水稻条纹叶枯病是由灰飞虱传播的发生严重的病毒病，近年来，在浙江北部稻区呈快速蔓延扩大趋势，对水稻安全生产构成极大威胁。为了调查测定水稻条纹叶枯病为害与损失，为制订防治指标提供科学依据，2005～2006年我们在浙江嘉兴对水稻条纹叶枯病为害损失进行较为系统的测定，现将结果综合整理如下：单季晚稻，秀水09。在4月下旬采用生物法测定当地灰飞虱带毒率。自5月15日播种后，每隔3～5天调查秧田期灰飞虱虫口密度；6月15日移栽后，每隔5天调查本田初期灰飞虱密度，于发病后（6月下旬）开始每隔3～5天定点调查水稻丛发病率、株发病率。于病情稳定后（8月15日），根据田间自然发病情况，选取不同发病率（形成发病梯度）的点59个，每个点抽查20丛（200株），调查株发病率，待水稻成熟后单丛考种测产。据生物法测定，灰飞虱带毒率为2.01%。5月中下旬调查，秧田期灰飞虱虫量平均每平方米213头，推算带毒虫量平均每平方米为4.473头。本田期病情稳定期调查，水稻株发病率平均为4.88%，二者之比为1：1.091，见表1、表2。调查日期（月/日）成虫数（头/m2）若虫数（头/m2）合计虫量（头/m2）折合667m2（亩）虫量（万头）5/207070.46675/23193221.46675/26292312.06675/29815865.73346/4145915410.26676/81961721314.20016/121842420813.86676/151653920413.6001表1 秧田期灰飞虱虫量调查（浙江嘉兴，2006）调查日期（月/日）定点丛数调查株数发病丛数发病株数丛病率（%）株病率（%）6/2020062000006/2420086000006/28200136015197.51.46/3020013602429122.17/320018603241162.27/520019003692184.847/720019003692184.847/10200205040100204.887/1720021804310221.54.65/152002180399719.54.45表2 本田期条纹叶枯发病的系统调查（浙江嘉兴，2006）水稻条纹叶枯病株发病与产量损失率关系测定结果，平均株发病率为0.5%～11.5%，产量损失率为0.33%～9.02%。株发病率与产量损失率二者之比为1：0.576～1.01，平均为1：0.792，见表3。随着水稻发病株率（X）上升，产量损失率（Y）加大，两者具密切的相关性，建立的关系式为：Y=0.4768+0.7276X，r=0.8898**。株发病率（%）水稻200穗产量（g）产量损失率（%）株病率与损失率之比0.0（对照）524.20.5522.50.330.661.0518.91.011.011.5518.11.160.7732.0514.71.820.912.5616.61.440.5763.0509.72.760.923.5508.92.910.8314.0507.343.210.8034.5504.63.730.8295.0504.73.730.7465.5501.64.320.7856.0502.04.240.7076.5501.74.290.667.0493.55.870.8397.5490.06.520.8698.0488.66.800.858.5489.26.670.7859.0490.46.460.71810.0483.67.750.77511.5476.99.020.784对照（0.0）524.2表3 水稻条纹叶枯病发病率与水稻产量损失率测定（浙江嘉兴，2005～2006）大田调查测定结果表明，水稻条纹叶枯病发生与灰飞虱虫口密度高低和带毒率具有密切相关性，随着灰飞虱虫口密度提高，为害程度上升，产量损失率加大，建立了为害损失关系式。条纹叶枯病发病株率与产量损失率之比，2年测定结果为1：0.576～1.01，平均为1：0.792。田间调查表明，水稻条纹叶枯病发病后，前期稻苗大多枯死，对产量损失大。该调查结果为条纹叶枯病发病为害损失评估，制订防治指标提供科学依据。

RSV(Rice stripe virus)is a kind of viral disease transmitted by Laodelphax striatellus(LS).Once paddy rice infected with the virus,it is difficult to control the disease which would cause great loss of rice production.In recent years,as the cropping system changed and climatic conditions suited,the trend of Rice stripe virus RSV disease tend to go up acutely in north part of Zhejiang,especially in Jiaxing and Huzhou.The two cities became the most severe area Rice stripe virus RSV occurred.The RSV forecasting and prediction was the foundation to control and prevent the disease.From 2005 to 2007,we selected the key predict factors based on the study of RSV occurrence patterns established forecasting model and predicted the disease successfully in 2006 and 2007.The integrated results reorganized as following:In the observation area,investigate the quantity of LS in wheat field,the seedling field time and rice growth stage,analysis the RSV disease rate under the conditions of different pest amount.Determine the disease rate of the winter generation of LS with quick-detection method and biological assay,compare the conversion relation between the two methods,and investigate the disease condition in the steady-going periods,analysis the relation between the carrier rate and the occurrence of the disease.Sow the seeds in four stages equally in 2006 and 2007,the sowing time respectively be May 15,on May 22,on May 29 and on June 5.There is 7-days interval between every two stages,duplicates 3 times in each stage,and the field area is 333m2in each plot.Sow the seeds by stages,transplant the seedling in turn when they are 30-days-growing periods.In the steady disease occurring time,investigate cluster disease incidence and individual disease incidence,analysis the influence of sowing time did on RSV.In the steady disease occurring time,do a large-area survey of RSV disease on the main paddy rice variety in the whole city,observes the anti-(bears)degree of each variety to RSV.Collect historical materials including cultivation,planting,variety and meteorology,analysis the relations between them and the plant disease.Use has gradually regression and simulating model methods to set up forecasting model,and predict the disease trend.2.1.1 The carrier rate of LS In 2005,2006 and 2007 we determined the carrier rate of LS by biological assay in Xiuzhou area,the city of Jiaxing,Zhejiang province.The results were 0.0%,2.01%and 2.69%respectively.We had a survey in the unprevented field in the steady disease occurring time in the middle ten days of July,and the result showed that disease conditions among the fields were remarkably different.The carrier rate could not be tested in 2005,so the disease was not serious and the average diseased cluster rates of early planting field,middle time planting field,late planting field were 3.1%,1.2%and 0.0%respectively.The disease aggravated in 2006,the carrier rate increased to 2.01%and the average diseased cluster rates of early planting field,middle time planting field,late planting field were 18.5%,10.1%and 1.2%respectively.When the carrier rate was 2.69%,the disease continually aggravated and the average diseased cluster rates of early planting field,middle time planting field,late planting field were 21.5%,16.5%and 1.5%respectively.It showed that the carrier rate affected the prevalence of disease directly,and the relationship between the two was very close.The higher the carrier rate was,the greater the disease incidence would be,instead the disease incidence lighter.According to the Japanese experience,when the carrier rate(qick-detection method)is more than 3%,the prevalence of RSV is more likely to happen.If the carrier rate ＞12%,there would be a seriously epidemic trend.According to the comparison of carrier rate and biological assay in recent years,the results tested by the two methods were different.The result of biological assay was significantly lower than that qick-detection method,and the ratio was about 1:1.75.Therefore,we chosed biological assay for prediction.When the carrier rate ＞1.71%,the disease had moderate trend,when the carrier rate ＞6.86%,there was a pandemic disease trend.YearInfestingnymphes(%)Infestedhill(%)EarlysowingMidsowingLattersowing20050.003.11.20.020062.0118.510.11.220072.6921.516.51.5Table 1 The relatonship between the rate of viruliferous LS and the ccurrence of Rice stripe virus RSV (Xiuzhou Jiaxing,2005～2007)2.1.2 Amount of LS Under certain conditions of carrier rate,amount of LS is an important factor to determine whether the RSV would be prevail or not.The higher the volume of insects was,the greater the incidence was,instead the incidence lighter.In recent years,amount of LS continued increase.In years 2005,2006,2007,the amount of first generation LS per 667m2 in wheat field reached 2.98 million,2.877 million and 4.093 million.LS transferred to the nearby weeds or other crops after the wheat harvest.They moved to the seedling when rice is planting and caused RSV occurring.It has been observed that the first peak incidence(7/early) caused by the first genenration LS generation was more serious than the second peak incidence(8/early)caused by the second generation insect,because the first generation LS had a large amount a high rate of virus spreading.But as the second generation LS lived in high-temperature season,the insect amount of was small and rate of virus spreading was low,so the disease was lighter.2.1.3 Sowing date of paddy rice Paddy rice sowing date is an important factor to influence RSV.The incidence would be heavier when the sowing time was sooner,otherwise the incidence was lighter or even not onset.We had a investigation in a stable condition period(mid-July)among different rice sowing time in years 2005~2007,and found that sowing time were closely related to the occurrence of diseases.For example,in accordance with the four sowing times in 2006,the cluster disease rates were 18.5%,10.0%,5.67%and 1.5%in turn,the individual disease rates were 4.07%,2.69%,1.89%and 0.42%in turn.With the sowing time delayed,the disease lightened.Among the four sowing times in 2007,disease in early planting field was the most serious,the cluster disease rates were 16.2%and 16.67%respectively,the individual disease rates were 5.18%and 7.31%respectively.Disease in late planting field was light,the cluster disease rates were 2.7%and 1.5%respectively,the individual disease rates were 1.9%and 0.7%respectively.YearSowingdateInfestedhill(%)Infestedplant(%)Dup1Dup2Dup3Aver0.050.01Dup1Dup2Dup3Aver0.050.01200620075/1517.516.521.518.50aA4.163.164.884.07aA5/2210.510.59.010.00bB2.553.332.182.69bAB5/296.04.56.55.67cC2.021.072.571.89bBC6/52.00.52.01.50dD0.630.130.500.42cC5/1516.017.015.516.20aA6.225.214.115.18aA5/2218.015.516.516.67aA9.315.826.807.31aA5/293.03.02.02.70bB2.472.350.891.90bB6/52.01.01.51.50bB0.770.680.640.70bBTable 2 RSV occurrence in different sowing date (Nanhu Jiaxing,2006～2007)2.1.4 Cultivation and planting system In recent years,the wheat area has expanded,which wasconducive to the survival and reproduction of the overwintering generation and first generation LS.A wide range of weeds in the field create good conditions for the insects to transit to the rice.According to the observation in 2006,that disease rates of all rice seedling fields near the wheat field was evidently higher than fields away from the wheat field.In the directseeding fields,disease rates in the verge was evidently higher than that in the medial part of the field.As a result of the sowing time was early in the transplanting field,the seedlings were easily infected by massive LS and the disease arised heavily.2.1.5 Paddy rice varieties There are certain differences among different varieties of RSV,generally,disease of sticky rice was heavier than late rice,disease of hybrid Japonica ricewas heavier than ordinary late rice,disease of Late japonica rice was heavier than mid japonica rice,desease of indica rice was lighter.Speaking of the present Zhejiang Jiaxing paddy rice,the disease resistance of the main varieties are all poor. A general disease survey in 2006 showed that the disease of Show You No.5 was the heaviest,incidences of Xiushui 09,Xiushui 110,Jiahua No.1 and Jia 991 were also heavier,Jialeyou 2 was lighter,see Table 3.VarietyInfestedplotsInfestedplantInvest.plotsInfestedplotsRate%Infestedplant%Range%Xiusui09391743.61.290~6.23Xiusui11018738.91.130~4.15Jiahua1261038.50.890~4.36Jia99112866.71.520~7.32Xiuyou510990.03.780~11.20Jialeyou29333.30.310~3.11Table 3 The resistance of rice variety to RSV (Jiaxing, 2006)2.1.6 Climatic conditions Winter temperatures directly influence overwinter LS According to information from meteorological departments in Jiaxing City:the average temperature in February-March in 2007 was 10.2°C,1.8℃higher than the same period in 2006,3.6°C higher than 2005.Because the winter temperature continued high,the survival rates of winter generation LS is high and quantity of insect was large.The quantity of overwintering insects was significantly higher than that of 2006,but in 2006 the quantity was higher than that in 2005.The three-body interaction among virus source,media and susceptible.Varieties was the important factor in the prevalence of RSV.Based on the carrier rate and RSV disease rate in the virus-transmitting period,or the relation between the early and late disease rate,key predictors was screened and a forecasting model was established as following:Y=1.6893X-1.6935X-carrier rate of LS,Y-RSV disease rate.There were many key factors which were conducive to the transition and migration of LS,for example,a higher carrier rate,a large amount of LS,the poor resistance of the main variety,the coincidence of rice-sowing time with the first adult generation insect virus-transmitting peak,the expanding wheat area a wide range of weeds in the fields and so on.In 2006,we had a comprehensive analysis of these key factors,predicted RSV trend quantitatively with forecasting model on May,18.It predicted that RSV disease would be moderate biased towards popular while measured result was moderate pandemic,the incidence area of the whole city was up to 15500 hectares.Compared to the previous year,the carrier rate in 2007 declined slightly,but the quantity of LS increased largely,and the other factors did not change significantly.We had a comprehensive analysis over such factors and predicted RSV disease trend with the forecasting model in April,26.We predicted the RSV disease would be moderately popular in our city and measured moderate pandemic,the incidence area was 16400 hectares.Two years application of forecast indicated that the forecasting time could be earlier if we used this forecasting model and predictors to analysis and forecasting the trend of RSV disease.We can make out accurate prediction in late April and before late May.The predictions above were generally in line with the actual results and provided a scientific basis for"pest control and disease prevention".Using methods of the system investigation and stepwise regression analysis,we screened primary predictors including carrier rate,the LS insect quantity,paddy rice varieties and sowing time,cropping and cultivation system and meteorological forecasting factor.Among these factors,the carrier rate(X)related to the individual rice disease rate(Y)most closely.We established the following forecasting model:Y=1.6893X-1.6935.Using this model and predict factor-integrated analysis,the mid-long period trend of RSV in 2006 and 2007 in Jiaxing City,Zhejiang was predicted and was generally in line with the actual results.The prediction provided a scientific basis for decision making of disease control and the production application has obtained obvious socio-economic and ecology benefits.

苹果锈病在冀北地区历年来均属零星发生，但近2年来在部分果园突然开始大发生，其中，2007年部分果园发病株率达到100%、病叶率90%以上，苹果产量和质量急剧下降，经济效益损失接近100%。笔者于2007年对冀北地区苹果主产地的宽城、兴隆、承德等县的苹果园进行了系统调查，发现苹果锈病在该地区普遍发生，给当地苹果生产造成了较大损失。苹果锈病又名赤星病、羊胡子，有的地区俗称黄斑病、长毛病。该病可为害叶片、新梢、果实，叶片先出现橙黄色、油亮的小圆点，后扩展，中央色深，并长出许多小黑点（性孢子器），溢出透明液滴（性孢子液），此后液滴干燥，性孢子变黑，病部组织增厚、肿胀（也就是群众所称的叶子上长了黄疙瘩），病斑多呈纺锤形，以后叶背面或果实病斑四周，逐渐长出黄褐色丛毛状物（锈孢子器，即群众所称的长胡子、长毛毛），内含大量褐色粉末（锈孢子）；果实发病，多在萼洼附近出现橙黄色圆斑，直径10mm左右，后变褐色，病果生长停滞，病部坚硬，多呈畸形。苹果锈病病原菌（Gymnosporangium yamadai Mouabe）称山田胶锈菌或苹果东方胶锈菌，属担子菌亚门真菌。该菌是转主寄生菌，在苹果、梨树上形成性孢子和冬孢子，在桧柏上形成冬孢子，以后萌发产生担孢子[1]。转主寄主主要是桧柏，其次是括高塔柏、新疆圆柏、欧洲刺柏、翠柏、龙柏等[2]。该病每年只侵染1次，病菌以菌丝体在桧柏类植物上越冬，翌年春天在桧柏上形成冬孢子角，冬孢子角内的胶状物质遇雨吸水膨胀，其中的冬孢子产生大量的担孢子。担孢子不能侵染桧柏，而是随气流传到苹果树上，致使苹果树发病，开始在叶片正面出现性孢子器，以后在叶背面出现锈孢子器，产生的锈孢子再随气流传到桧柏上为害、越冬，从而完成一个侵染循环。从苹果锈病的侵染循环可以看出，如果没有桧柏类植物，苹果锈病就不能完成侵染循环，也就不能发生。据有关资料[3]介绍，桧柏类植物上的担孢子传播距离一般为2.5～5km，最远50 km。因此，苹果锈病的发生与否或发生轻重主要决定于周围5 km有无桧柏等转主寄主的存在。该病作为初侵染源的冬孢子角的萌发和冬孢子、锈孢子的侵染都需要适当降雨和相对湿度大于90%的条件。因此，该病的发生轻重和早晚与春季降雨早晚和雨量大小关系密切，降雨早则发病早，雨量大则发病重。据笔者调查，在冀北地区，一般春季4月下旬至5月上中旬降雨量达到15mm以上时，桧柏类植物上的菌瘿开始迅速吸水膨大，形成花瓣状的冬孢子角，冬孢子随即萌发形成担孢子，随气流传播至苹果树染病，一般从5月下旬叶片正面开始出现病斑，6月上旬大量发病，至8月份叶背面开始出现锈孢子器。冀北地区农村历来有翠柏栽植，但一般都长在较偏僻的陡峭山上，距离苹果园较远，而桧柏只是在城镇有少量栽植，即使偶尔有苹果锈病的担孢子飞散传播，数量也相当少。因此，该地区苹果锈病历年均零星发生或不发生，果农对该病也比较陌生。近3年来，各地大搞文明生态村建设，为了绿化和美化农村环境，开始在农村的路边、房前屋后、群众休闲活动广场等地大量栽植桧柏类植物，这些地点一般距离苹果园较近，给苹果锈病完成侵染循环提供了充分的条件，致使这些地区苹果锈病在2007年偏重发生或大发生。据笔者对冀北地区6个距离桧柏不同远近的果园调查，凡是附近栽植桧柏的果园，苹果锈病就发生重，反之则发生轻。一般建在路边距离桧柏近的果园，苹果锈病发生重，建在山坡上距离桧柏相对较远的果园则发生轻，而发生程度与距离桧柏远近呈明显的正相关。从表1可以看出，与桧柏距离50m以内的苹果树，全部感染苹果锈病，病叶达到90%以上，每个病叶上平均有病斑3.7个；与桧柏距离80～120m的苹果树，全部感染苹果锈病，病叶率略有下降，但仍达到70%左右，每个病叶上平均有病斑2.3个；与桧柏距离180～230m的苹果树，全部感染苹果锈病，病叶率为20%左右，每个病叶上平均有病斑1.6个；与桧柏距离500～630m的苹果树，病株率为58.5%，病叶率10%左右，每个病叶上平均有病斑1.15个；与桧柏距离2100～2250m的苹果树，感染率为20%左右，病叶率仅为1.2%，每个病叶上仅有1个病斑；与桧柏距离5100～5200m的苹果树，感染率急剧下降，仅为4.5%，病叶率仅为0.2%，每个病叶上仅有1个病斑。与桧柏距离（m）50以内80～120180～230500～6302100～22505100～5200病株率（%）100.0100.0100.058.519.64.5病叶率（%）91.571.622.610.51.20.2平均百叶病斑数336.2166.736.512.11.20.2表1 苹果锈病的发生程度与距离桧柏的远近关系调查表（2007年6月14日，河北宽城）苹果锈病虽然不是冀北地区果园新发病害，但是由于其具有需转主寄主才能完成侵染循环的特性，发生极少，不如腐烂病、斑点落叶病、轮纹病等常发病害那样清楚，绝大多数果农根本不认识，因此预防意识淡薄，盲目引进了桧柏类植物，而在春季又没有对其进行防范措施，导致了该病的重发生。切断苹果锈病的侵染循环是防治该病最有效的手段，新建果园时，应当远离桧柏、翠柏、龙柏类植物5km以上，对于5km之内已有桧柏等植物的，有条件的建议彻底清除。对于彻底清除5km之内桧柏等植物有难度的果园，必须采取综合措施控制冬孢子萌发。第一，可以在早春苹果萌芽前，剪除桧柏类植物上的菌瘿并集中烧毁或喷药抑制冬孢子萌发；第二，可以喷药清除菌源。应根据天气情况，在苹果萌芽期至幼果拇指大小时，尤其是4月下旬至5月上中旬遇有15mm以上且持续时间较长的降雨时，必须及时在桧柏类植物上及时喷洒波美3度的石硫合剂或三唑酮等药剂，清除越冬病菌；第三，苹果锈病发生重的果园，还应在秋季喷药保护桧柏类植物，防治锈病侵染。对于附近有桧柏类植物的果园，除了清除转主寄主的菌源以外，还应对果树进行树上喷药保护，一般在苹果花芽露红和落花后各施一次药，发病严重的还应在落花后10～15天施第三次药。常用的药剂有：15%三唑酮可湿性粉剂1500～2000倍液、12%烯唑醇可湿性粉剂2000～2500倍液、43%戊唑醇（好力克）悬浮剂3000～4000倍液、25%戊唑醇（富力库）水乳剂1000～2000倍液、25%丙环唑（敌力脱）乳油1000～4000倍液、40%氟硅唑（杜邦福星）乳油8000倍液等。苹果锈病的担孢子可飞散传播5km以上，但由于冀北地区属山区，自然屏障较多，因此，以200m以内传染为害较重，如菌量充足，可使该范围内绝大多数苹果树发病，对产量影响极大，200～500m之间发生程度中等；距离转主寄主5km以上的苹果树虽然也可以发病，但发病率较低，对产量一般不会造成严重损失。切断侵染循环是防治苹果锈病的根本所在，而喷施药剂是防治该病的重要措施。

The small brown planthopper,Laodelphax striatellus Fallen(Homoptera:Delphacidae)is a widely geographical distributed planthopper in the Euro-Asian continents(Zhu et al.2005).It is the vector of the rice stripe disease caused by the rice stripe virus(RSV).RSV has been a destructive rice disease in the Eastern Asian countries(Hibino,1996;Cheng et al.2002;Zhu et al.2005;Zhu et al.2007).The transmission process and efficiency of a plant virus by their vectors was influenced by many factors(Gray&Banejee,1999),for instance,environmental temperature,plant species(Jin et al.1985),plant age(Wang et al.2007),but no information was documented on the role of the planthopper vector's age on the rice stripe virus.In the year 2006 and 2007,we collected nymphs and adults of the vector planthoppers from overwintering habits and biologically tested their transmission rates.In 2006,the small planthoppers in growth stages of large nymphs and macropterous and brachypterous adults were collected from overwintering habits such wheat,barley,rye fields and grasses in bank fields of 5 sites,e.g.Haiyan,Haining,Jiashan,Huzhou and Changxin,Northern Zhejiang Province.In 2007,the vectors were collected from 7 sites,e.g.Haiyan,Haining,Xiuzhou,Jiashan,Tongxiang and Changxin.More than 100 planthoppers were collected from each site each year.2.2 Rice seedlingThe most widely grown rice cultivar Xiushui 110,a Japonica type bred by Jiaxing Academy of Agricultural Sciences,was sown and maintained in greenhouse plots and the seedlings at age of 15 days were used for the bioassay.After they were collected and transported in healthy rice seedlings to the laboratory,the planthoppers were separated into groups of larger nymphs,macropterous and brachypterous adults as described in Sun et al.(2007).One rice seedling was set in a glass tube in size of 15cm×2cm and enclosed in one end with nylon mesh.After one planthopper of either nymph or adult was put into each glass tube,the second end was enclosed as for other the end and the glass tubes were marked for the vector's site etc.All the tubes and plants with planthoppers were sitting vertically on trays with still water to maintain the plants alive.The trays were kept in a greenhouse of RH75%,25～28℃ with 14L:10D.After 24 hours after infection,the seedlings were transplanted into plots in a screen house and covered by net cages in size of 30 cm in height×10cm in diameter individually.The seedlings were monitored and recorded daily for the incidence of the rice stripe disease till 30 days.Since all the incidence data of percentages of infected rice plants were lying within the range of 0 to 30%,the square-root transformation was used before analysis of variance.The Generic linear model(GLM)was applied to separate the factors and their interactions on the variance.Thereafter,the least significant difference(LSD)was used to compare the difference among the transmission rates of different status of vectors.The data analysis was performed in the DPS program(Tang and Feng 2006).The age and site of the vector had significant effect on the transmission rate(ANOVA,F(2,32)=82.85,P=0.0001;and F(6,32)=8.54,P=0.0098,Table 1),but the factor of year and the two-paired interactions among all the three factors were not significant(P>0.05,Table 1).This indicates that transmission competencies of the vectors collected from different sites were consistent over these two years.In both the years of 2006 and 2007 for each site,the transmission rate of large nymph was higher than those of brachypter and macropter,respectively,and the mean of the former was significantly higher than those of later(Table 2).The ratio of such transmission rates was nymph:macropter:brachypter=1:0.69:0.35 in 2006 and 1:0.68:0.45 in 2007.SourceofvarianceSSDegreeoffreedomdfMeansquaresMSFProbabilitylevel,PAge223.02572111.512982.84770.0001Site68.9879611.49808.54230.0098Year7.041717.04175.23160.0622Year×Age2.320621.16030.86200.4687Year×Site17.451335.81714.32180.0604Site×Age44.6304123.71922.76320.1107Error8.076061.3460Total335.229532Table 1 Analysis of variance of factors affecting the transmission rate of overwintering Laodelphax striatellus FallenSBPHoriginationsAgeofsmallbrownplanthopper(SBPH)20062007MacropterBrachypterLargenymphMacropterBrachypterLargenymphHaiyan3.36.258.233.525.026.12Haining3.855.136.992.143.035.81Jiashang2.783.836.222.594.216.25Tongxiang3.547.6913.64Xiuzhou3.595.267.13Changxin2.604.228.505.636.487.69Huzhou1.829.0911.29Mean±SE2.87±0.345.7±0.948.25±0.873.5±0.495.28±0.677.77±0.215%cbababa1%BAABABATable 2 Comparison of transmission rate (%) of the rice stripe virus by different age of the small brown planthopper (SBPH), Laodelphax striatellus FallenThe experiment presented in the paper showed that the large nymphs of the planthopper vector had higher transmission efficiency than their adults.Such discrepancy between adults and younger stages are found in many plant virus vectors.For both sexes of Frankliniella occidentalis(Pergande)(Thysanoptera:Thripidae),the vector of the tomato spotted wilt virus,the transmission efficiency dropped with age,simultaneously with the consumption rate(van de Wetering et al.1999).The transmission of Tomato spotted wilt virus by Thrips tabaci adults decreased with the age too at which the virus was acquired by larvae(Chatzivassiliou et al.,2002).In aphid vector of the persistent transmission of plant viruses,transmission efficiency decline with age though they remain infectivefor a long time,possibly over their whole life.Infectivity is not affected by molting,important because of existence of the virus as aphids mature.Foregut and hind gut is lined with cuticle that is shed with the molt;viruses transmitted in a persistent fashion must be either in midgut or within the body.But Ling(1975)noted that adult green leafhopper(Nephotettix virescens)is three times more efficient vector than nymphs in rice tungro transmission.The acquisition access period(AAP)and inoculation access feeding periods(IAP)are two of the important factors determining the transmission efficiency.The proportion of aster leafhoppers,Macrosteles quadrilineatus Forbes,that became vectors was significantly higher for bolt strain of aster yellows phytoplasma when leafhoppers acquired aster yellows phytoplasma as nymphs than as adults.Once leafhoppers became inoculative,the rate of transmission remained constant over their life spans(Murral et al.1996).Acquisition only occurs in the first and early second nymphal stages of the life-cycle and adult thrips cannot acquire the virus(Moritz et al.,2004).Due to the lack of strong evidence to elucidate the mechanism undergoing the different transmission ability between the ages and wing-morphs of the small brown planthopper,more experiments are necessary to carried out to draw the clear pictures.When winter crops such wheat,ryegrass are spatially connected with or temporally followed by rice seedling nursery or transplanted rice,viruliferous planthopper nymphs remained in the nearby winter crops or grasses will move by jumping to the newly-planted rice plants and transmit the virus to rice resulting in severer RSV incidence than viruliferous adults.Such event should be prevent through spatially and temporally isolation.Postpone of sowing date of rice has been tested experimentally as one of the effective approach to avoid RSV disease outbreak in rice(Zhu,et al.2007,in review).Additionally,the data can be used in a rice stripe disease epidemiological model to evaluate strategies for the disease management.The research presented in the paper is part of the Zhejiang Provincial Key Projects(2005C32033,2004E60055),China National High-Tech(863)Program(2007AA10Z220).

SNP （单核苷酸多态性） 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的 DNA 序列多态性，包含单个碱基的转换、颠换等。InDel是指插入/缺失 （Insertion/Deletion） 基因组中小片段的插入和缺失序列，个体重测序中特指1～50 bp 的小片段插入和缺失。在生物的进化进程中，生物全基因组水平上积累了大量的微小变异，主要包括SNP 和InDel。这些微小变异的变异程度决定了物种之间在表型和生理结构等方面的差异，为新物种的形成提供了最原始的动力，是物种多样性的本质体现。SNP 标记是基因组DNA序列中分布最广泛的一类标记，植物基因组中平均每数百bp就存在着一个SNP （Huang et al.，2010；Qi et al.，2013）。InDel标记也是一种重要的遗传标记，已被广泛应用于图位克隆、基因定位、动植物遗传多样性的鉴定、分子标记辅助育种等领域（Jander et al.，2002；Schnabel et al.，2005；王岩等，2009；王明军等，2010）。随着高通量测序技术的快速发展，利用全基因组重测序（whole genome re-sequencing，WGR） 技术结合混合分组分析法（bulked segregate analysis，BSA） 可高效检测出通过双亲杂交建立的后代群体中导致表型变异的 QTL和突变位点 （Abe et al.，2012；Takagi et al.，2013），并且可以识别大量的 SNP 和 InDel 位点，从而进行SNP 及InDel标记的开发，获得基因区间的SNP 及InDel标记。本研究利用WGR技术及 BSA法相结合，获取与抗炭疽菌叶枯病基因相关的SNP 和InDel位点，并通过对△ （SNP-index） 图谱分析，快速锁定抗病区域，再通过ANNOVAR软件分析，提取注释信息，筛选出候选的抗病基因。并利用实时荧光定量 PCR （qRT-PCR） 技术对候选基因经过炭疽叶枯病病原菌侵染后的不同时间段基因表达量的变化进行分析，寻找响应炭疽叶枯病病原菌侵染的抗病相关基因并对其进行详细的功能分析，以期揭示苹果抗炭疽菌叶枯病的分子机制。用于全基因组重测序的材料为 ‘金冠’ ‘富士’ 及第三章中经过抗病鉴定的 ‘金冠’ב富士’ 的 F1 代群体中极端抗炭疽菌叶枯病的20个单株和极端感炭疽菌叶枯病的20 个单株。取其嫩叶3～5 片，液氮速冻，置于-70℃冰箱保存，用于提取DNA。用于qRT-PCR 分析的材料为 ‘富士’ 和 ‘金冠’ 带嫩叶的一年生健壮新梢各30 枝，用于室内人工离体接种。接种方法同第二章，分别于接种后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h七个时间点采集叶片，液氮速冻后，用于提取RNA，检测基因表达。参考Doyle和Doyle （1987） 及 Cullings （1992） 提取基因组DNA的CTAB法，并加以改进，详见第三章。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的纯度和完整性。条带单一、清晰明亮、无降解、无污染的DNA样品作为合格样品用于后续研究。运用NanoPhotometer ? 分光光度计 （IMPLEN，CA，USA） 对DNA的纯度进行检测。DNA经过 Qubit ? DNA Assay Kit in Qubit ? 2.0 Flu-rometer （Life Technologies，CA，USA） 进行浓度的精确定量。将DNA浓度调整为100 ng/μl。苹果嫩叶总RNA的提取方法如下。（1） 将500 μl裂解液RLT Buffer、50 μl PLANTaid、5 μl β-巯基乙醇，依次加入灭菌的1.5 ml离心管中，混匀，待用。（2） 将冻存于-70℃下的苹果嫩叶0.2 g置于预冷的研钵中，加少量液氮快速研磨成细粉状后转入上述待用的的离心管内 （样品容易褐化，动作要迅速，并保证液氮挥发完全）。（3） 56℃温育5～10 min，期间不断剧烈震荡混匀，以保证充分裂解。（4） 12000 r/min 离心10 min，将离心管缓慢从离心机中取出，将上清液转到新离心管中 （吸取上清液时一定要缓慢，尽量不要吸到底部沉淀）。（5） 较精确估计上清液体积，加入 0.5 倍体积的无水乙醇，盖盖，上下颠倒混匀，此时可能会出现沉淀，但是不影响提取的过程。（6） 将混合物 （每次上样应小于800 μl，可分两次加入） 加入吸附柱中，12000 r/min离心60 s，弃废液。（7） 在吸附柱中加700 μl去蛋白液 RW1，室温下放置5 min （可稍延长时间，去除吸附柱上的蛋白污染），12000 r/min 离心30 s，弃废液。（8） 在吸附柱中加入 500 μl 漂洗液 RW （加过无水乙醇），12000 r/min离心 30 s，弃废液。再加入 500 μl 漂洗液 RW，重复1遍。（9） 将吸附柱放回空收集管中，12000 r/min空离心2 min，尽量除去吸附柱中残留的漂洗液。（10） 将吸附柱放入一个 RNase free 离心管中，在吸附膜上加40 μl RNase-free water （最好事先在 70～90℃中水浴加热），室温放置2 min，12000 r/min 离心1 min，如需RNA浓度较高，可重复离心1次。（11） 取4 μl RNA加入6×RNA Loading Buffer，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取的质量与纯度，并估测提取浓度。（12） 将检测质量好的RNA放入-70℃下保存备用。参照 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time） 试剂盒 （TaKaRa）。具体操作步骤如下 （全程冰上操作）。（1） 基因组 DNA 的去除。在 0.2 ml 灭菌的离心管中依次加入1 μg 总 RNA，2 μl 5×gDNA Eraser Buffer，1 μl gDNA Eraser，用RNase-Free水补足10 μl，42℃，2 min （或者室温5 min）；4℃。（2） 反转录反应。在0.2 ml灭菌的离心管中依次加入10 μl步骤1的反应液，1 μl PrimerScript RT Enzyme Mix I，1 μl RT Primer Mix，4 μl 5×PrimerScript Buffer 2 （for Real Time），用 RNase Free 水补足20 μl。37℃，15 min；85℃，5 s；4℃。（3） 质量检测。用 β-actin 基因的引物对反转录的 cDNA 进行PCR扩增，并用1%的琼脂糖电泳检测，选取质量好的样品在-20℃下保存备用。将 ‘金冠’ב富士’ 的F1 代群体中选取出的 20 个极端抗病的单株和20个极端感病的单株DNA等量混合构建成两个表型池。检验合格的4 份 DNA 样品每份取1.5 μg进行基因文库的构建。通过Covaris破碎机将DNA样品随机打断成长度为350 bp的片段。采用TruSeq Library Construction Kit 进行建库，严格使用说明书推荐的试剂和耗材。DNA 片段经末端修复、加 ployA 尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。构建好的文库通过 illumina HiSeqTM PE150进行测序 （附图4-1）。文库构建完成后，先使用 Qubit 2.0 进行初步定量，稀释文库至1 ng/μl，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段 （insert size） 进行检测，符合预期后，使用Q-PCR 方法对文库的有效浓度进行准确定量 （文库有效浓度＞2 nM），以保证文库质量。4个文库检验合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行 Illumina HiSeq TM PE 150 测序。围绕350 bp的片段进行双末端 125 bp 测序。表型差异的两个亲本测序深度为10 X，抗感池测序深度为20 X。信息分析的主要步骤如下 （附图4-2）。步骤一：对下机得到的原始测序数据 （Raw data） 进行质控得到有效测序数据 （Clean data）。步骤二：将Clean data比对到参考基因组上。步骤三：根据比对结果，进行 SNP、InDel 的检测，分析 SNP、InDel的分布情况并进行注释。步骤四：对子代SNP 频率差异进行分析。步骤五：根据分析结果对目标性状区域进行定位。步骤六：确定候选基因。测序得到的原始测序序列 （Sequenced Reads或者 raw reads），里面含有带接头的、低质量的 reads。为了保证信息分析质量，必须对raw reads过滤，得到有效测序序列 （clean reads），后续分析都基于clean reads。数据处理的步骤如下。一是去除带接头 （adapter） 的reads pair。二是当单端测序read中含有的N的含量超过该条read长度比例的10%时，需要去除此对paired reads。三是当单端测序read中含有的低质量 （Q≤5） 碱基数超过该条read长度比例的 50%时，需要去除此对paired reads。有效测序数据通过 BWA （http：//bio-bwa.sourceforge.net/） 软件 （Li and Durbin，2009） 与 ‘金冠’ 苹果的基因组 （ https：//www.rosaceae.org/data/download） 进行比对，确定reads在基因组上的位置。比对结果使用 SAMTOOLS （ http：//samtools.sourceforge.net/）软件进行SNP-calling （Li and Durbin，2009），发掘 reads 与参考序列以及 reads 之间的 SNP 位点，利用 SAMtools 软件中的 “rmdup” 指令去除序列文件中的重复。人们采用GATK3.3软件 （McKenna et al.，2010） 的UnifiedGeno-typer模块进行多个样本 SNP 和 InDel的检测，使用 VariantFiltration进行过滤，SNP 的过滤参数为：cluster Window Size 4，filter Expression“QD＜4.0 ‖ FS＞60.0 ‖ MQ＜40.0”，G filter “GQ＜20”。InDel的过滤参数为：cluster Window Size 4，filter Expression “QD＜4.0 ‖ FS＞200.0 ‖ ReadPosRankSum＜-20.0 ‖ InbreedingCoeff＜-0.8”。利用ANNOVAR软件 （Wang et al.，2010） 对 SNP 和 InDel 检测结果进行注释。SNP 频率的统计：SNP 频率是指所检测到的总的SNP 数与参考基因组序列的总长度的比值，是衡量一个物种变异程度和多态性的指标。转换颠换率的统计：分别统计发生转换和颠换的SNP 数目。子代 SNP 的频率 （Takagi et al.，2013），即 SNP-index，是与SNP 位点的测序深度相关的参数，是指某个位点含有 SNP 的 reads数与测到该位点的总 reads数的比值。以参考基因组作为参照，分析计算两个子代在每个 SNP 位点的 SNP-index。SNP-index计算方法如附图4-3所示。若该参数为0，则代表所有测到的reads都来自作为参考基因组的亲本，即 ‘金冠’。参数为1则代表所有的reads都来自另一个亲本，即 ‘富士’。参数为0.5，代表此混池中的 SNP 来自两个亲本的频率一致。为减少测序错误和比对错误造成的影响，对计算出 SNP-index后的亲本多态性位点进行过滤，过滤标准如下。（1） 两个子代中 SNP-index 都小于0.3，并且 SNP 深度都小于7的位点，过滤掉。（2） 一个子代SNP-index缺失的位点，过滤掉。计算△ （SNP-index），即两个子代 SNP-index 作差：△ （SNP-index）=SNP-index2 （极端抗病性状）-SNP-index1 （极端感病性状）。为直观反映△ （SNP-index） 在染色体上的分布情况，对其在染色体上的分布进行作图。默认选择1 Mb 为窗口，1 kb 为步长。进行1000次置换检验，选取95%置信水平作为筛选的阈值。为了不忽略掉微效QTL的影响，在全基因组范围内挑选两个子代在SNP-index差异显著的SNP 位点，即挑选子代2 （极端抗病性状） SNP-index大于0.7，且子代1 （极端感病性状） SNP-index小于0.3的位点，并与亲本 ‘富士’ 为纯合及亲本 ‘金冠’ 为杂合的位点取交集，做为候选的基因位点。提取ANNOVAR的注释结果，优先挑选使基因获得终止密码子的变异 （stop loss） 或者使基因失去终止密码子的变异 （stop gain） 或者非同义突变 （missense） 或可变剪接的位点（Splicing） 所在的基因作为候选基因。从网站 https：//www.rosaceae.org/gb/gbrowse/malus_x_domestica/下载候选基因的 mRNA，从基因编码区核苷酸序列的近3’端位置设计引物，PCR产物长度在150～250 bp，引物序列见表4-1，内参基因为β-actin基因。荧光定量 PCR 在罗氏 LightCycler 480 系统上进行，反应体系配制按 SYBR Green PCR Master Mix 说明书进行操作，具体如下：10.0 μl SYBR Premix Ex Taq Ⅱ （2×），0.8 μl正反向引物，2.0 μl cDNA，去离子水补足20 μl。反应程序为95℃ 预变性5 min，95℃ 10 s变性，55℃ 10 s退火，72℃ 10 s延伸，扩增45 个循环。循环结束后进行熔解曲线分析：95℃ 15 s，60℃ 20 s，然后缓慢升温至95℃。基因的相对表达量用公式：F=2-ΔΔCt，ΔΔCt=（待测组目的基因 Ct值-待测组内参基因 Ct值）-（对照组目的基因 Ct值-对照组内参基因Ct值）。Illumina HiSeqTM PE150 测序平台，四个样本共产生 47.115 G的测序原始数据 （Raw data），通过对原始数据中的接头序列，低质量碱基以及未测出的碱基 （用 N 表示） 进行过滤后，得到有效数据 （Clean data） 46.974 G，各样本的 Raw data 在 7774.247～17017.174 Mb，Clean date 在7751.990～16969.215 Mb，过滤后获得的有效数据比率在99.64%～99.72%，碱基错配率低于0.05%。测序质量 Q20 ≥ 95.08%、Q30 ≥ 88.97%，GC 含量在 39.04%～39.16%。这表明所有样本的数据量充足，测序质量很高，GC 分布正常，建库测序成功，保证了后续数据分析的准确性 （表4-1）。样本原始数据/bp有效数据/bp有效率/%错误率/%Q20/%Q30/%GC含量/%富士7774246500775199010099.710.0395.4389.6339.16金冠7900566600787192650099.640.0395.5589.8839.05BR（基因抗池）170171739001696921590099.720.0395.4489.6239.04BS（基因感池）144234894001438116750099.710.0495.0888.9739.15表4-1 测序数据质量概况将四个样品的有效数据与已经发布的金冠苹果参考基因组序列（https：//www.rosaceae.org/data） 进行比对，计算出比对到参考基因组 （参考基因组大小为609314018 bp） 上的 reads条数、测序深度及碱基覆盖率。结果表明，四个样品的比对率均在87%以上，两个亲本的测序深度达到15×以上，抗感池样品的测序深度达到 30×以上。在参考基因组中至少有1个碱基覆盖的位点占基因组的比例达到95%以上，至少有 4 个碱基覆盖的位点占基因组的比例 “富士” 为88.3%，“金冠” 为91.26%，其他两样品达到96%以上。这进一步的说明，本试验测序的数据质量很高，可用于后续的变异检测及相关分析 （表4-2）。样本比对到reference上的reads条数①有效测序数据的reads总条数比对率/%②平均测序深度/x③参考基因组中至少有1个碱基覆盖的位点占基因组的百分比/%参考基因组至少有4个碱基覆盖的位点占基因组的百分比/%富士455966535167993488.2315.9595.9588.3金冠459536665247951087.5615.6798.0991.26BR（基因抗池）10045340711312810688.834.4298.896.67BS（基因感池）8962925610163794888.1830.8898.7896.44表4-2 测序深度及覆盖度统计通过全基因组重测序技术共获得3399950个 SNP 位点，苹果参考基因组总长度为 609314018 bp，据此计算出 SNP 出现的频率为3399950/609314018=0.56%。转换 （T/C、C/T） 和颠换 （T/G、T/A、C/A、C/G） 发生频率 （附图 4-4） 的统计结果显示，T/C 和C/T转换发生的频率分别为 32.5%和 34.1%，T/G、T/A、C/A和C/G颠换发生的频率分别为 9.2%、9.4%、9.4%、5.4%。转换/颠换率为2.0。利用测序获得的有效数据，比对苹果参考基因组序列，经 ANN-OVAR软件分析共得到 SNP 位点 3399950个，InDel 位点 573040个，SNP 位点位于内含子上的465317个，位于外显子上的436309个，其中同义变异 210404个，非同义变异 220539个，InDel 位点位于内含子上的 108996个，位于外显子上的 19957个，其中插入或缺失3 或 3 的整数倍的碱基，不改变蛋白质的编码框的有 6928个。这表明绝大部分变异位于非编码区，或不会导致基因编码的改变，这有利于维持植物体正常的生长发育，保证品种特性的稳定遗传 （表4-3）。类别SNP数量基因上游184156获得终止密码子4837失去终止密码子529外显子同义变异210404非同义变220539内含子465317剪接位点2196基因下游177312基因上游/基因下游12750基因间区2105122转换2265734颠换1134216转换/颠换/%1.997合计3399950表4-3 SNP及InDel检测及注释类别InDel数量基因上游51816获得终止密码子376失去终止密码子68Frameshiftdeletion①7330外显子Frameshiftinsertion5255Non-frameshiftdeletion②3843Non-frameshiftinsertion3085内含子108996剪接位点598基因下游44305基因上游/基因下游3896基因间区342800插入262868缺失310172合计573040表4-3 SNP及InDel检测及注释（续）-1△ （SNP-index）=SNP-index B （极端抗病性状）-SNP-index A （极端感病性状）。进行1000次置换检验，选取95%置信水平作为筛选的阈值。一般情况下，在苹果 F1 群体中，由于每个位点的碱基均来源于双亲中的一个，所以在基因组中大部分区域的 SNP-index都在0.5附近。如果某个SNP 位点与抗性相关，那么在该处的 SNP-index就会显著偏离0.5，△ （SNP-index） 就会显著大于此处的阈值。从抗感池中△SNP-index值在染色体上的分布可以看出，在第15 条染色体2～5 Mb区间内△SNP-index值显著的大于阈值，预示着该区域内可能存在着与抗炭疽菌叶枯病基因相关的位点 （附图4-5）。这与第三章SSR标记所确定的抗性基因所在的区域吻合。在全基因组范围内挑选在两个子代池中 SNP-index 差异显著的SNP 位点，即挑选在抗池中 SNP-index 大于 0.7，在感池中 SNP-index小于0.3，△ （SNP-index） 大于 0.5 的 SNP 位点，并与亲本‘富士’ 为纯合，亲本 ‘金冠’ 为杂合的位点取交集，共得到258 个候选的多态性标记位点 （表4-4）。这258 个 SNP 位点中位于基因上游1 kb的19个，基因下游1 kb 的12 个，位于基因上游1 kb 区域，同时也在另一基因的下游1 kb区域的2 个，位于基因间区的173 个。位于外显子上非同义变异的13 个，同义变异7 个，位于内含子上的31个。其中位于第15条染色体上的有123 个，占整个候选 SNP 位点的47.7%。类别SNP数量基因上游19获得终止密码子0失去终止密码子0外显子同义变异7非同义变13内含子31剪接位点1基因下游12基因上游/基因下游2基因间区173转换161颠换97转换/颠换/%1.659合计258表4-4 候选多态性标记位点的注释提取ANNOVAR的注释结果，优先挑选能引起基因获得终止密码子、失去终止密码子的变异，或者非同义突变，或者可变剪接的位点所在的基因作为候选基因。经筛选后得到33 个 SNP 位点及所对应的29个候选基因 （表4-5）。这些SNP 位点中发生转换的 （G/A、C/T、T/C、A/G） 共 16 个，占 48.5%，发生颠换的 （G/C、C/G、G/T、A/C、A/T、T/G、T/A、C/A） 共17 个占51.5%，其中有21 个位于第15条染色体上。基因ID类型染色体SNP位点参考基因组碱基型Ref突变碱基型AltMDP0000294705nonsynonymous24029182TCMDP0000311597upstream26560007TCMDP0000335197upstream238255166CTMDP0000481284nonsynonymous511687941TCMDP0000266783nonsynonymous516570950ACMDP0000223383upstream814935907CTMDP0000203531upstream918259400TGMDP0000265695upstream919790733GAMDP0000224187nonsynonymous1034991229ATMDP0000226279upstream1123158805AGMDP0000480608upstream123704417TGMDP0000504610upstream1229472316TCMDP0000292279upstream151396770CTMDP0000686092nonsynonymous153955717AGMDP0000686092nonsynonymous153955724AGMDP0000686092nonsynonymous153955738TAMDP0000205432nonsynonymous154094431TAMDP0000120033upstream154236293AGMDP0000864010nonsynonymous154257246GAMDP0000945764nonsynonymous154336468CAMDP0000149107splicing154970310CTMDP0000609131upstream156771435CAMDP0000169753upstream157074724ACMDP0000296372upstream157704309CT表4-5 候选基因ID基因ID类型染色体SNP位点参考基因组碱基型Ref突变碱基型AltMDP0000199827upstream157710714TAMDP0000194508nonsynonymous157757532GAMDP0000320004upstream158084422ATMDP0000320004upstream158084636TCMDP0000320004upstream158084637ACMDP0000148808upstream158365795GTMDP0000133266upstream1533862275AGMDP0000157213nonsynonymous1549031042CGMDP0000169687nonsynonymous1552444208TC表4-5 候选基因ID（续）-1结合 SSR标记定位及全基因组重测序中对△ （SNP-index） 值分析的结果，从这29 个候选基因中筛选出位于第15 条染色体3.9～4.9 Mb距离内的5个基因 MDP0000686092、 MDP0000205432、MDP0000120033、 MDP0000864010、 MDP0000945764 做为抗炭疽菌叶枯病的最终候选基因。通过对5个候选基因进行 GO 功能富集分析发现，5 个候选基因中有3个功能未知。基因 MDP0000120033 具有核酸绑定功能，锌离子结合分子功能，参与 RNA 剪切生物过程，调节基因产物的表达。蛋白结构上具有CCHC型结构域的锌指结构，是丝氨酸精氨酸富集剪接因子。进一步同源比对该基因为 SR基因家族 RSZ亚家族基因，与拟南芥AtRSZ21蛋白的序列一致性达到60%，与花生AdRSZ21蛋白的序列一致性达到79%。基因 MDP0000864010 具有辅酶绑定功能，蛋白结构上具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 （磷酸盐） NAD （P） 绑定区域，属于NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族，进一步的同源性比对，该蛋白与鼠李糖生物合成酶 1 （rhamnose biosynthetic enzyme 1，RHM1） 有较高同源性 （表 4-6）。候选基因编码的氨基酸序列见附录五。基因ID基因功能注释MDP0000686092功能未知蛋白MDP0000205432功能未知蛋白质。MDP0000120033核酸绑定功能，锌离子结合分子功能，参与RNA剪切生物过程，调节基因产物的表达。具有锌指结构，CCHC型结构域，丝氨酸精氨酸富集剪接因子。MDP0000864010辅酶绑定功能，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸盐）NAD（P）绑定区域，NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族，可能与鼠李糖生物合成酶1有关。MDP0000945764功能未知蛋白表4-6 抗炭疽菌叶枯病候选基因的功能注释利用TMHMM2.0软件对候选基因进行跨膜结构分析，基因MDP0000686092和MDP0000120033具有跨膜结构。基因MDP0000686092具有1个跨膜区，基因MDP0000120033具有3个跨膜区，位置分别在153～172、187～209、214～236的区域内（附图4-6）。引物名称引物序列MDP0000686092基因荧光定量PCR引物P1-FP1-RF：5′-CAGGCTGGAGCGAAGTTTA-3′R：5′-CCTTTCTGTGATGGCATTGTT-3′MDP0000205432基因荧光定量PCR引物P2-FP2-RF：5′-GAAAAGCCAGCACCAGAAAC-3′R：5′-CGTATTCGTGGGGTTATAGAGC-3′MDP0000120033基因荧光定量PCR引物P3-FP3-RF：5′-TCTGGGAATGCTGCTAAAACTC-3′R：5′-GCAGGGCAGTAGTGAAGCAC-3′MDP0000864010基因荧光定量PCR引物P4-FP4-RF：5′-CGTGACCAATCGCCTAATA-3′R：5′-GGACGTGAGTGCCGTAGAC-3表4-7 荧光定量PCR引物引物名称引物序列MDP0000945764基因荧光定量PCR引物P5-FP5-RF：5′-TTTGCCAGCCTGTCAGAAGT-3′R：5′-AGTTGTAGAGGGAGGAGGAAGA-3′β-actin基因荧光定量PCR引物P6-FP6-RF：5′-CACTGCTTCTATGACTGGTTTTGA-3′R：5′-CTGGCATATACTCTGGAGGCTT-3′表4-7 荧光定量PCR引物（续）-1对接种炭疽菌叶枯病病菌后 0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h的 ‘富士’ 和 ‘金冠’ 枝条进行采样，提取 RNA，反转录成cDNA后，对5个候选基因的表达进行实时荧光定量分析。结果显示，5个基因均不同程度响应病原菌侵染 （附图4-7、 表4-7）。除了基因MDP0000864010在 ‘富士’ 叶片中的表达量表现为下调外，其余 4个基因均为上调表达。在 ‘富士’ 叶片中，基因 MDP0000205432、MDP0000120033和MDP0000945764 的表达量在接种后 24 h 均达到最高值，48 h降到最低值，然后又缓慢提高。在 ‘金冠’ 叶片中的表现不同于 ‘富士’，三个基因表达量的最高值出现在36 h，但最低值同样出现在48 h，这说明在这3个基因在抗病植株中对病原菌的应答要早于感病植株。尽管基因 MDP0000686092 和 MDP0000945764 在‘富士’ 和 ‘金冠’ 叶片中也均表现为上调表达，但是在 ‘金冠’ 叶片中的表达变化更为显著，基因 MDP0000945764 在 ‘金冠’ 叶片中的表达量达到最高值时为接种前的60 倍，而在 ‘富士’ 中的提高量为接种前的10倍。以上结果说明，5个候选基因均受炭疽菌叶枯病病菌的诱导，是苹果炭疽菌叶枯病抗病相关基因。SNP 标记的开发主要依赖于含有大量测序序列的数据库。通过全基因组测序，不仅可以获得大量的 SNP 标记，还可以了解到 SNP 标记在整个基因组中的分布情况，有利于我们进一步了解不同物种的生物学特性，以及利用标记进行不同需求的生物学研究。在葡萄的基因组测序中发现，SNP 位点的密度高达7%（Jaillon et al.，2007）；2010发表的金冠苹果全基因组序列中，SNP 标记的频率约为 4.4 kD/SM，即227 bp/SNP （Velasco et al.，2010）；梨的全基因组序列中共检测到3402159个 SNP 位点，约占基因组序列的 1.02%（Wu et al.，2013）；柑橘中得到的 SNP 位点数量为106 万个 （Xu et al.，2013）。对于有参基因组，通过全基因组重测序手段进行大量 SNP 标记开发，也是研究不同品种间差异的有效途径之一。通过对6 个玉米自交系的进行全基因组重测序，在非重复序列区域内共获得了 1272134个SNP 标记 （Lai et al.，2010）；对葡萄的230个基因片段重测序，数据统计结果显示，每64 个碱基中就存在着一个 SNP 位点 （Lijavetzky et al.，2007）；在水稻中，水稻籼稻恢复系 7302R 通过全基因组重测序，检测到307627个SNP 位点，其中有30239个位于mRNA序列中（Li et al.，2012b）；通过对苹果品种 ‘金冠’ 和 ‘红玉’ 进行全基因组重测序，在 ‘金冠’ 中得到了 2222816个 SNP 位点，在 ‘红玉’中得到了 4950346 个 SNP 位点，密度分别为 293 bp/SNP 和210 bp/SNP （孙瑞，2015）。SNP 变异从理论上来看主要包括转换、缺失、颠换和插入四种形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2∶1。并且SNP 在CG序列上出现的最为频繁，而且多是 C 转换为 T，主要原因为CG中的胞嘧啶常被甲基化，而后自发脱氨基形成胸腺嘧啶 T （Johnson and Told，2000；Mullikin et al.，2000）。从本实验中对 SNP转换/颠换频率统计结果来看，转换/颠换比为2.0，发生转换的频率为66.6%，发生颠换的频率为 33.4%，C/T 转换发生的频率最高为34.1%。这与前人研究的结论相符。通过重测序技术可以获得海量SNP 标记，利用这些标记构建高密度遗传连锁图谱为不同群体的进化分析，不同性状基因的遗传定位，分子标记辅助育种等提供有效信息。‘M.27’בM.116’ 的高密度遗传图谱是由306个SSR标记和2272个 SNP 标记组成，图谱密度达到了每 0.5 cM 一个标记 （Antanaviciute et al.，2012）。Khan 等（2012） 利用2875个分子标记构建了苹果的整合遗传图谱，其中包含了2033个 SNP 标记和 843 个 SSR 标记，总长为 1991.38 cM。Clark等 （2014） 利用3个不同的F1 杂交群体和SNP 芯片分型技术构建了包含1091个 SNP 标记的苹果品种 ‘Honeycrisp’ 的整合遗传图谱，标记间的平均距离为1.36 cM。基于高通量基因组重测序技术能够更加准确、全面的对测序物种进行全基因组水平上的位点进行评估，可以精确的完成单核苷酸多态性位点的检测，分子标记的开发，遗传图谱的构建，不同群体间的进化分析，与表型变异相关基因的挖掘以及快速定位等等。本研究通过运用全基因组重测序的方法对有着明显抗感性状分离的 ‘金冠’ 和 ‘富士’ 及其由 F1 代极端表型个体组成的抗感池进行全基因组范围内的遗传变异检测，共筛选得到 SNP位点3399950个，InDel位点573040个。通过对△SNP-index图谱的分析发现，在第15条染色体的2～5 Mb的区间内，△SNP-index显著的大于阈值，存在着明显的连锁不平衡，意味着该区域可能存在着抗炭疽菌叶枯病基因位点。这一结果与SSR标记所定位的抗炭疽菌叶枯病基因位点位置相吻合。SNP 广泛分布于基因组DNA中，且数量巨大。因为任何碱基均有可能发生变异，因此SNP 既有可能出现在基因的编码区，也有可能在基因的非编码区，或者两个基因之间的序列上。总的来说，位于基因内编码区的SNP 比较少，且该部分的 SNP 有可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此位于编码区 SNP 的研究更受关注。本试验对可能引起基因获得终止密码子、失去终止密码子、非同义突变、可变剪接的变异位点进行重点筛选，将其所在的基因作为候选基因。通过筛选共得到33个候选SNP 位点和29个候选基因。结合第三章SSR标记对炭疽叶枯病抗性基因的定位，最终锁定了 5 个候选基因： MDP0000686092、 MDP0000205432、 MDP0000120033、 MDP0000864010、MDP0000945764。锌指结构是一类在很多蛋白中存在的具有指状结构的模体，是具有识别特定碱基序列的一种转录因子结构。锌指的典型功能是作为互作的组件与核酸、蛋白质和小分子等多种物质相结合，参与多种细胞过程，如DNA的复制与修复、RNA 转录与翻译、物质代谢与信号转导、细胞的增殖与凋亡等 （Krishna et al，2003）。可变剪切 （Alternative splicing，AS） 是重要的转录后调控机制，在动物中对其在不同的生理以及病程条件下的可变剪切的调控作用研究的较多 （Garcia-Blanco et al.，2004；Nilsen and Graveley，2010）。据报道在拟南芥中超过 42%的外显子基因存在可变剪切现象（Filichkin et al.，2010）。在植物可变剪切数据库中有很大比例的 AS参与逆境响应基因的表达，这进一步强调了可变剪切在逆境响应中的重要作用 （Wang and Brendel，2006；Duque，2011）。在生物胁迫中，有许多试验证明AS参与植物的抵抗和防御机制。例如，在一些 R 基因中如番茄的N 基因，拟南芥的SNC1、 RPS4基因，发现可变剪切的存在 （Dinesh-Kumar and Baker，2000；Zhang and Gassmann，2003）。SR蛋白，丝氨酸/精氨酸富集剪切蛋白 （serine/arginine-rich proteins，SR protein） 是RNA绑定蛋白家族中功能和结构高度保守的一类因子，参与可变剪切过程。例如， AtSR30在高盐碱以及过氧逆境中被上调表达 （Tanabe et al.，2007）。SR在不同的环境条件下的表达量的差异说明了SR蛋白在逆境响应中的调控作用。基因MDP0000120033具有核酸绑定，锌离子结合分子功能，参与 RNA 剪切生物过程，调节基因产物的表达。具有CCHC型锌指结构和丝氨酸/精氨酸富集剪接因子，属于SR 基因家族 RSZ 亚家族基因。丝裂原活化蛋白激酶 MPK6 和MPK3在植物的防御反应中起着重要作用，而拟南芥基因 AtRSZ21 在体外试验中被发现能够被MPK6/MPK3磷酸化 （Feilner et al.，2005），这就意味着 AtRSZ21 也可能参与了植物的防御应答。Kumar 和 Kirti （2012） 报道了花生的一个属于 SR 亚家族基因 RSZ 蛋白基因AdRSZ21，在植物的超敏反应和抗逆反应中起着重要的作用。NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族是真菌病原体镰刀菌致病机制中的一个关键酶 （Srivastava et al.，2014）。细胞壁是植物细胞进行正常的生命活动不可缺少的重要组成部分。其不但在维持细胞形态、细胞间黏结、细胞壁的强度和调控细胞伸长等方面起着重要的作用，还参与了细胞的分化、抗病、细胞识别及信号传导等一系列生理、生化过程。细胞壁主要成分包含纤维素、半纤维素、果胶和少量的结构蛋白等。基因MDP0000864010属于依赖差向异构酶/脱氢酶家族，并且与鼠李糖合成酶Ⅰ （ RHMⅠ） 有较高的同源性。可能参与合成鼠李糖，而鼠李糖是细胞壁果胶多聚糖的重要组分之一。所以该候选基因有可能在细胞的组成层面增加个体的抗性。基因的相对表达量分析也表明，五个基因都不同程度的响应了病菌的诱导，是与抗炭疽菌叶枯病相关的候选基因。但是其参与抗病的机理和途径仍不清楚，深入的研究将继续展开。

马铃薯晚疫病是一种毁灭性病害，从20世纪在欧洲暴发引起大饥荒以来，在全球范围内绝大多数马铃薯栽培地区广泛传播。1996年，据CIP（国际马铃薯中心）估计，全球因晚疫病造成的直接经济损失达到170亿美元，发展中国家的损失53亿美元。晚疫病的危害性、防治难度及对社会的影响早已超过水稻稻瘟病和小麦锈病，被视为国际第一大作物病害。近几十年随着分子生物学技术的发展，各国科学家都对马铃薯晚疫病病菌的分子遗传学进行了深入的研究。本文仅对分子标记技术在晚疫病病菌研究中的应用进行简要的综述。限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，简称RFLP）。RFLP是出现最早，现在依然使用最普遍的DNA标记。RFLP技术的基本原理是：不同材料的DNA用已知的限制性内切酶消化后，产生许多大小不等的DNA片段，电泳分离、Southern印迹转移到硝酸纤维膜上，用放射性标记的探针与膜上变性的酶切DNA进行杂交，放射自显影，即可显示出不同材料的多态性图谱，即显示出所分析的DNA序列间的RFLP。目前，有两种方法可进行DNA的RFLP分析：①如原理中所述，其中用作RFLP的探针可以是特殊基因的DNA克隆、cDNA克隆、随机的基因组DNA克隆和合成的低聚核苷酸克隆。②对那些分子量较小的DNA样本（如线粒体DNA、核糖体DNA等），可在酶切后对其产物直接电泳，将不同大小的限制性酶切DNA片段分离，从而得到该DNA的RFLP图谱。RFLP反映了DNA水平上的差异，而差异往往是由变异造成的，变异分为单碱基突变型和结构重排型两大类。单碱基因突变发生在限制性内切酶的位点上，致使酶切位点增加或丢失而产生多态性，这称为点多态性。结构重排型是指DNA序列内部发生了较大的变化，如插入或缺失，从而使酶切位点间的长度发生改变，造成了片段长度的多态性。这些变异经酶切、分离、杂交、放射自显影就会使RFLP带的特征发生改变，由此对生物的变异进行分析。目前，在晚疫病病菌的研究中，RFLP技术主要用于病菌群体的遗传分化，如：分析一个国家或地区致病疫霉种群的基因结构及变化；有性生殖的发生情况等。1992年Stephen等利用RG57探针分析了墨西哥中北部的晚疫病病菌遗传结构，发现墨西哥中部病菌的遗传多样性非常明显，这也充分说明这个地区由于A2交配型的存在有性重组率高于其他地区[1]；1993年Drenth等将采自荷兰6个地区的153个菌株分为35个RG-57基因型，明确了荷兰不同地区基因型的分布情况[2]；1998年Lionel等利用RG57探针和同工酶基因型研究发现采自番茄和马铃薯上的晚疫病病菌基因型明显不同，说明晚疫病病菌有寄主专化作用[3]。目前利用该标记对来自全世界的成千上万的马铃薯晚疫病病菌建立了指纹图谱数据库。1990年Williams等人首次应用随机引物扩增寻找多态性DNA片段作为分子标记，并将此法命名为随机扩增多态性DNA（Random amplified polymorphism DNA，RAPD）[4]。RAPD技术是建立在PCR技术基础上的，利用随机的短的脱氧核苷酸序列作为PCR引物（通常为十聚体）以基因组DNA为模板进行PCR扩增。通过凝胶电泳分离得到扩增产物DNA片段的多态性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同，但对任一特定的引物，它同基因组DNA序列有特定的结合位点。如果基因组在这些有特定位点的区域发生DNA插入，缺失或碱基突变就可导致这些特定结合位点发生相应的变化。通过对PCR产物的检测可测出基因组DNA在这些区域的多态性。在RAPD分析中可用一系列的引物使检测区域扩大至整个基因组。因此，RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性分析，适于研究生物的遗传多样性及生物的遗传关系，进行遗传作图和基因定位等。在晚疫病病菌的研究中，RAPD技术一般多用于研究种内群体遗传分析。如：Mahuku[5]对1994～1996年采自加拿大的141个菌株进行RAPD分析，将其分为21个组，分析表明97%的变异来自于种群内，3%的变异来源于种群间。2001年朱杰华等利用RAPD方法研究了马铃薯晚疫病病菌DNA多态性与A2交配型的关系[6]。2005年侯淑英等使用178个10bp随机引物对晚疫病病菌的甲霜灵抗性性状进行RAPD分析，得到一个相对稳定的与甲霜灵抗性连锁或相关的标记S500，为晚疫病的有效防治和病原菌的抗药性治理提供了理论依据和实践方法[7]。AFLP是1993年由荷兰keygene公司科学家Zabeau等人发明的一种DNA分子标记技术[8]，该技术的基本原理是：对基因组DNA进行限制性酶切片段的选择性扩增。主要步骤是：将基因组DNA进行限制性酶切后，将特定的接头连接在DNA酶切片段的两端，从而形成一个带接头的特异片段，通过接头序列和PCR引物3'端的识别，进行PCR扩增，最终经过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，通过银染或放射自显影检测。AFLP技术实际上是将RFLP和PCR相结合的一种技术[9～10]。该技术既继承了RFLP的稳定性，又具有PCR反应快速、灵敏的特点，同时克服了RFLP和RAPD的缺点，且扩增的带纹多（50～100条）。AFLP的大多数扩增片段与基因组的单一位置相对应，实验重复性高，该标记为孟德尔式遗传。目前，AFLP 技术主要用于构建晚疫病病菌的基因连锁图谱，此外也被用来检测病菌的基因型。1997年，Van de Lee[11] 等完成了一张比较完整的致病疫霉基因连锁图谱，这张图谱包括183个AFLP标记，7 个RFLP 标记和交配型基因座，包括10个主要的连锁群和7个次要的连锁群，共827cm，并证明主要连锁群中的标记来自于两个亲本，而次要连锁群中的标记来自A1 交配型的亲本或来自A2 交配型的亲本。同时还证明了致病疫霉是同核型的二倍体[12]。Cooke[13]，Flier等[14]以及Knapova等[15]利用AFLP对来自墨西哥和欧洲的病菌研究发现，墨西哥的菌株几乎每个都具有其特异的AFLP基因型，而欧洲的菌株平均每两个就具有一个特异的AFLP基因型。AFLP带型在分裂中能够保持稳定，并遵循孟德尔遗传规律[16]。交配型及其所在的连锁群的其他标记均不遵循孟德尔遗传规律。AFLP技术用于构建基因连锁图谱，使我们可以从基因水平了解晚疫病病菌，为更好地研究晚疫病病菌、防治晚疫病提供理论依据。短序列重复即SSR（Short sequence repeat）、又称微卫星DNA或短串联重复（Short tandem repeat，STR），这是一类由1～5个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列[17]。同一类的微卫星DNA可分布于整个基因组的不同位置上，由于基本单元重复次数的不同以及重复程度的不完全而造成了SSR位点的多态性，这种多态性有比较丰富的信息量。由于在每个微卫星DNA两端的序列是相对保守的单拷贝序列，因而可根据两端的序列设计一对特定的引物，扩增每一位点的微卫星序列，再经凝胶电泳比较扩增产物的长度变化，即可显示不同基因型个体在微卫星DNA位点上的多态性[18～19]。SSR技术的特点是：呈共显性遗传；在数量方面没有生物学上的限制；其标记带型简单，记录的条带一致、客观、明确；采用PCR技术进行检测只需少量DNA样品，且质量要求不高，即使是部分降解的样品也可进行分析；每个位点均有许多等位形式；另外，它还具有多态性高、实验程序简单等优点[19～20]，所以自1989年SSR技术产生以来，被广泛应用于基因定位和QTLs分析、DNA指纹和品种鉴定、种质资源保存和利用、系谱分析和标记辅助育种[18]。2001年Knapova [21]等首次利用SSR技术研究了瑞士和法国的马铃薯和番茄的晚疫病病菌群体的遗传多样性，同时分析了致病疫霉有性杂交F1代的分离情况，结果发现被测菌株群体具有丰富的遗传多样性。试验中6个SSR位点被鉴定出来，其中的3个SSR位点具有多样性，他们又从3个SSR位点中选择了2个SSR位点的引物（Pi4G和Pi4B）对来源于瑞士和法国的176个菌株进行了鉴定，分别得到4种和6种不同长度的等位基因片段（共21个组合）。2002年G.Knappva [22]等再次报道了法国和瑞士的晚疫病病菌的表型和基因型结构，他们研究的马铃薯晚疫病病菌株中存在11个SSR基因型，其中以A-03和A-06为主，另有1/9的菌株是其他SSR基因型；但尚未发现SSR基因型与菌株的交配型、对甲霜灵的敏感性和菌株来源的地域性有相关关系。Knappva[21～22]等的研究揭示了SSR分子标记适用于分析晚疫病病菌的群体结构，同时也指出了SSR标记技术在病菌应用的潜力和存在的问题，如stutter bands、非特异扩增等。但同其他分子标记相比，SSR技术具有位点特异的优点，有利于分析全球马铃薯晚疫病病菌的种群结构。若能对SSR标记技术进行大量人力、物力的投入，获得更多理想的SSR标记，这种技术将具有巨大的应用潜力。2004年朱杰华用AFLP分子标记研究了河北、云南、四川及黑龙江省的50个晚疫病病菌株的DNA指纹，当欧式距离为10时，50个菌株被聚类为4组，分组情况与菌株来源的地理位置相关，表明马铃薯晚疫病病菌的DNA的AFLP分子标记多样性与病菌的地理来源及病菌对甲霜灵的抗性有一定相关性，但未发现和生理小种及交配型有相关性[23]。2004年魏长拴用RAPD分子标记分析了我国马铃薯主产区的晚疫病病菌的亲缘关系和遗传相关性[24]。2005年郭军等利用SSR、AFLP和线粒体DNA单倍型技术分析了内蒙古地区马铃薯晚疫病病菌的遗传多样性。2006年姚国胜等利用SSR技术测定出中国菌株中存在7种SSR基因型[25]。总的来说，分子标记技术在我国马铃薯晚疫病病菌的研究中应用还很少，今后应进一步将各种分子标记技术应用到马铃薯晚疫病病菌的研究中。综上所述，DNA分子标记技术在马铃薯晚疫病病菌遗传研究上具有重要应用价值，并已取得了可喜的进展，展现了广阔的应用前景。现已研究了晚疫病病菌发源和墨西哥以外地区A2交配型的来源，为晚疫病的防治提供理论基础；明确了一个地区不同菌株之间的基因结构变化，遗传结构差异。利用DNA分子标记技术绘制晚疫病病菌的连锁图谱，使两个标记间距离足够小；借助高密度标记对一些性状基因进行准确定位，从而为抗病育种研究提供科学依据；并运用分子标记找到与目的基因紧密连锁的标记，如在致病疫霉中找到与抗瑞毒霉基因连锁的标记，与毒力基因连锁的标记，从而指导晚疫病的防治。由于上述几种分子标记都各有优缺点，任何一种均不能满足晚疫病病菌遗传研究的所有要求。所以如何更好地利用各种分子标记研究马铃薯晚疫病病菌，预防和控制马铃薯晚疫病，仍需不断研究。

虫草属（Cordyceps）属于真菌门（Eumycota）、子囊菌亚门（Ascomycotina）、核菌纲（Pyrenomyceres）、麦角菌目（Clavicipitales）、麦角菌科（Clavicipitaceae）。本属真菌绝大多数能感染昆虫，并从其头部或体表长出子座体而构成虫、菌复合体——虫草。我国是世界上最早将虫生真菌——冬虫夏草进行药用的国家[1～6]，受我国对虫草传统药用的启发，加上微生物制药的诸多优点，近年来世界上许多国家都加强了虫生真菌的研究。初步研究已表明，虫草及相关真菌是最有潜力从中发现新型生物活性化合物或药物先导化合物的真菌类群[5～11]。根据寄生真菌和寄主的不同可以形成各式各样的虫草，虫草属作为药用真菌中的一个大类，目前报道虫草属真菌已达400多种，我国已记载的有90多种[12]。除冬虫夏草外，还有如霍克斯虫草、大团囊虫草、蛹虫草、珊瑚虫草、鳞翅目虫草等，其中冬虫夏草应用历史悠久，研究得最为深入[13]。尽管虫草在世界各地均有分布，但是相对集中地分布于亚欧大陆。研究表明，虫草可产生多种生理活性物质，这些物质分别具有抗菌、抗病毒、杀虫以及免疫调节等功能，它们在医药、农业、食品工业及现代生物技术的应用中皆有十分重要的意义。目前按其用途可将虫草资源分为3类：即药用、食用和害虫微生物防治资源。我国药用常用种有10余种，最多的是冬虫夏草（C.sinensis）群，其他还有蛹虫草（C.militaris）、亚香棒虫草（C.hawkesii）、大团囊虫草（C.ophioglossides）、凉山虫草（C.liangshanensis）、香棒虫草（C.barnesii）、古尼虫草（C.gunnii）、蝉花（C.sobolifera）等。对于虫草的认识，我国可追溯到公元前11世纪西周至秦朝。从出土的文物中就发现有以虫草作图案的玉雕饰品[14]。1578年成书的《本草纲目》中记载有雪蚕，根据其生活史、性味功效、形态、环境及产地判断，应当是冬虫夏草的古名。在1694年清朝汪昂的《本草备要》中也有关于冬虫夏草的论述，该书记载：“冬虫夏草，甘平，保肺益肾，止血化痰，止劳咳。四川嘉定府所产者佳。冬在土中形如老蚕，有毛能动，至夏则毛出土上，连身俱化成草”，这是冬虫夏草的最早文字记载[3]。赵学敏（1765）著的《本草纲目拾遗》把它的药用归之为“能治诸虚百损”[15～16]。在中华医药百味中，虫草正是以“治诸虚百损”、“阴阳平衡”、“保肺益肾、补精益气、专补命门”的神奇功效被认为是一种不可多得的中药之宝而蜚声华夏，饮誉海外，与人参、鹿茸齐名[14]，共称为中国的三大补品。虫草菌无性型种类包括20余属70余种，其中重要的有拟青霉属17种，头孢霉属6种，层梗孢属l1种，被毛孢属21种，葡萄穗霉属1种，小束梗孢属2种，刺束霉属3种，球束孢霉属1种，轮枝孢属3种，侧孢霉属3种及多头霉属的一些种，其中拟青霉、被毛孢霉、头孢霉及轮枝孢霉的许多种已用于害虫生物防治。早在20世纪50年代，前苏联科学家就用棒形虫草（Cordyceps clavulata）的性型蜡蚧被毛孢（Hirsutella lecanicola）人工培养后防治核桃介壳虫，并获得成功。Shimazu（1988）确证的布氏虫草（Cordyceps brongniartii）及其无性型布氏白僵菌（Beauveria brongniartii），是金龟子幼虫一种常见的病原，多年来日本、法国及我国利用该菌防治森林苗圃、牧场及农田的蛴螬均有较好的效果，在有些场合下可较长期地控制虫口。随着化学农药的大量使用对环境生态的严重影响，生物防治日益被人们所重视，利用昆虫病原微生物防治害虫是重要的手段之一。虫生真菌种类多，代谢类型复杂，以其安全有效，显著的流行潜力，容易大量生产等优点，在害虫的生物防治中占有越来越重要的地位。目前生物防治中应用最广的真菌杀虫剂是白僵菌、绿僵菌、汤普森多毛菌、蜡蚧轮枝菌、拟青霉等。据试验，白僵菌用于防治农、林、果、茶类30余种害虫，均取得良好的效果。国外对白僵菌研究较多的国家有前苏联、美国、日本、法国、德国等。前苏联在20世纪70年代批准登记为Boverin微生物杀虫剂，用作大面积防治马铃薯甲虫、苹果食心虫、小麦盾蝽、玉米螟和甜菜象甲等。我国利用该菌防治农林害虫每年达67万hm2 以上。绿僵菌仅次于白僵菌，目前美国、巴西已有绿僵菌商品制剂，主要用于防治沫蝉、蚊子等。国内应用其防治梨虎、天牛、梨心毛虫、菜青虫、蠹虫、蚊子等，其防效达30%～94%。有关资料显示，目前虫生真菌制剂的研究进展依然缓慢。至1996年，国外登记注册的只有27种剂型，40多种不同的虫生真菌制剂，其中主要为球孢白僵菌和金龟绿僵菌，而国内的商业产品均未形成[17]。因此，还有待于国内科研工作者进行广泛深入的研究。我国虫草资源主要用于药用，其次是食用，作为生物杀虫剂尚处在试验研究阶段。近年来由于人工滥采乱挖，以及生态环境的严重破坏，许多虫草菌面临灭绝的危险。研究人员已意识到这一点，从菌种分类、种类分布、生态、寄主、人工驯化与培养、化学成分、药理与临床等方面做了大量的研究，发现人工培养的菌丝体和发酵液，经化学、药理研究证明与天然虫草基本一致[18]，这无疑为虫草的获得开辟了一条新途径。总之，虫草属真菌的研究还有很多地方有待深入。虫草的药用价值和微生物防治还有很大的潜力可挖，只要广大真菌工作者不懈努力，这一古老的药用真菌必将为人类健康做出新的贡献。