5%柴油乳剂，消灭越冬若虫。（3）保护和利用天敌。少用或避免使用广谱性农药，以减少对黑缘红瓢虫等天敌的杀伤。（4）生长季药剂防治。要抓住两个防治关键：一是4月上中旬，虫体开始膨大时；二是5月下旬至6月上旬第1代若虫孵化盛期。发生严重果园于6月下旬加施一次。常用药剂：吡虫啉、啶虫脒、杀扑磷、苯氧威、吡蚜酮、毒死蜱等喷雾防治。喷药时加入渗透剂，可提高防治效果。据资料记载，为害葡萄的粉蚧类有四种：葡萄粉蚧(Grape mealbug)(Pseudococcus maritimus)、康氏粉蚧(Comestock mealybug)(Pseudococcus comstocki)、暗色粉蚧(Obscure mealbug)(Pseudococcus viburni)、长尾粉蚧(Longtailed mealybug)(Pseudococcus longispinus)。国家葡萄产业技术体系病虫害防控研究室正在对来自全国采集到的标本进行鉴定。以康氏粉蚧、葡萄粉蚧为例，介绍粉蚧类害虫。康氏粉蚧Pseudococcus Comstocki(Kuwana)康氏粉蚧属同翅目，粉蚧科，又名梨粉蚧。食性很杂，除为害葡萄外，还为害苹果、梨、山楂、桃、李、杏、樱桃、梅、板栗、核桃、柿、枣等多种果树及桑、杨、柳及蔬菜等多种植物。国内分布于吉林、辽宁、河北、北京、河南、山东、山西、四川等省、直辖市。以雌成虫和若虫刺吸嫩芽、嫩叶、果实、枝干的汁液。嫩枝受害后，被害处肿胀，严重时造成树皮纵裂而枯死。果实被害时，造成组织坏死，出现大小不同的褪色斑点、黑点或黑斑，为害处该虫所产白色棉絮状蜡粉等污染果实；排泄蜜露到果实、叶片、枝条上，造成污染，湿度大时蜜露上产生杂菌污染，形成煤污病；有煤污病的果实彻底失去食用和利用价值。粉蚧对葡萄造成的伤害不是特别严重，但危害和损失巨大(彩图9-3-3、彩图9-3-4)。成虫：雌成虫体长约5毫米，宽约3毫米，椭圆形，淡粉红色，被较厚的白色蜡粉。体缘具17对白色蜡刺，蜡丝基部粗向端渐细，体前端的蜡丝较短，向后渐长，最后1对最长，与体长接近。眼半球形，触角8节，足较发达疏生刚毛。雄成虫体长约1.1毫米，翅展2毫米左右，紫褐色，触角和胸背中央色淡，单眼紫褐色，前翅发达透明，后翅退化为平衡棒。尾毛较长。(彩图9-3-5)卵：椭圆形，长0.3～0.4毫米，浅橙黄色，附有白色蜡粉，产于白色絮状卵囊内。若虫：雌3龄，雄2龄，1龄椭圆形，长约0.5毫米，淡黄色，眼近半球形，紫褐色，体表两侧布满纤毛；2龄体长约1毫米，被白色蜡粉，体缘出现蜡刺；3龄体长约1.7毫米，与雌成虫相似。雄蛹：长约1.2毫米，淡紫褐色，裸蛹。茧体长2.0～2.5毫米，长椭圆形，白色絮状。康氏粉蚧1年发生3代，主要以卵在树体各种缝隙及树干基部附近土石缝处越冬，翌春葡萄发芽时，越冬卵孵化，爬到枝叶等幼嫩部位为害。第1代若虫盛发期为5月中、下旬，第2代为7月中、下旬，第3代为8月下旬。该虫第1代为害枝干，第2、第3代以为害果实为主。若虫发育期雌虫为35～50天，蜕皮3次即为雌成虫，雄虫为25～37天，蜕皮2次后化蛹，雄成虫羽化的时期，正值雌虫蜕第3次皮而为雌成虫，雌雄交尾。交尾后雄虫死亡，雌虫取食一段时间爬到枝干粗皮裂缝间、树叶下、枝杈处、果实上分泌卵囊，而后将卵产于卵囊内。每雌虫产卵200～400粒，以末代卵越冬。康氏粉蚧喜在阴暗处活动，套袋内是其繁殖为害的最佳场所，因此，套袋果园，树冠郁闭、光照差的果园发生较重。（1）冬春防治。果实采收后及时处理果园，将虫果、旧纸袋、落叶等集中烧毁或深埋。葡萄埋土防寒前（或出土上架时），清除枝蔓上的老粗皮，减少越冬虫口基数。春季发芽前喷3～5波美度石硫合剂或3%～5%柴油乳剂，消灭越冬卵和若虫。（2）生长季防治。生长期应抓住各代若虫孵化盛期，花序分离到开花前是防治第1代康氏粉蚧的关键时期，这是最重要的一次防治，因此要根据虫口密度适时用药1～2次。套袋前的防治非常重要；套袋后，康氏粉蚧有向袋内转移为害特点，所以套袋后3～5天是防治该虫的第3个最佳时期。药剂种类和用法同东方盔蚧。（3）土壤处理防治。在卵孵化期，根际施药，包括颗粒剂、片剂或药液土壤泼浇等。药剂一般使用具有内吸性的，如吡虫啉等。叶蝉是葡萄上的重要害虫，国内各葡萄产区普遍发生。为害葡萄的叶蝉主要有两种，即葡萄斑叶蝉Erythroneura apicalis(Nawa)(又名葡萄二星叶蝉或葡萄二点叶蝉)和葡萄二黄斑叶蝉Erythroneura sp.。属同翅目，叶蝉科。两种叶蝉在葡萄上常混合发生，除为害葡萄外，还为害桃、梨、苹果、樱桃、山楂等果树。葡萄斑叶蝉和葡萄二黄斑叶蝉主要分布在我国辽宁、北京、河北、山东、河南、湖北、安徽、江苏、浙江、陕西、甘肃、新疆等葡萄产区，尤其是管理粗放的果园发生严重。两种叶蝉在葡萄的整个生长期都能为害，以成、若虫群集于叶片背面刺吸汁液为害。一般喜在郁闭处活动取食，故为害时先从枝蔓中下部老叶和内膛开始逐渐向上部和外围蔓延。叶片受害后，正面呈现密集的白色失绿斑点，严重时叶片苍白、焦枯，严重影响叶片的光合作用、枝条的生长和花芽分化，造成葡萄早期落叶，树势衰退。所排出的虫粪污染叶片和果实，造成黑褐色粪斑，影响当年以至第2年果实的质量和产量。卵：初为乳白色，后变为黄白色，长椭圆形，稍弯曲，长约0.6毫米。若虫：体形似成虫，初为乳白色；老熟时黄白色，体长约2.0毫米(彩图9-4-1)。成虫：体长至翅端3.0～4.0毫米，体淡黄白色。头顶有2个明显的圆形黑色斑点，复眼黑色。前胸背板前缘有3个小黑点。小盾片前缘左右各有近三角形的黑色斑纹1个。前翅半透明，黄白色，有不规则的淡褐色斑纹。卵：和葡萄斑叶蝉卵相似。若虫：末龄若虫体长约1.6毫米，紫红色，触角、足体节间、背中浅淡黄白色。体略短宽，腹末几节向上方翘起。成虫：体长至翅端约3.0毫米。头顶前缘有2个黑褐色斑点，复眼黑或暗褐色。前胸背板中央具暗色纵纹，前缘有3个黑褐色小斑点。小盾片淡黄白色，前缘左右各有较大的黑色斑点1个。前翅表面暗褐色，后缘各有近半圆形的黄色斑纹2个，两翅合拢后在体背形成2个近圆形黄斑。成虫颜色有变化，越冬前为红褐色(彩图9-4-2)。(1)葡萄斑叶蝉。每年发生3～4代，以成虫在葡萄园的落叶、杂草下及附近的树皮缝、石缝、土缝等隐蔽处越冬。在华北地区，翌年成虫于3月中旬至4月上旬开始活动，先在园边发芽早的植物上为害，如苹果、梨、桃等，待葡萄展叶后即开始为害葡萄叶片。越冬成虫于4月中下旬产卵，5月中下旬若虫盛发。第1代成虫期在5月底至6月，第2、第3代成虫分别发生于6月下旬至7月、8月下旬至9月，后期世代重叠，10月下旬以后成虫陆续开始越冬。成、若虫多在叶背为害。雌成虫喜欢在成熟未老化的叶片上产卵，卵多产于叶背的叶脉上。在早晨、傍晚温度较低时，多潜藏于叶背面不活动，但中午阳光强烈时隐伏于叶背面避光处，活动取食高峰为7:00—9:00和18:00—20:00。成虫趋光性强，善飞蹦，受惊扰后即飞往他处。若虫受惊，则迅速爬行。(2)葡萄二黄斑叶蝉。生活史及习性和葡萄斑叶蝉相似。冬季气温偏暖对其越冬存活较为有利，春季开春早，气温回升快，夏季高温、干旱，极利于该虫繁殖。但葡萄园环境过于干旱，或植株叶片老化，可促使其迁飞扩散，种群数量下降。葡萄园内或周围种植杏树、桑树、杨树、榆树等，对其越冬及早春及时补充养分提供了有利条件，有利其种群发生。不同葡萄品种其发生为害程度也不同，一般叶片绒毛多的葡萄品种受害较轻，绒毛少的品种则受害重。该虫喜欢隐蔽的环境，一般通风透光差，修剪不好的葡萄园叶蝉为害较重。据调查，通风透光好的葡萄园百叶虫量最高为616头，通风透光差的葡萄园百叶虫量最高可达2390头。园内管理粗放，园内杂草丛生，有利其越冬及早春养分补充，为害严重。生长期有多种捕食性天敌，捕食能力强的主要为蜘蛛类，如丁纹豹蛛对葡萄斑叶蝉的日平均捕食量达5～7头。寄生性螨对葡萄斑叶蝉1、2龄的低龄若虫致死性较强。生长后期斑叶蝉卵常被寄生蜂寄生，寄生率可高达60%以上。（1）避免果园郁闭。合理修剪，改善架面通风透光条件及合理负载。生长期及时除萌、抹芽和打副梢，减少下部叶片，使葡萄枝叶分布均匀，通风透光，可减少叶蝉发生为害。（2）树种合理布局。果园内部和周围不种桃、梨、苹果、樱桃、山楂等果树及桑树、杨树、榆树等林木，以减少生长季节和越冬期的中间寄主。（3）清洁田园。生长期及时清除杂草，创造不利于其发生的生态条件。秋后彻底清除田间地头落叶和杂草，集中烧毁或深埋，消灭其越冬场所，能显著减少虫害基数。该虫对黄色有趋性，可设置黄板诱杀。方法：20～24厘米佳多黄板，用专用粘虫胶涂均匀，按20～30块/亩置于葡萄架上。当葡萄斑叶蝉粘满板面时，需要及时重涂。目前有两种粘虫胶，一种10天左右需要重涂一次，另一种为30天左右重涂一次(适合刮风较少的地方和温室等地使用)。（1）防治时期。防治葡萄斑叶蝉全年要抓住两个关键时期，即发芽后，是越冬代成虫防治关键期；开花前后是第1代若虫防治关键期。另外，幼果期根据虫口密度使用药剂，落叶前1个半月左右注意防控越冬成虫。（2）防治用药。可选用噻虫嗪、吡虫啉、多杀菌素、甲氰菊酯、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、辛硫磷等药剂喷雾。要注意喷雾均匀、周到、全面；同时注意喷防葡萄园的杂草及周围的林带、杂草。葡萄虎天牛(Xylotrechus pyrrhoderus Bates)，属鞘翅目，天牛科。又名葡萄天牛、葡萄枝天牛。它是蛀食葡萄枝蔓的主要害虫之一。葡萄虎天牛在我国东北、华北、华中及陕西、湖北、四川等葡萄产区均有发生。主要以幼虫为害枝蔓，初龄幼虫先在表皮下纵行蛀食，被害枝蔓的表皮稍隆起变黑，虫粪排于隧道内，不排出，所以不易被发现。幼虫蛀入木质部后，常将枝横向切断，造成枝条枯死，遇风容易折断，严重时造成一定的经济损失(彩图9-5-1)。成虫：体长约15毫米，体近圆筒形，大部黑色，头部有深而粗的刻点，触角短小，11节，仅伸到鞘翅基部。前胸背板、前、中胸腹板和小盾片深红色。前胸背板球形，长略大于宽，布有颗粒或刻点。小盾片半圆形，后端有少量黄毛。鞘翅黑色，两翅合并时，基部有“X”形黄白色斑纹，近端部有一黄白色横纹，端缘平直，外缘角极尖锐呈刺状。后胸腹板和第1、第2腹节后缘有黄色白绒毛，形成3条黄白色横纹。雄虫后足腿节长超过腹部末端，雌虫的短，仅至腹部末端(很少超过)(彩图9-5-2)。卵：椭圆形，长约1毫米，乳白色。幼虫：体长13～17毫米，淡黄白色，头小，无足。前胸宽大、淡褐色，后缘有“山”字形细凹纹；中胸至第8腹节背、腹面具肉状突起。蛹：长约15毫米，初淡黄白色，后逐渐加深为黄褐色。每年发生1代，以低龄幼虫在葡萄蔓内越冬，翌年春季葡萄发芽后开始活动，随龄期增大，可把枝条蛀空，使其充满虫粪、木屑，有时将枝条横向蛀断，使枝枯死，枝头脱落。7月间幼虫老熟在接近断口处化蛹，蛹期10～15天。8月羽化出现成虫，并产卵于芽鳞缝隙内或芽腋、叶腋缝隙处，卵散产，经5～6天孵化为幼虫，即由芽部蛀入茎内，粪便排于枝内，故从外部难以发现虫道。落叶后在节的附近，被害处表皮变黑，易于识别。结合冬季修剪，剪除节附近表皮变黑的虫枝，予以烧毁。春季萌芽期再细心检查，凡枝蔓不萌芽或萌芽后萎缩的，多为虫枝，应及时剪除。生长期随时检查，发现受害枝蔓及时剪除并深埋销毁或用铁丝插入蛀孔内刺杀幼虫。利用成虫迁飞能力弱的特点，人工捕捉成虫，一般可在8、9月早晨露水未干前进行捕捉，效果好。在8月成虫羽化期，利用其补充营养习性，可用敌敌畏、辛硫磷等喷雾。幼虫蛀入枝蔓后，在葡萄采收后喷施内吸性杀虫剂，或80%的敌敌畏乳油100倍液注射蛀孔并严密封堵。葡萄蓟马(Thrips tabaci Lindeman)，属缨翅目，蓟马科。又称烟蓟马、葱蓟马、棉蓟马。在我国各葡萄产区均有分布。寄主广泛，除为害葡萄外还为害苹果、李、梅、柑橘、草莓、菠萝、烟草等多种植物。若虫和成虫锉吸葡萄幼果、嫩叶、枝蔓和新梢的汁液。幼果受害初期，果面上形成纵向的黑斑，使整穗果粒呈黑色。后期果面形成纵向木栓化褐色锈斑，严重时会引起裂果，降低果实的商品价值。叶片受害后先出现褪绿黄斑，后变小，发生卷曲，甚至干枯，有时还出现穿孔(彩图9-6-1)。成虫：体长0.8～1.5毫米，淡黄色至深褐色，体光滑，复眼紫红色，单眼3个，其后两侧有一对短鬃。两对翅狭长，透明，前翅前缘有一排细鬃毛，前脉上有10～13根细鬃毛，后脉有14～17根细鬃毛。腹部第2～第8节背片前缘有一黑色横纹。触角6～9节，略呈珍珠状。卵：长约0.3毫米，淡黄色，似肾形。若虫：体长0.6～1.0毫米，初为白色透明，后为浅黄色至深黄色，与成虫相似(彩图9-6-2)。一年发生6～10代，多以成虫和若虫在葡萄、杂草和死株上越冬，少数以蛹在土中越冬。来年，葱、蒜返青开始恢复活动，为害一段时间后，便飞到果树、棉等作物上为害繁殖。在葡萄初花期开始发现有蓟马为害幼果的症状，6月下旬至7月上旬，在副梢二次花序上发现有若虫和成虫为害。7—8月间，几种虫态同时为害花蕾和幼果。至9月份虫口逐渐减少。10月早霜来临之前，大量蓟马迁往果园附近的葱、蒜、白菜、萝卜等蔬菜上进行为害。农业防治：清理葡萄园杂草，烧毁枯枝落叶，保持园内整洁。初秋和早春集中消灭在葱、蒜上为害的蓟马，以减少虫源。化学防治：蓟马为害严重的葡萄园需要药剂防治，喷药的关键时期应在开花前1～2天或初花期。可使用的药剂有吡虫啉、功夫等药剂。生物防治：保护、利用小花蝽、姬猎蝽等天敌，对蓟马发生有一定的控制作用。

以良种区域化，再配以优良的栽培管理技术，才能实现猕猴桃栽培的高产、稳产、优质、高效的目标。在栽培时间短、尚未实现规模化、产业化发展的地区，尤其应做好品种的引种、观察、筛选工作，建立良种区试基地，明确当地的最适栽培品种后，再大面积推广。对一个优良品种来说，最基本的要求是大果、优质、结果早、易丰产、耐贮运，品种的风味、口感应该适合当地群众的习惯。必须要考虑品种布局，应早、中、晚熟搭配，鲜食与加工品种搭配。适当减少中熟品种的发展，加大早熟、晚熟、极晚熟品种的栽培面积。将要发展的品种替代原有老品种，或者新发展品种的成熟期是原有品种群的上市空档。将发展的品种在本地必须生长良好，栽培管理容易，抗逆性强，抗病虫能力强。近几年，红心、黄心猕猴桃新品种相继出现并开始推广，具有很好的发展前景。一些特异品种，如白果品种、观赏品种也可以适量发展，以满足市场消费多样化的需求。苗木繁殖是猕猴桃优质丰产栽培的重要基础与技术环节，苗木质量的好坏直接影响猕猴桃结果及其产量、品质和经济寿命。自1978年以来，我国在借鉴新西兰猕猴桃产业苗木繁殖相关技术的基础上，针对我国特定的气候及栽培区域环境条件开展了猕猴桃繁殖方法的试验研究，并随着产业的迅速发展，建立了猕猴桃商品苗圃，不断研究和改进育苗方法和技术，保证了产业化发展中优质苗木的需求。种子采集是育苗成功的基础，选择充分成熟的果实取种，清洗出的种子放在室内摊薄晾干，然后用塑料袋封装后放入10℃以下低温冰箱贮藏备用。猕猴桃成熟的种子有休眠期，处在该时期的种子，即使温度、水分、空气等条件都已具备也不会发芽。必须创造适宜的外界条件，让种子度过休眠期，才能提高种子的发芽率和发芽整齐度。打破种子休眠主要用沙藏层积和变温处理2 种方法，其次是用激素处理。（1） 沙藏层积。将阴干的种子与5～10倍的湿润清洁消毒过的细河沙拌匀，细河沙湿度以用手捏能成团、松开团能散为宜，沙的含水量约为20%，然后将混匀好的种子用纤维袋 （或木箱） 装好，埋在室外地势高、干燥的庇荫处，并用稻草和塑料膜等覆盖，既防止雨雪侵袭又保证通透性，防止种子发霉腐烂。拌沙前种子用温水 （开水和凉水的比例为2 ∶ 1） 浸泡1～2天，效果更好。沙藏时间以40～60天最好，应不少于30天。（2） 变温处理。将种子放在4.4℃条件下6～8周，可以显著提高种子发芽率；或将种子放在4.4℃条件下2周以上，再进行变温处理，夜间10℃、白天20℃；或将种子贮藏于塑料袋内，放在4℃条件下5周，然后再经16小时的21℃和8小时的10℃变温处理，能得到更高的发芽率。（3） 激素处理。播种前用2.5～5.0克/升的赤霉素浸种24小时，亦可取得变温处理同样的效果。选择背风向阳、灌排方便的地方建苗圃，以富含有机质、疏松肥沃、呈中性或微酸性的沙质壤土播种为宜。为达到提早出苗，可采用塑料大棚或温室于12月至翌年1月播种，6月中下旬即可达到嫁接粗度。播种方法可采取条播或撒播。条播采用宽窄行；撒播是指将种子集中均匀撒在苗床上，出苗后达3片真叶即可移栽。播种后苗期管理是出苗率和苗木生长好坏的关键，特别是水分和遮阴的管理尤为重要；同时，需要及时清除杂草，保持苗木直立生长并及时摘心。对于1月播种或采用大棚播种的幼苗，于当年6月中旬苗木可达到嫁接粗度，实现当年播种、当年嫁接、当年成苗的效果，即猕猴桃 “三当” 育苗技术。嫁接是猕猴桃商品生产、保持品种特性的常用繁殖方法。我国对猕猴桃的嫁接方法研究颇多，针对猕猴桃枝梢生长特性，进行了嫁接方法的多种改进，嫁接技术也日益完善。我国在中华猕猴桃驯化的早期就开展了不同嫁接方法和时期的研究，逐步形成了劈接、舌接、切接、单芽枝腹接、皮下接、芽接等多种方法。除芽接仅在生长期使用外，其他方法除伤流期外，全年都可进行，春季伤流期之前是嫁接的最佳时期。除春季可采取扬接外，其他均在圃内嫁接。扬接 （相对常规圃内坐地嫁接，指掘起砧木于室内嫁接后再植于圃地），即在休眠期，提前将砧木挖出集中假植，在室内进行嫁接，比传统的室外坐地嫁接提高了嫁接速度和嫁接成活率。另外，提前将砧木挖出假植，推迟伤流期，可延长嫁接时间，且不受外界天气的影响，嫁接成活率可达95%。无论采用何种方法嫁接，嫁接成活的关键在于4个字——快、准、紧、湿，即削刀要快，砧穗的接合部位形成层要对准，包扎要紧，伤口要密封，枝接时要留保护桩，保持结合部位的湿润和土壤的湿润。目前国内多采用中华猕猴桃和美味猕猴桃实生苗作砧木，且美味猕猴桃砧木嫁接植株长势旺，适应性较强。北方种植软枣时主要采用扦插苗或抗寒性强的软枣猕猴桃作砧木；用长叶猕猴桃作砧木嫁接中华猕猴桃和美味猕猴桃品种，能进一步增强耐旱、抗病能力。研究表明，砧木 “凯迈” 可以提高 “海沃德” 品种的花芽量及产量；用大籽猕猴桃嫁接中华猕猴桃，有树体矮化的表现特性。猕猴桃砧木品种的研究和选育相对滞后于猕猴桃产业的发展，选育抗性更强的专用砧木如抗旱、耐湿的砧木或耐碱的砧木，是提高猕猴桃优质高产及扩大适栽区域的重要研发方向之一。嫁接后管理的好坏对接芽成活和生长发育有着直接的影响，除了加强肥水管理外，应及时做好断砧、除萌、摘心、立支柱等各项工作。嫩枝扦插也叫绿枝扦插，是指当年生半木质化枝条作插条培育苗木的方法。嫩枝扦插主要在猕猴桃的生长期使用，一般在新梢半木质化后的5—8月进行。在避风、阴凉的地方建立插床，铺上干净细河沙或蛭石作基质。选择露水未干前采集插穗，粗度以直径0.4～1.0厘米为好，长度10～15 厘米，有2～3 个芽，剪好的枝条应置于阴凉避风场地或室内，扦插前用促进生根的生长调节剂处理基部切口。扦插时，插条入土深度为插条长的2/3，密度以插下后插条叶片不相互遮盖为准。插好后，浇足水，使基质与插条紧贴。盖上遮阳网调整光照强度，保持整个环境通风，同时需要调整好插床的湿度，有条件的地方可采用自动喷雾装置，则生根效果更好。硬枝扦插是指利用1年生休眠期的枝条作插条培育苗木的方法。因木质化枝条组织老化，较难生根，特别是中华猕猴桃和美味猕猴桃，在刚开始驯化利用时，国内认为几乎不能生根，而国外仅日本扦插成活，成活率为66.7%。为了解决异地引种的问题，中国科学院武汉植物园针对难生根的原因开展了大量的试验，如在插穗类型、处理插穗的药剂筛选、药剂的处理浓度及时间、插床的温度调节如加埋地热线升温等，选择最佳的处理组合，使生根成活率达90%。猕猴桃组织培养繁殖研究始于20世纪70年代，首次以猕猴桃茎段为材料，进行离体培养的研究。我国相继对猕猴桃不同器官，例如茎段、叶片、根段、顶芽、腋芽、花药、花粉、胚、胚乳进行了离体培养研究，并开展了组织培养技术有关基础理论及应用的研究。近年来，我国在猕猴桃转基因体系研究方面取得了一些进展，获得了不同器官的试管苗，利用种胚、下胚轴、子叶等培养愈伤组织分化苗，利用胚乳培养三倍体植株也获得了成功。对离体培养的猕猴桃茎段愈伤组织发生的组织学和形态发生学研究表明，愈伤组织起源于形成层和韧皮部，初生木质部也参与了愈伤组织形成。意大利将扦插和组织培养相关技术集成，应用在商业化苗木繁殖，快速地为生产提供了大量优质苗木，即用组织培养产生大量幼小茎段为材料，用扦插繁殖的方法在棚内养苗，带钵移植，1年上架分枝，主干粗2厘米，长势旺；翌年即可结果。由于猕猴桃在长期系统发育过程中形成了 “三喜” “五怕”的特性，因此，在建园时必须充分考虑猕猴桃对环境条件的要求，尤其是气候条件、土壤条件和社会经济条件要满足猕猴桃生产的需求。因此我们建议各地果农在建园时，必须做到 “五要”，即态度上要有发展的积极性，环境上要有适宜的生态条件，产品上要有一定的发展规模，资金上要有相应的投资能力，科技上要有切实可行的技术保障。猕猴桃直插建园是将插条一次性扦插于植株栽植穴中，直接培育成苗的一种快速建园方法。由于繁苗与建园一次到位，方便简便，施工容易，建园成本低，在管理良好的条件下，苗木生长迅速健壮，一般翌年即可开始结果。由于直插建园枝条扦插的地方不仅是苗木培育的场所，也是今后植株生长的地方，所以一定要准备好栽植沟。先挖好宽0.6～0.8 米、深0.8 米的定植沟，沟底填入切碎的玉米秸秆，然后再用混合好的表土与有机肥将沟填平，并灌1次透水使沟内土壤沉实。按植株行距要求将定植沟内土壤翻锄、整平，做成宽度为60厘米的平畦。直插建园多用长条扦插，即1个插条上至少要保留2～3个芽眼，有利于插条发根和幼苗生长。在扦插时可按规定的株距，在定植沟的覆膜上先用前端较尖的小木棍在扦插穴上打2～3个插植孔。为了保证每个定植穴上都有成活的植株，一般每个插穴上应沿行向斜插2～3个插条，插条间距离10厘米，形成 “八” 字形，插条上部芽眼与地膜相平，扦插后及时向插植穴内浇水，为了保证良好的育苗效果和促进苗木健壮生长，直插建园时定植带应铺盖地膜，膜的周边用细土压实。覆膜能有效提高地温，并有保墒和减少杂草为害的作用。栽苗建园是整地后按一定的密度定植实生苗的建园方式。栽苗建园的优点是建园成本低，定植实生苗成活率高，品种搭配比较容易掌握，株行距规范，树体大小一致，生长旺盛，便于整形，便于集约化经营管理，早期丰产、稳产。在栽苗建园时，行距控制在4米左右，株距应保持在2米左右。先在种植园里挖深60厘米、长宽均为1米的定植坑，在坑内施足基肥，不但可以节省肥料，还有利于树体吸收养分。定植时，在坑内覆一层土再栽实生苗，否则会造成烧苗现象。栽好的实生苗经过1年生长后再高接，有利于成活。接口应距地面40厘米以上，避免接口冻害，一旦高接成活，则去除实生苗全部分枝，以免争夺养分。

水稻条纹叶枯病是由灰飞虱传播的发生严重的病毒病，近年来，在浙江北部稻区呈快速蔓延扩大趋势，对水稻安全生产构成极大威胁。为了调查测定水稻条纹叶枯病为害与损失，为制订防治指标提供科学依据，2005～2006年我们在浙江嘉兴对水稻条纹叶枯病为害损失进行较为系统的测定，现将结果综合整理如下：单季晚稻，秀水09。在4月下旬采用生物法测定当地灰飞虱带毒率。自5月15日播种后，每隔3～5天调查秧田期灰飞虱虫口密度；6月15日移栽后，每隔5天调查本田初期灰飞虱密度，于发病后（6月下旬）开始每隔3～5天定点调查水稻丛发病率、株发病率。于病情稳定后（8月15日），根据田间自然发病情况，选取不同发病率（形成发病梯度）的点59个，每个点抽查20丛（200株），调查株发病率，待水稻成熟后单丛考种测产。据生物法测定，灰飞虱带毒率为2.01%。5月中下旬调查，秧田期灰飞虱虫量平均每平方米213头，推算带毒虫量平均每平方米为4.473头。本田期病情稳定期调查，水稻株发病率平均为4.88%，二者之比为1：1.091，见表1、表2。调查日期（月/日）成虫数（头/m2）若虫数（头/m2）合计虫量（头/m2）折合667m2（亩）虫量（万头）5/207070.46675/23193221.46675/26292312.06675/29815865.73346/4145915410.26676/81961721314.20016/121842420813.86676/151653920413.6001表1 秧田期灰飞虱虫量调查（浙江嘉兴，2006）调查日期（月/日）定点丛数调查株数发病丛数发病株数丛病率（%）株病率（%）6/2020062000006/2420086000006/28200136015197.51.46/3020013602429122.17/320018603241162.27/520019003692184.847/720019003692184.847/10200205040100204.887/1720021804310221.54.65/152002180399719.54.45表2 本田期条纹叶枯发病的系统调查（浙江嘉兴，2006）水稻条纹叶枯病株发病与产量损失率关系测定结果，平均株发病率为0.5%～11.5%，产量损失率为0.33%～9.02%。株发病率与产量损失率二者之比为1：0.576～1.01，平均为1：0.792，见表3。随着水稻发病株率（X）上升，产量损失率（Y）加大，两者具密切的相关性，建立的关系式为：Y=0.4768+0.7276X，r=0.8898**。株发病率（%）水稻200穗产量（g）产量损失率（%）株病率与损失率之比0.0（对照）524.20.5522.50.330.661.0518.91.011.011.5518.11.160.7732.0514.71.820.912.5616.61.440.5763.0509.72.760.923.5508.92.910.8314.0507.343.210.8034.5504.63.730.8295.0504.73.730.7465.5501.64.320.7856.0502.04.240.7076.5501.74.290.667.0493.55.870.8397.5490.06.520.8698.0488.66.800.858.5489.26.670.7859.0490.46.460.71810.0483.67.750.77511.5476.99.020.784对照（0.0）524.2表3 水稻条纹叶枯病发病率与水稻产量损失率测定（浙江嘉兴，2005～2006）大田调查测定结果表明，水稻条纹叶枯病发生与灰飞虱虫口密度高低和带毒率具有密切相关性，随着灰飞虱虫口密度提高，为害程度上升，产量损失率加大，建立了为害损失关系式。条纹叶枯病发病株率与产量损失率之比，2年测定结果为1：0.576～1.01，平均为1：0.792。田间调查表明，水稻条纹叶枯病发病后，前期稻苗大多枯死，对产量损失大。该调查结果为条纹叶枯病发病为害损失评估，制订防治指标提供科学依据。

虫草属（Cordyceps）属于真菌门（Eumycota）、子囊菌亚门（Ascomycotina）、核菌纲（Pyrenomyceres）、麦角菌目（Clavicipitales）、麦角菌科（Clavicipitaceae）。本属真菌绝大多数能感染昆虫，并从其头部或体表长出子座体而构成虫、菌复合体——虫草。我国是世界上最早将虫生真菌——冬虫夏草进行药用的国家[1～6]，受我国对虫草传统药用的启发，加上微生物制药的诸多优点，近年来世界上许多国家都加强了虫生真菌的研究。初步研究已表明，虫草及相关真菌是最有潜力从中发现新型生物活性化合物或药物先导化合物的真菌类群[5～11]。根据寄生真菌和寄主的不同可以形成各式各样的虫草，虫草属作为药用真菌中的一个大类，目前报道虫草属真菌已达400多种，我国已记载的有90多种[12]。除冬虫夏草外，还有如霍克斯虫草、大团囊虫草、蛹虫草、珊瑚虫草、鳞翅目虫草等，其中冬虫夏草应用历史悠久，研究得最为深入[13]。尽管虫草在世界各地均有分布，但是相对集中地分布于亚欧大陆。研究表明，虫草可产生多种生理活性物质，这些物质分别具有抗菌、抗病毒、杀虫以及免疫调节等功能，它们在医药、农业、食品工业及现代生物技术的应用中皆有十分重要的意义。目前按其用途可将虫草资源分为3类：即药用、食用和害虫微生物防治资源。我国药用常用种有10余种，最多的是冬虫夏草（C.sinensis）群，其他还有蛹虫草（C.militaris）、亚香棒虫草（C.hawkesii）、大团囊虫草（C.ophioglossides）、凉山虫草（C.liangshanensis）、香棒虫草（C.barnesii）、古尼虫草（C.gunnii）、蝉花（C.sobolifera）等。对于虫草的认识，我国可追溯到公元前11世纪西周至秦朝。从出土的文物中就发现有以虫草作图案的玉雕饰品[14]。1578年成书的《本草纲目》中记载有雪蚕，根据其生活史、性味功效、形态、环境及产地判断，应当是冬虫夏草的古名。在1694年清朝汪昂的《本草备要》中也有关于冬虫夏草的论述，该书记载：“冬虫夏草，甘平，保肺益肾，止血化痰，止劳咳。四川嘉定府所产者佳。冬在土中形如老蚕，有毛能动，至夏则毛出土上，连身俱化成草”，这是冬虫夏草的最早文字记载[3]。赵学敏（1765）著的《本草纲目拾遗》把它的药用归之为“能治诸虚百损”[15～16]。在中华医药百味中，虫草正是以“治诸虚百损”、“阴阳平衡”、“保肺益肾、补精益气、专补命门”的神奇功效被认为是一种不可多得的中药之宝而蜚声华夏，饮誉海外，与人参、鹿茸齐名[14]，共称为中国的三大补品。虫草菌无性型种类包括20余属70余种，其中重要的有拟青霉属17种，头孢霉属6种，层梗孢属l1种，被毛孢属21种，葡萄穗霉属1种，小束梗孢属2种，刺束霉属3种，球束孢霉属1种，轮枝孢属3种，侧孢霉属3种及多头霉属的一些种，其中拟青霉、被毛孢霉、头孢霉及轮枝孢霉的许多种已用于害虫生物防治。早在20世纪50年代，前苏联科学家就用棒形虫草（Cordyceps clavulata）的性型蜡蚧被毛孢（Hirsutella lecanicola）人工培养后防治核桃介壳虫，并获得成功。Shimazu（1988）确证的布氏虫草（Cordyceps brongniartii）及其无性型布氏白僵菌（Beauveria brongniartii），是金龟子幼虫一种常见的病原，多年来日本、法国及我国利用该菌防治森林苗圃、牧场及农田的蛴螬均有较好的效果，在有些场合下可较长期地控制虫口。随着化学农药的大量使用对环境生态的严重影响，生物防治日益被人们所重视，利用昆虫病原微生物防治害虫是重要的手段之一。虫生真菌种类多，代谢类型复杂，以其安全有效，显著的流行潜力，容易大量生产等优点，在害虫的生物防治中占有越来越重要的地位。目前生物防治中应用最广的真菌杀虫剂是白僵菌、绿僵菌、汤普森多毛菌、蜡蚧轮枝菌、拟青霉等。据试验，白僵菌用于防治农、林、果、茶类30余种害虫，均取得良好的效果。国外对白僵菌研究较多的国家有前苏联、美国、日本、法国、德国等。前苏联在20世纪70年代批准登记为Boverin微生物杀虫剂，用作大面积防治马铃薯甲虫、苹果食心虫、小麦盾蝽、玉米螟和甜菜象甲等。我国利用该菌防治农林害虫每年达67万hm2 以上。绿僵菌仅次于白僵菌，目前美国、巴西已有绿僵菌商品制剂，主要用于防治沫蝉、蚊子等。国内应用其防治梨虎、天牛、梨心毛虫、菜青虫、蠹虫、蚊子等，其防效达30%～94%。有关资料显示，目前虫生真菌制剂的研究进展依然缓慢。至1996年，国外登记注册的只有27种剂型，40多种不同的虫生真菌制剂，其中主要为球孢白僵菌和金龟绿僵菌，而国内的商业产品均未形成[17]。因此，还有待于国内科研工作者进行广泛深入的研究。我国虫草资源主要用于药用，其次是食用，作为生物杀虫剂尚处在试验研究阶段。近年来由于人工滥采乱挖，以及生态环境的严重破坏，许多虫草菌面临灭绝的危险。研究人员已意识到这一点，从菌种分类、种类分布、生态、寄主、人工驯化与培养、化学成分、药理与临床等方面做了大量的研究，发现人工培养的菌丝体和发酵液，经化学、药理研究证明与天然虫草基本一致[18]，这无疑为虫草的获得开辟了一条新途径。总之，虫草属真菌的研究还有很多地方有待深入。虫草的药用价值和微生物防治还有很大的潜力可挖，只要广大真菌工作者不懈努力，这一古老的药用真菌必将为人类健康做出新的贡献。

The small brown planthopper,Laodelphax striatellus Fallen(Homoptera:Delphacidae)is a widely geographical distributed planthopper in the Euro-Asian continents(Zhu et al.2005).It is the vector of the rice stripe disease caused by the rice stripe virus(RSV).RSV has been a destructive rice disease in the Eastern Asian countries(Hibino,1996;Cheng et al.2002;Zhu et al.2005;Zhu et al.2007).The transmission process and efficiency of a plant virus by their vectors was influenced by many factors(Gray&Banejee,1999),for instance,environmental temperature,plant species(Jin et al.1985),plant age(Wang et al.2007),but no information was documented on the role of the planthopper vector's age on the rice stripe virus.In the year 2006 and 2007,we collected nymphs and adults of the vector planthoppers from overwintering habits and biologically tested their transmission rates.In 2006,the small planthoppers in growth stages of large nymphs and macropterous and brachypterous adults were collected from overwintering habits such wheat,barley,rye fields and grasses in bank fields of 5 sites,e.g.Haiyan,Haining,Jiashan,Huzhou and Changxin,Northern Zhejiang Province.In 2007,the vectors were collected from 7 sites,e.g.Haiyan,Haining,Xiuzhou,Jiashan,Tongxiang and Changxin.More than 100 planthoppers were collected from each site each year.2.2 Rice seedlingThe most widely grown rice cultivar Xiushui 110,a Japonica type bred by Jiaxing Academy of Agricultural Sciences,was sown and maintained in greenhouse plots and the seedlings at age of 15 days were used for the bioassay.After they were collected and transported in healthy rice seedlings to the laboratory,the planthoppers were separated into groups of larger nymphs,macropterous and brachypterous adults as described in Sun et al.(2007).One rice seedling was set in a glass tube in size of 15cm×2cm and enclosed in one end with nylon mesh.After one planthopper of either nymph or adult was put into each glass tube,the second end was enclosed as for other the end and the glass tubes were marked for the vector's site etc.All the tubes and plants with planthoppers were sitting vertically on trays with still water to maintain the plants alive.The trays were kept in a greenhouse of RH75%,25～28℃ with 14L:10D.After 24 hours after infection,the seedlings were transplanted into plots in a screen house and covered by net cages in size of 30 cm in height×10cm in diameter individually.The seedlings were monitored and recorded daily for the incidence of the rice stripe disease till 30 days.Since all the incidence data of percentages of infected rice plants were lying within the range of 0 to 30%,the square-root transformation was used before analysis of variance.The Generic linear model(GLM)was applied to separate the factors and their interactions on the variance.Thereafter,the least significant difference(LSD)was used to compare the difference among the transmission rates of different status of vectors.The data analysis was performed in the DPS program(Tang and Feng 2006).The age and site of the vector had significant effect on the transmission rate(ANOVA,F(2,32)=82.85,P=0.0001;and F(6,32)=8.54,P=0.0098,Table 1),but the factor of year and the two-paired interactions among all the three factors were not significant(P>0.05,Table 1).This indicates that transmission competencies of the vectors collected from different sites were consistent over these two years.In both the years of 2006 and 2007 for each site,the transmission rate of large nymph was higher than those of brachypter and macropter,respectively,and the mean of the former was significantly higher than those of later(Table 2).The ratio of such transmission rates was nymph:macropter:brachypter=1:0.69:0.35 in 2006 and 1:0.68:0.45 in 2007.SourceofvarianceSSDegreeoffreedomdfMeansquaresMSFProbabilitylevel,PAge223.02572111.512982.84770.0001Site68.9879611.49808.54230.0098Year7.041717.04175.23160.0622Year×Age2.320621.16030.86200.4687Year×Site17.451335.81714.32180.0604Site×Age44.6304123.71922.76320.1107Error8.076061.3460Total335.229532Table 1 Analysis of variance of factors affecting the transmission rate of overwintering Laodelphax striatellus FallenSBPHoriginationsAgeofsmallbrownplanthopper(SBPH)20062007MacropterBrachypterLargenymphMacropterBrachypterLargenymphHaiyan3.36.258.233.525.026.12Haining3.855.136.992.143.035.81Jiashang2.783.836.222.594.216.25Tongxiang3.547.6913.64Xiuzhou3.595.267.13Changxin2.604.228.505.636.487.69Huzhou1.829.0911.29Mean±SE2.87±0.345.7±0.948.25±0.873.5±0.495.28±0.677.77±0.215%cbababa1%BAABABATable 2 Comparison of transmission rate (%) of the rice stripe virus by different age of the small brown planthopper (SBPH), Laodelphax striatellus FallenThe experiment presented in the paper showed that the large nymphs of the planthopper vector had higher transmission efficiency than their adults.Such discrepancy between adults and younger stages are found in many plant virus vectors.For both sexes of Frankliniella occidentalis(Pergande)(Thysanoptera:Thripidae),the vector of the tomato spotted wilt virus,the transmission efficiency dropped with age,simultaneously with the consumption rate(van de Wetering et al.1999).The transmission of Tomato spotted wilt virus by Thrips tabaci adults decreased with the age too at which the virus was acquired by larvae(Chatzivassiliou et al.,2002).In aphid vector of the persistent transmission of plant viruses,transmission efficiency decline with age though they remain infectivefor a long time,possibly over their whole life.Infectivity is not affected by molting,important because of existence of the virus as aphids mature.Foregut and hind gut is lined with cuticle that is shed with the molt;viruses transmitted in a persistent fashion must be either in midgut or within the body.But Ling(1975)noted that adult green leafhopper(Nephotettix virescens)is three times more efficient vector than nymphs in rice tungro transmission.The acquisition access period(AAP)and inoculation access feeding periods(IAP)are two of the important factors determining the transmission efficiency.The proportion of aster leafhoppers,Macrosteles quadrilineatus Forbes,that became vectors was significantly higher for bolt strain of aster yellows phytoplasma when leafhoppers acquired aster yellows phytoplasma as nymphs than as adults.Once leafhoppers became inoculative,the rate of transmission remained constant over their life spans(Murral et al.1996).Acquisition only occurs in the first and early second nymphal stages of the life-cycle and adult thrips cannot acquire the virus(Moritz et al.,2004).Due to the lack of strong evidence to elucidate the mechanism undergoing the different transmission ability between the ages and wing-morphs of the small brown planthopper,more experiments are necessary to carried out to draw the clear pictures.When winter crops such wheat,ryegrass are spatially connected with or temporally followed by rice seedling nursery or transplanted rice,viruliferous planthopper nymphs remained in the nearby winter crops or grasses will move by jumping to the newly-planted rice plants and transmit the virus to rice resulting in severer RSV incidence than viruliferous adults.Such event should be prevent through spatially and temporally isolation.Postpone of sowing date of rice has been tested experimentally as one of the effective approach to avoid RSV disease outbreak in rice(Zhu,et al.2007,in review).Additionally,the data can be used in a rice stripe disease epidemiological model to evaluate strategies for the disease management.The research presented in the paper is part of the Zhejiang Provincial Key Projects(2005C32033,2004E60055),China National High-Tech(863)Program(2007AA10Z220).

SNP （单核苷酸多态性） 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的 DNA 序列多态性，包含单个碱基的转换、颠换等。InDel是指插入/缺失 （Insertion/Deletion） 基因组中小片段的插入和缺失序列，个体重测序中特指1～50 bp 的小片段插入和缺失。在生物的进化进程中，生物全基因组水平上积累了大量的微小变异，主要包括SNP 和InDel。这些微小变异的变异程度决定了物种之间在表型和生理结构等方面的差异，为新物种的形成提供了最原始的动力，是物种多样性的本质体现。SNP 标记是基因组DNA序列中分布最广泛的一类标记，植物基因组中平均每数百bp就存在着一个SNP （Huang et al.，2010；Qi et al.，2013）。InDel标记也是一种重要的遗传标记，已被广泛应用于图位克隆、基因定位、动植物遗传多样性的鉴定、分子标记辅助育种等领域（Jander et al.，2002；Schnabel et al.，2005；王岩等，2009；王明军等，2010）。随着高通量测序技术的快速发展，利用全基因组重测序（whole genome re-sequencing，WGR） 技术结合混合分组分析法（bulked segregate analysis，BSA） 可高效检测出通过双亲杂交建立的后代群体中导致表型变异的 QTL和突变位点 （Abe et al.，2012；Takagi et al.，2013），并且可以识别大量的 SNP 和 InDel 位点，从而进行SNP 及InDel标记的开发，获得基因区间的SNP 及InDel标记。本研究利用WGR技术及 BSA法相结合，获取与抗炭疽菌叶枯病基因相关的SNP 和InDel位点，并通过对△ （SNP-index） 图谱分析，快速锁定抗病区域，再通过ANNOVAR软件分析，提取注释信息，筛选出候选的抗病基因。并利用实时荧光定量 PCR （qRT-PCR） 技术对候选基因经过炭疽叶枯病病原菌侵染后的不同时间段基因表达量的变化进行分析，寻找响应炭疽叶枯病病原菌侵染的抗病相关基因并对其进行详细的功能分析，以期揭示苹果抗炭疽菌叶枯病的分子机制。用于全基因组重测序的材料为 ‘金冠’ ‘富士’ 及第三章中经过抗病鉴定的 ‘金冠’ב富士’ 的 F1 代群体中极端抗炭疽菌叶枯病的20个单株和极端感炭疽菌叶枯病的20 个单株。取其嫩叶3～5 片，液氮速冻，置于-70℃冰箱保存，用于提取DNA。用于qRT-PCR 分析的材料为 ‘富士’ 和 ‘金冠’ 带嫩叶的一年生健壮新梢各30 枝，用于室内人工离体接种。接种方法同第二章，分别于接种后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h七个时间点采集叶片，液氮速冻后，用于提取RNA，检测基因表达。参考Doyle和Doyle （1987） 及 Cullings （1992） 提取基因组DNA的CTAB法，并加以改进，详见第三章。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的纯度和完整性。条带单一、清晰明亮、无降解、无污染的DNA样品作为合格样品用于后续研究。运用NanoPhotometer ? 分光光度计 （IMPLEN，CA，USA） 对DNA的纯度进行检测。DNA经过 Qubit ? DNA Assay Kit in Qubit ? 2.0 Flu-rometer （Life Technologies，CA，USA） 进行浓度的精确定量。将DNA浓度调整为100 ng/μl。苹果嫩叶总RNA的提取方法如下。（1） 将500 μl裂解液RLT Buffer、50 μl PLANTaid、5 μl β-巯基乙醇，依次加入灭菌的1.5 ml离心管中，混匀，待用。（2） 将冻存于-70℃下的苹果嫩叶0.2 g置于预冷的研钵中，加少量液氮快速研磨成细粉状后转入上述待用的的离心管内 （样品容易褐化，动作要迅速，并保证液氮挥发完全）。（3） 56℃温育5～10 min，期间不断剧烈震荡混匀，以保证充分裂解。（4） 12000 r/min 离心10 min，将离心管缓慢从离心机中取出，将上清液转到新离心管中 （吸取上清液时一定要缓慢，尽量不要吸到底部沉淀）。（5） 较精确估计上清液体积，加入 0.5 倍体积的无水乙醇，盖盖，上下颠倒混匀，此时可能会出现沉淀，但是不影响提取的过程。（6） 将混合物 （每次上样应小于800 μl，可分两次加入） 加入吸附柱中，12000 r/min离心60 s，弃废液。（7） 在吸附柱中加700 μl去蛋白液 RW1，室温下放置5 min （可稍延长时间，去除吸附柱上的蛋白污染），12000 r/min 离心30 s，弃废液。（8） 在吸附柱中加入 500 μl 漂洗液 RW （加过无水乙醇），12000 r/min离心 30 s，弃废液。再加入 500 μl 漂洗液 RW，重复1遍。（9） 将吸附柱放回空收集管中，12000 r/min空离心2 min，尽量除去吸附柱中残留的漂洗液。（10） 将吸附柱放入一个 RNase free 离心管中，在吸附膜上加40 μl RNase-free water （最好事先在 70～90℃中水浴加热），室温放置2 min，12000 r/min 离心1 min，如需RNA浓度较高，可重复离心1次。（11） 取4 μl RNA加入6×RNA Loading Buffer，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取的质量与纯度，并估测提取浓度。（12） 将检测质量好的RNA放入-70℃下保存备用。参照 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time） 试剂盒 （TaKaRa）。具体操作步骤如下 （全程冰上操作）。（1） 基因组 DNA 的去除。在 0.2 ml 灭菌的离心管中依次加入1 μg 总 RNA，2 μl 5×gDNA Eraser Buffer，1 μl gDNA Eraser，用RNase-Free水补足10 μl，42℃，2 min （或者室温5 min）；4℃。（2） 反转录反应。在0.2 ml灭菌的离心管中依次加入10 μl步骤1的反应液，1 μl PrimerScript RT Enzyme Mix I，1 μl RT Primer Mix，4 μl 5×PrimerScript Buffer 2 （for Real Time），用 RNase Free 水补足20 μl。37℃，15 min；85℃，5 s；4℃。（3） 质量检测。用 β-actin 基因的引物对反转录的 cDNA 进行PCR扩增，并用1%的琼脂糖电泳检测，选取质量好的样品在-20℃下保存备用。将 ‘金冠’ב富士’ 的F1 代群体中选取出的 20 个极端抗病的单株和20个极端感病的单株DNA等量混合构建成两个表型池。检验合格的4 份 DNA 样品每份取1.5 μg进行基因文库的构建。通过Covaris破碎机将DNA样品随机打断成长度为350 bp的片段。采用TruSeq Library Construction Kit 进行建库，严格使用说明书推荐的试剂和耗材。DNA 片段经末端修复、加 ployA 尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。构建好的文库通过 illumina HiSeqTM PE150进行测序 （附图4-1）。文库构建完成后，先使用 Qubit 2.0 进行初步定量，稀释文库至1 ng/μl，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段 （insert size） 进行检测，符合预期后，使用Q-PCR 方法对文库的有效浓度进行准确定量 （文库有效浓度＞2 nM），以保证文库质量。4个文库检验合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行 Illumina HiSeq TM PE 150 测序。围绕350 bp的片段进行双末端 125 bp 测序。表型差异的两个亲本测序深度为10 X，抗感池测序深度为20 X。信息分析的主要步骤如下 （附图4-2）。步骤一：对下机得到的原始测序数据 （Raw data） 进行质控得到有效测序数据 （Clean data）。步骤二：将Clean data比对到参考基因组上。步骤三：根据比对结果，进行 SNP、InDel 的检测，分析 SNP、InDel的分布情况并进行注释。步骤四：对子代SNP 频率差异进行分析。步骤五：根据分析结果对目标性状区域进行定位。步骤六：确定候选基因。测序得到的原始测序序列 （Sequenced Reads或者 raw reads），里面含有带接头的、低质量的 reads。为了保证信息分析质量，必须对raw reads过滤，得到有效测序序列 （clean reads），后续分析都基于clean reads。数据处理的步骤如下。一是去除带接头 （adapter） 的reads pair。二是当单端测序read中含有的N的含量超过该条read长度比例的10%时，需要去除此对paired reads。三是当单端测序read中含有的低质量 （Q≤5） 碱基数超过该条read长度比例的 50%时，需要去除此对paired reads。有效测序数据通过 BWA （http：//bio-bwa.sourceforge.net/） 软件 （Li and Durbin，2009） 与 ‘金冠’ 苹果的基因组 （ https：//www.rosaceae.org/data/download） 进行比对，确定reads在基因组上的位置。比对结果使用 SAMTOOLS （ http：//samtools.sourceforge.net/）软件进行SNP-calling （Li and Durbin，2009），发掘 reads 与参考序列以及 reads 之间的 SNP 位点，利用 SAMtools 软件中的 “rmdup” 指令去除序列文件中的重复。人们采用GATK3.3软件 （McKenna et al.，2010） 的UnifiedGeno-typer模块进行多个样本 SNP 和 InDel的检测，使用 VariantFiltration进行过滤，SNP 的过滤参数为：cluster Window Size 4，filter Expression“QD＜4.0 ‖ FS＞60.0 ‖ MQ＜40.0”，G filter “GQ＜20”。InDel的过滤参数为：cluster Window Size 4，filter Expression “QD＜4.0 ‖ FS＞200.0 ‖ ReadPosRankSum＜-20.0 ‖ InbreedingCoeff＜-0.8”。利用ANNOVAR软件 （Wang et al.，2010） 对 SNP 和 InDel 检测结果进行注释。SNP 频率的统计：SNP 频率是指所检测到的总的SNP 数与参考基因组序列的总长度的比值，是衡量一个物种变异程度和多态性的指标。转换颠换率的统计：分别统计发生转换和颠换的SNP 数目。子代 SNP 的频率 （Takagi et al.，2013），即 SNP-index，是与SNP 位点的测序深度相关的参数，是指某个位点含有 SNP 的 reads数与测到该位点的总 reads数的比值。以参考基因组作为参照，分析计算两个子代在每个 SNP 位点的 SNP-index。SNP-index计算方法如附图4-3所示。若该参数为0，则代表所有测到的reads都来自作为参考基因组的亲本，即 ‘金冠’。参数为1则代表所有的reads都来自另一个亲本，即 ‘富士’。参数为0.5，代表此混池中的 SNP 来自两个亲本的频率一致。为减少测序错误和比对错误造成的影响，对计算出 SNP-index后的亲本多态性位点进行过滤，过滤标准如下。（1） 两个子代中 SNP-index 都小于0.3，并且 SNP 深度都小于7的位点，过滤掉。（2） 一个子代SNP-index缺失的位点，过滤掉。计算△ （SNP-index），即两个子代 SNP-index 作差：△ （SNP-index）=SNP-index2 （极端抗病性状）-SNP-index1 （极端感病性状）。为直观反映△ （SNP-index） 在染色体上的分布情况，对其在染色体上的分布进行作图。默认选择1 Mb 为窗口，1 kb 为步长。进行1000次置换检验，选取95%置信水平作为筛选的阈值。为了不忽略掉微效QTL的影响，在全基因组范围内挑选两个子代在SNP-index差异显著的SNP 位点，即挑选子代2 （极端抗病性状） SNP-index大于0.7，且子代1 （极端感病性状） SNP-index小于0.3的位点，并与亲本 ‘富士’ 为纯合及亲本 ‘金冠’ 为杂合的位点取交集，做为候选的基因位点。提取ANNOVAR的注释结果，优先挑选使基因获得终止密码子的变异 （stop loss） 或者使基因失去终止密码子的变异 （stop gain） 或者非同义突变 （missense） 或可变剪接的位点（Splicing） 所在的基因作为候选基因。从网站 https：//www.rosaceae.org/gb/gbrowse/malus_x_domestica/下载候选基因的 mRNA，从基因编码区核苷酸序列的近3’端位置设计引物，PCR产物长度在150～250 bp，引物序列见表4-1，内参基因为β-actin基因。荧光定量 PCR 在罗氏 LightCycler 480 系统上进行，反应体系配制按 SYBR Green PCR Master Mix 说明书进行操作，具体如下：10.0 μl SYBR Premix Ex Taq Ⅱ （2×），0.8 μl正反向引物，2.0 μl cDNA，去离子水补足20 μl。反应程序为95℃ 预变性5 min，95℃ 10 s变性，55℃ 10 s退火，72℃ 10 s延伸，扩增45 个循环。循环结束后进行熔解曲线分析：95℃ 15 s，60℃ 20 s，然后缓慢升温至95℃。基因的相对表达量用公式：F=2-ΔΔCt，ΔΔCt=（待测组目的基因 Ct值-待测组内参基因 Ct值）-（对照组目的基因 Ct值-对照组内参基因Ct值）。Illumina HiSeqTM PE150 测序平台，四个样本共产生 47.115 G的测序原始数据 （Raw data），通过对原始数据中的接头序列，低质量碱基以及未测出的碱基 （用 N 表示） 进行过滤后，得到有效数据 （Clean data） 46.974 G，各样本的 Raw data 在 7774.247～17017.174 Mb，Clean date 在7751.990～16969.215 Mb，过滤后获得的有效数据比率在99.64%～99.72%，碱基错配率低于0.05%。测序质量 Q20 ≥ 95.08%、Q30 ≥ 88.97%，GC 含量在 39.04%～39.16%。这表明所有样本的数据量充足，测序质量很高，GC 分布正常，建库测序成功，保证了后续数据分析的准确性 （表4-1）。样本原始数据/bp有效数据/bp有效率/%错误率/%Q20/%Q30/%GC含量/%富士7774246500775199010099.710.0395.4389.6339.16金冠7900566600787192650099.640.0395.5589.8839.05BR（基因抗池）170171739001696921590099.720.0395.4489.6239.04BS（基因感池）144234894001438116750099.710.0495.0888.9739.15表4-1 测序数据质量概况将四个样品的有效数据与已经发布的金冠苹果参考基因组序列（https：//www.rosaceae.org/data） 进行比对，计算出比对到参考基因组 （参考基因组大小为609314018 bp） 上的 reads条数、测序深度及碱基覆盖率。结果表明，四个样品的比对率均在87%以上，两个亲本的测序深度达到15×以上，抗感池样品的测序深度达到 30×以上。在参考基因组中至少有1个碱基覆盖的位点占基因组的比例达到95%以上，至少有 4 个碱基覆盖的位点占基因组的比例 “富士” 为88.3%，“金冠” 为91.26%，其他两样品达到96%以上。这进一步的说明，本试验测序的数据质量很高，可用于后续的变异检测及相关分析 （表4-2）。样本比对到reference上的reads条数①有效测序数据的reads总条数比对率/%②平均测序深度/x③参考基因组中至少有1个碱基覆盖的位点占基因组的百分比/%参考基因组至少有4个碱基覆盖的位点占基因组的百分比/%富士455966535167993488.2315.9595.9588.3金冠459536665247951087.5615.6798.0991.26BR（基因抗池）10045340711312810688.834.4298.896.67BS（基因感池）8962925610163794888.1830.8898.7896.44表4-2 测序深度及覆盖度统计通过全基因组重测序技术共获得3399950个 SNP 位点，苹果参考基因组总长度为 609314018 bp，据此计算出 SNP 出现的频率为3399950/609314018=0.56%。转换 （T/C、C/T） 和颠换 （T/G、T/A、C/A、C/G） 发生频率 （附图 4-4） 的统计结果显示，T/C 和C/T转换发生的频率分别为 32.5%和 34.1%，T/G、T/A、C/A和C/G颠换发生的频率分别为 9.2%、9.4%、9.4%、5.4%。转换/颠换率为2.0。利用测序获得的有效数据，比对苹果参考基因组序列，经 ANN-OVAR软件分析共得到 SNP 位点 3399950个，InDel 位点 573040个，SNP 位点位于内含子上的465317个，位于外显子上的436309个，其中同义变异 210404个，非同义变异 220539个，InDel 位点位于内含子上的 108996个，位于外显子上的 19957个，其中插入或缺失3 或 3 的整数倍的碱基，不改变蛋白质的编码框的有 6928个。这表明绝大部分变异位于非编码区，或不会导致基因编码的改变，这有利于维持植物体正常的生长发育，保证品种特性的稳定遗传 （表4-3）。类别SNP数量基因上游184156获得终止密码子4837失去终止密码子529外显子同义变异210404非同义变220539内含子465317剪接位点2196基因下游177312基因上游/基因下游12750基因间区2105122转换2265734颠换1134216转换/颠换/%1.997合计3399950表4-3 SNP及InDel检测及注释类别InDel数量基因上游51816获得终止密码子376失去终止密码子68Frameshiftdeletion①7330外显子Frameshiftinsertion5255Non-frameshiftdeletion②3843Non-frameshiftinsertion3085内含子108996剪接位点598基因下游44305基因上游/基因下游3896基因间区342800插入262868缺失310172合计573040表4-3 SNP及InDel检测及注释（续）-1△ （SNP-index）=SNP-index B （极端抗病性状）-SNP-index A （极端感病性状）。进行1000次置换检验，选取95%置信水平作为筛选的阈值。一般情况下，在苹果 F1 群体中，由于每个位点的碱基均来源于双亲中的一个，所以在基因组中大部分区域的 SNP-index都在0.5附近。如果某个SNP 位点与抗性相关，那么在该处的 SNP-index就会显著偏离0.5，△ （SNP-index） 就会显著大于此处的阈值。从抗感池中△SNP-index值在染色体上的分布可以看出，在第15 条染色体2～5 Mb区间内△SNP-index值显著的大于阈值，预示着该区域内可能存在着与抗炭疽菌叶枯病基因相关的位点 （附图4-5）。这与第三章SSR标记所确定的抗性基因所在的区域吻合。在全基因组范围内挑选在两个子代池中 SNP-index 差异显著的SNP 位点，即挑选在抗池中 SNP-index 大于 0.7，在感池中 SNP-index小于0.3，△ （SNP-index） 大于 0.5 的 SNP 位点，并与亲本‘富士’ 为纯合，亲本 ‘金冠’ 为杂合的位点取交集，共得到258 个候选的多态性标记位点 （表4-4）。这258 个 SNP 位点中位于基因上游1 kb的19个，基因下游1 kb 的12 个，位于基因上游1 kb 区域，同时也在另一基因的下游1 kb区域的2 个，位于基因间区的173 个。位于外显子上非同义变异的13 个，同义变异7 个，位于内含子上的31个。其中位于第15条染色体上的有123 个，占整个候选 SNP 位点的47.7%。类别SNP数量基因上游19获得终止密码子0失去终止密码子0外显子同义变异7非同义变13内含子31剪接位点1基因下游12基因上游/基因下游2基因间区173转换161颠换97转换/颠换/%1.659合计258表4-4 候选多态性标记位点的注释提取ANNOVAR的注释结果，优先挑选能引起基因获得终止密码子、失去终止密码子的变异，或者非同义突变，或者可变剪接的位点所在的基因作为候选基因。经筛选后得到33 个 SNP 位点及所对应的29个候选基因 （表4-5）。这些SNP 位点中发生转换的 （G/A、C/T、T/C、A/G） 共 16 个，占 48.5%，发生颠换的 （G/C、C/G、G/T、A/C、A/T、T/G、T/A、C/A） 共17 个占51.5%，其中有21 个位于第15条染色体上。基因ID类型染色体SNP位点参考基因组碱基型Ref突变碱基型AltMDP0000294705nonsynonymous24029182TCMDP0000311597upstream26560007TCMDP0000335197upstream238255166CTMDP0000481284nonsynonymous511687941TCMDP0000266783nonsynonymous516570950ACMDP0000223383upstream814935907CTMDP0000203531upstream918259400TGMDP0000265695upstream919790733GAMDP0000224187nonsynonymous1034991229ATMDP0000226279upstream1123158805AGMDP0000480608upstream123704417TGMDP0000504610upstream1229472316TCMDP0000292279upstream151396770CTMDP0000686092nonsynonymous153955717AGMDP0000686092nonsynonymous153955724AGMDP0000686092nonsynonymous153955738TAMDP0000205432nonsynonymous154094431TAMDP0000120033upstream154236293AGMDP0000864010nonsynonymous154257246GAMDP0000945764nonsynonymous154336468CAMDP0000149107splicing154970310CTMDP0000609131upstream156771435CAMDP0000169753upstream157074724ACMDP0000296372upstream157704309CT表4-5 候选基因ID基因ID类型染色体SNP位点参考基因组碱基型Ref突变碱基型AltMDP0000199827upstream157710714TAMDP0000194508nonsynonymous157757532GAMDP0000320004upstream158084422ATMDP0000320004upstream158084636TCMDP0000320004upstream158084637ACMDP0000148808upstream158365795GTMDP0000133266upstream1533862275AGMDP0000157213nonsynonymous1549031042CGMDP0000169687nonsynonymous1552444208TC表4-5 候选基因ID（续）-1结合 SSR标记定位及全基因组重测序中对△ （SNP-index） 值分析的结果，从这29 个候选基因中筛选出位于第15 条染色体3.9～4.9 Mb距离内的5个基因 MDP0000686092、 MDP0000205432、MDP0000120033、 MDP0000864010、 MDP0000945764 做为抗炭疽菌叶枯病的最终候选基因。通过对5个候选基因进行 GO 功能富集分析发现，5 个候选基因中有3个功能未知。基因 MDP0000120033 具有核酸绑定功能，锌离子结合分子功能，参与 RNA 剪切生物过程，调节基因产物的表达。蛋白结构上具有CCHC型结构域的锌指结构，是丝氨酸精氨酸富集剪接因子。进一步同源比对该基因为 SR基因家族 RSZ亚家族基因，与拟南芥AtRSZ21蛋白的序列一致性达到60%，与花生AdRSZ21蛋白的序列一致性达到79%。基因 MDP0000864010 具有辅酶绑定功能，蛋白结构上具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 （磷酸盐） NAD （P） 绑定区域，属于NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族，进一步的同源性比对，该蛋白与鼠李糖生物合成酶 1 （rhamnose biosynthetic enzyme 1，RHM1） 有较高同源性 （表 4-6）。候选基因编码的氨基酸序列见附录五。基因ID基因功能注释MDP0000686092功能未知蛋白MDP0000205432功能未知蛋白质。MDP0000120033核酸绑定功能，锌离子结合分子功能，参与RNA剪切生物过程，调节基因产物的表达。具有锌指结构，CCHC型结构域，丝氨酸精氨酸富集剪接因子。MDP0000864010辅酶绑定功能，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸盐）NAD（P）绑定区域，NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族，可能与鼠李糖生物合成酶1有关。MDP0000945764功能未知蛋白表4-6 抗炭疽菌叶枯病候选基因的功能注释利用TMHMM2.0软件对候选基因进行跨膜结构分析，基因MDP0000686092和MDP0000120033具有跨膜结构。基因MDP0000686092具有1个跨膜区，基因MDP0000120033具有3个跨膜区，位置分别在153～172、187～209、214～236的区域内（附图4-6）。引物名称引物序列MDP0000686092基因荧光定量PCR引物P1-FP1-RF：5′-CAGGCTGGAGCGAAGTTTA-3′R：5′-CCTTTCTGTGATGGCATTGTT-3′MDP0000205432基因荧光定量PCR引物P2-FP2-RF：5′-GAAAAGCCAGCACCAGAAAC-3′R：5′-CGTATTCGTGGGGTTATAGAGC-3′MDP0000120033基因荧光定量PCR引物P3-FP3-RF：5′-TCTGGGAATGCTGCTAAAACTC-3′R：5′-GCAGGGCAGTAGTGAAGCAC-3′MDP0000864010基因荧光定量PCR引物P4-FP4-RF：5′-CGTGACCAATCGCCTAATA-3′R：5′-GGACGTGAGTGCCGTAGAC-3表4-7 荧光定量PCR引物引物名称引物序列MDP0000945764基因荧光定量PCR引物P5-FP5-RF：5′-TTTGCCAGCCTGTCAGAAGT-3′R：5′-AGTTGTAGAGGGAGGAGGAAGA-3′β-actin基因荧光定量PCR引物P6-FP6-RF：5′-CACTGCTTCTATGACTGGTTTTGA-3′R：5′-CTGGCATATACTCTGGAGGCTT-3′表4-7 荧光定量PCR引物（续）-1对接种炭疽菌叶枯病病菌后 0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h的 ‘富士’ 和 ‘金冠’ 枝条进行采样，提取 RNA，反转录成cDNA后，对5个候选基因的表达进行实时荧光定量分析。结果显示，5个基因均不同程度响应病原菌侵染 （附图4-7、 表4-7）。除了基因MDP0000864010在 ‘富士’ 叶片中的表达量表现为下调外，其余 4个基因均为上调表达。在 ‘富士’ 叶片中，基因 MDP0000205432、MDP0000120033和MDP0000945764 的表达量在接种后 24 h 均达到最高值，48 h降到最低值，然后又缓慢提高。在 ‘金冠’ 叶片中的表现不同于 ‘富士’，三个基因表达量的最高值出现在36 h，但最低值同样出现在48 h，这说明在这3个基因在抗病植株中对病原菌的应答要早于感病植株。尽管基因 MDP0000686092 和 MDP0000945764 在‘富士’ 和 ‘金冠’ 叶片中也均表现为上调表达，但是在 ‘金冠’ 叶片中的表达变化更为显著，基因 MDP0000945764 在 ‘金冠’ 叶片中的表达量达到最高值时为接种前的60 倍，而在 ‘富士’ 中的提高量为接种前的10倍。以上结果说明，5个候选基因均受炭疽菌叶枯病病菌的诱导，是苹果炭疽菌叶枯病抗病相关基因。SNP 标记的开发主要依赖于含有大量测序序列的数据库。通过全基因组测序，不仅可以获得大量的 SNP 标记，还可以了解到 SNP 标记在整个基因组中的分布情况，有利于我们进一步了解不同物种的生物学特性，以及利用标记进行不同需求的生物学研究。在葡萄的基因组测序中发现，SNP 位点的密度高达7%（Jaillon et al.，2007）；2010发表的金冠苹果全基因组序列中，SNP 标记的频率约为 4.4 kD/SM，即227 bp/SNP （Velasco et al.，2010）；梨的全基因组序列中共检测到3402159个 SNP 位点，约占基因组序列的 1.02%（Wu et al.，2013）；柑橘中得到的 SNP 位点数量为106 万个 （Xu et al.，2013）。对于有参基因组，通过全基因组重测序手段进行大量 SNP 标记开发，也是研究不同品种间差异的有效途径之一。通过对6 个玉米自交系的进行全基因组重测序，在非重复序列区域内共获得了 1272134个SNP 标记 （Lai et al.，2010）；对葡萄的230个基因片段重测序，数据统计结果显示，每64 个碱基中就存在着一个 SNP 位点 （Lijavetzky et al.，2007）；在水稻中，水稻籼稻恢复系 7302R 通过全基因组重测序，检测到307627个SNP 位点，其中有30239个位于mRNA序列中（Li et al.，2012b）；通过对苹果品种 ‘金冠’ 和 ‘红玉’ 进行全基因组重测序，在 ‘金冠’ 中得到了 2222816个 SNP 位点，在 ‘红玉’中得到了 4950346 个 SNP 位点，密度分别为 293 bp/SNP 和210 bp/SNP （孙瑞，2015）。SNP 变异从理论上来看主要包括转换、缺失、颠换和插入四种形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2∶1。并且SNP 在CG序列上出现的最为频繁，而且多是 C 转换为 T，主要原因为CG中的胞嘧啶常被甲基化，而后自发脱氨基形成胸腺嘧啶 T （Johnson and Told，2000；Mullikin et al.，2000）。从本实验中对 SNP转换/颠换频率统计结果来看，转换/颠换比为2.0，发生转换的频率为66.6%，发生颠换的频率为 33.4%，C/T 转换发生的频率最高为34.1%。这与前人研究的结论相符。通过重测序技术可以获得海量SNP 标记，利用这些标记构建高密度遗传连锁图谱为不同群体的进化分析，不同性状基因的遗传定位，分子标记辅助育种等提供有效信息。‘M.27’בM.116’ 的高密度遗传图谱是由306个SSR标记和2272个 SNP 标记组成，图谱密度达到了每 0.5 cM 一个标记 （Antanaviciute et al.，2012）。Khan 等（2012） 利用2875个分子标记构建了苹果的整合遗传图谱，其中包含了2033个 SNP 标记和 843 个 SSR 标记，总长为 1991.38 cM。Clark等 （2014） 利用3个不同的F1 杂交群体和SNP 芯片分型技术构建了包含1091个 SNP 标记的苹果品种 ‘Honeycrisp’ 的整合遗传图谱，标记间的平均距离为1.36 cM。基于高通量基因组重测序技术能够更加准确、全面的对测序物种进行全基因组水平上的位点进行评估，可以精确的完成单核苷酸多态性位点的检测，分子标记的开发，遗传图谱的构建，不同群体间的进化分析，与表型变异相关基因的挖掘以及快速定位等等。本研究通过运用全基因组重测序的方法对有着明显抗感性状分离的 ‘金冠’ 和 ‘富士’ 及其由 F1 代极端表型个体组成的抗感池进行全基因组范围内的遗传变异检测，共筛选得到 SNP位点3399950个，InDel位点573040个。通过对△SNP-index图谱的分析发现，在第15条染色体的2～5 Mb的区间内，△SNP-index显著的大于阈值，存在着明显的连锁不平衡，意味着该区域可能存在着抗炭疽菌叶枯病基因位点。这一结果与SSR标记所定位的抗炭疽菌叶枯病基因位点位置相吻合。SNP 广泛分布于基因组DNA中，且数量巨大。因为任何碱基均有可能发生变异，因此SNP 既有可能出现在基因的编码区，也有可能在基因的非编码区，或者两个基因之间的序列上。总的来说，位于基因内编码区的SNP 比较少，且该部分的 SNP 有可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此位于编码区 SNP 的研究更受关注。本试验对可能引起基因获得终止密码子、失去终止密码子、非同义突变、可变剪接的变异位点进行重点筛选，将其所在的基因作为候选基因。通过筛选共得到33个候选SNP 位点和29个候选基因。结合第三章SSR标记对炭疽叶枯病抗性基因的定位，最终锁定了 5 个候选基因： MDP0000686092、 MDP0000205432、 MDP0000120033、 MDP0000864010、MDP0000945764。锌指结构是一类在很多蛋白中存在的具有指状结构的模体，是具有识别特定碱基序列的一种转录因子结构。锌指的典型功能是作为互作的组件与核酸、蛋白质和小分子等多种物质相结合，参与多种细胞过程，如DNA的复制与修复、RNA 转录与翻译、物质代谢与信号转导、细胞的增殖与凋亡等 （Krishna et al，2003）。可变剪切 （Alternative splicing，AS） 是重要的转录后调控机制，在动物中对其在不同的生理以及病程条件下的可变剪切的调控作用研究的较多 （Garcia-Blanco et al.，2004；Nilsen and Graveley，2010）。据报道在拟南芥中超过 42%的外显子基因存在可变剪切现象（Filichkin et al.，2010）。在植物可变剪切数据库中有很大比例的 AS参与逆境响应基因的表达，这进一步强调了可变剪切在逆境响应中的重要作用 （Wang and Brendel，2006；Duque，2011）。在生物胁迫中，有许多试验证明AS参与植物的抵抗和防御机制。例如，在一些 R 基因中如番茄的N 基因，拟南芥的SNC1、 RPS4基因，发现可变剪切的存在 （Dinesh-Kumar and Baker，2000；Zhang and Gassmann，2003）。SR蛋白，丝氨酸/精氨酸富集剪切蛋白 （serine/arginine-rich proteins，SR protein） 是RNA绑定蛋白家族中功能和结构高度保守的一类因子，参与可变剪切过程。例如， AtSR30在高盐碱以及过氧逆境中被上调表达 （Tanabe et al.，2007）。SR在不同的环境条件下的表达量的差异说明了SR蛋白在逆境响应中的调控作用。基因MDP0000120033具有核酸绑定，锌离子结合分子功能，参与 RNA 剪切生物过程，调节基因产物的表达。具有CCHC型锌指结构和丝氨酸/精氨酸富集剪接因子，属于SR 基因家族 RSZ 亚家族基因。丝裂原活化蛋白激酶 MPK6 和MPK3在植物的防御反应中起着重要作用，而拟南芥基因 AtRSZ21 在体外试验中被发现能够被MPK6/MPK3磷酸化 （Feilner et al.，2005），这就意味着 AtRSZ21 也可能参与了植物的防御应答。Kumar 和 Kirti （2012） 报道了花生的一个属于 SR 亚家族基因 RSZ 蛋白基因AdRSZ21，在植物的超敏反应和抗逆反应中起着重要的作用。NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族是真菌病原体镰刀菌致病机制中的一个关键酶 （Srivastava et al.，2014）。细胞壁是植物细胞进行正常的生命活动不可缺少的重要组成部分。其不但在维持细胞形态、细胞间黏结、细胞壁的强度和调控细胞伸长等方面起着重要的作用，还参与了细胞的分化、抗病、细胞识别及信号传导等一系列生理、生化过程。细胞壁主要成分包含纤维素、半纤维素、果胶和少量的结构蛋白等。基因MDP0000864010属于依赖差向异构酶/脱氢酶家族，并且与鼠李糖合成酶Ⅰ （ RHMⅠ） 有较高的同源性。可能参与合成鼠李糖，而鼠李糖是细胞壁果胶多聚糖的重要组分之一。所以该候选基因有可能在细胞的组成层面增加个体的抗性。基因的相对表达量分析也表明，五个基因都不同程度的响应了病菌的诱导，是与抗炭疽菌叶枯病相关的候选基因。但是其参与抗病的机理和途径仍不清楚，深入的研究将继续展开。

马铃薯晚疫病是一种毁灭性病害，从20世纪在欧洲暴发引起大饥荒以来，在全球范围内绝大多数马铃薯栽培地区广泛传播。1996年，据CIP（国际马铃薯中心）估计，全球因晚疫病造成的直接经济损失达到170亿美元，发展中国家的损失53亿美元。晚疫病的危害性、防治难度及对社会的影响早已超过水稻稻瘟病和小麦锈病，被视为国际第一大作物病害。近几十年随着分子生物学技术的发展，各国科学家都对马铃薯晚疫病病菌的分子遗传学进行了深入的研究。本文仅对分子标记技术在晚疫病病菌研究中的应用进行简要的综述。限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，简称RFLP）。RFLP是出现最早，现在依然使用最普遍的DNA标记。RFLP技术的基本原理是：不同材料的DNA用已知的限制性内切酶消化后，产生许多大小不等的DNA片段，电泳分离、Southern印迹转移到硝酸纤维膜上，用放射性标记的探针与膜上变性的酶切DNA进行杂交，放射自显影，即可显示出不同材料的多态性图谱，即显示出所分析的DNA序列间的RFLP。目前，有两种方法可进行DNA的RFLP分析：①如原理中所述，其中用作RFLP的探针可以是特殊基因的DNA克隆、cDNA克隆、随机的基因组DNA克隆和合成的低聚核苷酸克隆。②对那些分子量较小的DNA样本（如线粒体DNA、核糖体DNA等），可在酶切后对其产物直接电泳，将不同大小的限制性酶切DNA片段分离，从而得到该DNA的RFLP图谱。RFLP反映了DNA水平上的差异，而差异往往是由变异造成的，变异分为单碱基突变型和结构重排型两大类。单碱基因突变发生在限制性内切酶的位点上，致使酶切位点增加或丢失而产生多态性，这称为点多态性。结构重排型是指DNA序列内部发生了较大的变化，如插入或缺失，从而使酶切位点间的长度发生改变，造成了片段长度的多态性。这些变异经酶切、分离、杂交、放射自显影就会使RFLP带的特征发生改变，由此对生物的变异进行分析。目前，在晚疫病病菌的研究中，RFLP技术主要用于病菌群体的遗传分化，如：分析一个国家或地区致病疫霉种群的基因结构及变化；有性生殖的发生情况等。1992年Stephen等利用RG57探针分析了墨西哥中北部的晚疫病病菌遗传结构，发现墨西哥中部病菌的遗传多样性非常明显，这也充分说明这个地区由于A2交配型的存在有性重组率高于其他地区[1]；1993年Drenth等将采自荷兰6个地区的153个菌株分为35个RG-57基因型，明确了荷兰不同地区基因型的分布情况[2]；1998年Lionel等利用RG57探针和同工酶基因型研究发现采自番茄和马铃薯上的晚疫病病菌基因型明显不同，说明晚疫病病菌有寄主专化作用[3]。目前利用该标记对来自全世界的成千上万的马铃薯晚疫病病菌建立了指纹图谱数据库。1990年Williams等人首次应用随机引物扩增寻找多态性DNA片段作为分子标记，并将此法命名为随机扩增多态性DNA（Random amplified polymorphism DNA，RAPD）[4]。RAPD技术是建立在PCR技术基础上的，利用随机的短的脱氧核苷酸序列作为PCR引物（通常为十聚体）以基因组DNA为模板进行PCR扩增。通过凝胶电泳分离得到扩增产物DNA片段的多态性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同，但对任一特定的引物，它同基因组DNA序列有特定的结合位点。如果基因组在这些有特定位点的区域发生DNA插入，缺失或碱基突变就可导致这些特定结合位点发生相应的变化。通过对PCR产物的检测可测出基因组DNA在这些区域的多态性。在RAPD分析中可用一系列的引物使检测区域扩大至整个基因组。因此，RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性分析，适于研究生物的遗传多样性及生物的遗传关系，进行遗传作图和基因定位等。在晚疫病病菌的研究中，RAPD技术一般多用于研究种内群体遗传分析。如：Mahuku[5]对1994～1996年采自加拿大的141个菌株进行RAPD分析，将其分为21个组，分析表明97%的变异来自于种群内，3%的变异来源于种群间。2001年朱杰华等利用RAPD方法研究了马铃薯晚疫病病菌DNA多态性与A2交配型的关系[6]。2005年侯淑英等使用178个10bp随机引物对晚疫病病菌的甲霜灵抗性性状进行RAPD分析，得到一个相对稳定的与甲霜灵抗性连锁或相关的标记S500，为晚疫病的有效防治和病原菌的抗药性治理提供了理论依据和实践方法[7]。AFLP是1993年由荷兰keygene公司科学家Zabeau等人发明的一种DNA分子标记技术[8]，该技术的基本原理是：对基因组DNA进行限制性酶切片段的选择性扩增。主要步骤是：将基因组DNA进行限制性酶切后，将特定的接头连接在DNA酶切片段的两端，从而形成一个带接头的特异片段，通过接头序列和PCR引物3'端的识别，进行PCR扩增，最终经过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，通过银染或放射自显影检测。AFLP技术实际上是将RFLP和PCR相结合的一种技术[9～10]。该技术既继承了RFLP的稳定性，又具有PCR反应快速、灵敏的特点，同时克服了RFLP和RAPD的缺点，且扩增的带纹多（50～100条）。AFLP的大多数扩增片段与基因组的单一位置相对应，实验重复性高，该标记为孟德尔式遗传。目前，AFLP 技术主要用于构建晚疫病病菌的基因连锁图谱，此外也被用来检测病菌的基因型。1997年，Van de Lee[11] 等完成了一张比较完整的致病疫霉基因连锁图谱，这张图谱包括183个AFLP标记，7 个RFLP 标记和交配型基因座，包括10个主要的连锁群和7个次要的连锁群，共827cm，并证明主要连锁群中的标记来自于两个亲本，而次要连锁群中的标记来自A1 交配型的亲本或来自A2 交配型的亲本。同时还证明了致病疫霉是同核型的二倍体[12]。Cooke[13]，Flier等[14]以及Knapova等[15]利用AFLP对来自墨西哥和欧洲的病菌研究发现，墨西哥的菌株几乎每个都具有其特异的AFLP基因型，而欧洲的菌株平均每两个就具有一个特异的AFLP基因型。AFLP带型在分裂中能够保持稳定，并遵循孟德尔遗传规律[16]。交配型及其所在的连锁群的其他标记均不遵循孟德尔遗传规律。AFLP技术用于构建基因连锁图谱，使我们可以从基因水平了解晚疫病病菌，为更好地研究晚疫病病菌、防治晚疫病提供理论依据。短序列重复即SSR（Short sequence repeat）、又称微卫星DNA或短串联重复（Short tandem repeat，STR），这是一类由1～5个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列[17]。同一类的微卫星DNA可分布于整个基因组的不同位置上，由于基本单元重复次数的不同以及重复程度的不完全而造成了SSR位点的多态性，这种多态性有比较丰富的信息量。由于在每个微卫星DNA两端的序列是相对保守的单拷贝序列，因而可根据两端的序列设计一对特定的引物，扩增每一位点的微卫星序列，再经凝胶电泳比较扩增产物的长度变化，即可显示不同基因型个体在微卫星DNA位点上的多态性[18～19]。SSR技术的特点是：呈共显性遗传；在数量方面没有生物学上的限制；其标记带型简单，记录的条带一致、客观、明确；采用PCR技术进行检测只需少量DNA样品，且质量要求不高，即使是部分降解的样品也可进行分析；每个位点均有许多等位形式；另外，它还具有多态性高、实验程序简单等优点[19～20]，所以自1989年SSR技术产生以来，被广泛应用于基因定位和QTLs分析、DNA指纹和品种鉴定、种质资源保存和利用、系谱分析和标记辅助育种[18]。2001年Knapova [21]等首次利用SSR技术研究了瑞士和法国的马铃薯和番茄的晚疫病病菌群体的遗传多样性，同时分析了致病疫霉有性杂交F1代的分离情况，结果发现被测菌株群体具有丰富的遗传多样性。试验中6个SSR位点被鉴定出来，其中的3个SSR位点具有多样性，他们又从3个SSR位点中选择了2个SSR位点的引物（Pi4G和Pi4B）对来源于瑞士和法国的176个菌株进行了鉴定，分别得到4种和6种不同长度的等位基因片段（共21个组合）。2002年G.Knappva [22]等再次报道了法国和瑞士的晚疫病病菌的表型和基因型结构，他们研究的马铃薯晚疫病病菌株中存在11个SSR基因型，其中以A-03和A-06为主，另有1/9的菌株是其他SSR基因型；但尚未发现SSR基因型与菌株的交配型、对甲霜灵的敏感性和菌株来源的地域性有相关关系。Knappva[21～22]等的研究揭示了SSR分子标记适用于分析晚疫病病菌的群体结构，同时也指出了SSR标记技术在病菌应用的潜力和存在的问题，如stutter bands、非特异扩增等。但同其他分子标记相比，SSR技术具有位点特异的优点，有利于分析全球马铃薯晚疫病病菌的种群结构。若能对SSR标记技术进行大量人力、物力的投入，获得更多理想的SSR标记，这种技术将具有巨大的应用潜力。2004年朱杰华用AFLP分子标记研究了河北、云南、四川及黑龙江省的50个晚疫病病菌株的DNA指纹，当欧式距离为10时，50个菌株被聚类为4组，分组情况与菌株来源的地理位置相关，表明马铃薯晚疫病病菌的DNA的AFLP分子标记多样性与病菌的地理来源及病菌对甲霜灵的抗性有一定相关性，但未发现和生理小种及交配型有相关性[23]。2004年魏长拴用RAPD分子标记分析了我国马铃薯主产区的晚疫病病菌的亲缘关系和遗传相关性[24]。2005年郭军等利用SSR、AFLP和线粒体DNA单倍型技术分析了内蒙古地区马铃薯晚疫病病菌的遗传多样性。2006年姚国胜等利用SSR技术测定出中国菌株中存在7种SSR基因型[25]。总的来说，分子标记技术在我国马铃薯晚疫病病菌的研究中应用还很少，今后应进一步将各种分子标记技术应用到马铃薯晚疫病病菌的研究中。综上所述，DNA分子标记技术在马铃薯晚疫病病菌遗传研究上具有重要应用价值，并已取得了可喜的进展，展现了广阔的应用前景。现已研究了晚疫病病菌发源和墨西哥以外地区A2交配型的来源，为晚疫病的防治提供理论基础；明确了一个地区不同菌株之间的基因结构变化，遗传结构差异。利用DNA分子标记技术绘制晚疫病病菌的连锁图谱，使两个标记间距离足够小；借助高密度标记对一些性状基因进行准确定位，从而为抗病育种研究提供科学依据；并运用分子标记找到与目的基因紧密连锁的标记，如在致病疫霉中找到与抗瑞毒霉基因连锁的标记，与毒力基因连锁的标记，从而指导晚疫病的防治。由于上述几种分子标记都各有优缺点，任何一种均不能满足晚疫病病菌遗传研究的所有要求。所以如何更好地利用各种分子标记研究马铃薯晚疫病病菌，预防和控制马铃薯晚疫病，仍需不断研究。