SNP （单核苷酸多态性） 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的 DNA 序列多态性，包含单个碱基的转换、颠换等。InDel是指插入/缺失 （Insertion/Deletion） 基因组中小片段的插入和缺失序列，个体重测序中特指1～50 bp 的小片段插入和缺失。在生物的进化进程中，生物全基因组水平上积累了大量的微小变异，主要包括SNP 和InDel。这些微小变异的变异程度决定了物种之间在表型和生理结构等方面的差异，为新物种的形成提供了最原始的动力，是物种多样性的本质体现。SNP 标记是基因组DNA序列中分布最广泛的一类标记，植物基因组中平均每数百bp就存在着一个SNP （Huang et al.，2010；Qi et al.，2013）。InDel标记也是一种重要的遗传标记，已被广泛应用于图位克隆、基因定位、动植物遗传多样性的鉴定、分子标记辅助育种等领域（Jander et al.，2002；Schnabel et al.，2005；王岩等，2009；王明军等，2010）。随着高通量测序技术的快速发展，利用全基因组重测序（whole genome re-sequencing，WGR） 技术结合混合分组分析法（bulked segregate analysis，BSA） 可高效检测出通过双亲杂交建立的后代群体中导致表型变异的 QTL和突变位点 （Abe et al.，2012；Takagi et al.，2013），并且可以识别大量的 SNP 和 InDel 位点，从而进行SNP 及InDel标记的开发，获得基因区间的SNP 及InDel标记。本研究利用WGR技术及 BSA法相结合，获取与抗炭疽菌叶枯病基因相关的SNP 和InDel位点，并通过对△ （SNP-index） 图谱分析，快速锁定抗病区域，再通过ANNOVAR软件分析，提取注释信息，筛选出候选的抗病基因。并利用实时荧光定量 PCR （qRT-PCR） 技术对候选基因经过炭疽叶枯病病原菌侵染后的不同时间段基因表达量的变化进行分析，寻找响应炭疽叶枯病病原菌侵染的抗病相关基因并对其进行详细的功能分析，以期揭示苹果抗炭疽菌叶枯病的分子机制。用于全基因组重测序的材料为 ‘金冠’ ‘富士’ 及第三章中经过抗病鉴定的 ‘金冠’ב富士’ 的 F1 代群体中极端抗炭疽菌叶枯病的20个单株和极端感炭疽菌叶枯病的20 个单株。取其嫩叶3～5 片，液氮速冻，置于-70℃冰箱保存，用于提取DNA。用于qRT-PCR 分析的材料为 ‘富士’ 和 ‘金冠’ 带嫩叶的一年生健壮新梢各30 枝，用于室内人工离体接种。接种方法同第二章，分别于接种后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h七个时间点采集叶片，液氮速冻后，用于提取RNA，检测基因表达。参考Doyle和Doyle （1987） 及 Cullings （1992） 提取基因组DNA的CTAB法，并加以改进，详见第三章。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的纯度和完整性。条带单一、清晰明亮、无降解、无污染的DNA样品作为合格样品用于后续研究。运用NanoPhotometer ? 分光光度计 （IMPLEN，CA，USA） 对DNA的纯度进行检测。DNA经过 Qubit ? DNA Assay Kit in Qubit ? 2.0 Flu-rometer （Life Technologies，CA，USA） 进行浓度的精确定量。将DNA浓度调整为100 ng/μl。苹果嫩叶总RNA的提取方法如下。（1） 将500 μl裂解液RLT Buffer、50 μl PLANTaid、5 μl β-巯基乙醇，依次加入灭菌的1.5 ml离心管中，混匀，待用。（2） 将冻存于-70℃下的苹果嫩叶0.2 g置于预冷的研钵中，加少量液氮快速研磨成细粉状后转入上述待用的的离心管内 （样品容易褐化，动作要迅速，并保证液氮挥发完全）。（3） 56℃温育5～10 min，期间不断剧烈震荡混匀，以保证充分裂解。（4） 12000 r/min 离心10 min，将离心管缓慢从离心机中取出，将上清液转到新离心管中 （吸取上清液时一定要缓慢，尽量不要吸到底部沉淀）。（5） 较精确估计上清液体积，加入 0.5 倍体积的无水乙醇，盖盖，上下颠倒混匀，此时可能会出现沉淀，但是不影响提取的过程。（6） 将混合物 （每次上样应小于800 μl，可分两次加入） 加入吸附柱中，12000 r/min离心60 s，弃废液。（7） 在吸附柱中加700 μl去蛋白液 RW1，室温下放置5 min （可稍延长时间，去除吸附柱上的蛋白污染），12000 r/min 离心30 s，弃废液。（8） 在吸附柱中加入 500 μl 漂洗液 RW （加过无水乙醇），12000 r/min离心 30 s，弃废液。再加入 500 μl 漂洗液 RW，重复1遍。（9） 将吸附柱放回空收集管中，12000 r/min空离心2 min，尽量除去吸附柱中残留的漂洗液。（10） 将吸附柱放入一个 RNase free 离心管中，在吸附膜上加40 μl RNase-free water （最好事先在 70～90℃中水浴加热），室温放置2 min，12000 r/min 离心1 min，如需RNA浓度较高，可重复离心1次。（11） 取4 μl RNA加入6×RNA Loading Buffer，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取的质量与纯度，并估测提取浓度。（12） 将检测质量好的RNA放入-70℃下保存备用。参照 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time） 试剂盒 （TaKaRa）。具体操作步骤如下 （全程冰上操作）。（1） 基因组 DNA 的去除。在 0.2 ml 灭菌的离心管中依次加入1 μg 总 RNA，2 μl 5×gDNA Eraser Buffer，1 μl gDNA Eraser，用RNase-Free水补足10 μl，42℃，2 min （或者室温5 min）；4℃。（2） 反转录反应。在0.2 ml灭菌的离心管中依次加入10 μl步骤1的反应液，1 μl PrimerScript RT Enzyme Mix I，1 μl RT Primer Mix，4 μl 5×PrimerScript Buffer 2 （for Real Time），用 RNase Free 水补足20 μl。37℃，15 min；85℃，5 s；4℃。（3） 质量检测。用 β-actin 基因的引物对反转录的 cDNA 进行PCR扩增，并用1%的琼脂糖电泳检测，选取质量好的样品在-20℃下保存备用。将 ‘金冠’ב富士’ 的F1 代群体中选取出的 20 个极端抗病的单株和20个极端感病的单株DNA等量混合构建成两个表型池。检验合格的4 份 DNA 样品每份取1.5 μg进行基因文库的构建。通过Covaris破碎机将DNA样品随机打断成长度为350 bp的片段。采用TruSeq Library Construction Kit 进行建库，严格使用说明书推荐的试剂和耗材。DNA 片段经末端修复、加 ployA 尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。构建好的文库通过 illumina HiSeqTM PE150进行测序 （附图4-1）。文库构建完成后，先使用 Qubit 2.0 进行初步定量，稀释文库至1 ng/μl，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段 （insert size） 进行检测，符合预期后，使用Q-PCR 方法对文库的有效浓度进行准确定量 （文库有效浓度＞2 nM），以保证文库质量。4个文库检验合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行 Illumina HiSeq TM PE 150 测序。围绕350 bp的片段进行双末端 125 bp 测序。表型差异的两个亲本测序深度为10 X，抗感池测序深度为20 X。信息分析的主要步骤如下 （附图4-2）。步骤一：对下机得到的原始测序数据 （Raw data） 进行质控得到有效测序数据 （Clean data）。步骤二：将Clean data比对到参考基因组上。步骤三：根据比对结果，进行 SNP、InDel 的检测，分析 SNP、InDel的分布情况并进行注释。步骤四：对子代SNP 频率差异进行分析。步骤五：根据分析结果对目标性状区域进行定位。步骤六：确定候选基因。测序得到的原始测序序列 （Sequenced Reads或者 raw reads），里面含有带接头的、低质量的 reads。为了保证信息分析质量，必须对raw reads过滤，得到有效测序序列 （clean reads），后续分析都基于clean reads。数据处理的步骤如下。一是去除带接头 （adapter） 的reads pair。二是当单端测序read中含有的N的含量超过该条read长度比例的10%时，需要去除此对paired reads。三是当单端测序read中含有的低质量 （Q≤5） 碱基数超过该条read长度比例的 50%时，需要去除此对paired reads。有效测序数据通过 BWA （http：//bio-bwa.sourceforge.net/） 软件 （Li and Durbin，2009） 与 ‘金冠’ 苹果的基因组 （ https：//www.rosaceae.org/data/download） 进行比对，确定reads在基因组上的位置。比对结果使用 SAMTOOLS （ http：//samtools.sourceforge.net/）软件进行SNP-calling （Li and Durbin，2009），发掘 reads 与参考序列以及 reads 之间的 SNP 位点，利用 SAMtools 软件中的 “rmdup” 指令去除序列文件中的重复。人们采用GATK3.3软件 （McKenna et al.，2010） 的UnifiedGeno-typer模块进行多个样本 SNP 和 InDel的检测，使用 VariantFiltration进行过滤，SNP 的过滤参数为：cluster Window Size 4，filter Expression“QD＜4.0 ‖ FS＞60.0 ‖ MQ＜40.0”，G filter “GQ＜20”。InDel的过滤参数为：cluster Window Size 4，filter Expression “QD＜4.0 ‖ FS＞200.0 ‖ ReadPosRankSum＜-20.0 ‖ InbreedingCoeff＜-0.8”。利用ANNOVAR软件 （Wang et al.，2010） 对 SNP 和 InDel 检测结果进行注释。SNP 频率的统计：SNP 频率是指所检测到的总的SNP 数与参考基因组序列的总长度的比值，是衡量一个物种变异程度和多态性的指标。转换颠换率的统计：分别统计发生转换和颠换的SNP 数目。子代 SNP 的频率 （Takagi et al.，2013），即 SNP-index，是与SNP 位点的测序深度相关的参数，是指某个位点含有 SNP 的 reads数与测到该位点的总 reads数的比值。以参考基因组作为参照，分析计算两个子代在每个 SNP 位点的 SNP-index。SNP-index计算方法如附图4-3所示。若该参数为0，则代表所有测到的reads都来自作为参考基因组的亲本，即 ‘金冠’。参数为1则代表所有的reads都来自另一个亲本，即 ‘富士’。参数为0.5，代表此混池中的 SNP 来自两个亲本的频率一致。为减少测序错误和比对错误造成的影响，对计算出 SNP-index后的亲本多态性位点进行过滤，过滤标准如下。（1） 两个子代中 SNP-index 都小于0.3，并且 SNP 深度都小于7的位点，过滤掉。（2） 一个子代SNP-index缺失的位点，过滤掉。计算△ （SNP-index），即两个子代 SNP-index 作差：△ （SNP-index）=SNP-index2 （极端抗病性状）-SNP-index1 （极端感病性状）。为直观反映△ （SNP-index） 在染色体上的分布情况，对其在染色体上的分布进行作图。默认选择1 Mb 为窗口，1 kb 为步长。进行1000次置换检验，选取95%置信水平作为筛选的阈值。为了不忽略掉微效QTL的影响，在全基因组范围内挑选两个子代在SNP-index差异显著的SNP 位点，即挑选子代2 （极端抗病性状） SNP-index大于0.7，且子代1 （极端感病性状） SNP-index小于0.3的位点，并与亲本 ‘富士’ 为纯合及亲本 ‘金冠’ 为杂合的位点取交集，做为候选的基因位点。提取ANNOVAR的注释结果，优先挑选使基因获得终止密码子的变异 （stop loss） 或者使基因失去终止密码子的变异 （stop gain） 或者非同义突变 （missense） 或可变剪接的位点（Splicing） 所在的基因作为候选基因。从网站 https：//www.rosaceae.org/gb/gbrowse/malus_x_domestica/下载候选基因的 mRNA，从基因编码区核苷酸序列的近3’端位置设计引物，PCR产物长度在150～250 bp，引物序列见表4-1，内参基因为β-actin基因。荧光定量 PCR 在罗氏 LightCycler 480 系统上进行，反应体系配制按 SYBR Green PCR Master Mix 说明书进行操作，具体如下：10.0 μl SYBR Premix Ex Taq Ⅱ （2×），0.8 μl正反向引物，2.0 μl cDNA，去离子水补足20 μl。反应程序为95℃ 预变性5 min，95℃ 10 s变性，55℃ 10 s退火，72℃ 10 s延伸，扩增45 个循环。循环结束后进行熔解曲线分析：95℃ 15 s，60℃ 20 s，然后缓慢升温至95℃。基因的相对表达量用公式：F=2-ΔΔCt，ΔΔCt=（待测组目的基因 Ct值-待测组内参基因 Ct值）-（对照组目的基因 Ct值-对照组内参基因Ct值）。Illumina HiSeqTM PE150 测序平台，四个样本共产生 47.115 G的测序原始数据 （Raw data），通过对原始数据中的接头序列，低质量碱基以及未测出的碱基 （用 N 表示） 进行过滤后，得到有效数据 （Clean data） 46.974 G，各样本的 Raw data 在 7774.247～17017.174 Mb，Clean date 在7751.990～16969.215 Mb，过滤后获得的有效数据比率在99.64%～99.72%，碱基错配率低于0.05%。测序质量 Q20 ≥ 95.08%、Q30 ≥ 88.97%，GC 含量在 39.04%～39.16%。这表明所有样本的数据量充足，测序质量很高，GC 分布正常，建库测序成功，保证了后续数据分析的准确性 （表4-1）。样本原始数据/bp有效数据/bp有效率/%错误率/%Q20/%Q30/%GC含量/%富士7774246500775199010099.710.0395.4389.6339.16金冠7900566600787192650099.640.0395.5589.8839.05BR（基因抗池）170171739001696921590099.720.0395.4489.6239.04BS（基因感池）144234894001438116750099.710.0495.0888.9739.15表4-1 测序数据质量概况将四个样品的有效数据与已经发布的金冠苹果参考基因组序列（https：//www.rosaceae.org/data） 进行比对，计算出比对到参考基因组 （参考基因组大小为609314018 bp） 上的 reads条数、测序深度及碱基覆盖率。结果表明，四个样品的比对率均在87%以上，两个亲本的测序深度达到15×以上，抗感池样品的测序深度达到 30×以上。在参考基因组中至少有1个碱基覆盖的位点占基因组的比例达到95%以上，至少有 4 个碱基覆盖的位点占基因组的比例 “富士” 为88.3%，“金冠” 为91.26%，其他两样品达到96%以上。这进一步的说明，本试验测序的数据质量很高，可用于后续的变异检测及相关分析 （表4-2）。样本比对到reference上的reads条数①有效测序数据的reads总条数比对率/%②平均测序深度/x③参考基因组中至少有1个碱基覆盖的位点占基因组的百分比/%参考基因组至少有4个碱基覆盖的位点占基因组的百分比/%富士455966535167993488.2315.9595.9588.3金冠459536665247951087.5615.6798.0991.26BR（基因抗池）10045340711312810688.834.4298.896.67BS（基因感池）8962925610163794888.1830.8898.7896.44表4-2 测序深度及覆盖度统计通过全基因组重测序技术共获得3399950个 SNP 位点，苹果参考基因组总长度为 609314018 bp，据此计算出 SNP 出现的频率为3399950/609314018=0.56%。转换 （T/C、C/T） 和颠换 （T/G、T/A、C/A、C/G） 发生频率 （附图 4-4） 的统计结果显示，T/C 和C/T转换发生的频率分别为 32.5%和 34.1%，T/G、T/A、C/A和C/G颠换发生的频率分别为 9.2%、9.4%、9.4%、5.4%。转换/颠换率为2.0。利用测序获得的有效数据，比对苹果参考基因组序列，经 ANN-OVAR软件分析共得到 SNP 位点 3399950个，InDel 位点 573040个，SNP 位点位于内含子上的465317个，位于外显子上的436309个，其中同义变异 210404个，非同义变异 220539个，InDel 位点位于内含子上的 108996个，位于外显子上的 19957个，其中插入或缺失3 或 3 的整数倍的碱基，不改变蛋白质的编码框的有 6928个。这表明绝大部分变异位于非编码区，或不会导致基因编码的改变，这有利于维持植物体正常的生长发育，保证品种特性的稳定遗传 （表4-3）。类别SNP数量基因上游184156获得终止密码子4837失去终止密码子529外显子同义变异210404非同义变220539内含子465317剪接位点2196基因下游177312基因上游/基因下游12750基因间区2105122转换2265734颠换1134216转换/颠换/%1.997合计3399950表4-3 SNP及InDel检测及注释类别InDel数量基因上游51816获得终止密码子376失去终止密码子68Frameshiftdeletion①7330外显子Frameshiftinsertion5255Non-frameshiftdeletion②3843Non-frameshiftinsertion3085内含子108996剪接位点598基因下游44305基因上游/基因下游3896基因间区342800插入262868缺失310172合计573040表4-3 SNP及InDel检测及注释（续）-1△ （SNP-index）=SNP-index B （极端抗病性状）-SNP-index A （极端感病性状）。进行1000次置换检验，选取95%置信水平作为筛选的阈值。一般情况下，在苹果 F1 群体中，由于每个位点的碱基均来源于双亲中的一个，所以在基因组中大部分区域的 SNP-index都在0.5附近。如果某个SNP 位点与抗性相关，那么在该处的 SNP-index就会显著偏离0.5，△ （SNP-index） 就会显著大于此处的阈值。从抗感池中△SNP-index值在染色体上的分布可以看出，在第15 条染色体2～5 Mb区间内△SNP-index值显著的大于阈值，预示着该区域内可能存在着与抗炭疽菌叶枯病基因相关的位点 （附图4-5）。这与第三章SSR标记所确定的抗性基因所在的区域吻合。在全基因组范围内挑选在两个子代池中 SNP-index 差异显著的SNP 位点，即挑选在抗池中 SNP-index 大于 0.7，在感池中 SNP-index小于0.3，△ （SNP-index） 大于 0.5 的 SNP 位点，并与亲本‘富士’ 为纯合，亲本 ‘金冠’ 为杂合的位点取交集，共得到258 个候选的多态性标记位点 （表4-4）。这258 个 SNP 位点中位于基因上游1 kb的19个，基因下游1 kb 的12 个，位于基因上游1 kb 区域，同时也在另一基因的下游1 kb区域的2 个，位于基因间区的173 个。位于外显子上非同义变异的13 个，同义变异7 个，位于内含子上的31个。其中位于第15条染色体上的有123 个，占整个候选 SNP 位点的47.7%。类别SNP数量基因上游19获得终止密码子0失去终止密码子0外显子同义变异7非同义变13内含子31剪接位点1基因下游12基因上游/基因下游2基因间区173转换161颠换97转换/颠换/%1.659合计258表4-4 候选多态性标记位点的注释提取ANNOVAR的注释结果，优先挑选能引起基因获得终止密码子、失去终止密码子的变异，或者非同义突变，或者可变剪接的位点所在的基因作为候选基因。经筛选后得到33 个 SNP 位点及所对应的29个候选基因 （表4-5）。这些SNP 位点中发生转换的 （G/A、C/T、T/C、A/G） 共 16 个，占 48.5%，发生颠换的 （G/C、C/G、G/T、A/C、A/T、T/G、T/A、C/A） 共17 个占51.5%，其中有21 个位于第15条染色体上。基因ID类型染色体SNP位点参考基因组碱基型Ref突变碱基型AltMDP0000294705nonsynonymous24029182TCMDP0000311597upstream26560007TCMDP0000335197upstream238255166CTMDP0000481284nonsynonymous511687941TCMDP0000266783nonsynonymous516570950ACMDP0000223383upstream814935907CTMDP0000203531upstream918259400TGMDP0000265695upstream919790733GAMDP0000224187nonsynonymous1034991229ATMDP0000226279upstream1123158805AGMDP0000480608upstream123704417TGMDP0000504610upstream1229472316TCMDP0000292279upstream151396770CTMDP0000686092nonsynonymous153955717AGMDP0000686092nonsynonymous153955724AGMDP0000686092nonsynonymous153955738TAMDP0000205432nonsynonymous154094431TAMDP0000120033upstream154236293AGMDP0000864010nonsynonymous154257246GAMDP0000945764nonsynonymous154336468CAMDP0000149107splicing154970310CTMDP0000609131upstream156771435CAMDP0000169753upstream157074724ACMDP0000296372upstream157704309CT表4-5 候选基因ID基因ID类型染色体SNP位点参考基因组碱基型Ref突变碱基型AltMDP0000199827upstream157710714TAMDP0000194508nonsynonymous157757532GAMDP0000320004upstream158084422ATMDP0000320004upstream158084636TCMDP0000320004upstream158084637ACMDP0000148808upstream158365795GTMDP0000133266upstream1533862275AGMDP0000157213nonsynonymous1549031042CGMDP0000169687nonsynonymous1552444208TC表4-5 候选基因ID（续）-1结合 SSR标记定位及全基因组重测序中对△ （SNP-index） 值分析的结果，从这29 个候选基因中筛选出位于第15 条染色体3.9～4.9 Mb距离内的5个基因 MDP0000686092、 MDP0000205432、MDP0000120033、 MDP0000864010、 MDP0000945764 做为抗炭疽菌叶枯病的最终候选基因。通过对5个候选基因进行 GO 功能富集分析发现，5 个候选基因中有3个功能未知。基因 MDP0000120033 具有核酸绑定功能，锌离子结合分子功能，参与 RNA 剪切生物过程，调节基因产物的表达。蛋白结构上具有CCHC型结构域的锌指结构，是丝氨酸精氨酸富集剪接因子。进一步同源比对该基因为 SR基因家族 RSZ亚家族基因，与拟南芥AtRSZ21蛋白的序列一致性达到60%，与花生AdRSZ21蛋白的序列一致性达到79%。基因 MDP0000864010 具有辅酶绑定功能，蛋白结构上具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 （磷酸盐） NAD （P） 绑定区域，属于NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族，进一步的同源性比对，该蛋白与鼠李糖生物合成酶 1 （rhamnose biosynthetic enzyme 1，RHM1） 有较高同源性 （表 4-6）。候选基因编码的氨基酸序列见附录五。基因ID基因功能注释MDP0000686092功能未知蛋白MDP0000205432功能未知蛋白质。MDP0000120033核酸绑定功能，锌离子结合分子功能，参与RNA剪切生物过程，调节基因产物的表达。具有锌指结构，CCHC型结构域，丝氨酸精氨酸富集剪接因子。MDP0000864010辅酶绑定功能，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸盐）NAD（P）绑定区域，NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族，可能与鼠李糖生物合成酶1有关。MDP0000945764功能未知蛋白表4-6 抗炭疽菌叶枯病候选基因的功能注释利用TMHMM2.0软件对候选基因进行跨膜结构分析，基因MDP0000686092和MDP0000120033具有跨膜结构。基因MDP0000686092具有1个跨膜区，基因MDP0000120033具有3个跨膜区，位置分别在153～172、187～209、214～236的区域内（附图4-6）。引物名称引物序列MDP0000686092基因荧光定量PCR引物P1-FP1-RF：5′-CAGGCTGGAGCGAAGTTTA-3′R：5′-CCTTTCTGTGATGGCATTGTT-3′MDP0000205432基因荧光定量PCR引物P2-FP2-RF：5′-GAAAAGCCAGCACCAGAAAC-3′R：5′-CGTATTCGTGGGGTTATAGAGC-3′MDP0000120033基因荧光定量PCR引物P3-FP3-RF：5′-TCTGGGAATGCTGCTAAAACTC-3′R：5′-GCAGGGCAGTAGTGAAGCAC-3′MDP0000864010基因荧光定量PCR引物P4-FP4-RF：5′-CGTGACCAATCGCCTAATA-3′R：5′-GGACGTGAGTGCCGTAGAC-3表4-7 荧光定量PCR引物引物名称引物序列MDP0000945764基因荧光定量PCR引物P5-FP5-RF：5′-TTTGCCAGCCTGTCAGAAGT-3′R：5′-AGTTGTAGAGGGAGGAGGAAGA-3′β-actin基因荧光定量PCR引物P6-FP6-RF：5′-CACTGCTTCTATGACTGGTTTTGA-3′R：5′-CTGGCATATACTCTGGAGGCTT-3′表4-7 荧光定量PCR引物（续）-1对接种炭疽菌叶枯病病菌后 0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h的 ‘富士’ 和 ‘金冠’ 枝条进行采样，提取 RNA，反转录成cDNA后，对5个候选基因的表达进行实时荧光定量分析。结果显示，5个基因均不同程度响应病原菌侵染 （附图4-7、 表4-7）。除了基因MDP0000864010在 ‘富士’ 叶片中的表达量表现为下调外，其余 4个基因均为上调表达。在 ‘富士’ 叶片中，基因 MDP0000205432、MDP0000120033和MDP0000945764 的表达量在接种后 24 h 均达到最高值，48 h降到最低值，然后又缓慢提高。在 ‘金冠’ 叶片中的表现不同于 ‘富士’，三个基因表达量的最高值出现在36 h，但最低值同样出现在48 h，这说明在这3个基因在抗病植株中对病原菌的应答要早于感病植株。尽管基因 MDP0000686092 和 MDP0000945764 在‘富士’ 和 ‘金冠’ 叶片中也均表现为上调表达，但是在 ‘金冠’ 叶片中的表达变化更为显著，基因 MDP0000945764 在 ‘金冠’ 叶片中的表达量达到最高值时为接种前的60 倍，而在 ‘富士’ 中的提高量为接种前的10倍。以上结果说明，5个候选基因均受炭疽菌叶枯病病菌的诱导，是苹果炭疽菌叶枯病抗病相关基因。SNP 标记的开发主要依赖于含有大量测序序列的数据库。通过全基因组测序，不仅可以获得大量的 SNP 标记，还可以了解到 SNP 标记在整个基因组中的分布情况，有利于我们进一步了解不同物种的生物学特性，以及利用标记进行不同需求的生物学研究。在葡萄的基因组测序中发现，SNP 位点的密度高达7%（Jaillon et al.，2007）；2010发表的金冠苹果全基因组序列中，SNP 标记的频率约为 4.4 kD/SM，即227 bp/SNP （Velasco et al.，2010）；梨的全基因组序列中共检测到3402159个 SNP 位点，约占基因组序列的 1.02%（Wu et al.，2013）；柑橘中得到的 SNP 位点数量为106 万个 （Xu et al.，2013）。对于有参基因组，通过全基因组重测序手段进行大量 SNP 标记开发，也是研究不同品种间差异的有效途径之一。通过对6 个玉米自交系的进行全基因组重测序，在非重复序列区域内共获得了 1272134个SNP 标记 （Lai et al.，2010）；对葡萄的230个基因片段重测序，数据统计结果显示，每64 个碱基中就存在着一个 SNP 位点 （Lijavetzky et al.，2007）；在水稻中，水稻籼稻恢复系 7302R 通过全基因组重测序，检测到307627个SNP 位点，其中有30239个位于mRNA序列中（Li et al.，2012b）；通过对苹果品种 ‘金冠’ 和 ‘红玉’ 进行全基因组重测序，在 ‘金冠’ 中得到了 2222816个 SNP 位点，在 ‘红玉’中得到了 4950346 个 SNP 位点，密度分别为 293 bp/SNP 和210 bp/SNP （孙瑞，2015）。SNP 变异从理论上来看主要包括转换、缺失、颠换和插入四种形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2∶1。并且SNP 在CG序列上出现的最为频繁，而且多是 C 转换为 T，主要原因为CG中的胞嘧啶常被甲基化，而后自发脱氨基形成胸腺嘧啶 T （Johnson and Told，2000；Mullikin et al.，2000）。从本实验中对 SNP转换/颠换频率统计结果来看，转换/颠换比为2.0，发生转换的频率为66.6%，发生颠换的频率为 33.4%，C/T 转换发生的频率最高为34.1%。这与前人研究的结论相符。通过重测序技术可以获得海量SNP 标记，利用这些标记构建高密度遗传连锁图谱为不同群体的进化分析，不同性状基因的遗传定位，分子标记辅助育种等提供有效信息。‘M.27’בM.116’ 的高密度遗传图谱是由306个SSR标记和2272个 SNP 标记组成，图谱密度达到了每 0.5 cM 一个标记 （Antanaviciute et al.，2012）。Khan 等（2012） 利用2875个分子标记构建了苹果的整合遗传图谱，其中包含了2033个 SNP 标记和 843 个 SSR 标记，总长为 1991.38 cM。Clark等 （2014） 利用3个不同的F1 杂交群体和SNP 芯片分型技术构建了包含1091个 SNP 标记的苹果品种 ‘Honeycrisp’ 的整合遗传图谱，标记间的平均距离为1.36 cM。基于高通量基因组重测序技术能够更加准确、全面的对测序物种进行全基因组水平上的位点进行评估，可以精确的完成单核苷酸多态性位点的检测，分子标记的开发，遗传图谱的构建，不同群体间的进化分析，与表型变异相关基因的挖掘以及快速定位等等。本研究通过运用全基因组重测序的方法对有着明显抗感性状分离的 ‘金冠’ 和 ‘富士’ 及其由 F1 代极端表型个体组成的抗感池进行全基因组范围内的遗传变异检测，共筛选得到 SNP位点3399950个，InDel位点573040个。通过对△SNP-index图谱的分析发现，在第15条染色体的2～5 Mb的区间内，△SNP-index显著的大于阈值，存在着明显的连锁不平衡，意味着该区域可能存在着抗炭疽菌叶枯病基因位点。这一结果与SSR标记所定位的抗炭疽菌叶枯病基因位点位置相吻合。SNP 广泛分布于基因组DNA中，且数量巨大。因为任何碱基均有可能发生变异，因此SNP 既有可能出现在基因的编码区，也有可能在基因的非编码区，或者两个基因之间的序列上。总的来说，位于基因内编码区的SNP 比较少，且该部分的 SNP 有可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此位于编码区 SNP 的研究更受关注。本试验对可能引起基因获得终止密码子、失去终止密码子、非同义突变、可变剪接的变异位点进行重点筛选，将其所在的基因作为候选基因。通过筛选共得到33个候选SNP 位点和29个候选基因。结合第三章SSR标记对炭疽叶枯病抗性基因的定位，最终锁定了 5 个候选基因： MDP0000686092、 MDP0000205432、 MDP0000120033、 MDP0000864010、MDP0000945764。锌指结构是一类在很多蛋白中存在的具有指状结构的模体，是具有识别特定碱基序列的一种转录因子结构。锌指的典型功能是作为互作的组件与核酸、蛋白质和小分子等多种物质相结合，参与多种细胞过程，如DNA的复制与修复、RNA 转录与翻译、物质代谢与信号转导、细胞的增殖与凋亡等 （Krishna et al，2003）。可变剪切 （Alternative splicing，AS） 是重要的转录后调控机制，在动物中对其在不同的生理以及病程条件下的可变剪切的调控作用研究的较多 （Garcia-Blanco et al.，2004；Nilsen and Graveley，2010）。据报道在拟南芥中超过 42%的外显子基因存在可变剪切现象（Filichkin et al.，2010）。在植物可变剪切数据库中有很大比例的 AS参与逆境响应基因的表达，这进一步强调了可变剪切在逆境响应中的重要作用 （Wang and Brendel，2006；Duque，2011）。在生物胁迫中，有许多试验证明AS参与植物的抵抗和防御机制。例如，在一些 R 基因中如番茄的N 基因，拟南芥的SNC1、 RPS4基因，发现可变剪切的存在 （Dinesh-Kumar and Baker，2000；Zhang and Gassmann，2003）。SR蛋白，丝氨酸/精氨酸富集剪切蛋白 （serine/arginine-rich proteins，SR protein） 是RNA绑定蛋白家族中功能和结构高度保守的一类因子，参与可变剪切过程。例如， AtSR30在高盐碱以及过氧逆境中被上调表达 （Tanabe et al.，2007）。SR在不同的环境条件下的表达量的差异说明了SR蛋白在逆境响应中的调控作用。基因MDP0000120033具有核酸绑定，锌离子结合分子功能，参与 RNA 剪切生物过程，调节基因产物的表达。具有CCHC型锌指结构和丝氨酸/精氨酸富集剪接因子，属于SR 基因家族 RSZ 亚家族基因。丝裂原活化蛋白激酶 MPK6 和MPK3在植物的防御反应中起着重要作用，而拟南芥基因 AtRSZ21 在体外试验中被发现能够被MPK6/MPK3磷酸化 （Feilner et al.，2005），这就意味着 AtRSZ21 也可能参与了植物的防御应答。Kumar 和 Kirti （2012） 报道了花生的一个属于 SR 亚家族基因 RSZ 蛋白基因AdRSZ21，在植物的超敏反应和抗逆反应中起着重要的作用。NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族是真菌病原体镰刀菌致病机制中的一个关键酶 （Srivastava et al.，2014）。细胞壁是植物细胞进行正常的生命活动不可缺少的重要组成部分。其不但在维持细胞形态、细胞间黏结、细胞壁的强度和调控细胞伸长等方面起着重要的作用，还参与了细胞的分化、抗病、细胞识别及信号传导等一系列生理、生化过程。细胞壁主要成分包含纤维素、半纤维素、果胶和少量的结构蛋白等。基因MDP0000864010属于依赖差向异构酶/脱氢酶家族，并且与鼠李糖合成酶Ⅰ （ RHMⅠ） 有较高的同源性。可能参与合成鼠李糖，而鼠李糖是细胞壁果胶多聚糖的重要组分之一。所以该候选基因有可能在细胞的组成层面增加个体的抗性。基因的相对表达量分析也表明，五个基因都不同程度的响应了病菌的诱导，是与抗炭疽菌叶枯病相关的候选基因。但是其参与抗病的机理和途径仍不清楚，深入的研究将继续展开。

植物病原菌的生物控制是最有前景也是比较实际的一种方法，众多的微生物已被证实具有生防效果（Massarty等，2006）。目前，棉花枯萎病的生防因子比较多，主要有微生物的利用和棉花枯萎病抑菌土的形成。应用拮抗微生物防治棉花枯萎病是比较有前景的防治方法。目前，用于防治棉花枯萎病的微生物主要包括真菌和细菌等。能够对棉花枯萎病产生拮抗作用的真菌较多，主要是木霉，包括哈茨木霉菌、绿色木霉菌等主要种类。此外，还有青霉菌、黏帚菌、曲霉菌以及非致病性尖孢镰刀菌等，也可作为防治棉花枯萎病的拮抗真菌。木霉（Trichodermaspp.）是土壤中广泛存在且有生防作用的一类真菌，对多种植物病原菌都有很强的拮抗作用，是自然界中普遍存在并有丰富资源的拮抗微生物。早在1932年，Weindling首次发现木霉菌对植物病原真菌有拮抗作用，据不完全资料，木霉对18个属29种病原真菌表现拮抗作用，在农业上应用木霉菌防治土传病害已有许多成功的报道。1999年，Sivan等对哈茨木霉防治棉花枯萎病的机制进行了研究认为，营养竞争作用是哈茨木霉减少枯萎病菌群体的机制之一。涉及的营养基质有葡萄糖和天门冬酰胺。在非根际土壤中，哈茨木霉不能减少枯萎病菌的数量。Ordentlich等（1991）试验结果表明，在平板对峙试验中，木霉菌株T-68和Gh-2生长迅速，其菌落能够扩展到棉花枯萎菌菌落中，并寄生在枯萎菌菌丝上。另一个木霉菌T-35（哈茨木霉）不能扩展到枯萎菌菌落中去，但温室盆栽试验表明，这3株木霉菌均能显著地防治棉花枯萎病。Silva-Hanlin等（1997）测试了5种木霉（Trichoderma polysporum、T.koningii、T.pseudokoningii、T.viride和T.harzianum）对棉花枯萎菌的作用。结果表明，供试的5种木霉菌均具有不同程度抑菌效果，其中，T.polysporum抑菌效果最强，其抑菌机理主要是导致菌丝内液泡增加和细胞质壁分离。而T.harzianum则是通过菌丝缠绕在棉花枯萎菌的菌丝上，并能够穿透病原菌菌丝。T.pseudokoningii也表现出穿透枯萎菌的能力。T.polysporum和T.viride还能够强烈地抑制病原菌分生孢子的萌发。温室生测试验中，T.harzianum、T.koningii和T.viride能够显著减轻棉苗枯萎病的为害。高智谋等（2007）利用平板对峙法和杯碟法测定了从安徽萧县枯萎病田土壤中分离、鉴定获得的哈茨木霉TH-1菌株对棉花枯萎病菌的拮抗作用。结果表明，哈茨木霉TH-1菌株与病菌对峙培养、以及在培养基中加入TH-1菌株孢子悬浮液，对供试棉花枯萎病菌有较好的抑制效果。平板对峙培养2天后，哈茨木霉TH-1菌株和供试病原菌沿接种点连线方向的生长均受到对方的抑制，但前者对后者的抑制作用更为明显。表8-1是培养3天和4天后各供试病原菌单独培养和与TH-1菌株对峙培养沿接种点连线方向的生长距离测定结果。从表8-1可知，TH-1菌株对各供试病菌菌株均有显著的抑制效应，抑制效应大小，菌株间有一定差异。对峙培养4天后，枯萎病菌WWKW1-1、WJKW2-4和XXKW5-1的菌落被哈茨木霉TH-1包围，菌落背面颜色由紫色变为橘黄色，并不再生长，两菌落间形成对抗局面。其后，TH-1可继续向前生长，并部分覆盖于枯萎病菌菌落之上，但最终不能完全覆盖枯萎病菌。说明在对峙培养中，哈茨木霉TH-1菌株的营养和空间竞争能力优于供试病原菌。培养5天后，哈茨木霉TH-1菌株各浓度处理对所有供试菌株的菌丝生长均有显著的抑制作用，且总体来说，抑菌率随TH-1菌株菌液量的增加而呈现递增的趋势。其中，2.50ml的处理对各供试病菌均完全抑制；1.00ml的处理对WWKW1-1、WJKW2-4和XXKW5-1菌株的抑制率分别为70.71%、37.80%和72.96%，培养5天后还观察到枯萎病菌WWKW1-1、WJKW2-4和XXKW5-1的菌落被哈茨木霉TH-1包围，菌落边缘颜色变褐，并不再生长，而TH-1可继续扩展，但最终不能完全覆盖枯萎病菌。在玻片对峙培养最初12h，哈茨木霉TH-1和枯萎病菌XXKW5-1的菌丝均独立生长，显微镜下观察不到相互作用；24h后于两菌株菌丝交接处，显微镜下可观察到TH-1菌丝与枯萎病菌XXKW5-1菌丝缠绕和平行生长，并产生附着胞结构与病菌菌丝附着；还观察到枯萎病菌XXKW5-3受到TH-1菌丝寄生而发生裂解现象。这表明，哈茨木霉TH-1对枯萎病菌XXKW5-1进行了重寄生。供试菌株培养3天后生长距离培养4天后生长距离对峙培养（cm）单独培养（cm）抑制率（%）对峙培养（cm）单独培养（cm）抑制率（%）WWKW111.432.6445.831.503.2854.27WJKW241.272.0838.941.302.4346.50XXKW511.432.7147.231.533.2953.50表8-1 平板对峙培养哈茨木霉TH-1菌株对棉花枯萎病菌生长的抑制作用对棉花枯萎病具拮抗作用的真菌，不仅可从棉田土壤中分离获得，而且也从蘑菇培养料废料和某些昆虫体内分离获得。张军华等（2009）从蘑菇培养料废料中，分离筛选出10株生防真菌。通过室内抑菌试验筛选出生防效果显著的7个菌株：TH、TP、TV、T1-5、TK、T1-1和T2-2（表8-2）。温室盆栽防病试验采用生防菌PD液的处理和采用生防菌棉籽壳制剂的处理，在温室灭菌土中（接种病菌）的相对防病效果分别为87.2%和90.6%，并且稳定性好。大田防病效果测定表明，棉籽壳生防菌剂明显降低了棉花枯萎病的病情，增产效果显著。当生防菌剂施入土壤后，就暂时打破了棉花根际原有的微生态平衡，成了这一微生态群的优势种群，对枯萎病菌发生拮抗作用，并与病原菌争夺营养物质和生存空间，阻隔了病原菌与棉花幼根接触；另外，棉籽壳的后发酵释放热量还可提高地温1.0～1.5℃，促幼苗早发，或在其他方面影响病原菌的生长和蔓延，使棉花枯萎病发病率降低或推迟。但这种被打破了的微生态平衡，有倾向于恢复正常的趋势。随着时间的推移，生防菌的种群优势逐渐削弱，棉花根际的微生态恢复常态，在土壤中普遍存在枯萎病菌的情况下，棉株罹病率可能会增加，但这种显著降低和推迟棉枯萎病田间病情的效能是非常可贵的，因为造成棉花产量损失的主要因素是前期发病，发病越迟对产量的影响越小。编号拮抗菌株R值菌株来源采集地TLTrichodermalongibrachiatum0.6802a棉籽壳平菇培养料东昌府THTrichodermaharzianum0.3980bc棉籽壳平菇培养料东昌府TVT.viride0.4151bc棉籽壳平菇培养料莘县TCT.citrinoviride0.6763a棉籽壳平菇培养料冠县TKT.koningi0.4827b棉籽壳平菇培养料莘县TPT.pseudokoningi0.3827c棉籽壳平菇培养料东昌府T1-1T.sp0.4527b木屑香菇培养料冠县T2-2T.sp0.5927a木屑香菇培养料冠县T1-5Trichodermaspp0.4127bc玉米芯平菇培养料莘县PPeniciliumsp.0.7027a玉米芯平菇培养料莘县CK1—表8-2 蘑菇培养料分离所得拮抗菌对棉花枯萎病菌抑菌效果金龟子绿僵菌是一种广谱性的昆虫病原真菌，其寄主范围广泛，能够侵染多种农业害虫，人类利用它防治害虫的历史已愈百年，但国内外有关虫生真菌对棉花枯萎病菌的生防效果鲜见报道。齐永霞等（2010）采用平板对峙培养法和杯碟法测定了金龟子绿僵菌对棉花枯萎病菌的拮抗作用。结果表明，金龟子绿僵菌Ma10、Ma27和Ma55菌株与棉花枯萎病菌WWKW、WJKW和SZKW菌株对峙培养以及在培养基中加入金龟子绿僵菌Ma55菌株的分生孢子悬浮液，对供试棉花枯萎病菌菌丝生长均有较好的抑制作用。平板对峙培养4天后，金龟子绿僵菌菌株和供试棉花枯萎病菌菌株沿接种点连线方向的菌丝生长均受到对方的抑制，但前者对后者的抑制作用更为明显。由图8-1可以看出，绿僵菌Ma55与棉花枯萎病菌WJKW在对峙培养处形成明显的隔离带。液体振荡培养不同时间获得的金龟子绿僵菌Ma55发酵液对棉花枯萎病菌WJKW、WWKW和SZKW的菌丝生长、分生孢子产生量及分生孢子萌发均具有一定的抑制作用（表8-3）。其中，液体振荡培养20天获得的Ma55发酵液对棉花枯萎病菌WJKW、WWKW和SZKW的菌丝生长抑制率分别达到59.86%、56.99%和57.09%，对棉花枯萎病菌WJKW、WWKW和SZKW的分生孢子产生量和分生孢子萌发率具有显著的抑制作用（表8-4、表8-5）。上述结果说明，金龟子绿僵菌Ma55对供试棉花枯萎病菌的抑制作用主要是通过营养竞争、空间竞争及抗生作用来实现的。图8-1 金龟子绿僵菌Ma55与棉花枯萎病菌WJKW的对峙培养（4天）发酵液培养时间（天）抑制率（%）WJKWWWKWSZKW74.20±0.563.96±0.093.35±0.161025.60±0.9223.37±0.6223.38±0.501228.77±0.5226.93±0.5527.10±0.501436.23±0.4534.17±0.6734.54±0.471637.57±0.5136.04±0.4735.89±0.522059.86±1.3856.99±0.6057.09±0.66表8-3 金龟子绿僵菌Ma55发酵液对棉花枯萎病菌菌丝生长的影响发酵液培养时间（天）棉花枯萎病菌分生孢子产生量（×106）（cfu/ml）WJKWWWKWSZKW0（CK）8.90±0.039.13±0.049.21±0.0378.74±0.078.93±0.029.01±0.03107.51±0.047.90±0.028.04±0.02127.03±0.027.28±0.047.51±0.03146.20±0.026.41±0.036.64±0.04165.39±0.025.56±0.045.84±0.04203.14±0.043.37±0.043.91±0.05表8-4 金龟子绿僵菌Ma55发酵液对棉花枯萎病菌分生孢子产生量的影响发酵液培养时间（天）棉花枯萎病菌分生孢子萌发率（%）WJKWWWKWSZKW0（CK）65.89±0.1563.89±0.1162.07±0.94758.94±0.0857.82±0.1858.88±0.461049.83±0.0647.54±0.3648.48±0.501239.94±0.0738.49±0.3039.71±0.571434.54±0.0630.25±0.0633.37±0.671624.21±0.0722.77±0.2023.89±0.262011.66±0.2910.67±0.0913.00±.12表8-5 金龟子绿僵菌Ma55发酵液对棉花枯萎病菌分生孢子萌发率的影响绿僵菌素是金龟子绿僵菌分泌的一种次生代谢物质，具有明显的杀虫活性。自从1961年Kodaira在培养金龟子绿僵菌的滤液中首次发现绿僵菌素以来，科学工作者对绿僵菌素开展了广泛的研究，但国内研究较少。1985年，Hino等从绿僵菌属中分离出苦马豆素，发现苦马豆素是一种很有潜力的免疫调节剂。金龟子绿僵菌Ma55发酵液对棉花枯萎病菌的菌丝生长、分生孢子产生量及分生孢子萌发具有较好的抑制作用，与绿僵菌素和苦马豆素的产生是否有关系尚待进一步研究。总之，金龟子绿僵菌是一种重要的昆虫病原真菌。昆虫病原真菌在代谢类型上十分复杂，能产生多种生理功能特异的生物活性物质。这种代谢产物的多样性，为人类开发新的生物防治制剂、药品及在其他领域的利用提供了重要的途径。来自昆虫的病原真菌球孢白僵菌（Beauveria bassiana），具有分布和寄主范围广、环境安全、易大量培养等优点，已在农林害虫生物防治中发挥着重要作用，迄今已有不少应用该昆虫病原真菌防治植物病害的成功报道（Renwick等，1991；Flor等，1993；Kapongo等，2008；Onley等，2008；Clark，2005）。这些结果表明，该菌有潜力成为具有防虫和防病双重功效的生防因子。张胜利等（2011）体外测定了8株球孢白僵菌[菌株RCEF0013、4452和0383分别分离自马尾松行书虫（Dendrolimus punctatus）、光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）和松墨天牛（Monochamus alternatus），产地分别为安徽霍邱、蚌埠和日本；1151、2901和2909均分离自安徽宣城的松林土壤；3051分离自安徽滁州琅琊山的阔叶林土壤；3108分离自福建武夷山的阔叶林土壤]对棉花枯萎病菌的拮抗作用。平板对峙培养时，枯萎病菌的生长均受到明显抑制（表8-6）。不同含孢量的球孢白僵菌对枯萎病菌的抑制效果不同，且抑制率与孢子浓度呈显著的线性关系；在接种量为6×107个孢子/ml时，抑制率达到90%以上。球孢白僵菌代谢液对枯萎病病原菌也表现出抑菌作用，并且抑制率与代谢液浓度呈显著的线性关系（表8-7）。综上所述，球孢白僵菌对枯萎病的拮抗作用的机制主要涉及营养和空间竞争以及抗生作用，其中，抗生作用对拮抗作用的贡献更大。对抗生性代谢液的初步分析发现，醇沉后的上清液冻干粉经4种有机溶剂浸提后，无明显的抑菌作用；而向培养基中添加球孢白僵菌多糖和蛋白粗提物均能显著抑制两种镰孢菌的菌丝生长。因此，抑菌活性物质主要是大分子的多糖和蛋白。菌株培养3天培养5天生长距离（cm）抑制率（%）生长距离（cm）抑制率（%）038318.54±0.16cdBC20.5519.02±0.16bB44.83445218.05±0.47dC22.6518.55±0.41bB46.29115118.63±0.17cdBC20.1819.11±0.21bB44.58310818.35±0.26cdBC21.3518.79±0.45bB45.39001318.44±0.36cdBC21.0017.94±0.12bB45.14290919.36±0.31bcBC17.0619.33±0.34bB42.41290119.20±0.16bcBC17.7419.33±0.32bB42.88305119.69±0.48bB15.6219.97±0.32bB41.41CK23.34±0.20aA—33.61±3.39aA—表8-6 8株白僵菌平板对峙培养对棉花枯萎病菌生长的抑制作用发酵液（ml）3天抑制率（%）5天抑制率（%）2.538.8244.04233.8141.481.534.2035.76123.5728.080.514.1119.83表8-7 白僵菌菌株4452的发酵滤液对棉花枯萎病菌生长的影响目前，已报道的用来防治棉花枯萎病的拮抗细菌主要有假单胞菌[恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、荧光假单胞菌（P.fluorescens）和产碱假单胞菌（P. alcaligenes）]、芽孢菌[短小芽胞杆菌（Bacillus pulniLus）、枯草芽胞杆菌（B.subtilis）和蜡质芽胞杆菌（B.cereus）]、天牛金杆菌（Aureobacterium saperdne）、茜草叶杆菌（ Phyllohactgrium rubiaceurum）、茄伯克霍尔德氏菌（ BurkholcEeria solanacearum）和放线菌（Actinomycesspp.）等。内生细菌是指能在健康植物的组织内定殖，在一定的条件下与植物体建立和谐互惠，互相制约关系的一类微生物。实际上50多年以前就已有关于植物体内存在内生细菌而不引起植物病症的报道。人们不断地从植物的根、叶、茎和种子上分离并鉴定出多种植物内生细菌，目前，已从近30多种植物中分离到了近60个属的内生细菌。研究发现，内生细菌寄生在植物的组织内部，其代谢产物不仅对植物本身有各种各样的影响，而且对其他病原生物也有各种不同的作用。内生细菌在植物组织内有足够的碳源、氮源，并且受到植物组织的保护，所以，比暴露于恶劣环境的附生菌和腐生菌更具有稳定的生存环境，易于发挥作用，因此，内生细菌作为生防因子的研究越来越受人们的广泛重视，成为国内外生物防治的又一热点。棉花植株的内生细菌由许多不同的种群组成。由于棉花各种组织具有不同的生理及营养环境，从而制约着共生的细菌的种类。但一种植物中往往以某一两种细菌为主要种群。鲁素云等（1989）于1979～1984年，先后从北京、河北等7省市棉花枯萎病田采集无病株和轻病株，以及无病田的健株4000余株，其中，包括生产用抗病和感病品种10余个，在我国首次进行了维管中主要微生物类群分析。结果表明，棉株维管中除了定殖引致萎蔫病的病原真菌之外，还有大量的非病原真菌和细菌。维管真菌是以镰刀菌（Fusariumspp.）为主的半知菌，细菌有芽胞杆菌（Bacillusspp.）、黄单胞杆菌（Xanthomonasspp.）和欧氏杆菌（Erwiniaspp.）为主要成员。不同品种间，其维管组织中的主要真菌和细菌类群大体相似。这种相似性可能与导管中的营养贫瘠和氧气稀薄等条件有关。导管通常被视为植物体的“沙漠地区”，一些对营养要求不高而有耐性的真菌和细菌可能易于在此定殖下来。Misaghi等（1990）从两个栽培品种DP41和DP61的胚根、根、茎、蕾、铃等器官中分离到欧氏杆菌、芽胞杆菌、棒杆菌及黄单孢菌等内生细菌种群，其中，欧氏杆菌为其优势菌种。他对其中6种主要的内生细菌进行了抗生素突变体回接及再分离的研究，其优势种欧氏杆菌（Erwiniasp.）的重分离率分别达69%（DP41）和51%（DP61），而芽胞杆菌（Bacillussp.）则为12%，其他几种依次减少，与最初分离率呈正比，这些回接的内生细菌在这两个栽培种中不引起任何病害症状。罗明等（2004）对不同品种和不同种植地区的健康棉花植株组织中内生细菌进行分离，共得到102个菌株。经鉴定分属于芽胞杆菌属（Bacillussp.）、黄单胞菌属（Xanthomonassp.）、假单胞菌属（Pseudomonassp.）、欧文氏菌属（Erwiniasp.）及短小杆菌属（Curtobacteriurnsp.），其中，芽胞杆菌的分离频率最高，为优势种群（表8-8）。李春宏等（2009）对枯萎病菌具有拮抗的内生细菌进行了分子鉴定，16S rDNA分子序列分析显示，44个拮抗枯萎病的内生菌株包括了两个门（变形杆菌门、拟杆菌门）8个属，优势种群为肠杆菌属（Enterobacter）和泛菌属（Pantoea）。肠杆菌属具有最多的拮抗内生菌株，共18株，存在于所有棉花品种之中。与已报道的菌株16S rDNA序列同源性在97%上有11株，S04、HA01、HB04、C04、C03、C09与已报道的菌株16S rDNA序列同源性相似性分别为91.9%、94.0%、95.5%、96.1%、96.7%和96.9%。泛菌属是除肠杆菌属外具有最多的拮抗内生菌株，共15株，与已报道的菌株16s rDNA序列同源性都在97%以上，其中，11株与Pantoea agglomerans同源性在97.4%～100.0%，在泛菌属中出现频率最高。欧文氏菌属（Erwiniasp.）共6株，都与Erwinia sp.CU208同源，但与已报道的菌株相似度除S03为99.5%，其余10个菌株在97%以下，可能是新的种（属）。除了以上出现频率较高的菌以外，还分离到稳杆菌属（Empedobactersp.）、根瘤菌属（Rhizobiamsp.）、沙雷氏菌属（Serratiasp.）、埃希氏菌属（Escherichiasp.）和克雷伯氏菌属（Klebsiellasp.）各1个菌株，都与已报道的菌株16S rDNA序列相似度高于97%以上。以上的结果分析表明，从棉花中分离到的内生细菌的种类基本相似，但其中的优势种群则有所不同。这可能与棉株不同的生长环境有较大关系。鲁素芸等（1989）研究认为，维管组织的内生菌种群和含量与地理环境及理化环境均有较密切关系。属名菌落形态革兰氏染色反应芽孢接触酶氧化酶需氧性测定芽胞杆菌属（Bacilus）圆形或不规则形，灰白，灰色或乳白色直杆状，成对或链状排列+有，椭圆、卵圆、圆形或柱状阳性阳性或阴性好氧或兼性厌氧欧文氏菌属（Erwinia）白色，凸起液状，中心呈稠密凝絮状或呈规则中心环直杆状，单生，成对有时成链—无阳性阴性兼性厌氧假单胞菌属（Pseudomonas）直或微弯中性培养基上蓝色—无阳性阳性或阴性好氧黄单胞菌属（Xanthomonas）黄色直杆菌，多单生—无阳性弱阳或阴性好氧短小杆菌属（Curtobacte-rium）光滑，凸起，常黄色到橙色幼龄培养物中细胞呈小短及不规则杆菌，老培养物变成类球类+无阳性阳性或阴性好氧表8-8 内生细菌属的主要特征内生细菌可以随棉花植株的生长而繁殖运转。在棉株生长的各个不同阶段，其中的细菌群体的数量有较大变化，通常内生细菌种群数量从种子开始萌发就开始上升，至花期达最高，此后，则趋于平稳或降低。鲁素芸等（1989）报道，棉花内生细菌数量和组成，随棉株生长发育而变化，从幼芽期开始急剧上升，直到结铃期达到高峰，吐絮开始后又略有下降。Mclnroy等（1991）对大田中棉株内生细菌在整个生长季节种群密度的变化进行了较详细研究，结果表明，在种子萌发时，种群密度为每克组织含1×103个菌，到成株期上升为1×105～1×106个，但到成熟期却降为1×103个，从棉桃中几乎回收不到菌，这与其他作物如玉米（成熟期1×1010）有很大的不同。这可能与不同的植物种类成熟期各器官的生活状态有关。Mclnroy等（1990）对棉花内生细菌的来源及其动态影响因素进行了探讨。他们将棉花和玉米种子分别种植在：①琼脂（种子表面未消毒）及②未灭菌的土钵（种子表面消毒）中，萌发6天后检测苗中的内生细菌数量发现：在①中每克棉花组织中含1×105个菌，而②中每克组织中仅有1×102个菌，在玉米中所得到的结果则与棉花正好相反，即①中菌量少于1×102个/g而②中则达1×106个/g，由此说明内生细菌可以是植物种子内带菌（如棉花中），并随植株生长而繁衍；也可以来自土壤（如玉米中），从植物根部进入植物其他器官。罗明等（2004）对内生细菌数量测定表明，棉花种子、根、茎、叶柄、叶片等组织内均存在大量的内生细菌。不同品种、组织及种植地，内生细菌的数量不同。各组织中内生细菌的种群密度的分布特点是，种子中最多，其次为根，再次为茎，叶片、花蕾，叶柄中最少（表8-9）。李春宏等（2009）研究了棉花内生菌的数量动态。结果表明：①棉花不同器官的内生细菌数量不同。根中内生细菌数量波动的幅度在lg 4.88～6.79cfu/g-fw，总均值lg 5.59cfu/g-fw；茎和叶波动的幅度在lg 2.597～5.00 cfu/g-fw和lg 2.39～4.60 cfu/g-fw，总均值分别为lg 3.79，3.70cfu/g-fw。根中内生细菌的数量显著高于茎和叶片，这种趋势表现在6个棉花品种取样的不同生育期。②棉花不同生育期的内生细菌数量不同。在根中，苗期内生细菌数量波动的幅度在lg 4.88～5.55 cfu/g-fw，均值lg 5.25 cfu/g-fw；开花期数量波动的幅度在lg 4.72～6.19 cfu/g-fw，均值lg 5.32cfu/g-fw；吐絮期数量波动的幅度在lg 5.24～6.79 cfu/g-fw，均值lg 5.98 cfu/g-fw。除了亚7113开花期的内生细菌数量低于苗期外，棉花根中苗期的内生细菌数量低于开花期与吐絮期。在茎中，苗期内生细菌数量波动的幅度在lg 3.29～4.50 cfu/g-fw，均值lg 3.88 cfu/g-fw；开花期数量波动的幅度在lg 2.97～5.00 cfu/g-fw，均值lg 3.74 cfu/g-fw；吐絮期数量波动的幅度在lg 3.04～4.55 cfu/g-fw，均值lg 3.76 cfu/g-fw。在叶中，苗期内生细菌数量波动的幅度在lg 2.93～4.13 cfu/g-fw，均值lg 3.71 cfu/g-fw；开花期数量波动的幅度在lg 2.47～4.60 cfu/g-fw，均值lg 3.59 cfu/g-fw；吐絮期数量波动的幅度在lg 2.39～4.57 cfu/g-fw，均值lg 3.74 cfu/g-fw。棉花不同生育期茎、叶中的内生细菌数量波动不一，趋势性不明显。③棉花不同品种间的内生细菌数量不同。在根中，虽同一品种内不同生育期间的内生细菌数量存在显著差异，但6个棉花品种根中，内生细菌总体数量的平均值在lg 5.52～5.58 cfu/g-fw，品种之间的差异并不显著。在茎、叶中，棉花不同品种间的内生细菌数量呈现一定程度的差异，茎中内生细菌数量以草7005为最高（lg 4.62 cfu/g-fw）和海岛20次之（lg 4.24 cfu/g-fw），显著高于其他品种；叶中内生细菌数量以常抗棉为最高（lg 4.17 cfu/g-fw），与亚7113、海岛16、苏棉16差异不显著，显著高于草棉（lg 3.30 cfu/g-fw）和海岛20（lg 2.96 cfu/g-fw）。生育期地点品种根茎叶片叶柄蕾苗期鄯善五家渠农大试验田高抗5号7.0×1042.6×103120×104新陆早10号2.4×1030.2×1031.8×103新陆早13号1.0×10410×104150×104草棉15×10410×104金科18号1.5×1041.3×1030.1×103新海18号100×1041.6×1030.2×103石彩6号990×1040.21×108990×104中棉36号210×1043.1×1043.8×103新陆早8号120×1041.4×1037.0×104表8-9 不同棉花品种不同时期内生细菌的数量（cfu/g鲜重）生育期地点品种根茎叶片叶柄蕾温室运早2543.0×1041.2×103180×104新海160.8×1043.0×1030.5×103142100×1046.9×1030.4×104蕾期鄯善农大试验田高抗5号4.0×104300×1043.0×1041.0×1046.9×104草棉3.5×1042.0×1041.4×1041.2×10419×104金科18号1.9×1042.5×1045.1×1039.1×1031.1×104新海18号0.5×1042.0×1042.1×1042.4×10437×104表8-9 不同棉花品种不同时期内生细菌的数量（cfu/g鲜重）（续）-1内生细菌作为植物微生态系统的组成成分，相对于腐生（附生）细菌、PGPR等生防因子，内生菌更具竞争力，更有利于生防作用的发挥。Chen等（1995）从棉株体内分离到170个细菌菌株，其中，49株已知对棉花枯萎病菌有防治作用，经针刺接种到棉花幼茎上，10天后棉花茎部接种枯萎菌小孢子，12天后枯萎病症状开始出现，利用0～Ⅳ级发病情况计算供试的内生菌对棉花枯萎病的抑制作用。结果显示，其中，6株内生菌在试验中都减轻了棉花枯萎病的发病程度。经鉴定，这6株菌是天牛金杆菌（Aureobacterium saperdae）、短小芽胞杆菌 （Bacillus pumilus）、茜草叶杆菌（Phyllobacterium rubiacearum）、2株恶臭假单胞菌 （Pseudomonas putida）和茄伯克霍尔德氏菌（Burkholderia solanacearum）。定殖试验表明，这些内生菌可以在棉株体内存活28天。通过测定其中5株内生菌在棉株茎内的运动能力，发现有2株在14天后可以进行有限的移动，但不超过5cm。有些内生菌在施用后的短期内还能增殖。罗明等（2004）从87个棉花内生菌的分离菌株中，筛选出对棉花枯萎病菌有体外拮抗活性的菌株22个，占菌株总数的25%，其中，有些菌株表现出较强的抑菌活性，具有作为生防菌的潜能（表8-10）。李春宏等（2009）根据内生细菌的颜色、形态、大小从6个棉花品种的根、茎、叶中，分别分离537个、417个、352个菌株共1306个。平板对峙鉴定，显示根、茎、叶中显著拮抗（抑菌半径大于2mm）枯萎病菌的菌株分别为170个、32个、15个，累计拮抗枯萎病菌株数为217个。根中拮抗菌株比例为31.66%；茎中拮抗枯萎病菌株比例为7.67%；叶中拮抗菌株比例为4.26%。以上结果表明，根中拮抗内生细菌远高于茎和叶。研究筛选出的拮抗菌的生防效果如何，尚需测定其在棉花植株体内的定植力、持久性及回接后对棉花生长的影响、防病效果的田间试验等加以证实，为进一步开发应用这一生防菌资源，防治棉花病害提供科学依据。菌株抑菌圈半径（mm）菌株抑菌圈半径（mm）0074.00435.00165.70466.00174.00474.50214.50512.00233.70555.00243.50565.50252.50575.00303.50615.80314.00620375.20635.00385.00674.00424.0表8-10 内生细菌对枯萎病菌抑菌作用的测定苦豆子（Sophora alopecuroides）别名草本槐、苦豆根，为豆科多年生耐盐旱生草本植物。苦豆子含有多种单体生物碱，并具有抗癌、提高免疫力等活性。它由于能与根瘤菌共生固氮而含有丰富的蛋白质，具有较高的饲用价值。苦豆子的内生细菌由于长期存在于苦豆子内，与苦豆子建立了和谐的关系，有可能产生与苦豆子产生的相同或相似的生物碱，或者与苦豆子植物较高的抗逆能力有关，因此，系统研究苦豆子内生细菌对于合理开发苦豆子资源具有重要的意义。龚明福等（2006、2009）对新疆塔里木盆地不同地区、月份的苦豆子根、茎、叶、种子、根瘤等组织进行内生细菌分离，共得到550株内生细菌，苦豆子在不同地区、同一地区不同月份、不同组织部位内生细菌数量和种类均存在较大的差异，苦豆子内生细菌资源非常丰富。通过对550株苦豆子内生细菌进行皿内涂布、对峙培养和胞外分泌物拮抗性试验，筛选到大量的拮抗性苦豆子内生细菌资源。内生拮抗细菌胞外分泌物对棉花枯萎病菌的抑菌活性存在明显差异，其中，抑菌距离在5mm以下21株，5.1～10mm 23株，10.1～15mm 8株，15.1～20mm 4株，最大值19.3mm。这些内生细菌不是以单一的方式对棉花枯萎病菌产生拮抗作用，因为在皿内涂布、对峙培养和胞外分泌物的拮抗性试验中，同一菌株对棉花枯萎病菌拮抗能力大小表现不完全一致。在皿内涂布和对峙培养中，拮抗能力强的菌株，其胞外分泌物对棉花枯萎病菌的拮抗能力不一定很强，甚至表现为无明显拮抗作用。相反，胞外分泌物拮抗性强的菌株在皿内涂布和对峙培养中，拮抗能力并不一定表现很强。不过内生细菌的拮抗性在皿内涂布和对峙培养中表现比较一致。由此可以推测，苦豆子内生细菌对棉花枯萎病菌的拮抗作用通过两种以上的方式来实现，一种方式是通过营养竞争，内生细菌通过其快速繁殖吸收利用培养基中的营养物质，导致棉花枯萎病菌菌丝因营养缺乏而生长不良；另一种方式是内生细菌在生长过程中，产生某些对棉花枯萎病菌菌丝有毒害作用的物质，导致菌丝不能良好生长。定殖到棉花中的苦豆子内生细菌是否仍具有对棉花枯萎病菌的拮抗作用，苦豆子内生细菌能否用作生物农药在棉花生产中广泛应用，为解决这些问题，正在进行苦豆子内生细菌在棉花中的定殖试验和田间防效试验。根据菌落特征，10h菌龄的鞭毛染色结果，20h菌龄的菌体形态、大小及革兰氏染色反应，48h菌龄的芽孢染色和72h菌龄的荚膜染色结果，参照东秀珠（2001）的方法进行分类鉴定，具有较强拮抗活性的56株内生细菌分别属于气芽胞杆菌属（Aerobacillussp.）、气单胞菌属（Aeromonasssp.）和芽胞杆菌属（Bacillussp.）、黄单孢杆菌属（Xanthomonassp.）、假单胞杆菌属（Pseudomonarssp.）和土壤杆菌属（Agrobacteriumsp.）（表8-11）。序号分类特征菌株数1气芽孢杆菌属菌体杆状，1.75μm×0.554μm；革兰氏阳性；有芽孢，芽孢囊棒状；侧生鞭毛；无荚膜；菌苔白色，半透明72气单胞菌属菌体杆状，1.83μm×0.73μm；革兰氏阳性；鞭毛偏单生；无芽孢；无荚膜；菌苔浅黄色，透明8表8-11 56株苦豆子内生细菌的分类鉴定（龚福明等，2009）序号分类特征菌株数3芽孢杆菌属菌体杆状，1.51μm×0.55μm；革兰氏阳性；有芽孢，芽孢囊棒状；周生鞭毛；无荚膜；菌苔浅黄色，透明254黄单孢杆菌属菌体杆状，1.53μm×0.43μm；革兰氏阳性；鞭毛偏单生；无芽孢；无荚膜；菌苔浅黄色，透明55假单孢杆菌属菌体杆状，1.16μm×0.48μm；革兰氏阳性；鞭毛偏单生；无芽孢；无荚膜；菌苔白色，透明56土壤杆菌属菌体杆状，2.55μm×0.75μm；革兰氏阳性；周生鞭毛；无芽孢；无荚膜；菌苔白色，透明6表8-11 56株苦豆子内生细菌的分类鉴定（龚福明等，2009）（续）-1中国野生甘草分布广泛，主要分布于新疆维吾尔自治区、内蒙古自治区、甘肃、宁夏回族自治区、青海、陕西，河北、西藏自治区也有少量分布。新疆的塔里木河流域是我国甘草蕴藏量、产量最高的地区，有大面积的野生甘草群落。甘草具有很多药用价值，对植物病原真菌也具有一定的拮抗性，甘草内生细菌长期与甘草和谐共存，可能也具有对植物病原真菌的拮抗活性。龚明福等（2007）研究了甘草内生细菌对棉花枯萎病菌的拮抗性，以期筛选出对棉花枯萎病具有生物防治作用的内生细菌，用于生物农药的生产。研究表明，从新疆阿拉尔地区采集野生甘草进行内生细菌分离，共分离得到125份分离物，内生细菌在各个组织部位中的分布是不同的，从根、茎、叶、种子和根瘤中分离得到的内生细菌数分别为35、25、30、15和20。对分离得到的125份内生细菌分离物进行皿内拮抗性试验，结果表明，有31株甘草内生细菌对棉花枯萎病菌表现出明显的拮抗活性，菌落直径1.00～2.86cm，相对抑菌率51.7%～84.7%。这些菌株能否在棉花中定殖，以及在棉花中定殖以后是否仍具有拮抗活性，还有待于进一步研究。根据菌落特征，10h菌龄的鞭毛染色结果，20h菌龄的菌体形态、大小及革兰氏染色反应，48h菌龄的芽孢染色和72h菌龄的荚膜染色结果，参照东秀珠（2001）的方法进行分类鉴定，具有较强拮抗活性的31株内生细菌分别属于气芽胞杆菌属（Aerobacillussp.）、气单胞菌属（Aeromonassp.）、芽胞杆菌属（Bacillussp.）、黄单孢杆菌属（Xanthomonassp.）、假单胞杆菌属（Pseudomonassp.）和土壤杆菌属（Agrobacteriumsp.）（表8-12）。序号分类特征菌株数1气芽孢杆菌属菌体杆状，1.75μm×0.554μm；革兰氏阳性；有芽孢，芽孢囊棒状；侧生鞭毛；无荚膜；菌苔白色，半透明22气单胞菌属菌体杆状，1.83μm×0.73μm；革兰氏阳性；鞭毛偏单生；无芽孢；无荚膜；菌苔浅黄色，透明33芽孢杆菌属菌体杆状，1.51μm×0.55μm；革兰氏阳性；有芽孢，芽孢囊棒状；周生鞭毛；无荚膜；菌苔浅黄色，透明104黄单孢杆菌属菌体杆状，1.53μm×0.43μm；革兰氏阳性；鞭毛偏单生；无芽孢；无荚膜；菌苔浅黄色，透明55假单胞杆菌属菌体杆状，1.16μm×0.48μm；革兰氏阳性；鞭毛偏单生；无芽孢；无荚膜；菌苔白色，透明56土壤杆菌属菌体杆状，2.55μm×0.75μm；革兰氏阳性；周生鞭毛；无芽孢；无荚膜；菌苔白色，透明6表8-12 31株苷草内生细菌分类鉴定结果（龚明福等，2007）包括棉花在内的植物内生细菌种类丰富，开发利用内生细菌作为生物农药的潜力很大。但是关于它对整个生态及人类身体健康影响的报道较少。在防治病害方面，多数生防制剂的防效还不能令人满意，内生细菌的应用潜力还没有完全开发出来。从整体上看，利用内生细菌防治病害存在以下问题：①内生细菌的分离方法尚待改进和完善。内生细菌的分离过程中，灭菌过轻或过重都会影响植物内生细菌调查的准确性，前者会扩大植物内生细菌的生物多样性，而后者会导致内生细菌的丢失；②内生生防细菌的筛选通常是先在实验室的平板对峙培养上进行的，具有很大的局限性，除了拮抗、寄生等作用方式外，许多通过其他方式起作用的菌株不能被筛选到；③内生生防细菌在筛选过程中，往往是采用一种病原菌作为筛选目标，造成生防菌防效单一，综合防病效果差；④内生细菌依赖环境性强，室内试验结果与室外防效不一致；⑤内生细菌作为生防因子，必须考虑其致病性。针对以上问题，必须解决消毒剂的选择与使用问题；在筛选生防菌过程中，采用多种病原菌作为筛选目标，变单一菌剂的使用为多菌配合使用，提高防效和实现防病的广谱性，并降低对环境的依赖性；另外，对土壤中内生细菌的生态学进行更多的研究，使环境和操作更有利于生防细菌作用的发挥；在内生细菌的应用上，必须检测其对人畜和植物的安全性问题。内生细菌在防治棉花病害的应用上虽然面临许多问题，但作为生防菌株，依然具有广阔的前景。在植物根围区系中存在着大量的微生物，许多微生物及其代谢产物能够抑制植物病原菌的生长发育，因此，从土壤中筛选植物病原菌的拮抗菌，反施于土壤，人为增加有益微生物类群，限制有害微生物生长而进行的生物防治，既可减少化学农药可能带来的环境污染，又解决了抗病棉品种筛选周期长，抗病单一的缺点，被国内外学者广泛研究。芽胞杆菌（Bacillusspp.）是自然界广泛存在的一类细菌，可以产生杆菌肽、环脂、氨基酸类、核酸类和类噬菌体颗粒等多种抗菌物质，在植物病害生物防治中被广泛应用。王少杰（1991）报道了利用对棉花祜萎病菌有拮抗作用的两株荧光假单胞杆菌和两株产芽孢细菌在田间防治棉花枯萎病的试验。结果表明，两株荧光假单胞杆菌的防治效果较好，在苗期的防治效果为73.14%～73.63%，在开花期的防治效果为74.73%～49.73%，棉花增产率分别为15.79%和12.03%。两株产芽孢细菌在苗期和开花期的防治效果分别为62.25%～75.61%和23.98%～55.16%，棉花增产率分别为-0.18%和+4.88%。Zhang（1995）利用枯草芽胞杆菌处理棉种后发现，该菌也能在棉苗根部定殖，并随根的生长而扩展，从而导致枯萎菌在根部的定殖量减少，降低了棉花枯萎病的发生。袁红霞等（1998）报道了两株芽胞杆菌对棉花枯萎病的防治效果为分别36.4%和54.0%。Gamliel等（1993）利用恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、荧光假单胞菌（P.fluorescens）和产碱假单胞菌（P.alcaligenes）蘸根处理棉苗，并将棉苗移栽到经过日晒处理的土壤中，可以减轻棉花枯萎病的为害，同时，还能够促进棉苗的生长。研究表明，施用的拮抗假单胞菌可以有效地阻止枯萎病菌在棉花根部的定殖，从而起到防治病害的作用。芽胞杆菌是一类需氧或兼性厌氧、G+（目前也发现有G-的），在一定条件下能产生抗逆性内生孢子的化能异养菌。其抗菌谱广泛，对多种病原真菌、细菌均有较强的抑制作用。从土贝母和腊肠等中药和发酵食品中，筛选出对棉花枯萎病菌有广谱拮抗作用的芽胞杆菌29株，其中，有12株菌产抗菌蛋白。有5株抑菌活性较强：H110、H184、H216、B316和B382。经初步鉴定，H110和H184为枯草芽胞杆菌，H216、B316和B382为地衣芽胞杆菌。5株菌的蛋白粗提液对热稳定，对蛋白酶K、胰蛋白酶均不敏感，但H184、H216的蛋白粗提液对胃蛋白酶部分敏感（齐东梅等，2005）。对棉花枯萎病菌有强烈抑制作用的芽胞杆菌菌株B110分离自中药白豆蔻，根据其形态特征和生理生化特征初步鉴定为枯草芽胞杆菌，其蛋白粗提液经SephadexTMG-75后得到两个峰，其中，峰a有较强抑菌活性，命名为B110-a，峰b基本无活性；SDS-PAGE分析结果显示，B110-a主要由两种蛋白组成，含量较高的分子量为50kD，含量较低的分子量为29kD（梁启美等，2005）。利用划线法和杯碟法，曹君等（2005）研究了枯草芽胞杆菌BS菌株和哈茨木霉TH-1菌株对棉花枯萎病菌的拮抗作用。结果表明，枯草芽胞杆菌BS菌株及其代谢液对棉花枯萎病菌均有抑制作用，抑菌率均在70%以上。说明BS菌株对枯萎病菌的作用机制主要通过营养竞争方式，抑菌物质产生的作用相对较小。芽胞杆菌Bl5对棉花枯萎病菌具有较强的抑制作用，抑菌圈达30mm。其抗菌谱广，拮抗性能稳定，拮抗作用主要源于其代谢产生的拮抗物质。B15营养要求简单，繁殖迅速，在含黄豆粉培养基中，48h即全部生成芽孢，易于扩大培养。在试验所用多种培养基上，包括PDA均能产生拮抗物质，拮抗物质的产生与生长同时进行，这使得B15能在不同的营养环境中及时发挥拮抗作用。不同温度土壤中放置30天，菌株存活率最高可达55.5%，表明其抗逆性较强。综上所述，芽胞杆菌B15是一株极具开发潜力的生防菌株（朱薇玲等，2006）。但作为有实际应用意义的生防菌，还需从生产、储运、经济、田间应用等方面做进一步研究。王娜等（2007）筛选到的5株拮抗细菌均为革兰氏阳性细菌，挑选其中抗性最强的S6进行研究，经过16S rDNA鉴定，S6为枯草芽胞杆菌。S6生长迅速，2h即能达到生长对数期。同时，S6生长温度范围比较广，在15～50℃均能良好生长，棉花枯萎病发病一般需要在24～28℃，在这个温度内S6能正常生长。一般情况下，枯草芽胞杆菌在pH值7左右时生长良好，pH值低于6或者高于8时生长受到显著抑制，而S6在pH值为5时能良好生长。S6对盐的耐受能力达到10%。因此，S6能良好、迅速生长，快速地占领生存空间，抢占营养，从而有利于抑制其他病原微生物的生长。拮抗细菌对枯萎病的抗菌效率一般在20%～30%，达到50%以上的即为高效拮抗细菌。S6对棉花黄萎病的拮抗效率达到53.1%，对棉花枯萎病的拮抗效率达到55.2%，因此，S6作为生防菌应用的潜能是很高的。S6具有一定的开发利用价值，但是，其在植株上的定殖、生物防治效果、抗菌成分分析、高效基因工程菌的构建和发酵工艺等方面需要研究。缪礼鸿等（2008）从植物根际土壤中，筛选到3株对大豆根腐病、棉花枯萎病、小麦赤霉病等多种作物真菌病害有较强拮抗性的芽胞杆菌菌株Bacillus sp.920，Bacillus sp.930和Bacillus sp.932。用琼脂块法分别测定了它们对11种植物病原真菌的抗菌谱、发酵液的抑菌活性大小及其热稳定性，并对发酵液中的抑菌活性物质进行了初步提取。结果表明，920和932菌株为广谱性抗真菌菌株（表8-13）；930菌株仅表现出对稻瘟病菌具有较强的拮抗性。Bacillus sp.920发酵液中的抑菌活性物质可被酸沉淀，并具有较好的热稳定性。棉花盆栽试验结果表明，接种芽胞杆菌920菌剂可使棉花枯萎病引起的棉苗死亡率由15%降至3.7%，发芽率比对照提高了10%。病原真菌920菌株930菌株932菌株大豆根腐病菌+++—+++棉花枯萎病菌+++—+++油菜核盘病菌+++++++小麦赤霉病菌+++—+++水稻恶苗病菌+++—++小麦全蚀病菌++++—小麦根腐病菌+++++++玉米小斑病菌++++++++水稻稻瘟病菌++++++++++水稻纹枯病菌+++—++柑橘黑腐病菌++++++++表8-13 3株芽胞杆菌的抗菌谱及抑菌强度测定结果枯草芽胞杆菌对棉花枯萎病菌的拮抗作用试验结果表明，首先，枯草芽孢菌杆对棉花枯萎病菌菌丝生长有明显的抑制作用。在平板对峙培养中，培养第一天时菌落平均直径为1.1 cm，菌丝向上向外有少许蓬松生长，并且出现明显的抑菌圈，抑菌效果为23.6%。在第三天和第五天时，菌落平均直径分别为1.54 cm和1.46 cm，芽胞杆菌越过抑菌带向菌饼处扩展，菌丝有少许向外生长，气生菌丝消失，菌丝稀薄。抑菌效果分别为54.4%和73.9%。培养至第七天时，菌丝不再向外生长，菌丝非常稀薄，由干燥逐渐变为油状，颜色由白色逐渐变为无色。对照菌丝生长蓬松，菌落厚实，此时已长满皿，抑菌效果为88.8%。其次，枯草芽胞杆菌在培养前期生长速度很快，有很强的占位效应，说明与棉花枯萎病菌存在空间和营养的竞争。显微镜检结果发现，枯萎菌的菌丝相较于正常的菌丝会发生变异，菌丝颜色变褐色、膨大、断裂，消融、释放原生质等物质。说明枯草芽胞杆菌对棉花枯萎病菌的拮抗机制可能还与其分泌的抑菌物质有关，其作用方式和作用机制均有待于进一步研究（但红侠等，2010）。APS是一种由蜡状芽胞杆菌产生的新型抗真菌环状多肽。刘建国等（1999）研究表明，APS具有广谱抗菌性，其对棉花枯萎病等多种病原真菌及黑曲霉的孢子萌发具有强烈的抑制作用（表8-14），最小的MIC达2.5μg/ml，对真菌的生长亦具有强烈的抑制作用。随着APS处理浓度的增加，菌丝生长速度明显降低，甚至为零。扫描电镜观察表明，经APS处理后，菌丝发生顶端膨大、分支缩短等异常形态学变化。植物病原真菌处理浓度（μg/ml）菌落直径（mm）抑菌率（%）菌丝生长速度（mm/h）48h72h48h72h48h72h棉花枯萎病菌CK34.543.50.720.60棉花枯萎病菌2514.919.056.955.80.310.26棉花枯萎病菌756.86.880.780.30.140.09棉花枯萎病菌1505.05.085.588.40.100.07小麦赤霉病菌CK33.744.00.700.61小麦赤霉病菌2511.312.066.572.70.240.17小麦赤霉病菌756.06.082.286.40.130.08表8-14 APS对病原真菌菌丝生长的影响植物病原真菌处理浓度（μg/ml）菌落直径（mm）抑菌率（%）菌丝生长速度（mm/h）48h72h48h72h48h72h小麦赤霉病菌1505.55.583.687.50.110.07水稻稻瘟病菌CK32.064.00.670.89水稻稻瘟病菌2510.512.068.781.40.220.14水稻稻瘟病菌756.06.081.290.60.130.08水稻稻瘟病菌1506.06.081.290.60.130.08表8-14 APS对病原真菌菌丝生长的影响（续）-1关于枯草芽胞杆菌对植物病原菌的作用方式，有人认为，是病菌孢子萌发受到抑制，也有报道是菌丝顶端的畸形。孔建等（1998）将枯草芽胞杆菌B-903菌株液体培养72h后，将培养滤液高温灭菌，以不同比例将培养滤液加入镰刀菌孢子悬浮液中，置于扫描电镜和光学显微镜下定时观察。结果表明，镰刀菌孢子悬浮液培养12h后，无菌水处理的病菌孢子均已萌发形成细长菌丝，培养至18h菌丝生长正常，长而均匀，有分枝，培养至48h菌丝未见异常。但经B-903滤液处理的镰刀菌，培养12h后在光学显微镜下观察，孢子尚有部分未萌动，孢子短粗变形，已萌动的芽管出现扭曲状，但多数孢子随后仍能发育成菌丝。上述异常现象随B-903滤液处理浓度增高而加剧。将镰刀菌孢子悬浮液培养15h在扫描电镜下观察，经B-903滤液处理的菌丝端部和中部的细胞开始明显膨胀呈球状，球状细胞的细胞壁皱缩干瘪，分析应是内含物外泄后所致。小孢子端部亦膨大形成远大于自身的球状结构，并看到内含物外泄的现象。经B-903滤液处理18h在光学显微镜下看到，所有的菌丝细胞均出现畸形。细胞呈圆形或椭圆形，以致整个菌丝由丝状变为捻珠状，此时透过细胞壁，其细胞内含物清晰可见。然而至28h，球状细胞进一步膨大，胞内物质减少，细胞透明度增加，并且菌丝开始有断裂现象。36h后观察，串珠状菌丝已纷纷断裂成片段，5～7个球体细胞连成一串，细胞内含物消失，变成空胞，镜下看去类似一串串的肥皂泡。至48h，细胞之间相互离解，菌丝体完全崩溃，最终这些单个的圆形空胞也逐渐瓦解消融。试验中观察到，不同浓度的B-903滤液处理，病菌孢子和菌丝的畸变过程是类似的，而高浓度的处理会使整个过程缩短，症状亦更明显。由此认为，枯草芽胞杆菌对植物病原菌的抑制怍用主要依赖于其生活过程中产生于体外的某种抗高温的代谢产物，即抗菌物质，它可使病菌孢子和菌丝畸形，细胞崩解，内含物外泄，从而使病菌丧失对植物的侵染能力，在许多枯草芽胞杆菌防治病害的试验中，多数方法是将大量培养的活菌接种于表面或植物根际土壤中，其防治效果可能亦得益于该菌在土壤中产生的抗菌物质，而非微生物之间对生态位的占领竞争。事实上，在大量培养枯草芽胞杆菌时，当单位容积中的菌体细胞达到一定数量或培养时间超过21h，大部分该菌细胞即开始自融，起防病作用的还是培养液中的代谢物，因此，从抗菌素的角度来研究枯草芽胞杆菌的开发利用，可能更有价值。利用木霉菌属、芽孢菌属和假单胞杆菌作为生防制剂防治棉花病害已经取得进展。张克诚等（2002）利用一株从小麦根际筛选的链霉菌属（Streptomycesspp.）拮抗菌株S-5拌土或拌种，不仅防治棉花苗期病害效果明显，对棉花生长中后期的枯、黄萎病也取得了较好的防病效果。用链霉菌菌剂拌种，对棉花苗期病害的防病效果为65.5%，比多菌灵的防效高出25.5个百分点。田间防治枯、黄萎病效果，不同施用量，链霉菌S-5对枯、黄萎病的防病效果差别明显。使用2.5kg/667m2拌种，对枯萎病防病效果为81.8%；对黄萎病防病效果为100%。这为进一步开展以链霉菌作为生防制剂的棉花病害生物防治研究奠定了基础。利用拮抗微生物防冶土传病害，是建立在作为生防制剂的微生物能否在植物根际定殖的基础上的。然而，拮抗微生物在根际定殖受到许多环境因素如土壤pH值、矿质营养、含水量、土著微生物的种类，以及植物种类、植物不同生育期等的影响。因此，有必要进一步了解在根际微生态中拮抗微生物与土著微生物包括病原微生物的相互作用及其对植物的影响。具体来讲，需有明确链霉菌S-5抑制土传病害，促进植物生长的作用机制，在弄清生防菌作用机理的基础上，改进应用技术，提高生物防治效果。防治效果的稳定性是土传病害生物防治中最关键的问题，也是决定一种生防微生物能否在生产上推广应用的前提。为提高链霉菌S-5菌株生防效果的稳定性，可以采用与S-5菌株相容的其他根际微生物如木霉属、杆菌属的菌株混合使用的方法来改进，因此，还需要进一步研究链霉菌S-5与植物改进其他微生物间的互作关系。植物病害抑菌土（Pathogen suppressive soil）是指在土壤中有某种病原菌存在下，种植感病植物，由该病原菌引起的病害的发生、发展受到抑制的土壤。抑菌土的形成须具备两个条件：一是土壤中存在足够以致病的病原菌的量；二是同时种植感病品种，而植株不发病，或发病很少。从抑菌土的发现到21世纪初，对抑菌土的研究已有100多年的历史。马存等（2007）将抑菌土的研究历程划分为4个阶段。第一阶段：从19世纪末至20世纪20年代，主要是对不同类型土壤病害发生情况的研究报道，是抑菌土研究的初创时期。研究结果只是相继证实了这种现象，均未涉及土壤中是否含有致病菌，以及病原菌含量上的差别。第二阶段：从20年代末到50年代末，Menzies（1959）提出抑菌土概念为止。抑菌土的概念已初步显现。第三阶段：从60年代起至70年代末，由于抑菌土概念的提出以及对环境保护的重视，使植物病理学家对非化学方法保护农作物抵御各种病害的侵袭日益重视，使抑菌土的抑菌机理研究逐步深入，以期从中发现病害防治的新途径。第四阶段：从70年代开始至今，抑菌土的本质得到初步揭示，对其机制的研究逐渐从单一集中于生物因子的主导作用，发展为生物因子和非生物因子共同作用的结果。对抑菌土的研究已成为植物病害生物防治的一项重要内容。棉花枯萎病重病田或枯萎病圃，连续种植抗病品种多年后，再种植感病品种则发病显著降低，称做病圃衰退。徐富有（1985）认为，抗枯萎病品种连作3年后土壤内枯萎菌致病力显著减弱。张卓敏等（1980）和吴传德（1985）认为，土壤内枯萎菌量随抗病品种连作年限增加而减少，致病力也有随连作年限增加而降低的趋势。中国农业科学院植物保护研究所河南新乡县王屯基点，1972年在发病率接近100%，死苗率80%的枯萎病绝产田块建立枯萎病圃，1973年开始种植抗病品种，到1976年再种植感病品种岱字棉15、发病率降低到35.4%，病指22.3，该病圃在1982年、1983年、1985年曾3次用带病棉柴及人工培养的枯萎菌接种，但感病品种的发病率无显著提高。Baker等（1974）和Cook（1981）认为，具有抑制病害发展的土壤称为抑菌土（Suppressive soil），无抑菌作用的土壤称为导菌土（Conductive soil）。马存等（1992）于1987～1988年两年进行盆栽试验结果表明，86-1根围土（抗病品种86-1连作10年以上田块的棉株5cm内土壤）枯萎病平均发病率37.3%，病指19.5，与对照（无植棉史的果园土或种植1～2年感病棉花品种的土壤）相比，抑菌效果达60.5%。86-1田间土（抗病品种86-1连作10年以上田块土壤）枯萎病平均发病率48.3%，病指29.4，抑菌效果39.9%。枯萎病圃土（作为棉花育种抗病性鉴定病圃连作棉花10年以上病圃土壤）平均发病率55.3%，病指27.2，抑菌效果43.9%。感病品种棉田土发病率72.8%，病指66.9，无抑菌效果。对照果园土平均发病率70.1%，病指48.7（表8-15）。以上结果表明，86-1根围土、86-1田间土、枯萎病圃土对枯萎病菌均有显著的抑菌效果，86-1根围土抑菌效果最强，比病圃土效果高27.4%。感病品种棉田土和果园土对枯萎病菌无抑菌效果。土样发病率（%）病指抑菌效果（%）861根围土37.319.560.5861田间土48.329.439.9枯萎病圃55.327.243.9感病品种田72.866.9—果园土（CK）70.148.7—861根围灭菌72.455.6—861根围+果园（1∶1）55.237.324.1表8-15 不同土样对枯萎病菌抑菌效果比较（盆栽）李长兴等（1996）报道的盆栽试验结果指出，种植抗病品种10年以上的重枯萎病圃再种感病品种（辽棉6号），发病率为80.2%，病指为47.8；多年没有种植过棉花的小麦田土发病率为92.2%，病指为65.0。种植抗病品种10年以上的重枯萎病圃显著比多年没种植过棉花的小麦田土（对照）发病率、病指低，分别低12.02%和17.21%（表8-16）。处理项目枯萎病发病率（%）病指抑菌效果（%）抑菌土（10年）80.247.826.5抑菌土（5年）93.258.69.9抑菌土（高压灭菌）86.158.210.4小麦田土（CK）92.165.0—表8-16 盆栽试验的抑菌效果河南新乡田间小区试验结果，86-1连作10年田枯萎病平均发病率9.8%，病指4.4，与对照果园田比较，抑菌效果达85.8%。连作10年以上枯萎病圃，平均发病率17.1%，病指6.8，抑菌效果75.2%。对照果园田平均发病率57.l%，病指28.8（表8-17）。在辽宁辽阳试验结果，连作10年枯萎病圃枯萎病发病率39.0%，病指19.3，对照菜园土发病率75.9%，病指44.1，抑菌效果平均56.2%（表8-18）；连作5年的枯萎病发病率66.7%，病指37.8，抑菌效果17.6%。发病率和病指比连作10年病圃分别高27.7%和18.5%，而抑菌效果低36.6%。还可看到未接菌小区连作10年和5年病圃田，枯萎病指分别为8.1和14.1，这说明病圃连作年限愈长，病圃衰退愈明显，而对枯萎病菌抑菌效果也就愈显著。河南新乡、辽宁辽阳两地田间小区试验结果基本一致均证明，连续种植抗病品种多年后的棉田，或连作多年的枯萎病圃，对枯萎病菌均有抑制作用，存在抑菌土。田块处理枯萎病发病率（%）病指抑菌效果（%）861连作田接菌9.84.485.8未接1.00.3—枯萎病圃田接菌17.16.8—未接1.90.676.2果园田（CK）接菌57.128.8—未接0.00.0—表8-17 田间小区对枯萎病菌抑菌效果比较（河南新乡）（马存等，1992）田块接菌情况发病率（%）病指抑菌效果（%）连作10年病圃田接菌39.019.356.2不接菌15.58.1—果园田（CK）接菌76.944.1—不接菌0.00.0—连作5年病圃田接菌66.737.817.6不接菌28.514.1—果园田（CK）接菌71.045.9—不接菌0.00.0—表8-18 不同田间小区对枯萎病菌抑菌效果比较（辽宁辽阳）（马存等，1992）杨之为等（1995）按不同年限的土样分别接入1%土样的棉枯萎病菌麦粒沙培养物，当种植感病品种冀棉11时，从苗期病情看，连作3年、6年、8年、9年、11年和15年土样的发病率依次为66.67%、55.6%、42.8%、33.3%、11.7%和3.3%，松林土（CK）发病率为85.7%（表8-19）。抗病品种岱字棉16连作6年的土样发病率为CK的64.8%，连作11年、15年的土样发病率仅为CK的13.6%和3.8%。将高压灭菌土样再接入等量病菌培养物，测定其土样致病力，可以看出（表8-19），当抗病品种连作少于8年时，土壤中抑病因子大多被降解，棉苗发病率81%～92%；但连作9年以上则发病率在33.3%～63.3%，低于重病田，说明经高压灭菌的土样中仍可能存在少量抑病因素。土样来源原土样灭菌土样发病率（%）病指发病率（%）病指松林土85.771.466.354.5重病田土40.020.085.771.4连作3年66.733.381.863.6连作6年55.630.6——连作8年42.817.691.668.7连作9年33.330.533.316.7连作11年11.75.963.650.0连作15年3.30.0156.640.0表8-19 不同土样接菌后的抑病效果（接菌量1%）形成抑菌土的因子主要有生物因子和非生物因子，不同抑菌土起作用的因子各有不同。在生物因子中，主要是土壤中的微生物。非生物因子是指土壤的矿物质含量、土壤的酸碱性、土壤质地、土壤颗粒结构等物理和化学性质。国际上有研究认为，土壤微生物种群结构的改变，尤其是一些拮抗微生物的增加，是形成棉花枯萎病田抑菌土的主要生物因子。杨之为等（1995）和王汝贤等（1998）从棉花根系分泌物对棉花枯萎病的影响和连作抗枯萎病品种棉田微生物数量变化做了系统研究后认为，棉花抗病品种连作田土壤中，棉枯萎菌数量的减少，是土壤致病力下降的主要原因，而造成棉枯萎菌数量减少的主要原因，则是土壤中的有益放线菌、细菌增长导致棉花抗病品种根系分泌物中的抑菌物质对病菌抑制的结果。土壤有益微生物增长的原因：一是棉花抗病品种根系分泌物为这些有益菌提供了良好的生活条件；二是可能因棉花枯萎菌数量的减少，有益菌减少了竞争对手，使其有了扩大繁殖的机会，这一切变化又均与棉花抗病品种连作分不开。抗病品种连作3年，土壤带菌量约为重病田土样菌量的43%，连作6年为重病田土样菌量的57%；连作8年的土样带菌量降低幅度较大，为重病田的23%；连作10年以上的土壤中，棉枯萎病菌很少（表8-20）。在不同连作年限的抑菌土中种植感病品种冀棉11，重病田的棉苗发病率为31.25%；抗病品种连作3年的棉苗发病率为12.5%；连作6年的发病率为9.09%；连作9年以上的除连作11年发病率4.55%外，其他基本不发病。这表明，随着抗病品种连作年数的增长，土壤中，棉枯萎病菌的数量和致病性逐年降低，说明棉枯萎病抑菌土的形成是抑病因子逐渐积累的过程。土样来源土样带菌量（个/克土）发病率（%）病指松林土（CK）000重病田土217631.7514.06连作3年114712.509.38连作6年12369.094.56连作8年5008.304.00连作9年5800连作10年1000连作11年1484.564.56连作15年000表8-20 不同棉田土样致病力比较（杨之为等，1995）马存等（1992）在盆栽土样内枯萎菌菌量测定结果表明，86-1根围土，每皿平均有菌落22.5个（每克土样内有菌落4500个），比对照果园土减少56.7%。86-1田间土每皿有菌落21.4个（每克土有4250个），比果园土减少59.2%。枯萎病圃土每皿有菌落32.2个（每克土有6440个），比果园土减少52.9%。对照果园土每皿有菌落52个（每克土有10400个）。田间小区内枯萎菌菌落，86-1田间土、枯萎病圃土每皿有菌落分别为138个（每克土有2760个）和1486个（每克土有2920个），分别比菜园土减少51.4%和48.6%。菜园土每皿有菌落284个（每克土有5580个）。从上述结果清楚的看到，在相同接菌量情况下，种植一季感病棉花品种后，3个抑菌土土样内，枯萎病菌菌量比对照菜园土减少48.6%～59.2%，说明抑菌土对接入土壤内的枯萎病菌有极显著的抑制作用，因而枯萎病发病率显著降低，达到控制枯萎病为害的效果。王汝贤等（1998）从棉花抗病品种连作3年、6年、8年、9年、10年的土样中分离出3830个真菌菌落，其主要类群归入11个真菌属。随着棉花抗病品种连作年限的增长，土壤中，真菌和放线菌的种类和数量逐渐增加（表8-21、表8-22）。对棉枯萎病菌抑制性较强的种类有：细黄链霉菌（Streptomyces microflavus）、球孢链霉菌黄色变种（S.globisp var.llavus）和紫链霉菌淡红变种（S.wolaceus）。供试土样中，分离到的3315个细菌菌落按菌落特征可分为9个类型，其中，Ⅲ型和Ⅳ型对棉枯萎菌有较强的抑菌作用，初步鉴定为枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis和B.sp.，它们在连作年限较长的土样中出现的频率较高，但土样中细菌的总数量与棉花抗病品种连作的年份成反相关（表8-23）。供试土样中分离出3种主要线虫，其中，螺旋线虫、滑刃线虫和真滑刃线虫的数量也随抗病棉花连作时间的延长而增加（表8-24）。菌类连作年限10年9年8年6年3年菌落数百分率（%）菌落数百分率（%）菌落数百分率（%）菌落数百分率（%）菌落数百分率（%）脊霉菌属9.448.48.455.36.550.010.163.99.659.3曲霉菌属6.131.43.523.03.829.23.220.34.729.0链格孢属0.84.10.74.60.64.60.31.90.53.1毛壳属0.21.00.95.90.32.31.59.50.21.2园酵母属0.31.50.10.70.32.30000黑粘座孢霉属0.10.5000.21.50.10.60.10.5瓶粳脊霉属00000.10.80.21.300毛霉属000.10.70.21.50.10.600木霉属00000.10.8000.21.2粘帚霉属000.10.70.21.50000镰孢属0.52.60.32.00.21.50.10.60.31.9其他2.010.51.27.20.54.00.31.70.83.8平均每皿菌落总数19.415.313.015.916.2种类数1812141110表8-21 棉花不同连作年限土样中真菌类群比较（平均每皿菌落数）菌类连作年限10年9年8年6年3年菌落数菌落数菌落数菌落数菌落数纤维螺旋链霉菌5456341325产二素链霉菌482323813天冬素紫色链霉菌3725281110球孢链霉菌黄色变种2118141110土味链霉菌48173紫色链霉菌01000球孢链霉菌01000表8-22 不同连作年限土样中放线菌数量的变化（个）菌类连作年限10年9年8年6年3年菌落数菌落数菌落数菌落数菌落数细黄链霉菌00300绿色产孢链霉菌00200其他6127116合计1701391126167群落数11101197菌落数（皿）28.323.218.710.211.2抑制性菌落数3.53.33.21.81.7表8-22 不同连作年限土样中放线菌数量的变化（个）（续）-1菌类连作年限10年9年8年6年3年菌落数菌落数菌落数菌落数菌落数Ⅰ2254596151Ⅱ2925465781Ⅲ25012109Ⅳ00013Ⅴ004130Ⅵ16213Ⅶ011000Ⅷ024000Ⅸ002800菌落数45665菌落数（皿）77120151142153抑制性菌落数25401089表8-23 不同连作年限土样中细菌的类群及数量（个）土样螺旋线虫滑刃线虫真滑刃线虫垫刃线虫短体线虫其他合计连作9年16271230058连作6年2014851250连作4年1410028连作2年0110002表8-24 不同连作年限土样中线虫数量的变化（个）李长兴等（1996）连续3年对4类型土壤采土，在不同棉花生育期采土分离结果，10年以上的枯萎病圃中，细菌、青霉、曲霉、放线菌的数量显著比未植棉土壤和小麦田土壤多，有芽孢细菌比未植棉土多1.13倍，无芽孢多1.69倍；真菌中，青霉多0.76倍、曲霉多1.11倍；放线菌多0.86倍（表8-25）。并且在放线菌对棉花枯萎病菌拮抗作用测定中，筛选出2株具有拮抗作用的菌株。这表明生物抑菌因子的存在，种植抗病品种多年的重枯萎病田根围土或根际土中，有可能筛选到拮抗作用强的抗生菌。土样类型真菌（×103个/克土）细菌（×104个/克土）青霉曲霉木霉有芽孢无芽孢放线菌（×104个/克土）抑菌土（10年）105.869.70.768.3285.8255.8抑菌土（5年）100.360.5047.7204.9221.1小麦田土63.321.2046.3149.6109.9未植过棉土67.830.8041.298.2141.3表8-25 不同类型土样菌量对病菌小孢子萌发、厚垣孢子产生数量的测定结果表明（表8-26），不同连作年限土样浸出液对病菌小孢子萌发的影响没有显著差异；对厚垣孢子的形成却有一定影响：连作6年以下每视野（16×10）平均17～18.8个厚垣孢子，9年有13.3个厚垣孢子，连作15年仅有4.9个厚垣孢子，说明随抗病品种种植年限的增长，厚垣孢子的形成数量逐渐减少，由此推测土壤中，有抑制厚垣孢子形成的物质，该物质随年限的增长而逐渐增多。土样来源病菌小孢子萌发率（%）病菌厚垣孢子的形成数量（个/视野）ⅠⅡⅢⅣ显著水平*松林土（CK）81.120.224.311.818.8a重病田土70.720.514.217.817.5a连作6年70.720.718.517.318.8a连作9年63.915.017.87.213.3ab连作11年—11.27.012.810.3ab连作15年84.63.37.83.74.9b表8-26 不同土样浸出液对棉枯萎菌的影响（杨之为等，1995）总之，对棉花枯萎病抑菌土的研究，为枯萎病等多种病害开辟了生物防治途径，利用抑菌土或筛选抑菌生物因子防治植物病害，随着研究的不断深入和技术方法的逐步完善，将可能取得较大的经济效益和社会效益。尽管棉花枯萎病的生物防治研究工作已历时数十年，但至今未形成商品化制剂。究其原因，马存等（2007）认为，是由于对许多问题还缺乏研究，许多困难有待解决。与整个生物防治普遍存在的问题一样，在这些问题与困难解决之前，生物防治尚难以作为常规手段用于棉花枯萎病的治理。这些问题主要包括：一是生态学障碍。从实验室向大田阶段的过渡往往遭到失败，其中，生态障碍是主要原因；二是防治对象单一。生物防治研究仅仅针对其中一种或几种病害，往往不被工业化生产所接受；三是缺乏适合工业化生产的扩繁技术。在实验室内可以不计成本培养所需生防制剂，但在商业化生产上则要考虑经济效益，与规模化生产有关的大量培养技术则有待提高；四是缺乏准确可靠的筛选技术与筛选标准。目前，生防菌的筛选技术和标准仍然是沿用传统的平板对峙法和在平板上对病原菌的拮抗能力，其预见性较差，如果结合生防菌的其他特性，如定殖能力的测定，则有望筛选到更有潜力的菌株；五是缺乏规范化的菌剂制备技术。有关生防菌剂制剂化和规范化的配套研究相对缺乏，无法将有效的生防菌开发成规范的产品；六是缺乏配套的生防菌田间施用技术。植病生防的研究目的是防治田间植物病害，其田间施用技术选择的适当与否，决定着该菌剂的有效性。针对上述棉花枯萎菌生防菌所存在的问题，结合工业化生产需要，认为生防菌株应具有如下特点：①生长速度快，产孢量大。②作用谱广泛。③作用机制多样性。④可在棉花根际大量定殖。⑤能作用于棉花内部的枯萎病菌。⑥不受土壤抑菌作用的干扰。⑦休眠孢子有较强的耐干燥能力。⑧对棉花生长有促进作用。⑨要有合适的生防菌剂剂型及相应的施用方法。虽然目前没有登记注册的防治棉花枯萎菌的生防菌，但已有防治其他作物枯萎病的生防制剂商品。例如，意大利S.I.A.P.A公司登记的利用非致病性尖孢镰刀菌作为生防菌的产品Biofox C，可防治由尖孢镰刀菌引起康乃馨和番茄等病害；由法国Matural Plant Protection公司注册的同类产品Fusaclean，可防治由尖孢镰刀菌所引起的芦笋、康乃馨和番茄等作物病害。说明应用生防手段防治棉花枯萎病前景乐观。随着棉花枯萎病生防菌在菌株人工改良技术、生防菌剂生产条件以及生防菌剂型的多方面研究，生物防治棉花枯萎病有可能在近期取得一些突破。

导致棉花枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌萎蔫专化型 [Fusarium oxysporumSchlectend：Fr.f.sp.vasinfectum（Atk.）W.C.Snyder&.H.N.Hans.]。在相当长的一段时期内，镰刀菌的分类是很混乱的，各研究者曾把该属划分为1000种以上的种、变种和型（俞大绂，1977；张素轩，1991；Bilai等，1955；Tousson等，1975）。1935年Wollenweber等把镰刀菌归纳为16组、143种、变种和型，奠定了镰刀菌分类的基础。在其以后，Suyder等（1968）、Joffe（1974）、Gordon（1952）、Bilai（1955）等对镰刀菌分类都进行了大量的研究，并提出各自的分类概念和系统（Amstrong等，1977；Nelson等，1983）。但所有这些都是以Wollenweber Reinking的专著《镰刀菌属》（Die Fusarien，1935）为基础的。Booth（1971）根据Gordon的分类体系，以大形分生孢子形态作为鉴别镰刀菌种的主要特征，重视标准培养条件、分生孢子梗形状和分生孢子的产生方式，把分生孢子形态、大小、菌落颜色、产孢细胞和厚垣孢子有无及着生位置、生长速度以及基质特性等作为区分组、种、变种的重要依据。中国一些研究者在分离棉花枯萎镰刀菌研究中，注意到有不同类型大分生孢子，除典型的Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum（尖孢镰刀菌萎蔫专化型）外，还分离到在孢子形态、菌落色泽、培养性状和致病性方面不同于前者的菌株，对此提出质疑，认为我国棉花枯萎镰刀菌可能还有F.redolens Wr.（芬芳镰刀菌）或者F.oxysporum var.redolens（Wr.）Gordon（尖孢镰刀菌芬芳变种）。澄清我国棉花枯萎镰刀菌的种、型，查明其在分类上的归属是一项十分必要的基础工作，对指导棉花抗病育种与品种合理布局具有重要意义。为此，陈其英和孙文姬（1992）从全国15个植棉省、自治区采集棉花枯萎病株，经分离纯化，获得273个单孢菌株，并对其中13个单孢菌株进行系统研究，断定我国棉花枯萎镰刀菌是尖孢镰刀萎蔫专化型。隶属的分类体系是：半知菌亚门（Deuteromycotina）、丝孢目（Moniliales）、瘤座孢科（Tuberculariaceae），镰孢属（Fusarium Lind），美丽组（Eleganswu.），尖孢种（Oxyporumschl.）。棉花枯萎病菌为尖孢镰刀菌萎蔫专化型，其培养性状，在PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）培养基上，菌丝为白色，若培养时间稍长培养基经常出现紫色，菌丝体透明，有分离。具有3种类型孢子，分别为大型分生孢子、小孢子和厚垣孢子（图2-1）。镜检时，重点检查有无镰刀状大型分生孢子和厚膜孢子。大型分生孢子呈镰刀形，略弯曲，两头稍尖，足孢明显，无色，大多具3个分隔，少数为2个，偶见有4～5个分隔，大小为（22～23）μm×（3～5）μm（以3个隔膜的大型分生孢子长度和宽度作标准）。小分生孢子呈卵圆形或纺锤形，无色透明，大多数为单胞，少数有一个分隔，大小为（5～6）μm×（2～3.5）μm。厚膜孢子近圆形，顶生或间生1～3个，但也有数个相连的，卵黄色，直径5～15μm，厚膜孢子是抵抗不良环境的繁殖体。图2-1 棉花枯萎病菌自Alkinson 1892年首先提出引起棉花枯萎病菌是侵染导管萎蔫镰刀菌（Fusarium vasinfectumAtk）后，认为棉花枯萎病菌的寄生性很强，寄主范围很窄。但Butler（1926）、Kulharm（1934）、Armstrong（1940）、Armstrong和Bennoett（1942）、Ebbeds等（1975），前后报道枯萎病菌的寄主多达40余种，计有大豆、烟草、花椰菜、卷心菜、辣椒、牛角椒、木豆、决明、咖啡、印度麻、黄瓜、龙爪稷、三叶胶、秋葵、番茄、苜蓿、类香蒲、狼尾草、绿豆、豌豆、豇豆、蓖麻、茄子、高粱、肿柄菊、大麦、铁荸荠、小花锦葵、大花苘麻、几内亚茴麻、毛里塔尼亚苘麻、束黄麻、酸木槿、柠檬黄木槿、洋麻、裂叶木槿、类酸浆木槿、葡萄叶木槿、尖刺黄花稔和印度蛇婆子等。许如琛等（1964）用人工接菌盆栽试验，甘薯、玉米、薄荷、黄麻、烟草、荞麦、小麦、大麦、黑麦、燕麦、大豆、豌豆、蚕豆、四季豆、胡萝卜、黄瓜、萝卜、莴苣、油菜、菠菜、青菜和婆婆纳等共47种植物因均不发病，故没有作为枯萎病菌的寄主植物。顾本康等（1979）将生长在枯萎病菌人工接菌土内的供测作物植株、采用组织捣碎稀释分离的方法，能够分离出枯萎病病原菌，将它回接到棉花上能够表现枯萎症状，再从菌落形态及孢子大小，都证明是棉花枯萎病病原菌，因此认为，玉米、牛角椒、大麦、元麦、小麦、番茄、乌豇豆、茄子、大豆、柽麻、芝麻、花生、山芋、赤豆和扁豆等作物虽然没有明显症状，而确是棉花枯萎病菌的带菌植物。棉花枯萎病菌在很多植物上只能停留于植物的根表皮，但不能深入导管系统，所以，往往出现隐症状态。因此认为，除已被证明的许多作物或杂草是棉花枯萎病菌的寄主植物外，实际上还有更多植物是棉花枯萎病菌的不表现症状的带菌体；这就是在枯萎病区推行与旱作物轮作对防治枯萎病无效的道理。李君彦等（1990）对小麦、大麦、玉米、高粱、甘薯、大豆、豌豆、红麻、向日葵、烟草、番茄、茄子、辣椒、黄瓜和笋瓜15种植物作棉花枯萎病致病或带菌的研究，其结果表明，15种作物都可带菌，只是带菌的部位有差异，将病菌在棉花上回接，只有小麦、玉米、高粱和向日葵回接不成功。植物病原菌在不同环境、营养条件和寄主植物影响等外界因素作用下，再加上自身的遗传变异，致病力不断地变化。但在长期演变过程中逐渐形成了一些比较稳定的类型，这就是在种和变种以下所区分的转化型、生理型或小种。专化型是一个群体，据不同鉴别寄主的致病反应，可以进一步化分为若干生理小种。鉴定棉花枯萎病生理小种，以及生理小种在不同地区的分布，对培育棉花抗病品种，以及优良品种在不同种植区的分布有指导意义。棉花枯萎病菌具有较强的专化性，不同地区的枯萎病菌尽管形态相似，但致病力不一定相同。Elbeles（1975）根据枯萎病菌对陆地棉、海岛棉、亚洲棉及某些作物的侵染能力的差异，划分为5个生理小种：小种1号和2号，来源于美国，严重感染陆地棉，轻度感染海岛棉，不感染亚洲棉，但小种2号尚能感染烟草及Yel-redo大豆；小种3号为来自埃及的枯萎病菌，感染海岛棉和亚洲棉，不感染陆地棉；小种4号为印度的枯萎病菌，只感染亚洲棉，不感染海岛棉和陆地棉；小种5号为苏丹的枯萎病菌，感染亚洲棉，不感染海岛棉及陆地棉。Armstrong等（1978）描述并提出了巴西的棉花枯萎病菌小种6号。至此，全世界报道的棉花枯萎病生理小种共6个。1972～1973年全国棉花枯萎病、黄萎病综合防治研究协作组收集了我国主要枯萎病区（冀、豫、晋、陕、鲁、皖、苏、浙、鄂、川等省的县）有代表性的菌株76个，在海岛棉、陆地棉和中棉3个棉种的9个鉴别寄主棉花品种上测定其致病力。结果菌株被划分为3个致病型（表2-1）：Ⅰ型侵染海岛棉、陆地棉和中棉，包括南方棉区的22个菌株，北方棉区的26个菌株；Ⅱ型侵染海岛棉和陆地棉，但不侵染中棉，包括南方棉区的17个菌株和北方棉区的16个菌株，为害陆地棉严重；Ⅲ型只侵染海岛棉，不侵染陆地棉和中棉。鉴别品种致病型Ⅰ致病型Ⅱ致病型Ⅲ海岛棉SSS陆地棉SSR中棉SRR表2-1 全国各地棉花枯萎病菌在鉴别寄主上的接菌反应陈其煐等（1985）于1982年用国际通用的一套鉴别寄主对中国各地采集的144菌系筛选出有代表性的17个菌系进行全面的研究，发现我国的棉花枯萎病菌致病力与当时国际上已报道的6个小种有区别。为此，将我国的棉花枯萎病菌分为3个小种，即3号、7号和8号，其中7号、8号小种是首次报道，并认定棉花枯萎病Ⅲ型即为国际3号小种，而Ⅰ型、Ⅱ型被定为新小种，即7号和8号。7号小种是我国的优势小种，广泛分布于国内的各主产棉区，对鉴别寄主中的海岛棉、陆地棉和亚洲棉均表现出高度侵染，不感染或轻度感染5个非棉属寄主；而8号小种则不感染或轻度感染3个棉种的7个品种，轻度感染非棉属的秋葵、金元烟和大豆，严重感染紫苜蓿和白肋烟，仅在我国湖北省的新洲县和麻城县及江苏省的南京发现；3号小种严重感染海岛棉的Coastland、Sakel和亚洲棉的Ronzi，不感染海岛棉的Ashmouni和陆地棉，不感染非棉属寄主的秋葵、金元烟、白肋烟和大豆，极轻度感染紫苜蓿（表2-2）。鉴别寄主小种及分布3新疆麦盖提和吐鲁番7全国各地8湖北麻城及江苏南京海岛棉AshmouniRSW-RCoastlandSSWSakelSSW表2-2 我国不同小种对鉴别寄主植物的侵染力（陈其煐等，1985）鉴别寄主小种及分布3新疆麦盖提和吐鲁番7全国各地8湖北麻城及江苏南京陆地棉AcalaRSWRowdenRSWStonevileRSW亚洲棉RoziSSW秋葵ClemsonspinelaesRW-RW紫苜蓿GrimmRW-RS烟草Burley5RW-RSGolddolarRRW大豆YelredoRW-RW-R表2-2 我国不同小种对鉴别寄主植物的侵染力（陈其煐等，1985）（续）-1致病性是病原、寄主和环境条件相互作用的结果。棉枯萎菌致病性变异的原因比较复杂，可能有：镰刀菌发生突变、异核现象和准性生殖而发生变异；棉花种和品种的更换，造成寄主基因型对病原菌群体遗传结构的影响而发生变异；随土壤中微生物群落变化而发生变异及棉枯萎菌靠寄主种子远距离传播，导致外来致病菌的传入或为新小种提供亲本等。为此，孙文姬等（1999）采用国际通用的鉴别寄主（简称通用寄主）包括棉属寄主海岛棉的SaKel、Coastland、Ashmouni；陆地棉的Rowden等4个；非棉属寄主紫苜蓿（Grimm）、白肋烟（Berley5）、金元烟（Gold dollar）3个，以及鉴于国际通用的鉴别寄主中的所有棉属寄主均被7号小种菌系高度感染，不能明显区分广泛分布于我国各棉区7号小种不同菌系间的致病力强弱，于是在1996～1997年试验中，增加了抗病性不同的辅助棉属鉴别寄主（简称辅助寄主），包括海岛棉的8763依（感病）、K102（抗性敏感）；陆地棉的鄂荆1号（感病）、86-1号（抗病）等4个品种，对1986～1997年在我国河北、河南、山东、山西、安徽、湖北、江苏、陕西、辽宁和新疆10个主要产棉省（自治区）采集的84个棉枯萎镰刀菌代表菌系进行了生理小种变异监测研究。结果表明：与陈其煐等（1985）报道的基本相同，仍为第3号、7号、8号3个小种，其中，7号小种占83.3%，是我国毒力强的优势小种，广泛分布于我国各大棉区；3号和8号小种分别局限于新疆吐鲁番地区和湖北新洲地区。同时，发现局部地区有些菌系出现了变异，特别是1991～1994年采集的3号小种5个菌系出现了对鉴别寄主Sakel的致病力明显减弱的变异型。分布于黄河、长江流域及新疆广大棉区，对非棉属寄主表现为“R”（发病株率为0）或“W”型（发病株率为50%以下），在棉属寄主上以“S”型（病指为20.1以上）为主。1996～1997年28个代表菌系在8个棉属寄主上测定结果，除2个菌系对Sakel致病力为“W”型（病指为20.0以下）外，其余26个菌系对Ashmoumi、SaKel、Coastland、Rowden、8763依、鄂荆1号等6个棉属寄主致病力均为“S”型；28个菌系在有一定抗性的K102寄主上，13个为“W”型，15个表现为“S”型；在抗病品种86-1寄主上，24个为“W”型，4个为“S”型。按各菌系在8个棉属鉴别寄主上平均病指划分为强、中、弱3个类群，4个菌系为强致病类型，17个菌系为中等致病类型，7个菌系为弱致病类型。1998年发现湖北新洲的1个菌系和山西太原菌系对抗病品种86-1的致病力接近“S”型。1988年分离的3号小种2个菌系和1991～1994年分离的3号小种变异型5个菌系均分布于3号小种的原发生地新疆吐鲁番地区。对非棉属寄主均为“R”或“W”型；对陆地棉Rowden均为“R”型（病指为0），对海岛棉Coastland均为“S”型。2个3号小种与5个3号小种变异型的差异表现在对Ashmouni和SaKel的致病力上，前者在Ashmouni和Sakel上分别为“R”和“S”型；后者对Ashmoum的致病力增强了，除l个为“R”型外，2个为“W”型，2个为“S”型，而对SaKel的致病力减弱了，均为“W”型。另外，1995～1998年从该地区采集的海岛棉病株上一直未分离到3号小种。1988～1995年分离的8号小种5个菌系均分布于其原发地区的湖北新洲地区，在非棉属鉴别寄主紫苜蓿和白肋烟上均表现为“S”型，4个在棉属鉴别寄主上表现为“R”或“W”型，其中，1995年分离的Ag136菌系对抗病品种86-1表现为“S”型（病指25.0）。另外，1998年从该地区采集的病株上分离出8号小种6个菌系。2007年，马存等把目前世界上已报道的棉花枯萎病菌8个小种归纳成如表2-3所示。寄主植物小种编号12345678分布地区世界各地美国埃及印度苏丹巴西中国中国亚洲棉（G.arboreumcv.Ronzi）RRSSSRSR海岛棉阿西莫尼（G.barbadebsecv.Ashmouni）SSRRSSSR海岛棉萨克耳（G.barbadebsecv.Sakel）SSSRSSSR陆地棉阿卡拉44（G.hirsutumcv.Acala44）SSRRRSSR金元烟（Nicotianatabacumcv.GoldDolar）RSRR—RRR大豆（Glycinemaxcv.Yelredo）RS——RRR羽扁豆苜蓿（Lupinusluteuscv.Weiko）SS——R表2-3 世界各国不同小种对不同寄主植物的侵染力新疆棉区棉花枯萎病生理小种，自徐怡心（1994）鉴定认为国际7号小种之后，李国英等（1998）、缪卫国等（2000）、王雪薇等（2001）、吴彩兰等（2004）和张莉等（2005）采用目前国际上通用的一套棉属鉴别寄主及当地的辅助鉴别寄主对从不同产棉县（市、团场）采集的枯萎病菌株样本鉴定后认为，目前，7号生理小种仍为新疆棉花枯萎病菌优势生理小种，主要分布在新疆南疆（和田、喀什、阿克苏）、北疆（石河子、昌吉、乌苏）、东疆（吐鲁番）主要棉区。从各供试菌系对9个品种的发病始期及发病程度看，新疆棉花枯萎病菌菌系强致病型主要分布在南、北疆主要棉区，部分菌系属中等致病型，枯萎病菌为害时期较早，棉株出苗后10～12天，造成棉苗子叶青枯萎蔫或叶脉黄化网纹；新疆棉花枯萎病菌菌系弱致病型主要分布在东疆棉区，枯萎病菌为害时期均较晚，较南、北疆棉区发病始期晚5～7天，即棉花出苗后15～20天才出现子叶青枯萎蔫或叶脉黄化网纹症状。营养体亲和性（Vegetative Compatibility，简称VC）是指缺乏有性生殖真菌，通过不同菌系间的菌丝融合交流物质，进而形成异核体的能力，其实质就是异核体亲和性，会导致病原菌形态和致病性的变异。由若干具有营养体亲和性的菌系构成的群，称为营养体亲和群（Vegetative Compatibility Group，简称VCG）。做致病性测定存在着费时、费力、结果易受外界因素影响及不能反映不同菌株间的遗传关系等公认的问题（Hart等，1981；Kraft等，1978；Pound等，1953），所以，有必要探索和寻找鉴别小种更为简便有效的途径。Puhalla（19850）首先确立的用不能还原硝酸盐作唯一氮源生长的突变体（nit突变体）作营养体亲和性试验的方法，为此提供了一条有效的途径。此法通过观察不同菌株的nit突变体之间能否互补而形成异核体把它们分成不同的营养体亲和群。根据他的理论，亲和与否反映出不同菌株在遗传进化过程中的亲缘性远近，国内外不少报道都认为营养体亲和性是鉴别镰刀菌不同专化型及小种间菌株的有效方法。1985年Puhalla首次将VCG技术应用到尖孢镰刀菌专化型的研究，结果认为专化型与VCG之间有一定的对应关系，即同一VCG的菌系属于同一专化型，而不同专化型的菌系属于不同VCG。随后，大量的不同专化型的菌系证明了Puhalla的观点（Ploetz，1990）。鲍建荣等（1992）对尖孢镰刀菌的6个专化型的20个菌系进行了营养体亲和性研究，结果显示，不同专化型菌系的nit株之间无互补反应，而同一专化型的不同菌系上分离的nit株之间可产生亲和反应，也证明了nit突变株的营养体亲和群与菌系的专化型有相关性。在棉花专化型内，研究证明，生理小种与VCG有一定的相关性，来自同一生理小种的菌系，甚至是不同地理来源的菌系，都可划为同一VCG。Katan等（1988）测定来自以色列全国不同地区的同为3号生理小种的12株棉花枯萎病菌菌系，结果均属于同一VCG。丁之金等（1992）采用不能还原利用硝酸盐作唯一氮源生长的突变体（nit突变体），对中国棉枯萎镰刀菌的3号、7号、8号小种的61个菌株做了营养体亲和性研究。结果表明，第3号小种7个菌株和第7号小种42个菌株各属一个不同的营养体亲和群，第8号小种的8个菌株则属6个不同亲和群，不同小种的菌株间没有亲和性。营养体亲和性试验结果与致病性测定结果吻合，能从遗传学角度区分棉枯萎菌不同小种，用它作为鉴定手段，结果更能反映出不同菌系间的本质联系，并可克服致病力测定工作中费时、费力及结果不稳定等缺点。王克荣等（1996）利用氯酸钾毒性，诱变棉花枯萎病菌产生硝酸盐利用缺陷型突变体（nit）。通过对nit突变体在亚硝酸盐和次黄嘌呤为唯一N源的MM营养基上的生长鉴定，获得了4种生理表现型的nit突变体。在485个nit突变体中，nit A为357个（73.6%），nit B 59个（12.3%），nit C 65个（13.4%），nit D 4个（0.8%）。4种类型的突变体产生的频率差别很大，nit A类型最易产生，nit D突变类型则很难得到。Nit A类型的突变体也很容易回变成野生型。不同菌株产生突变类型的比例也有差异。菌株258产生的11个突变体均为nit A型，而菌株262产生的8个突变体都是nit B型，菌株207和328则产生4种生理表现型的突变体。产生nit突变体的107个菌株经互补类型配对测定的结果见表2-4。由此看出，我国的棉花枯萎病菌中，以VCG1为优势群体，分布广泛。有8个菌株分属另外3个VCGS，这些群体是否属于尖孢镰孢萎蔫转化型（Fusarium oxysporumf.sp.vasinfectum），可能需要进行分子遗传学比较才能明确。营养体亲和群（VCG）菌株数菌株来源营养体亲和群（VCG）菌株数菌株来源VCG15江苏丹徒VCG26江苏丹徒（303，315，316，319，328，329）江苏江浦江苏启东江苏淮海农场VCG31江苏丹徒（234）新疆四川浙江VCG41江苏南京（402）江西表2-4 棉花枯萎病菌的营养体亲和群及其来源除了属于4个VCGs的103个菌株，另有4个菌株（菌株号219，226，227，302）只产生一种表观型的突变体（nit A），这些突变体与其他菌株的互补型突变体配对不能形成亲和性反应。这些实验结果表明，我国的部分地区，包括新疆、四川、浙江、江西和江苏的棉花枯萎病菌多属于同一个营养体亲和群。在表现症状的棉花上部茎叶中也分离到其他营养体亲和群的菌株，这些菌株经测定，对陆地棉的棉花品种具有寄生能力和一定的致病力。王雪薇等（1996）报道，新疆棉花枯萎病株或病田土中分离得到的尖孢镰刀菌具有明显的营养体亲和性。将分离自新疆5个不同地点的棉病株或棉田土的7个菌株经单孢分离得到18个单孢株，经鉴定均为尖孢镰孢。7个菌株的18个单孢株分别在KPS培养基上诱得数量不等的nit突变体，将它们分别与两个采自老病区莎车的棉枯萎病菌株进行营养体配对试验，结果显示，7个菌株分别归属2个营养体亲和群（VCGs），其中，与莎车菌株明显亲和，属V1的6个菌株与莎车菌株应同属于尖孢镰孢萎蔫专化型。研究结果还表明，不同菌株产生的亲和带的形态特征不同，如MK菌株的各nit突变株间产生的亲和带均表现为水平扩展，迅速呈纺锤形，但气生菌丝不发达，亲和带仅表现为菌丝层比突变体菌丝层厚，随着亲和带的发展可在两突变株间连成片，暂称扩展型亲和带；而MK7-1菌株的各nit突变株间产生气生菌丝茂密，且扩展宽度均匀的线形亲和带，亲和带朝更浓密方向发展，仅加宽，但不易成片，暂称线型亲和带。所有亲和菌株（或单孢株）与MK形成的亲和带均属扩展型亲和带，而与MK7-1形成的均属线型亲和带。依据不能利用硝酸盐的突变体（nit）间营养体亲和性划分出的棉花枯萎病菌营养体亲和群（VCGs）与其生理小种间高度相关，即不同生理小种间营养体不亲和，而同一生理小种归属于一个或少数几个VCGs。张莉等（1998）从新疆各植棉区采集棉花枯萎病病株，经分离纯化获49个单孢菌株。经营养体亲和性测定结果表明，供测49个菌株分为4个亲和群，其中，VCG1包括46个菌株，占供测菌株的93.9%，均与标准菌株中的7号小种Ag84亲和，另外3个（吐-2、昌-4、石-2）分属不同的亲和群，它们与标准菌株中的7号、8号和3号小种的Ag84、Ag16、Ag2菌株的突变体均不亲和。20世纪90年代后期以来，随着新疆植棉面积的不断扩大及从各地大量调运棉种，其病原种群是否有所变化，不少植棉单位存在一定疑问。为此，张莉等（2005）采用营养体亲和性技术，对新疆棉花枯萎病菌的生理小种类型及其病原种群进行了变异监测研究。结果表明，28个供试菌系高度侵染海岛棉、陆地棉及K102（辅助鉴别寄主），属典型的7号生理小种，其余12个菌系在鉴别寄主上的反应与7号生理小种略有差异；供试菌系属于一个营养亲合群，且与7号生理小种的标准菌系相亲和，与3号、8号小种的标准菌系不相亲和；新疆棉花枯萎病菌依旧以7号生理小种为主。与以往的研究结果相比，新疆棉花枯萎病菌的群体组成基本没有发生变化。此外，王雪薇等（2000）的研究结果也表明，52个待测菌株与7号小种的4个标准菌株间存在着不同程度的营养体亲和性，而与3号小种和8号小种的标准菌株均不亲和。因此，它们属于7号小种营养体亲和群—VCG701。在棉花枯萎病菌的生理小种及其遗传进化关系的研究中，通过突变体的诱发而进行的营养体亲和群判别方法是行之有效的重要研究方法之一，但在突变体的诱发与鉴定上存在较大的难度，方法不一，试验的稳定性较差。为此，白剑宇等（2007）对棉花枯萎病菌突变体的诱发与鉴定做进一步的方法验证与技术探讨。从32个供试棉花枯萎病菌菌株中共诱得288个nit突变体，根据其在不同氮源培养基上的生长划分出4种突变体类型：nit 1、nit 3、nit M和nit 8。对各菌株的突变体诱发与鉴定结果表明诱得突变体的难易程度主要因菌株的不同有很大差异，有些菌株（FKLMYN-23，FKTN-11，FSYN-Z6）很容易诱得各类型突变体，有些菌株不易诱得某种突变体类型，有个别菌株（FMYN-02，FYL2N-07）在KClO3含量10～60g/ml的各浓度梯度中都未能诱发出任何突变体。不同KClO3浓度梯度的KPS培养基上的突变体诱发情况比较表明，在KClO3浓度为25g/ml时诱得突变体的比例最高，约76%的菌株在此浓度下诱得突变体。85.0%的供试菌株上诱发到的突变体类型不全，只有15.0%的菌株能诱发到4种类型的突变体。在诱得的288个突变体中，各突变体类型所占比率高低依次为nit 1＞nit 3＞nit 8＞nit M。在这4种突变体中，nit 1型突变体的诱得比例最高（76.7%），且在绝大多数菌株（93.7%）中易诱得，此结果与王雪薇等（1996）和李国英等（1998）的报道基本一致。但nit M型突变体较难诱发到，供试的32个菌株中，只有13个菌株诱发到了nit M突变体，其比率为40.0%，在所有诱发到的288个突变体中，nit M所占比例仅为4.9%，该结果与王雪薇等（1996）和李国英等（1998）的报道有所差异。这些结果对建立稳定和准确的实验方法体系，为进一步查明棉花枯萎病菌的营养体亲和群分化情况，营养体亲和群与生理小种的对应关系，生理小种的种类及其分布，病原菌的分化，遗传进化关系提供了有科学价值的依据。异核现象是半知菌普遍具有的特性，也是病原菌变异的主要原因。史大刚等（1991）结合新疆吐鲁番地区，原只发现枯萎菌生理Ⅲ型，后又发现了生理Ⅱ型的现象，研究了异核现象与枯萎菌变异的关系认为，异核现象是导致生理Ⅲ型菌系致病力增强产生生理Ⅱ型的重要因素。棉花枯萎病菌在遗传上都是十分复杂的种群，遗传的多变性可以由多种因子引起，例如，转座因子、染色体突变、基因漂移、准性生殖等。这种种群上遗传多变性决定了必须依靠更为客观的研究方法来研究它。VCG是依靠真菌自身遗传特征来划分的，不仅能反映菌系之间的遗传相似性，而且有助于真菌繁殖方式及其群体遗传结构的分析。但目前，棉花枯萎病菌营养体亲和性研究菌系来源十分有限，而且棉花枯萎病菌主要集中在专化型内，这样不能更为确切地了解种群的发育与变异。因此，今后应进一步扩大棉花枯萎病菌的研究种群，并结合更多的研究技术，包括分子技术，对日益复杂化的棉花枯萎病菌的种群进行更深入的研究。生物体内的同工酶是基因与生物外部形态性状的连接物，同工酶酶谱是生物内部生物化学特性的反映，许多学者认为，病菌不同的致病类型与酯酶同工酶有较密切的关系。吕金殿等（1982）用聚丙烯酰胺凝胶电泳对42个采自我国各省（自治区）的棉花枯萎病菌的酯酶同工酶进行了比较研究，根据主酶带的情况可将42个菌系分为3个类型，分别为类型Ⅰ，包括4条主酶带，含有31个菌系，来自13个省（直辖市）；类型Ⅱ，包括3条主酶带，含有6个菌系，来自6个省；类型Ⅲ，包括2条主酶带，含有1个菌系，来自新疆。张莉等（2000）用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定新疆棉花枯萎病菌酯酶同工酶，同时结合以往研究分析其酶谱类型与生理小种的关系。结果表明：（1）新疆棉花枯萎病菌有4种酶谱类型，供试的30个菌株中有25个菌株的酶谱属于类型Ⅰ据以往研究，这25个菌株中，有24个菌株属于7号生理小种，它们与标准的7号生理小种的酯酶同工酶酶谱基本一致。这说明，可利用酯酶同工酶作为研究棉花枯萎病菌致病力分化的一种辅助方法。同时，从生化的方面再次证明7号生理小种是新疆棉花枯萎病菌的优势小种。（2）主酶带的多少与致病力的强弱成正相关类型Ⅰ中的菌株有5条主酶带，次酶带也最多，在供试菌株中属致病力最强的类型；类型Ⅱ中的菌株有2条主酶带，次酶带较少，属供试菌株中致病力较弱的类型。（3）试验证明，酶谱类型与生理小种的类型并不完全一致如塔2菌株的酶谱类型属于类型Ⅳ，它与本次试验提供的3个标准菌株酶谱均不相似，但在利用鉴别寄主的鉴定中属7号小种；还有石-15菌株酶谱类型与标准3号小种相一致，但其小种也属于7号。这些现象有待进一步研究。曹君等（2005）通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定了各供试枯萎病菌酯酶同工酶，并结合同工酶谱的聚类分析研究其酶谱类型与菌株致病力及生理分化的关系。结果表明，在棉花枯萎病菌中酯酶含量较高，电泳酶谱稳定，重复性好。14个供试菌株与标准菌株J-1的枯萎病菌酯酶酶谱基本一致，既反映了棉花枯萎病菌在专化型水平上的遗传一致性，又能在专化型下区分出不同的致病类型。根据酯酶酶谱和聚类分析结果（图2-2）将供试菌株分为4种类型。类型Ⅰ的菌株有5条主酶带，次酶带也最多，在供试菌株中属致病力强的类型；类型Ⅱ中的菌株的致病力属于中等水平，类型Ⅲ、类型Ⅳ的菌株分别有3条、2条主酶带，次酶带较少，属供试菌株中致病力较弱的类型，表明主酶带的多少与致病力的强弱有关。因此，酯酶同工酶酶谱类型和致病类型有较密切的相关性，利用酯酶同工酶分析能够准确且快速地鉴别出棉花枯萎病菌的不同致病类型，克服了传统棉花枯萎病菌致病性鉴定方法的一些弊端，且该方法简单、方便、准确，重复性好，可以成为鉴定棉花枯萎病菌不同致病类型的重要方法之一。图2-2 同工酶酶谱聚类分析树状图棉花枯萎病菌各生理小种间，不论是酯酶同工酶、过氧化物同工酶，还是可溶性蛋白质，经电泳后或多或少都可出现特征性条带，差异比较明显，易于区分。吴彩兰等（2004）对棉花枯萎病菌的3号、8号和7号3个生理小种的标准菌株和新疆所采31个供试菌株采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行了酯酶同工酶谱、过氧化物同工酶谱和可溶性蛋白质谱分析。结果表明：①菌体酯酶同工酶电泳：所有供试菌株的酯酶同工酶酶谱多态性丰富，谱带数目一般为3～8条，清晰可辨。棉花枯萎病菌不同生理小种的酯酶同工酶谱存在明显差异，3号生理小种有6条谱带，8号生理小种有3条谱带，7号生理小种有8条谱带，其中，Rf值为0.1和0.35的两条带为7号生理小种的特征性条带。供试菌株谱带数为4～8条，其谱带虽具有多型性，但都与7号生理小种标准菌株的特征性条带中的一条或两条一致。31个供试菌株经可溶性蛋白质谱分析，它们与7号生理小种的标准菌株的特征性条带中的一条或两条一致，说明新疆棉花枯萎病菌仍以7号生理小种为主要的优势小种，这与多次用鉴别寄主法测定的结果一致。在同工酶电泳实验中，过氧化物同工酶因其为单位结构，故谱带少，多态性差，有的菌株谱带不清；酯酶同工酶谱和可溶性蛋白质谱不仅谱带数目多，而且具有清晰易辨的特点，效果好，在实验中拟优先选用。②过氧化物同工酶电泳：所有供试菌株的过氧化物同工酶谱带数目为1～4条，多态性差，且有的菌株谱带不清。但不同生理小种间仍存在差异，其中，Rf值为0.42和0.56，为3号生理小种的特征性条带，Rf值为0.52为8号小种的特征性带，Rf值为0.4为7号小种的特征性条带。31个供试菌株谱带数都少，但它们基本都与7号小种的特征性条带一致。③可溶性蛋白质谱。棉花枯萎病菌不同生理小种的可溶性蛋白质谱存在明显的差异，3号和7号生理小种均有6条谱带，8号生理小种标准菌株只有4条谱带。谱带Rf=0.1、Rf=0.3和Rf=0.52为该3个生理小种所共有，8号生理小种Rf=0.4的谱带又与7号生理小种所共有，即8号生理小种的4条谱带均与7号生理小种共有；谱带Rf=0.2、Rf=0.38和Rf=0.45是3号生理小种所独有的特征性带；谱带Rf=0.08和Rf=0.42是7号生理小种所独有的特征性带。31个供试菌株可溶性蛋白质谱虽有差异，但差异不大；它们绝大部分谱带都具有7号生理小种的特征性谱带1条或2条，而不具有其他小种的特征性带。吴彩兰等（2004）采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，对2002～2003年，从新疆各主要植棉区采集到的31个棉花枯萎病菌菌株及3号、7号和8号生理小种的标准菌株进行了可溶性蛋白质谱分析。结果表明，棉花枯萎病菌不同生理小种的谱带存在明显差异，易于区分，并且3号和7号标准菌株都有自己的特征性谱带；同一生理小种不同菌株谱带的一致性较高，差异不大，供试菌株与7号生理小种的特征性谱带中的1条或2条一致。从电泳图谱聚类分析可将其分为3类：3号和8号标准菌株各为1类，供测大部分菌株的电泳图谱与7号生理小种标准菌株的相似性水平高，亲缘关系近，与3号生理小种的相似性水平低，亲缘关系最远（图2-3）。这与鉴别寄主法进行生理小种测定的结果基本一致，说明采用可溶性蛋白凝胶电泳对棉花枯萎病菌生理小种的鉴定具有重要的参考价值，可作为常规鉴别寄主法和营养体亲和群鉴定法的一种重要辅助手段。图2-3 棉花枯萎病菌供试菌株电泳图谱聚类分析树状图由于传统的生理小种划分主要以病菌对特定寄主的致病力强弱作为依据，病菌自身的变异及环境因子的复杂变化也可造成致病力变异，仅依靠传统的形态学和致病力差异来划分病菌生理小种已难以得出令人信服的结论。因此，需要借助于诸如遗传学、生物化学、分子生物学的手段加以验证，如血清学、营养体亲和性、凝胶电泳以及近年来发展迅速的RFLP及RAPD等技术，已逐步应用于病原菌的鉴定。而采用分子生物学手段，可将致病力在分类中的作用从遗传学的角度加以重新评价。随着分子生物学技术的发展，利用分子特征进行真菌分类鉴定已逐步被人们所采纳。在对病菌遗传背景了解甚少的情况下，采用随机引物扩增多态性DNA分子标记对尖孢镰刀菌专化型以下的小种进行多态性分析是行之有效的。RAPD（Random Amplified Podymorphic DNA）技术是20世纪90年代由William等在PCR基础上创立起来的一种利用随机引物扩增DNA的分子标记方法。该技术一出现，就以其快速而便于检测大量样品，所需DNA量少、不需要生物的特殊基因文库作探针以及操作安全、所需费用较低等突出优点，迅速应用于生物学研究的各个领域。冯洁等（1999）对来自中国11个省（自治区）的棉花枯萎病菌不同生理小种菌株的基因组DNA进行随机扩增，筛选出10个扩增多态性好且稳定的随机引物，不同引物的条带数为9～19条，扩增片段的DNA分子量为300～3000bp，10个引物扩增得到的140个DNA条带中，有123个多态性条带，占总条带的87.8%。根据供试菌株RAPD-PCR扩增条带的有无，以1.0记数，统计稳定、清晰出现的条带，采用Statistics统计软件对数据进行类平均法系统聚类分析，建立树状图（图2-4）。以连锁距离为5.0划分时，供试的29个菌株可划分为6个RAPD组。Ⅰ组为所有的3号小种菌株（1～5）及国外3号小种对照（29）；Ⅱ组为所有的7号小种共16个菌株（11～26）；Ⅲ组为8号小种的3个菌株（6～8）；Ⅳ组为8号小种的另外2个菌株（9、10）；V、Ⅵ组分别为国外的1号小种（27）及6号小种（28），它们各独自为一类。通过亲缘关系树状图可以看出，我国的3号小种与国外的3号小种对照亲缘关系十分密切，同属于一个RAPD组Ⅰ，这个RAPD组与其他5个组的菌株在亲缘关系上相距较远，独为一类；我国特有的7号小种自成一类；而我国的8号小种遗传背景较为复杂，分属于2个不同的RAPD组，其中，归为第Ⅳ的菌株（9、10）与7号小种的亲缘关系较近，归为第Ⅲ组的菌株（6～8）与7号小种的亲缘关系较远。国外的1号、6号小种（27、28）与我国的7号、8号小种在亲缘关系上相距较远。从亲缘关系树状图中还可以看出，我国的3号、7号小种都分别属于两个独立的RAPD组，8号小种分属于两个不同的RAPD组，这与传统的以致病力差异为依据的鉴别寄主划分生理小种的结果基本一致。从分子水平上证实了中国生理小种划分的正确性，并证明中国除3号小种与国外相同外，7号、8号小种是不同于国外其他小种的独立小种。8号小种在我国的分布只局限在湖北新洲和南京江浦，是遗传背景最为复杂的一个小种，今后在这一群体中可能会划分出新的小种。图2-4 供试棉花枯萎病菌菌株的RAPD聚类分析树状图新疆是我国最大的棉花生产基地，但植棉面积迅速扩大、连作年限延长、引种频繁，导致棉花枯萎病迅速扩展，为害严重。为了有效控制棉花枯萎病菌，有必要对新疆不同植棉区枯萎病菌的生理小种及遗传多样性进行分析，为新疆棉花抗病育种、植物检疫及病害防治提供科学依据。王雪薇等（2001）和田新莉等（2002）利用RAPD技术比较新疆棉花枯萎病菌不同菌株间在分子水平上的共性与差异。RAPD分析结果显示出这37个供试菌株与7号小种各对照菌株间基因组DNA的指纹图谱高度相似，属同一遗传相似组，而与3号和8号小种的对照菌株间遗传差异较大，亲缘关系较远，即7号生理小种是组成目前新疆棉花枯萎病菌群体的优势小种。仅发现一株可能属于3号小种的菌株，未发现属于8号小种的菌株。此外，从分子水平上证明新疆棉花枯萎病菌存在明显的遗传分化，即使在7号小种内也存在遗传上的差异，从而导致致病性强弱的不同。冯洁等（2000）采用10个随机引物对我国3个棉花枯萎病小种的26个菌株PCR扩增结果表明，不同小种在扩增的DNA条带之间差异明显，并分别筛选到了3号、2号和8号小种的特征带。3号小种特征条带2以OPF-10为引物扩增，3号小种的5个菌株（编号l～5）均在分子量为513bp处出现OPF-10513特征条带，而其他小种菌株均未扩增出此带。7号小种特征条带以OPF-08为引物，所有的7号小种菌株（编号11～26）均扩增出了分子量为371bp的特征条带OPF-08371。8号小种特征条带以OPF-12为引物，供试的5个8号小种菌株均在703bp处扩增出了特征条带OPF-12703。采用ABI 377全自动测序位，以T7方向进行序列测定，3个插入片段均可一次通读全部序列，3号小种的特异性探针OPF-10511含有513个碱基，内含5个内切酶位点（Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、Xba Ⅰ、BstⅪ、EeorⅤ），G+C含量为45.4%；7号小种特异性探针OPP-08371含有371个碱基，内含7个内切酶位点（Ecor V、Bsp 106、Nci I、Dra Ⅱ、Xho I、Sac I、Ecor V），G+C含量为43.4%；8号小种特异性探针OPF-12703含有703个碱基，内含7个内切酶位点（Kpn Ⅰ、Bsp 106、Hind Ⅲ、Aat Ⅱ、Ecor V、Bsp106、Kpn Ⅰ），G+C含量为42.1%。利用随机引物对棉花枯萎病菌不同生理小种的菌株进行PCR扩增，获得了大量的RAPD标记，并分别筛选到可将不同小种扩增出不同特征带的引物，为以致病力差异为基础的鉴别寄主划分生理小种的传统方法提供了分子水平的证据，说明我国棉花枯萎菌不同生理小种间在分子水平上存在较大差异，并且这种差异导致了病菌致病力的不同，不同小种之间特征性条带的存在也正是基因序列改变的真实体现。在棉花枯萎病菌小种间寻找到特异性DNA扩增片段，目前在国内外尚属首例。AFLP（Amplified Fragmentlength Polymorphism）分子标记技术是在基因序列未知的情况下，利用少数几对引物对相关物种基因组多态性进行有效检测。AFLP、RAPD及RFLP 3种分子标记多态性的检出效率的大小顺序依次为：AFLP>RAPD>RFLP。由于AFLP综合了RAPD和RFLP的技术优点，因而在植物病原真菌的遗传多样性分析、构建遗传图谱、标定基因、辅助育种的研究中得到了广泛应用。王兰等（2008）应用AFLP分子标记技术，选用9对EcorⅠ和MseⅠ引物组合，对新疆南疆地区不同团场的枯萎病菌12个菌系进行AFLP扩增，结果显示，每对引物均扩增出多态性的位点，说明供试菌系之间在DNA分子水平上存在丰富的遗传变异。9对引物共产生条带总数263条，其中，多态性条带205条，占总数的77.9%。参照琼脂糖凝胶电泳图谱，利用DPS数据处理软件中类平均法聚类分析，建立树状图谱（图2-5）。由图2-5可知，供试的12个菌系在0.52的水平上可分为4类，第Ⅰ类包括6个菌系，分别为F05、F06、F07、F011、F016和F043；第Ⅱ类为3个菌系，分别为F01、F012和F015；第Ⅲ类为2个菌系，分别为F09、F013；第Ⅳ类为1个菌系F03。（......）而与其同属于相同生态环境条件的菌系却属于另一个AFLP组。这说明同一生态环境下的棉花枯萎病菌株在遗传上可能不一致。图2-5 12个不同菌株AFLP聚类的树状图张莉等（2009）研究结果显示，新疆棉花枯萎病菌的AFLP多态性较高，这充分反映了枯萎病菌7号生理小种的群体内存在着一定的遗传多样性。出现这种情况的原因可能有两个：一是棉花枯萎病主要靠种子带菌传播，新疆大量从内地调运棉花种子，外来的棉花枯萎病菌传入新疆，这也暗示着新疆棉花枯萎病菌最初可能不是共同的来源；二是随着抗病品种的应用以及气候条件的变化，当地菌株发生突变，形成了适应新品种和当地自然条件的新菌株。研究的结果还表明，新疆棉花枯萎病菌AFLP多态性与菌株的地理来源有一定的相关性，但基于AFLP标记划分的AFLP类群与基于寄主病指划分的致病力类群间关系不一致。出现这种结果的原因可能有：①所用引物数目相对较少，揭示的可用于区分菌株的多态性不丰富；②所用菌株材料均仅根据致病力的不同而选定，忽视其他遗传差异的存在，加之选用菌株数目较多，干扰了分析结果；③AFLP分子标记所揭示的遗传变异反映了整个基因组水平的变异，而生理小种、致病性等表型变异仅反映一个或几个基因的变异程度。AFLP技术包含多个实验环节，要想获得理想的实验结果，需要对每个实验环节进行优化。在DNA酶切、连接试验过程中，需要制备高质量的DNA：一方面，DNA的纯度影响着酶切的效果；另一方面，DNA的完整性影响着实验结果的稳定性和重复性。单纯固体或液体培养基中含有糖和琼脂等营养物质，培养过程中使棉花枯萎病菌细胞中富含多糖、蛋白质等杂质，不利于DNA的纯化。限制性内切酶的选择对AFLP分析的准确度具有关键性作用，一般采用双酶切，其组合由1个高频内切酶和1个低频内切酶组成。目前国内外大多采用EcoRⅠ/MseⅠ和PstⅠ酶切组合，但Gomez等利用HaeⅢ/PstⅠ酶切组合和EcoR I/Mse I酶切组合对黑莓锈病病菌（Phragmidium violaceum）进行遗传多样性研究，结果显示HaeⅢ/PstⅠ酶切组合的AFLP分析虽然获得的扩增条带较少，但多态性位点较多，更利于条带的统计分析。王晓光等（2011）采用玻璃纸PDA培养基来收集棉花枯萎病菌菌丝体，采用改良CTAB法提取、纯化棉花枯萎病菌基因组DNA，最终得到了纯度高、适合AFLP分析的基因组DNA，而后利用HaeⅢ/PstⅠ酶切组合对棉花枯萎病菌进行了AFLP分析，结果显示，利用3对引物组合共获得301条带，其中，多态性条带164条，表明利用该酶切组合对棉花枯萎病菌进行AFLP分析能够得到较为丰富的多态性条带，能够用于棉花枯萎病菌遗传多态性的分析。通过对酶切时间、预扩增模板浓度、选择性扩增模板浓度进行梯度优化试验，建立了适合棉花枯萎病菌的AFLP分析体系，即酶切反应：250ng DNA经HaeⅢ/PstⅠ 37℃酶切2h后，加入1μl PstⅠ再进行酶切2h；连接反应：酶切产物25℃连接过夜（≥16h）；PCR反应中，以连接产物稀释10倍（P10）作为预扩增模板，预扩增产物稀释50倍（P10S50）作为选择性扩增模板。利用优化的AFLP反应体系对棉花枯萎病菌标准菌株进行分析，发现能够完全区分3号、7号和8号生理小种，证明了其有效性，可从整个基因组水平反映不同棉花枯萎病菌生理小种之间的遗传差异。对20个棉花枯萎病菌代表菌株进行AFLP分析，聚类分析结果表明，它们均与7号生理小种具有较高的遗传相似性，印证了7号生理小种是我国棉花枯萎病菌的优势小种，但同一生理小种内不同供试菌株之间也存在一定的差异性。棉花枯萎病菌的生长及其产孢量是病原菌生命活动和自身遗传的反应，同时也受到温度、pH值、碳源和氮源等因素的影响。李生才等（1998）认为，病菌生长温度范围为10～33℃，最适温度为27～30℃。曹君等（2005）研究结果表明（图2-6），供试棉花枯萎病菌菌株在10～35℃下均能生长，最适温度为25℃。棉花枯萎病菌生长温度因菌株不同而有差异已经得到证实。Raillo（1958）指出，尖孢镰刀菌生长适宜温度15～25℃，最高温度为35℃；陈其煐等（1992）报道，棉花枯萎病菌最适生长温度为25℃，最高温度大多为35℃，但有2个菌株能在37℃下生长；缪卫国等（2000）的研究结果与陈其煐等（1992）报道相似，但同时发现新疆吐鲁番棉枯萎病菌菌株HAI-17较耐高温，能在40℃下生长。不同研究结果所显示的棉花枯萎病菌生长温度的差异可能主要与供试菌株个体差异性有关，后者又与遗传和环境等因子有关。李生才等（1998）报道，棉花枯萎病菌在pH值2.5～7.0均可生长，pH值3.5～5.3为最适。曹君等（2008）研究结果指出（图2-7），棉花枯萎病菌在pH值4～10范围的PDA培养基上均能生长，最适pH值6～7。pH值6与pH值7差异不大，生长量几乎是其他各处理的2倍。这种不同研究结果的差异可能主要与供试菌株个体差异性有关，后者又与遗传和环境等因素有关。图2-6 不同温度对棉花枯萎病菌菌丝生长的影响图2-7 不同pH值对棉花枯萎病菌菌丝生长的影响在供试的4种碳源中，供试菌株在以蔗糖、乳糖、可溶性淀粉为碳源的培养基上菌丝生长较快，3种碳源之间在0.05水平上无明显差异。在以甘油为碳源的培养基上生长相对较慢，无碳源（对照）的生长与可溶性淀粉相似，但其菌丝不产生色素，而且气生菌丝稀疏、贴附生长。液体培养的菌丝干重与平板培养的菌丝干重之间有一定的变化：蔗糖作为碳源时，菌丝在平板上生长最快，但菌丝干重略低于可溶性淀粉；甘油作为碳源时菌丝在平板上生长略低于乳糖，而液体培养时却略好于乳糖。平板培养与液体培养之间有一定的联系，但结果不一定完全相同。蔗糖作为碳源时产孢量最大，可溶性淀粉其次，乳糖和甘油较差，清水（对照）最差（表2-5）。因此，做产孢实验时宜用蔗糖作为碳源。碳源生长速率（mm/天）菌丝干重（g）产孢量（个/ml）CK（清水）—0.0732.80×106蔗糖12.611.94845.93×107可溶性淀粉12.362.21854.76×107乳糖12.080.29211.20×108甘油11.210.33512.50×107表2-5 碳源对棉花枯萎病菌生长、产孢的影响（曹君等，2008）在供试的5种氮源中，供试菌株在以脲、硝酸钠为氮源的培养基上菌丝生长较快，两氮源在0.01水平上无明显差异。硝酸铵其次，在0.05水平上与前两种氮源以及磷酸氢二铵、硫酸铵差异明显。磷酸氢二铵、硫酸铵两氮源对菌丝生长影响较小。在供试氮源中，对菌丝干重而言，硝酸铵最好，磷酸氢二铵其次，脲、硝酸钠菌丝干重的差异不明显，硫酸铵较差，无氮处理（CK）的菌丝干重很少，说明氮是该菌生长的必需元素，对该菌的生长必不可少。对于产孢量而言，在供试氮源中以硝酸铵最好，脲、硝酸钠、磷酸氢二铵以及无氮对照其次，硫酸铵的产孢量较少（表2-6）。碳源生长速率（mm/天）菌丝干重（g）产孢量（个/ml）CK（无氮）—0.06483.21×107脲12.560.20624.28×107硝酸钠12.500.20683.32×107硝酸铵10.670.27301.40×108磷酸氢二铵5.610.22782.24×107硫酸铵3.200.17373.80×106表2-6 氮源对棉花枯萎病菌生长、产孢的影响（曹君等，2008）

多数苹果属植物野生种或栽培种的花和果都具有观赏价值，在观赏园艺花卉树木中占有重要地位。20世纪以来，国外植物学家从我国引种并进行了大量杂交选育工作，培育了一系列具观赏用途的海棠品种，统称为观赏海棠（Malus spp.）。近年来，国内学者从国外引进的观赏海棠品种几十个，它们姿态各异，色彩斑斓，大量果实点缀枝头直到深冬，丰富了景观内容。但是，这些观赏海棠不少品种的植株枝干上往往产生大量轮纹状、马鞍形的瘤状突起，严重时，病斑相连，导致树皮粗糙，严重影响树势甚至引起枝干坏死。本研究对其病原进行了初步研究，以期为进一步研究其发生发展规律和防治技术奠定基础。观赏海棠（M.spp.）植株为山东省泰安市区栽植树种。在6月份从病树上采集病斑，显微切片观察其病原形态，并对其大小进行测定。按常规方法，进行分离培养并纯化。观察其培养性状和产孢特征。在6月底，将分离纯化的病原菌分别采用烫伤接种法、针刺接种法、喷雾接种法对健康的海棠枝条进行接种，定期观察其发病情况，确定其致病性。设置不同温度条件（5℃、15℃、25℃、28℃、37℃、40℃）、不同pH值条件（pH值4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）、不同培养基条件（琼脂、蛋白胨、LB、BPY、PMA、PSA、PDA），用菌碟法分别测定不同条件下病原菌的菌丝生长状况；并在以上不同温度、不同pH值条件以及不同营养条件（0.5%、1%、2%葡萄糖，0.5%、1%、2%蔗糖）下，采用凹穴法测定病原菌孢子萌发情况。受害海棠枝干从皮孔开始发病，以皮孔为中心形成近圆形斑点，暗褐色，凹陷，边缘稍隆起；随后病斑中央突起，呈瘤状，质地坚硬，成为灰白色；病健交界处发生龟裂，病皮翘起，有点呈马鞍状，或呈轮纹状；病斑表面产生黑色的小粒点。严重时，病斑相连，病皮粗糙，导致部分枝干死亡。对病斑上黑色粒点切片镜检，发现：子座扁球形，其上分生孢子器1～3个，分生孢子器扁圆形或椭圆形，大小为（142～284）μm×（162～289）μm；内壁密生分生孢子梗，分生孢子梗棍棒状，单胞，顶端着生分生孢子；分生孢子单细胞，无色，纺锤形或长椭圆形，一端钝圆，一端截平，大小为（20.1～32.9）μm×（7.6～9.8）μm。从发病枝干上分离培养获得病原菌纯培养，菌落初灰白色，逐渐呈灰黑色，气生菌丝浓密，呈絮状隆起，后期菌落中产生灰黑色子座。对病原菌进行致病性测定，通过不同方法对海棠进行接种试验，发现烫伤接种法和针刺接种法处理的海棠发病率为100%，而喷雾接种法处理的海棠则几乎没有发病。其症状表现为，伤口先凹陷变黑，后形成褐色小突起。同时发现，在山东省泰安市，在6月底接种，该病原菌侵染的潜伏期为7～10天。经鉴定，认为该病害的病原为Botryosphaeria berengeriana，病害为观赏海棠轮纹病。25～28℃、pH值4.0～7.0、BPY和PDA培养基等条件，最适合菌丝生长，菌落生长快，且菌丝白色浓密呈絮状隆起，易产生黑色分生孢子器。28℃、pH值7.0、1%蔗糖条件最适合病原菌分生孢子萌发，12h观察孢子萌发率能达到80%左右，孢子萌发芽管较短、粗，多数两端萌发。观赏海棠轮纹病发病严重，目前对其病原鉴定方面未见报道。本研究初步确定其病原为Botryosphaeria berengeriana，并测定了其部分生物学特性。结果也显示该病原菌从形态和生物学特性上与引起苹果轮纹病的病原菌[1]和梨轮纹病[2，3]的病原菌有一定的差异。该菌的寄主范围、对苹果属、梨属植物的致病性、ITS的序列测定等工作正在开展中，这些信息对于该菌分类地位的进一步确定有重要价值。

棉花枯萎病[Fusarium oxysporumf.sp.vasinfectum （Atk.）Snyder et Hansen]是世界性的两大棉花病害之一，世界一些主要产棉国家都受到它的为害，造成不同程度的损失，同样也对我国棉花生产的持续稳定发展构成严重威胁。自1891年Atkinson首先在美国发现并报道枯萎病以后，陆续在其他产棉国和地区相继有发生和为害的报道。到21世纪初，棉花枯萎病的发病地区已遍及亚洲、非洲、北美洲、南美洲及欧洲等地，包括印度、巴基斯坦、缅甸、扎伊尔、埃塞俄比亚、加蓬、乌干达、乍得、南非、苏丹、坦桑尼亚、美国、阿根廷、巴西、秘鲁、乌拉圭、委内瑞拉、圣文森特岛、希腊、意大利、南斯拉夫、俄罗斯和澳大利亚等，几乎已遍及世界各植棉国家。随着美国棉花品种种子的引进，枯萎病传入我国。1931年冯肇传首先在华北地区发现棉花枯萎病；1934年黄方仁报告棉花枯萎病在江苏南通发生为害；1936年沈其益报道在南京、上海发现棉花枯萎病。以后随着棉花种子的繁殖、调运和推广，病区逐年扩大，为害也日趋严重。1949年前，棉花枯萎病已扩展到7个省、市、自治区，其中，陕西泾惠灌区由兴平至咸阳一线和泾灌区的局部棉田，山西曲沃、临汾一线、四川涪江两岸的射洪、三台等县，江苏省的南京、南通、启东和上海市，辽河流域的盖州、营口，河南弈川，安徽萧县，浙江慈溪，云南宾川，河北正定等地发病较为集中，但尚未构成对棉花生产的威胁。1949年后，随着农业生产的发展，棉花产区不断扩大，棉花种子调运、串换频繁，加之植物检疫措施执行不严，防治措施不力等原因，棉花枯萎病的传播、蔓延加快，为害也加重，截至20世纪60年代，棉花枯萎病已遍及我国主要产棉省、市、自治区。据全国棉花枯萎病、黄萎病综合防治研究协作组调查，1973年全国发病面积为499.5万亩（15亩=1hm2。亩≈667m2，全书同），1978年达850.5万亩。1982年农业部开展全国棉花枯萎病、黄萎病普查，病田面积上升到2223万亩，其中，大部分为枯、黄萎病混生区。发病面积接近或超过100.5万亩的产棉省有山东、河南、河北、山西、陕西、江苏和四川等。从枯萎病发生县看，1982年比1963年有明显的增加（表1-1）。枯萎病1963年南北方棉区总发病县为75个，1982年扩大到595个。（单位：发病县数）省（区、市）南方棉区19631982省（区、市）北方棉区19631982江苏349河南580四川1347山东172湖北643河北069安徽135陕西1843浙江226山西1437湖南020辽宁715江西016新疆*110广东02甘肃-4云南22北京010上海210天津-3总计29250总计46343表1-1 棉花枯萎病在各棉区扩展蔓延概况比较（马存等，2007）20世纪80年代初我国大力推广抗枯萎病棉花品种，而抗病品种的棉种也可能携带少量枯萎病菌，使枯萎病发病面积进一步扩大，但是由于抗病品种在重病田发病也很轻，到80年代末枯萎病的严重为害已得到控制。从30年代枯萎病传入到被控制，马存等（2007）把我国棉花枯萎病的发生分为以下4个阶段：第一阶段，20世纪30年代到新中国成立为传入阶段；第二阶段，20世纪50～60年代为扩展蔓延阶段；第三阶段，70～80年代为进一步扩展蔓延及严重为害阶段；第四阶段，90年代以后为控制为害阶段。然而，1999年转基因抗棉铃虫棉花品种示范推广以后，新品种对枯萎病的抗性出现了较大的波动。例如，根据江苏省棉花品种区试汇总结果，2011年32个参试品种枯萎病指平均14.85，比1998年23个参试品种平均病指3.18上升11.67。棉花枯萎病病原菌从根部侵入、系统侵染为害棉株，因此，从苗期到成株期的各个生育阶段，均可表现病症。概括起来，枯萎病的症状类型有：黄化型、黄色网纹型、紫红型、青枯型、半边黄型、皱缩型、枯斑型和光秆型。其中，前面4个症状多见于苗期阶段；黄色网纹型、半边黄型、皱缩型是枯萎病病株的典型症状类型。病株的症状是受病株一系列病理生理变化的外部反应，与病原菌致病力的强弱也有一定的关系。此外，症状表现往往因品种和自然环境的不同而有差异，如抗病品种中的感病株多呈青枯型、黄化型。而同期的感病品种则有多种症状型，气温低时为紫红型，雨后转晴时呈青枯型，严重的呈皱缩型、枯斑型，再严重的呈光秆型。在生产上，往往几种症状型混生于一株上，尤其是枯、黄萎病混合发生田，混生的症状类型更为普遍。在枯、黄萎病混生地区，两病可以同时发生在一株棉花上，叫做同株混生型，有的以枯萎病症状为主，有的以黄萎病症状为主，使症状表现更为复杂，调查时需注意加以区分。兹将两病发病症状比较如表1-2所示。项目枯萎病黄萎病株型植株节间缩短弯曲、有时顶端枯死一般植株不矮缩，顶端不枯死枝条有半边枯萎，半边无症状下部发病叶片可长出新枝叶叶片顶端叶片一般先显症下部叶片先显症，逐渐向上发展表1-2 棉花枯萎病、黄萎病的症状比较项目枯萎病黄萎病叶脉叶脉常发黄色，呈明显的黄色网纹叶脉绿色、脉间叶肉及叶绿变黄色呈斑块状叶形常增厚、皱缩，深绿色，叶缘向下弯曲大小形状无异，叶缘向上卷曲维管束木质部变褐色明显，色深褐木质部变色，色淡褐表1-2 棉花枯萎病、黄萎病的症状比较（续）-1在田间普查诊断棉花枯萎病时，除了观察病株外部症状外，必要时应剖开茎秆检查维管束变色情况。感病严重植株，从茎秆到枝条甚至叶柄，内部维管束全部变色。一般情况下，枯萎病株茎秆内维管束呈褐色或黑色条纹。调查时剖开茎秆或掰下空枝、叶柄，检查维管束是否变色，这是田间识别枯萎病的可靠方法，也是区别枯萎病与红（黄）叶茎枯病，排除旱害、碱害、缺肥、蚜害、药害等原因引起类似症状的重要依据。此外，由于枯萎病维管束变色的深浅不是绝对的，有时黄萎病重病株比枯萎病轻株维管束变色还要深些，这就需要辅之以室内分离鉴定工作。枯萎病会影响棉花的正常生长发育，在生长前期，枯萎病可造成死苗，中后期则影响蕾铃生长发育直至脱落，导致棉花产量严重下降，纤维品质变劣。关于枯萎病为害产量的损失，早期已有报道，Ware等（1934）调查研究认为，植株发病死亡率10%应该作为一个经济阈值，如高出这个数字，将会给产量带来负面影响。Chester（1946）估计，植株死亡率在60%之内，死亡率每增加5%，产量就要大约损失3%。20世纪80年代末，美国在全国范围内进行棉花枯萎病为害产量损失评估，1989年估计损失皮棉0.2%（Blasingame，1990）。也有报道重病年份损失皮棉1.05亿kg。姚耀文等（1963）研究结果指出，感枯萎病棉株的铃重（4.94g）、衣指（6.08g）、籽指（10.35g）和单株籽棉产量（60.91g）分别比健株减0.71g、0.59g、1.45g和31.75g，减少百分率分别为12.5%、8.8%、12.2%和34.27%。据马存等（1986）测算，棉田枯萎病发生后，随着病级的提高，产量损失增大。Ⅰ级损失23.64%，Ⅱ级损失48.38%，Ⅲ级损失73.12%。其病级与产量的回归方程为：y=-5.8851+0.9062x，（r=0.9080，P＜0.01）。即田间病指每增加1，皮棉产量损失率增加0.91%；当病指在6以下时，皮棉产量损失率在1%以下，几乎没有产量损失。棉株感染枯萎病后对棉花产量影响很大，病株的皮棉产量和籽棉产量均比健株极显著减产。具体表现在单株成铃数极显著减少；衣分显著降低；单铃重明显下降（表1-3和表1-4）。病级皮棉产量（g/株）为0级的（%）籽棉产量（g/株）为0级的（%）衣分（%）单铃重（g）单株铃数（个）0级13.67aA100.0032.45aA100.0042.34aA4.09aA7.94aAⅠ级10.05bB73.5224.45bB75.3541.17bAB3.90abAB6.20bBⅡ级7.45cC54.5018.41cC56.7340.45bcB3.64bcBC4.79cCⅢ级6.21cC45.4315.48cC47.7040.04cB3.38cC4.49cCⅣ级3.04dD22.247.85dD24.1938.79dC2.88dD2.62dD表1-3 棉株枯萎病对产量的影响（吴征彬等，2004）病情分级单铃重（g）衣分（%）籽指（g）衣指（g）0级5.341.410.97.7Ⅰ级4.240.29.86.7Ⅱ级3.640.19.66.4Ⅲ级3.241.17.85.9Ⅳ级2.340.06.94.6表1-4 棉花枯萎病对产量的影响（万英，2005）吴征彬等（2004）对棉花枯萎病与棉花产量之间回归分析结果指出，当棉株枯萎病每提高1个级别，其单株皮棉产量的减产率为18.361%，单株籽棉产量减产率为17.927%，其衣分约下降0.824个百分点，单铃重约下降0.293g，单株结铃约减少1.235个。棉株感染枯萎病后，其纤维长度等品质指标与健株相比都有显著降低。姚耀文等（1963）报道，感枯萎病棉株的纤维长度（30.1mm）和单强（3.69g）分别比健株减少2.0mm和0.64g。棉株的发病级别与纤维品质指标之间存在负相关，即棉株发病程度越重，其纤维品质越差（表1-5，表1-6）。吴征彬等（2004）回归分析结果表明，当棉株枯萎病每提高1个级别时，棉花纤维品质指标中，其纤维长度减少0.422mm；比强度约下降0.675cN/tex；马克隆值下降0.172。病级纤维长度（mm）整齐度（%）比强度（cN/tex）伸长率（%）马克隆值0级30.48aA85.95aA31.03aA8.14aA4.55aAⅠ级30.01bAB84.23bB29.75bAB7.62bB4.39aABⅡ级29.60bBC84.08bB29.53bB7.51bB4.35abABⅢ级29.11cCD83.91bB28.90bcBC7.51bB4.15bBⅣ级28.82cD83.80bB28.08cC7.50bB3.81cC表1-5 棉花枯萎病对纤维品质的影响（吴征彬等，2004）病级马克隆值比强度（cN/tex）纤维长度（mm）0级4.129.429.7Ⅰ级3.727.928.8Ⅱ级3.526.227.7Ⅲ级3.225.227.3Ⅳ级2.922.425.8表1-6 棉花枯萎病对纤维品质的影响（万英，2005）棉花枯萎病的发生，除了与病原菌的种、生理小种或生理型的不同致病力等致病因素有关外，还与气候条件、土壤耕作栽培条件、品种和生育阶段等条件有关。众多研究结果表明，温度是影响棉花枯萎病的重要因素之一。棉花枯萎病菌在培养基上生长的最适温度为18～25℃，最高为35℃，最低为5℃；而在田间，当土壤温度超过28℃时，棉花播种12天即可侵染发病，而土温下降到25℃时，发病则需要24天（陈其煐等，1990）。过崇俭等（1964）在江苏省南通三余观察到，当地温上升达20℃左右时，田间发现病苗，随着地温上升，枯萎病苗率显著增加；6月底至7月初，棉花现蕾期间，土壤温度上升到25～30℃时，常常引起发病高峰；至7月中旬，地温达30℃以上，枯萎病发病受到抑制。马存等（1980）在河南新乡调查发现，5月上旬田间开始出现棉花枯萎病株，5月下旬至6月中旬为田间发病高峰期，7月中旬进入高温季节，枯萎病症状开始隐蔽，8月下旬至9月中旬发病又有回升，但不出现明显的发病高峰；当土壤温度上升到21℃左右时开始发病，24～27℃是发病的最适温度，而当平均地温高达28℃以上时，病指开始下降；花铃期连续高温达30℃以上时，则造成症状的隐蔽。沈其益等（1984）研究报道表明，在北京地区条件下，7月初棉花枯萎病开始发生，7月下旬棉花处于现蕾期，因气温多在28℃以上，不适于病菌扩展，发病率只有20.93%，虽有增长，但未达最高；8月中旬以后气温平均下降至24～28℃，发病率迅速上升，高达50%～60%；在一般情况下地温对棉花枯萎病的影响远不如气温重要，因为地温只影响病菌对棉株的侵入，当病菌已经侵入棉株，并沿维管束扩展蔓延时，主要受气温影响。缪卫国等（2000）于1997～1999年在新疆吐鲁番棉花枯萎病自然重病田和人工病圃，研究气温、地温对长绒棉棉区棉花枯萎病发生、发展的影响。研究表明，气温对棉花枯萎病影响较小，地温是影响棉花枯萎病发生发展的重要因素，灌溉和棉田日辐射是影响地温的主要因子。在火焰山以南，棉花枯萎病发生盛期较南北疆棉区早，5月是棉花枯萎病隐症期，7～8月该病发病率回升，这与其他棉区不同。在火焰山以北，地温超过30℃，棉花枯萎病发病率仍呈上升趋势。张升等（2000）研究结果认为，棉花枯萎病的发生与否主要决定于5～10cm的地温；棉田灌溉和棉花不同时期棉田日辐射量是影响5～10cm地温的主要因子，灌溉次数越多，棉田日辐射越小，棉花枯萎病发生越严重。在适温条件下，降水量是影响棉花枯萎病发生程度的一个重要因素。棉花枯萎病的发展情况还取决于发病期雨量的多少与分布。一般6～7月雨水多、分布均匀，则发病重；如果雨量少或降雨集中，则发病轻。沈万陆等（1995）报道，江苏省启东市1986年6月中旬至7月中旬的连续低温阴雨，棉花枯萎病发生早且重，高峰期持续20多天；相反，1988年同期的连续高温干旱，发病迟而轻，高峰期仅持续5天。过崇俭等（1964）试验结果指出，江苏省南通三余1958年6月1日至7月10日的总雨量为201.07mm，1959年同期的降水量为207.28mm，但1958年雨量集中，6月26～30日，5天内降雨146.48mm，占总雨量的72%，最高发病率仅为14.99%；而1959年平均每5天有1次降雨，分布均匀，发病较重，最高发病率达45.48%，病情相差近3倍。棉花生长发育除需要适宜的气候条件外，也需要良好的土壤耕作栽培条件，良好的土壤和耕作栽培条件可以促进棉花健壮生长，并能增进其对病害的抗病能力；反之则棉花生长不良，抗病性降低。枯萎病菌在棉田定植以后，连作棉花年限愈长，土壤中病菌量积累愈多，病害就会愈严重。河南新乡县七里营公社调查（1977），连作2年棉田枯萎病发病率为4%～31.5%，死苗率为4.5%，连作3年的棉田发病率达36%～42%，死苗率为4%～9%；连作4年的棉田发病率高达58%～71%，死苗率达9%～12%。棉花枯萎病菌在pH值2.8～9.0范围内的培养基上均能生长，说明其对酸碱度的适应性较广，但最适宜的pH值范围是在3.0～5.5。因此，枯萎病菌在田间引起棉花发病，对土壤酸碱度的适应范围较广，没有十分严格的界限。棉田地势低洼、排水不良，或者灌溉棉区，一般枯萎病发病较重。灌溉方式和灌水量都能影响发病，大水漫灌往往起到传播病菌的作用，并造成土壤含水量过高，不利于棉株生长而有利于病害的发展。营养失调也是促成棉株感病的诱因。氮、磷是棉花不可缺少的营养，但偏施或重施氮肥，反而能助长病害的发展。原河南农学院（现河南农业大学）（1976）研究棉花营养与枯萎病发生的关系认为，单施氮肥较之单施磷肥或钾肥，发病率显著提高。氮磷钾配合适量施用，将有助于提高产量和控制病害发生。不同类型肥料的施入也会改变局部土壤状况，进而影响棉花枯萎病的发生发展。简桂良等（1996）通过田间及盆栽试验研究认为，棉花枯萎病菌抑菌性土壤施入不同形式的有机肥后，抑菌性发生了变化。施入马粪后，抑菌性被削弱，枯萎病菌增殖加快，棉花枯萎病发病率与导菌土相当，而施入棉籽饼及豆饼之后，则抑菌性增强，抑菌效果增加，尖孢镰刀菌萎蔫专化型的增殖受到抑制，而非致病性镰刀菌及产荧光假单胞菌含量增加。Elad等（1985）认为，荧光假单胞菌与病原镰刀菌在根际和土壤中通过对根际碳素营养和铁离子的竞争，使病原菌由于缺乏营养及厚垣孢子萌发所必需的铁离子，从而无法萌发及增殖；而非致病性镰刀菌对根表侵染位点的竞争及组织的专性位点的定殖，从而使病原菌失去这些生态点，病害因而减轻。不同育苗方式对棉花枯萎病有一定影响。阚画春等（2006）报道，营养钵育苗移栽的棉花比直播的发病轻，无土育苗移栽的棉花发病比营养钵育苗移栽的轻，地膜覆盖的棉花发病比无覆盖的轻（表1-7）。直播营养钵育苗移栽无土育苗移栽直播地膜覆盖营养钵覆膜移栽无土育苗覆膜移栽发病株率（%）32.3911.253.3533.336.991.46病指26.564.382.0619.493.600.49表1-7 不同育苗方式与枯萎病发病关系刘海艳等（2008）通过2005～2006年病情系统调查和气象因子分析，查明新疆地膜棉田枯萎病的发生和内地一样有两个明显的发病高峰，并且与气温、降雨有十分密切的关系，但在地膜覆盖植棉的情况下，其发病比内地明显提高，当连续5天的平均气温达14℃左右，田间开始陆续出现病苗，当连续5天的平均气温达20℃左右，进入迅速发病期，很快出现第一个发病高峰；当连续5天的平均气温达24℃以上，则进入病情减轻或高温隐症期；7月下旬或8月上旬随温度下降，病情又有所回升，进入第二个发病高峰。降雨与棉花枯萎病的发生也有一定的关系，在6月15日以前，累计降水量越大的年份，枯萎病发生也越严重。棉花不同的种或品种，对枯萎病的抗病性具有很大差异。一般亚洲棉对枯萎病抗病性较强，陆地棉次之，海岛棉较差。在陆地棉中各品种间对枯萎病的抗性差异也很显著。20世纪70年代前育成的52-128、陕棉4号、86-1号等品种抗病性很强，尤其是52-128已成为我国抗枯萎病育种的抗原。棉花枯萎病的田间发病与棉株的不同生育阶段也有一定的关系。虽然在温室内人工接种棉苗，均可在子叶展平期或真叶期出现症状，尤以三叶期更易接种成功。但田间的症状出现期，棉枯萎病多在5月见症，蕾期（即5月底至6月份）为显症高峰。当然发病高峰与这段时间内的适宜温、湿度有关。中国农业科学院植物保护研究所（1974）进行的病圃分期播种试验，设4个播种期，从出苗到出现发病高峰，尽管分别经历29～55天时间，但都是在现蕾前后进入发病盛期，若现蕾期推后则发病高峰也顺延，发病高峰的出现不因早播而提前。马存等（1980）在河南调查发现，5月26日棉花处于3～4片真叶期，枯萎病指为16.5；至6月3日，棉花进入现蕾期，病指上升到43.4，进入发病高峰期。如果分别于3月20日、4月15日、5月15日和6月15日播种，检查结果，病指高峰值32.1、43.0、31.0和8.9都是在现蕾期。综上所述，棉花枯萎病发生与为害的主要影响因子是气候、土壤与耕作栽培等环境条件，棉花品种和生育阶段对棉花枯萎病亦有重要影响。发病高峰期主要出现在棉花现蕾期，若在现蕾期土温在25℃左右且连续阴雨，将会造成枯萎病暴发，高温干旱则造成症状的隐蔽，发病较轻。育苗移栽、地膜覆盖及合理增加种植密度等科学的栽培管理可以减轻棉花枯萎病的为害。线虫是一类体形细长、不分节、无色透明的无脊椎动物。在自然界中，线虫的种类仅次于昆虫，但数量比昆虫还要多。据估计线虫有50多万种之多。植物寄生线虫主要存在于土壤中，根据在植物上的寄生部位可分为内寄生线虫和外寄生线虫两大类，少数属于半内寄生线虫。植物寄生线虫都是专性寄生物，必须从活的细胞内吸取食物。植物寄生线虫都具有口针，用以穿透细胞壁而侵入及从寄主细胞中摄取营养物质。大多数植物寄生线虫寄生于根部，为害根系，地上部无明显的特殊症状。据国内外研究报道，已知为害棉花的植物线虫属和种主要有根结线虫（Meloidogynespp.）、肾形线虫（Rotylenchulusspp.）、纽带线虫（Hoplolaimusspp.）、根腐线虫（Pratylenchusspp.）和刺线虫（Belonolaimus longicaudatus）。此外，其他的植物线虫属如剑线虫（Xiphinemaspp.）、长针线虫（Longidorusspp.）、拟毛刺线虫（Paratrichodorusspp.）和盾线虫（Scutellonemaspp.）等也可以为害棉花（Bridge，1992）。棉田植物寄生线虫和棉花枯萎病的发生有一定关系。Orlon（1910）指出，根结线虫的严重侵染，必然会破坏棉花对枯萎病的抗性。Martin等（1956）用南方根结线虫和枯萎菌联合接种，枯萎病发病率显著提高。Holdeman等（1954），用刺线虫（Belonolaimus gracillis）和枯萎菌联合接种时，大大提高了棉花枯萎病的发生。刘存信（1978）研究认为，各类棉枯萎病株根围线虫群体数量普遍比健株多；各地棉田病株根旁和行间的线虫数都比健株多，不同棉区大多数重病田比轻病田的线虫群体多。马承铸等（1994）温室测定结果，拟粗壮螺旋线虫（Helicotylenchas psead orobusous）接种量在每100cm3土壤100～1000条的条件下，接种30天后棉苗生长量比无线虫对照苗显著降低（P＜0.05）。抗枯萎病品种86-1在单接枯萎菌无线虫处理中不发生枯萎病，在枯萎菌接种量为每克土7.5×105孢子和线虫（每100 cm3土500～1000条）组合处理中发病，棉苗枯萎病指与线虫接种量之间呈正相关（r=0.97）。线虫不仅可单独发生，直接造成棉花经济损失，还可与真菌、细菌和病毒病原协同发生，构成线虫—病害复合症，加重病害对棉花的为害。线虫在病害复合症中的作用主要是直接为害棉花之后改变植株的生理状况，并造成寄主植物（棉花）机械损伤，成为病菌侵入寄主的孔口，使病害加重；枯萎病菌侵入木质部导管需经由根尖组织，线虫在棉花1～2片真叶以后主要为害须根和根尖，造成伤口，有利于病菌的侵入；线虫取食造成的伤口愈合慢，且使主根和茎基部的木质部与韧皮部的再生组织形成缓慢，延长了病菌的感染时期，增多了侵入机会，发病率高；线虫吸食棉株养分，伤害根尖，导致畸形发展，失去根的机能；线虫分泌物使棉株生理反常，造成棉株衰弱，不抗病、不耐病；线虫的刺吸活动和分泌物，有利于病菌胞子的增殖。线虫在病害复合症中，作为致病诱因，常使棉品种对枯萎病的感病性提高，线虫和病菌并存而协同发生，棉花枯萎病发生更加严重，Carber等（1953）指出，在有根结线虫存在时，棉花表现为高度感染枯萎病，但在没有根结线虫存在时，棉花则高抗枯萎病，表现了根结线虫对棉花感枯萎病的诱因作用。Holdeman等（1954）试验结果，单独接种枯萎病菌，抗性品种Coker 100不发生枯萎病；当刺线虫和枯萎病菌联合接种时，抗病品种的枯萎发病率为60%，感病品种的发病率为78%，证明不论是抗病品种，还是感病品种，刺线虫都大大地促进棉花枯萎病的发生。王汝贤等（1998）通过田间及温室盆栽试验，证明供试的3类线虫（N1=加州螺旋线虫，N2=小杆目线虫，N3=具有吻针非植物寄生线虫）单独存在均不能引起棉株发病；棉花枯萎病菌与加州螺旋线虫混合存在时可加重病害的发生程度，但其他2类线虫与棉枯萎病菌混合存在皆不能加重病害的发生（表1-8）。年份（1）接种物（2）发病率（%）播后天数303743检验（3）（43天）发病率（%）播后天数303743检验（4）（43天）1985N1+F54.295.2100F42.172.283.3N2+F22.233.980.0F19.032.477.8CK0001.2340.23134.757.977.427.950.681.48.317.452.510.321.256.90002.0330.6771986N1+F33.373.386.7F30.480.070.0N3+F13.333.373.3F20.040.073.3CK0000.68213.345.077.313.836.352.55.022.353.313.335.066.70002.5241.490表1-8 不同类型线虫与棉花枯萎病菌的协同作用*年份（1）接种物（2）发病率（%）播后天数303743检验（3）（43天）发病率（%）播后天数303743检验（4）（43天）1987N1+F22.244.472.2F16.729.252.2N3+F12.525.050.0F16.729.252.2CK0000.9830.51612.523.654.27.315.634.83.112.525.07.315.634.80002.6640.971表1-8 不同类型线虫与棉花枯萎病菌的协同作用*（续）-1邓先明等（1992，1993）报道，无论感病或抗病品种盆栽棉株单接肾形线虫（Rotylenchulus reniformis）处理（C）和空白对照（D）均未发现枯萎病，即发病率和病指均为0。肾形线虫和枯萎菌联合接种处理（A）的发病率和病指都高于单接枯萎病菌处理（B），平均值之差，感病品种洞庭1号分别为23.8%和30.9，抗病品种川73-27分别为14.0%和8.3（表1-9）。感病品种棉株茎部维管束呈褐色至深褐色，而抗病品种则未变色。单接肾形线虫的植株瘦高，叶部有轻微失绿，少数植株有紫斑，根系不发达，根表有肾形线虫为害造成的微伤口，周围组织变褐、细胞崩解。品种日期（日/月）发病株率（%）病指ABA-BABA-B洞庭1号（感病品种）11/1119.316.28.08.04.53.518/1170.752.018.739.821.018.825/1189.857.232.672.028.843.22/1294.859.534.380.737.143.69/12100.070.729.390.845.545.3平均74.951.123.858.327.430.9川73-27（感病品种）11/116.706.71.601.618/1115.06.78.36.62.14.525/1125.08.316.711.63.38.32/1230.013.316.717.05.811.29/1238.316.721.625.49.216.2平均23.09.014.012.44.18.3表1-9 棉花枯萎病发病株率和病指枯萎病棉株上的棉籽内部带菌问题，已为国内外研究所证实。Elliot（1923）首先肯定棉籽可以携带枯萎病菌。Taubenhans于1929～1931年在分离5094粒棉籽中，带菌率为5.01%。枯萎病随棉籽调引而传播，已被生产实践所证实。追溯我国各地棉花枯萎病最初传入和逐步扩散的历史，不难发现该病大多是由国外引种或从调进外地病区棉种开始的。1935年从美国引进大批斯字棉4B种子，未做消毒处理，就分发到陕西泾阳等处农场和农村种植，这些地方后来就成为我国枯萎病发病最早和最重的病区。在生产上，棉花枯萎病往往是先在引种带病棉种单位的田里发生，然后又随棉种的推广而蔓延为害。过崇俭等（1957）分离岱字棉14种子时，观察到种胚带枯萎病菌率为1.6%，种子表面带菌率为1.4%；1971年又分离4740粒棉籽，带菌率为0.1%，种子表面带菌率为0.3%，胚叶带菌率为0.6%，胚根带菌率为0.3%。顾本康等（1975）分离抗病品种陕401棉籽15646粒，带枯萎病菌率为0.01%；感病品种岱字棉15带枯萎病菌率为0.1%。可见，无论是抗病品种还是感病品种，只要收获自病田的，均可能带菌，只是带菌率高低不同而已。陈吉棣等于1964～1999年分离11505粒棉种，带菌率为0.026%；仇元等（1963）多次分离棉籽的带菌率为5.9%～39.8%，表明棉籽上可带有多量的病原菌。Evans（1966）分离后认为，未脱绒的棉籽最易粘附病残体，每粒棉种上平均约有10个微菌核。中国农业科学院棉花研究所（1972）在未种过棉花的黄河故道上进行的试验结果表明，从枯萎病田混收的棉种，其发病率约0.7%；从病株单收的棉种，其发病率为2.2%；而经硫酸脱绒后，其发病率下降97%。这说明种子带菌主要在棉籽的外部，特别是在棉籽的短绒上；但经硫酸脱绒的棉籽，仍有0.23%的棉株发病，间接地证明了棉籽内部可能带有少量的枯萎病菌。籍秀琴等（1980）进一步研究了棉花种子带镰刀菌种类问题。对8350粒棉花种子进行分离的结果表明，仅镰刀菌即有8种，出现频率较多的有半裸镰刀菌（Fusarium semiteectumBerK.et Rev.）、木贼镰刀菌[F.equiseti（Carda.）Sacc.]、串珠镰刀菌（F.moniliforme Sheld.）、腐皮镰刀菌[F.solani（Mart.）Sacc.]及尖孢镰刀菌萎蔫专化型[F.oxysporum f.sp.vasinfectum（Atk.）Snyder Hansen]，同时伴随出现的还有拟枝镰刀菌（F.sporotrichioides Sherb.）、禾谷镰刀菌（F.graminearm Schwabe）以及燕麦镰刀菌[F.avenaceum（Cor.et Fr.）Sacc.]等。孙君灵等（1998）对中国8省（自治区）24县（市）棉花枯萎病种子带菌量进行了检测。结果表明，仅新疆莎车县的棉籽上枯萎病菌孢子负荷量为0，其余23个县（市）为（0.8～31.8）×107个/g。新疆维吾尔自治区（全书简称新疆）、山东省、河北省、河南省和安徽省的棉花种子枯萎病菌孢子负荷量较低，为（0～8.6）×107个/g。江苏太仓为最高，31.8×107个/g。马存等（2007）归纳了中国农业科学院植物保护研究所等4单位关于棉籽带枯萎病菌率的研究结果（表1-10），带菌率在0.14%～6.6%。研究单位年份种子数（粒）带菌率（%）种子来源中国农业科学院植物保护研究所19647200.14辽宁省辽阳江苏省农业科学院197147400.101江苏省南通中国农业科学院植物保护研究所197531600.15～2.68河南省新乡中国农业科学院植物保护研究所19781506.6陕西省泾阳表1-10 不同单位研究的棉花棉籽带枯萎病菌情况自20世纪90年代以来，尽管我国推广经硫酸脱绒后再包种衣剂的包衣棉籽对减轻因种子带菌而发生的枯萎病有较好的效果，但棉籽带菌的客观事实，仍不容忽视，切实按照国家有关法规的规定，搞好棉籽的检验、检疫与调运，势在必行。棉花枯萎病病株的根、茎、叶等残体均带有枯萎病菌，这些病残体成为第二年的病菌主要来源。早期发病的病叶及残枝，落在田间也可以引起当年的再侵染。黄仲生等（1979）进行棉花枯萎病株残体传病试验，施用病叶和病秆沤制的堆肥，枯萎病率为84.1%；施用病叶、病秆喂猪所积的粪肥，枯萎病发病率为14.0%；而施不带菌厩肥或粪肥的对照区，则没有发现病株。试验结果不仅说明病叶、病秆等病株残体在传播枯萎病上所起的作用，而且还证明病叶、病秆经过猪的消化道后，病菌仍不能全被杀死，其粪肥也能传播病害。Evans（1966）测定，每张病叶平均携带200～400个微菌核，病叶上的病原菌是传播病害的重要来源。1963年，前苏联学者测定，相同重量的病叶接种土壤比病茎秆接种土壤，棉株的显症发病率要高出2～3倍，比病棉根接种土壤的显症率又要高出5～6倍，可见，病叶是病害流行中很重要的环节。关于棉田内病残体的测定方法，有间接证明和直接土样测定两种，后者是因为有了选择性培养基，可以从土壤内直接分离病原菌。20世纪50年代，过崇俭等在江苏三余棉场，从枯萎病重病田内，按0～10cm，10～20cm、20～40cm、40～60cm的不同土层，取土置于盆钵内，播种消毒的感病棉种，显症后调查发病率，结果依次为17%、19.6%、10.8%和11.9%，表明40～60cm处的病土仍可引起棉株发病。采用病土播种，土壤内按不同土层掩埋病株体后再播种，均可间接证明由于病土内存在着病原菌而导致棉株显症发生病害。顾本康等（1977）用选择性培养基，在病田内按5点取样法，从表土，10cm、20cm、30cm、40cm、50cm和60cm处取样，经5次取样分离后的平均数，每克土样的棉枯萎病菌的菌落数依次为16.7cm、22.2cm、22.2cm、11.1cm、5.6cm、0cm和0个。证明棉花枯萎病菌可在土壤40cm处的较深层存活，也充分显示棉花枯萎病菌一旦入土，就难以采用土壤处理消灭为害。枯萎病残体内病菌的存活时间，与它所在条件有关。干燥或水浸对病菌存活均不利，深埋土层20cm内的病株残体内的病菌，19个月存活率才有降低的趋势，而在土表或表土6～7cm内的病菌经18个月就全部死亡。在室内干燥的条件下，13个月不再存活；倘若浸泡水中，则病菌易于死亡，如在室温条件下，病株组织浸于水中46天，病菌存活率较对照降低68%，浸于泥水中降低到80%～90%；如果置于25℃定温条件下，在水中存活率降低到60%～90%，而在泥水中则全部死亡。综合防治中提倡稻棉轮作，或病田泡水其道理即在于此。遥感技术的发展和应用为作物的长势监测、种植面积调查和产量估算提供了一个新的科学手段。高光谱遥感技术以其较高的光谱分辨率在植物生物物理参数的遥感定量研究和产量估计中已表现出巨大的应用潜力。利用高光谱遥感技术可以快速精确地获取作物生长状态和环境胁迫的各种信息，是未来精准农业和农业可持续发展的重要手段（陈永芳等，2002）。中国在棉花高光谱遥感上的研究，多集中在棉花光谱反射率（或导数光谱反射率）与棉花的农学参数，生理参数和水、氮胁迫的相关性分析。唐延林等（2003）研究发现，随着发育期的推移，棉花冠层光谱反射率在可见光范围内降低，在近红外区域增高；叶面积指数、鲜叶重、干叶重和叶绿素含量等与红边的位置、幅值、面积均存在显著的相关性。王秀珍等（2004）指出应用导数光谱法研究棉花光谱特征可以有效地消除土壤背景的影响，在寻找特征波长方面具有广阔的应用潜力。黄春燕等（2003，2006）研究发现，748 nm波段处的一阶微分光谱值与棉花干物质积累量有较高的相关性；反射光谱“红谷”区的数值积分面积和最低反射率与叶片光合速率呈显著的线性负相关，并指出用“绿峰”的偏移作为棉花功能衰退的指标是不可取的。柏军华等（2006）以棉花全生育期叶面积指数与棉花产量的关系和近地高光谱遥感参数模型监测的多时相叶面积指数，可以很好地预测棉花产量。王登伟等（2003）指出棉花一阶微分光谱值与棉叶叶绿素浓度有很高的正相关性，群体叶面积指数与ND-VI呈很好的对数相关性，红边的积分面积与冠层叶片的全氮含量有很高的正相关性。冯先伟等（2004）发现，可见光和近红外波段光谱反射率能够反映出棉花生长发育的动态特征，棉花的花铃期是高光谱遥感对棉花长势和生理参数定量诊断的最佳时期。棉花枯萎病可以造成棉叶皱缩、失水、叶片紫红色或出现黄色网纹，使棉花的生理参数发生较大改变，这种变化必然会反映在棉叶的光谱曲线上。因此，乔红波等（2007）在温室条件下，利用便携式高光谱仪研究不同抗病性品种在接菌后棉苗的冠层光谱特性。结果表明，冠层光谱反射率对棉花品种间的差异敏感，病指与光谱反射率呈负相关。对枯萎病抗性越强，则其在近红外区的反射率越大，而感病品种光谱反射率则很小；病情越轻，光谱反射率越高，而品种间两次测定的值也存在这种负相关性。病指和光谱反射率线性回归分析，近红外波段决定系数较高，表明该波段对病指比较敏感，可用来监测棉花枯萎病害。田会东等（2008）采用“积分球——光谱仪”联用技术测量了健康棉叶和感染了枯萎病的棉叶的光谱反射率，发现健康棉叶与感病棉叶在光谱曲线上有很高的可区分性。用健康棉叶的波谱带作为分类器分别对“健康—发病期”和“健康—潜病期”两组棉叶的波谱集合进行分类，总体分类精度分别为100%和92%。将测得的光谱数据转化为Landsat TM 卫星多光谱数据，同样用健康棉叶的光谱带对以上两组波谱带进行分类，总体分类精度分别为96%和92%。上述试验结果为遥感技术在监测棉花枯萎病发生的应用提供了理论支持。

调查前海一线黑松，查明黑松生长衰弱的原因后，研究以黑松复壮为主的综合防治技术，采取地上与地下共同治理技术。“树上生长看树下”，只有树下根系生长好了，才能给树上部分提供营养元素，使其健康生长。2009年3月在鲁迅公园进行试验示范性研究，观察分别施用含微量元素的有机肥、根外菌根剂、更换土壤并使用含微量元素的有机肥3种方法对黑松生长势的影响。经过一个生长周期后，从实验点采取复壮措施的黑松中随机选取30株作为实验对象，周边不采取任何措施的黑松作为对照，详见表2～表5。（1）施用有机肥 在每株黑松树冠投影垂直约2/3处即距主干1.5～2m处环绕树体挖复壮沟3处，宽度30～40cm，深度为40～60cm，每株施“八福仙”牌高级动植物有机肥料（动植物有机质占30%以上，含有30%以上的氮、磷、钾大量元素，还含有钙、镁、锌、硼等多种微量元素及微生物菌群，土壤有益菌≥2亿/g）5～10 kg与挖出的表土混匀，培土浇水，施肥1 000株。为防止一次性伤根过多，每棵树分3年完成。并在相邻区域选取生长状况相近10株黑松作为对照。（2）使用菌根菌制剂 对部分生长衰弱的黑松接种中国林科院生产的菌根菌制剂——丰林菌根菌衣剂（是一种由菌根真菌菌体为主，吸水剂、黏着剂、膨胀剂、稳定剂和湿润剂组成的具有黏着和包裹植物材料特性和促进植物生长作用的菌根菌制剂），将该制剂稀释1 000倍，与上述土壤快速而平稳地混合1～2min，每株施用100 g，挖到黑松的毛细根处灌根，最好涂抹在毛细根处，处理100株。并在相邻区域选取生长状况相近10株黑松作为对照。（3）砌筑鱼鳞坑 对坡度较大的鲁迅公园部分黑松在坡地上砌筑“鱼鳞坑”，大约1～1.5m3，添加种植土与八福仙”牌高级动植物有机肥（混合比例5 ∶ 1），处理120株。并在相邻区域选取生长状况相近10株黑松作为对照。新发枝条越长，黑松的生长越旺盛；针束是黑松主要的光合作用器官，松针越长越多对植物的光合作用越有利，越利于促进植物的生长势；根系是黑松吸收水分和养分的主要器官，单位面积的根系越多其吸收作用越强，越有利于黑松生长状况的改善。故从新发枝条、新生针叶长度、黑松根干重3个方面调查黑松生长势的变化，黑松生长势变化与黑松枝枯病的相关性。表2 新发枝条的长度 （单位：cm）表3 新生针叶长度 （单位：cm）表4 黑松根干重 （单位：g）表5 黑松枝枯病的发病情况表2～表5表明，采取复壮措施后，黑松新梢的生长量、针束长度、单位面积的根干重都比以前有不同程度的增加，其中，建鱼鳞坑（图61-1 已建成的鱼鳞坑）换土掺加有机肥料复壮效果最好，但费用是3种复壮措施中最高的，主要适用于坡度大、水土流失严重的区域。换土与“八福仙”牌高级动植物有机肥料混合施用比单一采用一种复壮措施更有利于恢复黑松长势的结果显示，有机肥料与菌根肥结合施用或换土、有机肥料与菌根肥三者混合施用将比单独采用一种复壮措施效果要好得多。3种不同的复壮措施均能产生一定的防治效果，平均病情指数下降37.5～50.1，相对防效在71.0%～94.9%（图61-2 关于黑松施基肥的报道）。图61-1 已建成的鱼鳞坑图61-2 关于黑松施基肥的报道在八大关、栈桥、东海路绿地等前海一线黑松林推广使用复壮沟时发现，土壤板结重的区域在雨季复壮沟易成为积水沟，反而导致黑松根部受损。由于青岛为丘陵地区，土层浅，复壮沟大部分仅能挖到30～40cm，再往下沙石较多，需要投入的人力、物力更多，成本比较高，难应用于黑松的日常养护中。听过北京植物园熊德平博士的讲座后，认为其复合渗水透气井理念比较适合青岛地区，操作简单，多用途（可以是透气孔、深层浇水孔、施肥孔、注药孔等），成本较低，污染小，应用前景广阔。我们根据青岛的地形地质特点对复合渗水透气井进行改良，打孔深度随地形地质灵活掌握，一般控制在50～80cm，复合渗水透气井设计高度分为4种型号，50cm、60cm、70cm、80cm（图62～图63复合渗水透气井的结构与原理）。专用基质的配方：有机羊粪（来自内蒙古大草原天然羊厩肥）、松针土、发酵过的树叶（园林绿化废弃物再利用）、外生菌根（外生菌根存在于健康松林下的新鲜腐殖土中，当天采集的菌根土，掺加一定量的玉米面有利于外生菌根的繁殖）、功能菌群（芽孢杆菌、酵母菌群、乳酸菌群、双歧杆菌、革兰氏阳性放线菌群、光合菌群、丝状菌群、硝化细菌等）（图64～图67 专用基质混配）。2014年11月～12月在百花苑公园进行试验研究，使用地钻和洛阳铲在每棵树的树冠投影附近打孔4个（图68～图76 复合渗水透气井的应用），观察复合渗水透气井对生长虚弱的黑松影响。结合黑松休眠期使用3～5波美度的石硫合剂2次，2015年4月10日通过复合透气井灌50%多菌灵可湿性粉剂300倍液1次。经过一定生长期后，从实验点采取复壮措施的黑松中随机选取8个复合透气井的根系，观察不同土层根系的生长状况，测定复合渗水透气内土壤。详见表6和表7。图62 复合透气井结构与原理解析 （摄于熊德平讲座）图63 复合透气井结构图64 功能菌群图65 玉米面填加剂图66 采集健康松林下的根外菌根图67 功能菌、玉米面、根外菌根与发酵过的落叶混合为基质图68 打孔机图69 洛阳铲图70 打孔机打孔图71 洛阳铲破砂砾层图72 孔内土层黏重少根图73 打好的孔图74 向复合透气井内填充基质图75 捣实基质图76 清理现场表6显示，根茎径级越大，根越少，毛细根（根直径0.1～0.2mm）较多，占测量根系43.09%，黑松吸收养分和水分的能力加强了。表6还说明根量随着深度的增加而增加，说明通过增加复合渗水透气井达到了纵向深层引根的效果。表7与表1比较，说明复合渗水透气井基质可改善周边土壤的营养成分，加入的功能菌改善土壤结构，进而促进根系的健康生长。采取治疗与复壮相结合的措施，平均发病率为3%，平均病情指数为0.1，病情指数下降了52.7，相对防效高达99.8%。表6 黑松不同地表深度和根茎径级内根系数量 （单位：根）表7 黑松复合透气井专用基质测定结果在鲁迅公园、东海路公共绿地选取黑松集中的地块，2009年4月10～15日分别疏密、修枝、间伐和剪除被害干梢、虫果，及时清理枯枝落针。修枝强度以树冠长度与树高之比作为修枝强度指标，初次修枝强度不要超过树高的1/3。间伐本着留优去劣、留大砍小、留稀去密相结合的原则进行，病虫为害严重和枯死木应首先作为间伐首选对象。处理100株，随机选取30株标记观察，对照区设在距防治区500m外，不采取任何措施，于2010年春季4月20日调查发病率（表8）。表8 黑松枝枯病疏密与修枝防治效果相关调查结果表明，黑松及时修剪病枯枝、轮生枝、过密枝等措施，增加通光透气和减少黑松枝枯病的菌源也是一种有效的防治措施，病情指数下降了11.3～24.4，相对防效达到40.5%～87.5%（图77～图79 黑松疏枝、修枝、清理落针）。图77 黑松疏枝图78 清除黑松枯枝图79 清理黑松枯枝落针在八大关黑松枝枯病暴发的3～4月，在2009年4月2日、4月12日、4月22日，喷药3次，间隔10天。随机选取90株黑松，在第一次喷药后4月29日（即第27天）对不同药剂进行防效调查，对照区设在距防治区800m外，不采取任何措施（表9）。表9 黑松枝枯病化学药剂防治效果表9表明，50%多菌灵可湿性粉剂500倍液防治效果较好，相对防效为88.2%。50%多菌灵可湿性粉剂500倍液与0.3%尿素混合喷洒防治效果更好，相对防效为90.1%，也可与0.2%磷酸二氢钾混合，即50%多菌灵可湿性粉剂500倍液与0.3%尿素或与0.2%磷酸二氢钾交替喷洒。同样50%多菌灵可湿性粉剂500倍液也可以用70%甲基托布津可湿性粉剂1 000倍液交替与叶面喷肥混合喷洒，防治效果明显。由于黑松林郁闭度较大（58%～100%），栽植常绿草坪生长虚弱，越来越多的黑松林下改种丹麦草、扶芳藤、常春藤、小蔓长春花等，避免了常绿草坪生长期经常浇水，黑松根系生长不良的弊端（图80～图82 黑松林下植被）。图80 常春藤图81 小蔓长春花图82 丹麦草地被黑松地势低的区域需逐年撒土抬高地势，雨季及时排水，防止黑松树穴周边积水。

农业防治也称栽培防治，是农作物病虫草害综合防治的一项基础措施。利用农业生产过程中各种耕作制度、栽培技术和田间管理措施，创造有利于农作物生长和天敌繁育、不利于病虫草共生为害和大量繁殖的生态环境条件，从而避免或减轻病虫草的为害。主要措施有选用抗病虫品种和采用防治病虫草害的栽培技术两方面。这些基本技术不仅对作物本身的生长发育起到重要作用，而且是除虫防病不可缺少的具有相当积极意义的措施。侵染过程是指病原生物与寄主接触和侵入后，在寄主体内发育，而后引起病害发生的过程。但是侵染性病害的发生，必须有侵染的来源，并且病原生物必须经过一定的途径传播到植物上，才能引起侵染。同时，病原生物还要以一定的方式越夏和越冬，度过寄主的休眠期，才有可能引起下一季的发病。侵染循环是指病害从前一生长季节开始发病，到下一生长季节再度发病的过程。侵染循环是植物病理学上的中心问题，因为植物病害的防治措施主要是根据侵染循环的特征拟定的，棉花枯萎病也不例外。棉花枯萎病是为害棉株维管束的病害。在土壤中定殖的枯萎病菌，遇上适宜的温度、湿度，从病菌孢子萌发出菌丝体，接触到棉花的根系，菌丝体即可从根毛或伤口处（虫伤、机械伤）侵入根系内部。菌丝先穿过根系的表皮细胞，在细胞间隙中生长，继而穿过细胞壁再向木质部的导管扩展，并在导管内迅速繁殖，产生大量小孢子，这些小孢子随着输导系统的液流向上运行，依次扩散到茎、枝、叶柄、叶脉和铃柄、花轴、种子等棉株的各个部位。棉株感病枯死后，枯萎病菌在土壤中，能以腐殖质为生或在病株残体中存活，连作棉田土壤中不断积累菌源，就形成所谓的“病土”，此乃年复一年重复侵染并加重发病的主要根源。枯萎病菌在土壤里的适应性很强，当遇到干燥、高温等不利环境条件时，还能产生厚膜孢子、微菌核等休眠体以抵抗恶劣环境，所以，病菌在土中一般能存活8～10年。棉田一旦传入枯萎病菌，若不及时采取防治措施，将以很快的速度蔓延为害。枯萎病的侵染循环可用图6-1表示之。图6-1 棉花枯萎病侵染循环示意图植物病害的严重为害，有时是由常年连作引起的。连作除消耗地力、影响作物的生长和它的抗病能力以外，更重要的是土壤中病原生物休眠孢子和其他休眠体的积累，病株残体的增加和土壤中病原生物的大量繁殖，所以，轮作对于土壤传染的病害的防治最为重要。轮作防病效果以稻棉轮作效果最佳，其次是棉花与非寄主作物，包括禾谷类、绿肥、蔬菜等旱茬轮作。很多试验证明，稻棉轮作可以明显地减轻土壤传染病害的发生，如前苏联的试验，证明稻棉轮作是可控制棉枯萎病的为害措施。江苏射阳县在射兴2队，自1979年起将重病田改种水稻，以后每年换茬，形成稻、麦、棉、绿肥轮作制，再辅以抗病品种，效果良好。1985年调查，未改种的连作棉田泗棉2号枯萎病发病率85%、病指52；改种水稻2年后，第一年种棉花结果枯萎病病指在0.06～1.12，改水稻2年后第三年种棉花的，枯萎病病指在0.25～2.25。20世纪70年代中期在江苏常熟碧溪10队调查，一年稻、一年棉，棉枯萎病病株率0.1%～5.7%；一年稻两年棉，病株率13.4%；一年稻三年棉，病株率14.6%，表明改种水稻连种棉花，病情亦在回升。若两年稻一年棉，病株率只有0.05%～0.1%。四川、河北、湖北、浙江等地均有与水稻倒茬后种棉花的调查报告，结果一致认为，改种水稻需连作3年以上，对病情的减轻更为明显，而且也有利于生产实施。北方有与玉米换茬的习惯，河南省刘庄大队试验，棉花与玉米倒茬后，重种棉花一年的发病率1%～1.5%，种棉花2年发病率4%～31.5%；死株率4.5%，连作3年病株率为36%～42.0%，死株率4%～9%，连作4年的病株率达58%～77%，死株率 9%～12%。谭永久（1989）于1972～1988年分别对棉枯萎病菌在土壤及病株残体在水中和风干条件下的存活及致病力进行了研究。结果表明，棉枯萎病菌确属生存力极强的一种真菌，无论是生理型Ⅰ号的强菌系，或生理型Ⅱ号的弱菌系，均能在未种作物的干旱土壤中存活5年（表6-1）；在自然风干的病茎内存活6年；而淹没在水中的病枝、病茎内的病菌，随着温度的增高其存活期缩短，当平均温度在24℃以上时，淹没10天后，病枝内的病菌无存活，而病茎内要27天后才分离不到病菌，温度下降到15～17℃时，51天病茎内的病菌仍有存活，恰恰相反，仅浸泡浮于水面的病枝、茎，病菌不但没有死亡，反而温度增高，有利于菌丝的繁殖，并产生大量的分生孢子。病菌的生存力和致病力，在土壤及病株残体在水中和风干3种不同生态环境中，都是随着保存年限或淹没时期的增长而减弱，即使以保存一年的干病棉秆，病菌的生存力不仅有明显的减弱，而且致病力也有显著减退。测定土壤中，供试的5个菌系随着保存年限的缩短，菌系间致病力相对减退无明显差异；但保存时间不同，菌系间的培养性状表现出一定差异。病田轮作和消灭病株残体是棉枯萎病综合防治的一项重要措施。由于病菌的生存力顽强，病田旱地轮作，即使不种寄主作物，也要4年以上病菌的致病力才有所下降。因此，病田轮作，实质上只能起到减少发病的作用，短期的旱地轮作对根除病原是无济于事的。中国有的棉区棉农习惯于将整枝后的棉株枝、叶作泡清粪施于棉田，助长了病害的发生，加重了为害。若将带病枝、叶淹没于清粪水中，在7～8月份的高温条件下，病菌则易于死亡，1个月后施用对防治病害的扩大蔓延将更有效。年份病土保存期（年）川F5陕F9浙F2冀F8新F1新接川F5（CK）病指比1981年±%病指比1981年±%病指比1981年±%病指比1981年±%病指比1981年±%病指19810（CK）91.071.556.463.10.090.01984326.8-70.527.2-62.018.3-67.613.3-78.90.088.2198543.4-96.30.2-99.70.2-99.60.5-99.20.083.8198650.7-99.20.0-100.00.1-99.80.0-100.00.084.6表6-1 不同菌系病菌在土内的存活比较总之，棉花长期连作，地力下降，不仅不利于棉花生长发育，而且减弱其植株的抗病能力。对土传病害、土壤习居菌，由于有寄主作物长期存在，就不断地繁殖积累，从而增加病原物群体的数量，使病害逐年加重。经过轮作倒茬，由于寄主作物的更迭，专性寄生菌的繁殖、积累就受到干扰，经过一定时间，就将逐渐减少或消亡。另外，轮作还可调节土壤微生物群落的变化，促使对病原物有拮抗作用的微生物活动的加强，从而抑制病原物的滋长。轮作作物的有效性，要依据病原物的寄主范围及病原物在土壤中存活年限而确定。栽培管理措施防病作用，在于调整寄主作物——棉花与寄生生物——病菌所处的自然环境条件，旨在增强寄主作物的抗病性和补偿能力，削弱寄生物的致病性，抑制病害的发生发展，减少病害发生为害，从而达到防治棉花病害的目的。这一防病措施尽管不像药剂等防病措施那样立竿见影，完全彻底，但它对病害制约的持久性和对环境无公害是其他防病措施所没有的。更因为这一防病措施是结合必要的栽培管理措施进行，故无须额外的投入。合理的施肥与灌溉，有提高土壤养分，改善土壤结构，调节土壤温、湿度等环境条件的作用，可促进棉株生育健壮，提高抗病能力及抑制病菌生长繁殖和侵染为害的效果。水、肥不足或过多，往往削弱棉花的抗逆力，从而诱发多种寄生物的致病为害。肖作敏等（1996）的生物活性磷钾肥（生物活性菌糠+磷、钾肥）对棉花枯萎病防治效果试验结果表明，施生物活性磷钾肥较施磷钾肥的对照，防治枯萎病的效果为15.46%～38.98%；从剖秆情况看，施生物活性磷钾肥的虽不能阻止枯萎病原菌对棉花的侵染，但能有效地减轻它们对棉花的为害。施生物活性磷钾肥的枯萎病重症株率比对照低3倍以上。加入了生物活性菌糠的磷钾肥，由于其中磷、钾细菌的活动，不仅转化了肥料和土壤中的无效磷钾，为棉花提供养分，增强其抗逆性能，而且还产生多种生物活性物质，进一步抑制了枯萎病原菌的活力，所以，具有更好的防治效果。杨火发等（2008）报道，施钾肥能明显地减轻枯萎病的发生；随着钾肥用量增加，枯萎病明显减轻，品种1，缺钾时发病率为5.46%，施钾后发病率减少到4.76%；品种2更为明显，缺钾肥区发病率为7.14%，施钾肥后减少到5.36%，呈明显的负相关关系。农田土壤退化是世界农业面临的严峻问题。增施有机肥是农作物稳产高产、培肥地力，增强农业后劲的关键。施用有机肥或生物有机肥能显著提高土壤酶活性，活化土壤养分，从而增加耕层土壤氮、磷、钾养分含量，提高土壤肥力。黄干明（2008）试验结果认为，腐植酸氮磷钾复合肥能有效抑制棉花枯萎病的发生。棉花生长不论在苗期、花期还是结桃期都是叶片浓绿、茎秆粗壮，且坐桃率高，霜前花达80%以上；棉绒长、衣分高、品质好，产量高。腐植酸氮磷钾复合肥的作用在于：一是有抑制病菌的作用。施用腐植酸复合肥使土壤中好气性细菌、放线菌、纤维分解菌的数量增加，使真菌的数量明显减少，这对于由真菌引起的棉花枯萎病原菌无疑具有抑制作用。二是对棉花根系损伤具有愈合作用。腐植酸对根系损伤修复有明显的促进作用，它能够强烈地刺激愈伤组织细胞的繁殖，促进愈伤组织生长，有效地防止真菌从棉花根系损伤处侵入。这对于苗期及中期中耕除草、追施化肥时损伤的根系，有效地避免真菌从伤处侵入，从而降低枯萎病的发生，无疑产生重要作用。三是对棉花生长发育具有刺激作用，增强了棉花的生长能力。腐植酸是作物生长的调节剂，能促进棉籽早生根发芽、提高出苗率，特别在低温条件下明显能刺激棉花根系发育，主根生长快，侧根增多，吸收能力加强，茎叶粗壮，干物质积累多。四是改善棉田的土壤条件。腐植酸肥在土壤中施用，既能补充棉花需要的有机肥，又能增加土壤团粒结构，改良土壤，使棉花有了适宜的土壤条件。灌溉影响棉花枯萎病的发生程度，新疆吐鲁番棉区不同于内地棉区及新疆北部部分棉区，干旱少雨，4～8月降水量不足30mm（1998），降水对棉花枯萎病发生发展的影响极小。在吐鲁番棉花整个生育期，共灌溉4～5次水，在头水灌溉之前，棉田5～10 cm土温随气温的升高而升高，棉花枯萎病发病率随之降低，到6月6日5～10 cm土温达到棉花整个生育期最高值，为38.89℃，5月26日至6月16日棉田棉花枯萎病正处于隐症阶段，6月16日病害发生率最低，为3.26%。由于吐鲁番棉区棉株高大、松散，每亩株数一般为5000～8000株，因此，在6月初后，封行后的棉花遮阳能力强，减少了阳光对棉田地表的直接日辐射，并且伴随头水、二水、三水及四水，甚至五水，每次灌溉间隔期仅差10余天，尽管6～8月吐鲁番气温正值高温期，但田间5～10 cm地温却呈下降趋势，6月6日头水，灌溉前测定5～10 cm平均地温为38.89℃，6月16日地温则为29.17℃，至7月16日地温下降为28.31℃，棉花枯萎病呈上升趋势，6月16日枯萎病发病率为3.26%，至7月16日发病率上升为38.21%。8～9月，棉田停止灌溉，伴随棉花营养生长能力逐渐减弱，叶片老化脱落，阳光对棉田的直接日辐射增大，土温开始逐渐上升。因此，棉花灌溉是造成5～10cm土温降低、棉花枯萎病发病率上升的重要因素之一。这也与生产中反映头水后棉花枯萎病为害突然加重相一致（张升等，2000）。棉田采用地膜覆盖以后，能减少土壤水分蒸发，把太阳能转化为热能并传导给土壤，提高了地温，促进土壤微生物活动，提高肥料的分解利用，改善土壤物理化学性状，抑制棉田有害微生物（包括枯萎病菌）的生长发育，使棉田生态环境得以优化。从而促进了棉株根系生长，加速了棉株生长发育的进程。与其他调控技术配合，进一步促进了棉花早发、早熟、优质、高产。在黄河流域棉区，张卓敏等（1987，1991）的试验结果表明，棉田进行塑膜覆盖栽培对枯萎病有明显的减轻作用（表6-2）。盖膜棉田病指为5.39～37.5，不覆盖棉田为11.39～59.11，相对防治效果为23.68%～52.68%，平均为34.97%。不同播期覆盖对枯萎病防治作用试验结果表明（表6-3），3月27日、4月5日和4月15日相对防效分别为34.20%、35.48%和13.20%，显示出不同播期的处理对枯萎病均有一定的控制作用，尤以4月5日播期表现更优。从同一播期覆盖对枯萎病防治作用的效果看，虽然覆盖处理发病始期较早，病害初期相对重，但病害发展停止早；而露地（对照）虽发病始期较晚，初期病情相对较轻，但以后病势增长快，最后病情明显增高。覆盖棉田发病始期为5月11日，6月5日达到盛期；而未覆盖棉田发病始期为5月13日，6月10日达到盛期。覆盖棉田病指为63.44，未覆盖田为85.63，前者比后者减少22.19，相对防治效果为25.91%。地点品种处理发病率（%）病指死苗率（%）相对防治效果（%）永济南苏晋棉4号覆盖42.6337.5325.0434.28不覆盖61.8157.1145.22—永济白坊岱字棉16覆盖29.6424.1413.0323.68不覆盖38.0231.6316.62—襄汾文臣盖棉1号覆盖22.9918.309.4829.23不覆盖31.6325.8614.39—平遥丰依黑山棉覆盖7.015.392.8752.68不覆盖14.8711.394.99—表6-2 山西省枯萎病情多点对比试验结果播期（日/月）处理发病率（%）病指死苗率（%）相对防治效果（%）27/3覆盖35.0928.2516.3534.20露地50.0842.9326.92—5/4覆盖26.1720.429.5535.48露地38.9631.6518.72—15/4覆盖42.5734.7118.2113.29露地48.1640.0326.47—表6-3 不同播期枯萎病情统计在长江流域棉区，李经仪等（1983）报道，覆盖棉田土壤中的枯萎菌量较露地明显减少。其原因，一是棉田覆盖地膜后，土温高，湿度大，有利于土壤中病菌的萌发和侵染，所以，覆盖棉花发病早、初期程度重。二是覆盖栽培改善了土壤环境及棉株的光热效应，棉花长势健壮，生育进程加快，增强了寄主的抗病力，延缓了发病速度，减少了感病机会。三是枯萎病菌最高致死临界温度40℃，而覆盖棉田封垄前5cm和10cm地温均低于这一临界温度，说明覆盖棉田枯萎病菌量减少，与高温消毒作用关系不大，而可能与覆盖环境不利于病菌增殖有关。四是覆盖田枯萎病减轻，还可能与覆盖田苗期不中耕断根、从而减少了病菌侵染机会有关。贺忠秀等（1994）试验结果表明，抗病品种川73-27盖膜与否5月下旬发病率与病指随气温升高而逐渐增加，至7月10日，盖膜的发病率与病指达到最高值，分别为92.9%与28.4；不盖膜的为98.7%与43.3。差异分别达显著与极显著水平。到7月中旬后，由于连晴高湿干旱，发病率与病指迅速下降，但盖膜与不盖膜之间的差异仍达显著水平。在生长前期，盖膜的植株发病率与病指稍高，但与不盖膜的差异不显著。到6月下旬，不盖膜的发病率与病指高于盖膜处理，差异达显著水平。感病品种洞庭1号的发病动态与抗病品种川73-27的相似。盖膜与不盖膜处理，7月10日的发病率与病指皆达显著水平（表6-4）。日期（日/月）盖膜不盖膜发病率（%）病指发病率（%）病指川7327洞庭1号川7327洞庭1号川7327洞庭1号川7327洞庭1号23/517.921.24.55.314.016.03.54.02/612.819.93.25.010.312.22.73.011/67.721.81.95.97.118.62.15.420/620.538.55.110.117.343.64.612.9*30/657.776.914.922.681.085.322.628.710/792.4*97.428.4*38.5*98.3*100.043.3*50.1*20/756.487.214.122.675.693.619.928.225/717.9*28.24.5*7.136.5*42.39.1*12.2表6-4 棉枯萎病发病情况在新疆吐鲁番棉区，张升等（2000）研究结果指出，1998年铺膜的小区播种期与大田相同，于4月8日播种，不铺膜的于4月15日播种，铺膜能明显增温保墒，因此，铺膜棉花播种早，出苗快，棉花枯萎病发病时间相对较早，为害程度相对较重，铺膜的棉株4月12日出苗，4月19日发病；不铺膜的棉株4月25日出苗，5月5日发病，铺膜的比不铺膜的提前3天发病，6月5日铺膜棉株发病率为4.6%；不铺膜的为2.4%，前者发病率比后者高2.2个百分点，但到7月初铺膜与不铺膜地温已无太大差异；从发病率看，两者也无太大差异，表明铺膜与不铺膜只在4～6月对植株发病有影响，到7月后对植株发病率已无太大影响，导致最终发病率无明显差异。1999年4月13日，采用铺膜与不铺膜处理同时播种，铺膜提高了。4～5月5～10cm土温，平均为26.33℃，而不铺膜5～10cm土温为24℃，更适宜棉花枯萎病的发生，则造成不铺膜棉花枯萎病发生相对较重，7月6日之前，不铺膜棉花枯萎病发病率较铺膜棉花高3%～10%。两年试验结果表明，从棉花枯萎病发病时间看，铺膜棉花枯萎病发病时间及其为害程度与不铺膜相比差异不明显，在吐鲁番棉区，棉花枯萎病发生严重与否，并不与铺膜或不铺膜呈绝对的相关关系，主要影响因子应该是土壤适宜的温度与湿度，也就是说，采用适宜的播种时间和土壤墒情对减轻苗期棉花枯萎病为害具有重要意义。试验结果同时表明，6月中旬以前铺膜具有明显的增温效应，铺膜后5～10cm土温（18～34℃）比不铺膜的土温（15～32℃）高2～3℃，6月中旬以后，两者土温已无太大差异。不适宜的播种期对棉花生长的为害是严重的，抑制种子萌动、发芽、出苗，即使出苗，抵抗力也降低。所以，要选择适宜的播期，以使种子萌发，保证一播全苗，并使棉苗生长所需要的温、湿、光3要素达到最适条件，为棉花整个生长发育打下一个良好的基础。对营养钵育苗移栽的棉花而言，适宜的苗龄与移栽期可起到抗（避）枯萎病的作用。据沈万陆等（1995）观察，6月7日移栽的棉苗，移栽时苗龄为1叶和1叶的在6月29日发病，苗龄为3叶和4叶的在7月2日发病，5叶以上的移栽时苗龄为5叶、6叶、7叶、8叶均在7月5日发病，但不同栽移苗龄的发病高峰期均在7月10日前后，7月16日以后基本上不再有棉苗发病。6月24日移栽的棉苗发病期、发病高峰期与6月7日移栽的基本一致。表明移栽时棉苗真叶越少，发病越早。适当推迟移栽期（叶龄大些）就能缩短发病期。移栽时棉苗不同叶龄之间的枯萎病病指存在极显著差异。苗龄1～4叶移栽的发病程度重于5～8叶移栽的，以真叶6～7叶移栽的棉苗发病最轻，但与5叶棉苗移栽之间无显著差异。说明棉苗5～7叶移栽，既可降低发病率，亦能显著减轻发病程度（表6-5）。移栽时苗龄病指差异显著性5%1%一叶7.71aA二叶7.40aA表6-5 不同苗龄病指的多重比较（SSR法）移栽时苗龄病指差异显著性5%1%三叶6.25aA四叶5.78dAB五叶2.91bBC六叶2.27bC七叶1.91bC八叶1.25bC表6-5 不同苗龄病指的多重比较（SSR法）（续）-1合理密植，是指棉花既能有效地利用地力，又能有效地利用光能，减少棉田湿度和株间的郁闭程度，保持一个通风透光的良好的环境条件，这对防治棉花病害至关重要。在新疆棉区，稀植是指棉田每亩株数约为5000株，密植约为150 00株。5～6月稀植与密植处理棉花枯萎病发病发生率差异不显著，7月初以后，稀植棉花枯萎病发病率较密植处理相对较高（张升等，2000）。

对于枯萎病的致病机理，历来有不同的解释。其中，Melhus（1924）、Waggoner等（1954）提出堵塞说，认为棉株感病后导管被堵塞，水分不能向上移动之故。而Fahmy（1923）、Schaffnit等（1932）和Elpidina等（1935）认为，病菌对棉株产生有毒物质，并沿植株上行液流，流至各部，使原生膜透性、碳氮代谢、呼吸作用受损，各种酶系统均受影响，提出毒素说。Bishop（1983）研究发现，在适宜条件下接种枯萎菌孢子24～96h后就能发生侵染，孢子萌发后，菌丝体在根表大量生长，主要从根尖分生区和伸长区侵入，很少侵入根冠、根毛。在茎尖的成熟区以上，由于组织发育成熟，病菌难以通过内皮层而进入维管束内。病菌主要是在成熟区之前或在寄主伤根时进入维管束。黄建成（1990）从植物解剖学研究了枯萎病菌入侵途径、病菌与各器官结构的关系之后提出，菌丝的侵入主要在苗期感染下胚轴及其根系，亦可见于子叶，在根、茎中菌丝主要定殖于最初形成的次生木质部。枯萎病菌在棉苗不同生育阶段的侵入途径是不同的。无菌培养的结果，病菌可在棉株任何部位侵入，但主要在下胚轴部位，在温室培养的棉株，常在土面以下5～10mm的下胚轴，此部位因受土壤温湿度、苗株与土壤摩擦等因素的影响，容易受损，使菌丝较易在此部位侵入。下胚轴及根部的侵入。当菌丝接触下胚轴及其根系，常从破损的表皮细胞入侵滋生，并沿破损部位进入皮层，若菌丝比较多，也可从表皮细胞直接进入，表皮细胞无明显病变，菌丝进入皮层后，能在细胞内及细胞间生长，入侵的方法是径向的，菌丝常有粗、细的差异，粗的直径约为3.4μm，细的约为2.8μm，当菌丝进入中柱时，似乎不受内皮层的阻碍，若在下胚轴部位，菌丝沿着两个维管束之间的薄壁细胞到达髓部，然后向维管束的薄壁组织扩散，进入较大的孔纹及网纹导管，菌丝一旦进入维管组织的木质部，大体上就限制在较大的导管内，并向上扩展，以菌丝或分生孢子的形式，进入茎部。子叶部位的侵入。从接种病菌后的幼苗，菌丝入侵子叶，当初菌丝先在表皮上滋生，细胞变褐，部分溃烂，并扩展到邻近细胞，其后细胞胶状破毁，菌丝沿破壁毁处，深入叶肉，菌丝可从细胞间及细胞内穿过。受侵染的叶片厚度变薄，与正常叶比较，约减少102μm。根内的感染。从幼根的横切面看，菌丝可在表皮、皮层、维管组织中的薄壁组织中发现，并呈向心径向侵入，具有次生结构的根中，菌丝常限制在最初形成的次生木质部的导管中，它的纵向扩展则沿导管上升或下移，径向扩展是通过木质部射线细胞引伸。从老根的横切面看，木质部射线感病尤为严重，其壁黑褐色，离心引伸，放射状排列，壁加厚，有时具有菌丝。与射线邻近的薄壁细胞及导管，常先感病。从老根纵切面看，菌丝多集中在导管内，呈分枝状，引伸方向大致与导管主轴平行，菌丝可由一个导管经过纹孔进入另一导管，有时可看到分生孢子的存在，个别导管可看见胶状物和侵填体，呈黄褐色，有时附在导管内壁上，侵填体呈囊状，在一个导管中往往数量较多，个别有可能堵塞。茎内的感染。菌丝从根部侵入后，寄生在根部的导管及其邻近细胞内，随着导管向上输水，菌丝可向上、向下延伸，分生孢子也随水分上升而入侵茎、枝条、叶柄，并在这些部位的导管及其邻近细胞中萌发滋长。最初感染枯萎病的棉株，一般在茎秆外部形态上无特殊表现，稍后的生长，其节间比正常的缩短。从横断面可看到靠近髓部的木质部变黑褐色，若感染黄萎病，则可扩展到整个木质部，这是区别黄萎病及枯萎病的方法之一。在现蕾期前后，进行病株茎的解剖，其菌丝的定殖部位，与根基本相同，即定殖于最初形成的次生木质部中，并有大量的孢子及菌丝存在，有些孢子在导管及其邻近的细胞内萌发，初期即可见菌丝从一个细胞伸入另一细胞。菌丝是不断向邻近细胞入侵，木质部的射线细胞往往感病严重，并存有孢子，可能与其横向感染有关。叶的感染。棉花枯萎病在子叶期即表现病状，可分为黄色网纹型、紫红型、黄化型和急性青枯型，但以黄化型为基本性状，表现为叶子黄色兼有大块变色枯焦斑，最后叶子脱落。苗期从一些叶的横切片中，可看到一些菌丝在栅栏组织及海绵组织中滋长，可在细胞内或细胞间穿行，具有菌丝的细胞，叶绿体相对减少，壁加厚，表皮细胞也受损。后来在该部位呈黄色网纹状及大块枯焦斑。入秋后叶的横切面观察，叶柄的维管束可呈现黑色，细胞壁加厚，导管中可看见菌丝的存在，但不普遍，如具菌丝，多为扭曲或分枝状。当枯萎病菌侵入棉株体内后，因菌丝及孢子的大量繁殖而堵塞了棉株的导管；或者刺激邻近的薄壁细胞产生凝胶体和树胶等胶状物质或侵填体（tylose）而填塞导管；也可能是病菌入侵后，产生果胶酶，使棉株细胞中的胶状物质和细胞壁中的果胶物质被水解，引起组织解体而堵塞导管。导管被堵塞后，机械地阻碍了水分和养分在棉株体内的正常运输，加上地上部的蒸腾作用和呼吸作用旺盛，使水分失去平衡而导致棉株萎蔫。袁红旭等（2002）观察到接种枯萎病菌后棉苗病株茎内大小导管内有数目不等的菌丝体。少的每个导管内1～2根菌丝体，多的可充满整个导管。病菌菌丝多沿导管纵向生长，也能看到菌丝穿过导管壁横向生长进入薄壁细胞或其他导管，导管周围的薄壁细胞中同样存在菌丝，但韧皮部中未发现菌丝体。被侵染的导管数目依发病情况变化而变化，发病严重的感病品种显著高于抗病品种。受侵导管及周围薄壁细胞常发生褐变，这种现象在导管有大量菌丝时很常见，但也能观察到变褐的维管束中并没有菌丝的现象。在病害发展的早期没有明显的褐变现象，只有在病害进一步发展、植株有明显的症状出现时，褐变才大量出现。引起褐变的物质不仅横向扩展而且可随导管汁液纵向扩展。发病棉苗茎部产生填充物充塞导管，这种现象所有品种都存在，未接种的对照中没有观察到填充物。填充物有两种类型：一种为球状物；另一种为胶状物，用酸性品红染色时胶状物为橘红色，球状物为鲜红色；用番红染色时胶状物为鲜红色，而球状物为淡红色；用苏丹Ⅲ染色胶状物为橘红色，球状物无色；用10%三氯化铁染色，两种侵填物均不显色。由此可见，两种侵填物成分不同，但都不是单宁类物质，胶状物可能是脂类。此外，病菌粗毒素诱导的棉苗维管束褐变和导管堵塞现象与发病植株维管束的变化情况基本相同。堵塞导管的填充物也有两种类型：球状和胶状。两种填充物对染料的颜色反应与发病植株中的两种填充物相同。毒素处理后，处理根苗叶柄也存在维管束褐变和导管堵塞反应，而且发生较茎部为早。但试验观测到病株内由菌丝及填充物堵塞的导管仅是一小部分，即使是发病严重的植株被堵塞的导管也只是总导管的1/10。黄建成（1990）的研究结果指出，在现蕾前期调查统计感枯萎病植株维管束的1879个导管中，含菌丝有104个，在此范围内，其他细胞具菌丝可达40个，但有些材料的其他细胞，不含菌丝，具有感病性状。感病的导管和其他细胞的壁均变黑、加厚，其厚度为5.67～8.5μm，而正常壁的厚度为3.4～5.6μm，仅增厚约在3.5μm；具侵填体的导管数占总导管数的0.68%，其比例较小，在未观察的材料略有增加，但增幅不大。这说明单纯的导管堵塞论并不能完全解释病株萎蔫过程。早在1954年，Waggoner的研究报告指出，木质部导管堵塞可以引起水分运输障碍，但并不能完全切断水分流动，使棉株对水分输导功能全部丧失。Talboys（1964）指出，正常的木质部导管的潜在输水能力已远远超过棉株的总需水量，如果把茎部维管柱切去1/2，植株并不萎蔫。尽管如此，导管的堵塞总要在一定程度上影响到水分的输导。不少病原菌能产生可以扩散和转移的、对植物有毒的活性化合物，而导致对某些植物的病害。不少学者认为，棉花枯萎病菌入侵棉株后，引起导管的阻塞，只是导致棉株萎蔫的部分原因。更重要的是棉株体内产生某些有毒物质，使寄主细胞中毒死亡。病原菌对寄主产生有毒物质，早在19世纪末便有人提出。其后，进行了广泛的研究，并取得了较大的进展。在棉花方面，Brand早在1919便指出，棉株枯萎性状的发生，除导管堵塞外，还可能由于植物组织中毒。据国内外报道，当枯萎病菌侵染棉株后，分泌出对寄主有毒的物质，主要有类萜、酚类、糖甙及其衍生物。有的病原菌能分泌出多种的多糖水解酶，不仅可使寄主细胞壁降解，细胞分离，菌丝得以乘机而入；而且使寄主根部受伤，吸水力下降。有的病原菌可分泌出两种水解酶——蛋白酶和酯酶，它们可分解寄主细胞的膜蛋白和膜脂类物质，使细胞膜透性增大，散失水分加快，而引起萎蔫。棉花枯萎病菌的致病毒素是由枯萎病菌产生的镰孢菌酸（Fusaric acid，FA），又称萎蔫酸。它是一种非特异性的活体毒素（Vivotoxin），其学名为5-丁基吡啶-2羧酸（5-N-butylpiocolinic acid）（Keen，1972）。由于它的毒害作用，使寄主的保卫系统受到破坏，因而感病棉株的叶片出现网纹、皱缩或枯死；细胞原生质对水分的溶透性以及整个棉株的水分平衡受到破坏；多酚氧化物被抑制，从而产生明显的病理变化。Ganmann（1958）认为，萎蔫素一方面降低了细胞的保水能力，造成棉株失水；另一方面也破坏了原生质膜的渗透性，损坏了植株细胞膜的功能。仇元等（1963）发现，用枯萎病菌的培养滤液处理棉苗可以导致萎蔫。张献龙等（1993）将鄂棉14品种的3～4叶期切根苗插入盛有不同培养天数获得的毒素液中，以水和理查液处理为对照；进行室内观察。3天后，仅培养30天及40天获得的毒素液使幼苗萎蔫，其他处理（10天、15天、20天、25天）轻度萎蔫，培养5天的病菌产生的毒素液及两对照处理下的幼苗无萎蔫迹象。5天后，各毒素处理均使幼苗完全干枯，仅理查液和水处理下的幼苗叶片仍保持正常，这说明，毒素液确对幼苗有严重致萎作用，且随着病菌培养天数增加，其滤液的毒性增强。吴小月等（1993）也有类似的报道。他们用不同浓度枯萎病菌毒素提取液浸苗，稀释到1/4浓度的提取液对不同抗病品种致萎作用差异最明显。在这一浓度下，浸苗当天各品种均未出现萎蔫现象；第二天感病品种徐州1818开始出现轻度萎蔫；第三天感病品种萎蔫率达到最大，为94.4%，而3个抗病品种萎蔫率均只有5.6%；第四、第五天不同抗病品种间萎蔫率仍差异显著；第六天3个感病品种全部萎蔫，而抗病品种最大萎蔫率仅38.9%。由此可见，棉花品种的抗病力不同，棉苗对病菌毒素提取液的萎蔫反应也不一样。王贺祥等（1988）的研究发现，陆地棉不同品种对FA的抗性与它们在生产中表现出的对枯萎病的抗性相一致，证明FA是枯萎菌导致棉花萎蔫的重要致病因子。李成葆等（1990）用不同浓度的单一镰孢菌酸纯品处理具有不同抗性的棉花品种的种子后发现，感病品种鄂荆92和冀棉11号对镰孢菌酸很敏感，棉籽的萌发率、百苗鲜重都降低，棉苗萎蔫率、电导率增加，气孔阻力增高，蒸腾速率下降。而感病品种中棉12号和中5173对镰孢菌酸的敏感性差。所以，他们认为，当棉株根系吸收的镰孢菌酸运输到叶片后，具有半透性的原生质膜被破坏，叶片蒸腾所失水分大于根系所吸收的水分，破坏了体内的水分平衡，而导致棉株萎蔫。品种对FA的抗性与它在田间抗病性的表现呈正相关。易海艳等（2011）采用不同浓度的枯萎病原菌培养滤液对幼苗进行1h浸泡培养，结果表明，无论是新陆早16号不同抗感品系或新海21号不同抗感品系，病原菌培养滤液浓度不同、处理后时间不同，其病指均不同；随着处理后时间的延长和处理浓度的增加，病指大都呈增加趋势。而且在同一浓度下同一品种的抗感品系病指也存在较大的差异，均表现为在同一浓度下，其抗病转化品系的病指比原感病品种明显降低，且在100%浓度下棉花的抗感品种都呈现严重的萎蔫症状，而对照在观察期内始终不表现任何症状（表3-1）。品系镰刀菌酸培养滤液（%）处理后36h处理后72h处理后108h发病率（%）病指发病率（%）病指发病率（%）病指抗感抗感抗感抗感抗感抗感新陆早16号2531.641.77.914.610.525.02.610.410.533.36.618.85081.8100.031.845.891.7100.061.768.6100.0100.065.979.6100100.0100.039.670.8100.0100.072.975.0100.0100.095.8100.00（ck）0.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.0新海21号258.333.32.116.78.348.32.125.016.751.74.225.05081.890.022.737.5100.0100.047.760.0100.0100.047.779.6100.075.0100.027.152.1100.0100.070.875.0100.0100.091.7100.00（ck）0.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.0表3-1 病原菌培养滤液对新陆早16号和新海21号不同抗感品系的致萎作用镰孢菌酸除可增加植物细胞电解质的渗漏、改变细胞壁的透性外，还能和铁、铜、锰等金属离子螯合，造成植物对可被利用元素的缺乏（Wood，1972；Wilson等，1978；Barna等，1983）。也有的研究表明，镰孢菌酸还能降低光合作用效率，抑制琥珀酸氧化酶及线粒体中细胞色素氧化酶，破坏植物体中的碳、氮代谢等。所以，不少学者认为，枯萎病菌产生的镰孢菌酸的数量和致病力的强弱呈正相关。Chakrabarti（1979）用一个致病力强的菌株和一个致病力中等的菌株进行比较时发现，致病力强的菌株所产生的镰孢菌酸比致病力中等的菌株所产生的镰孢菌酸多2倍。当然，也有学者认为，病原菌致病力的强弱与各菌种产生的镰孢菌酸的数量没有直接关系。王贺祥（1984）用来自全国各地主产棉区的30个枯萎镰孢菌株分析指出，各菌株所产生的镰孢菌酸的数量，没有规律性；各生理型与镰孢菌酸的产量间也无相关性。枯萎病菌分泌的酶类是否参与萎蔫病害的致病过程，多年来一直存在争论。Kumar等（1979）对棉花枯萎病菌在体外及接种后棉花植株中各种果胶酶的变化做了研究发现，病菌毒力与所产生的endo-PG（内切多聚半乳糖醛酸酶）量有相关性，无毒力菌株体外培养时和未接种的健康棉花植株内都不含有endo-PG。Suresh等（1984）从棉花枯萎菌中提纯endo-PG，发现cndo-PG有3种同工酶，这3种同工酶之间在等电点和分子量上有差异，且3种同工酶之间诱导萎蔫的能力不同，共同作用可以造成100%萎蔫，及下胚轴壁的黑褐化。Endo-PG参与致萎的一些机理已有一些研究，Cooper等（1980）认为，病菌侵染时分泌的endo-PG降解寄主细胞壁并从纹孔膜处产生果胶胶体，这些胶体物堵塞了受侵染的木质部导管，使水分的上升运动受阻，从而使植株发生萎蔫。为进一步肯定或否定endo-PG对棉花枯萎致病的作用，郜会荣（1990）利用紫外诱变方法获得了枯萎病的内切多聚半乳糖醛酸酶（Endo-PG）的缺失突变株（PGmⅠ为endo-PG完全缺陷菌株，而PGmⅡ菌株还有微量的endo-PG产生，但它们和母菌株相比差别是十分显著的），用突变株和野生菌株接种棉苗，发现突变株的致萎能力远远低于野生菌株。两周棉苗用母菌株接种时，快速萎蔫的棉苗可达26%～70%，用PGmⅠ接种的只有2%～4%，用母菌株接种，两天根表就满布菌丝，根表变褐色，根下部的维管束以外的组织发生软化烂掉，这种严重损伤的根可达40%～100%；PGmⅠ接种的棉苗，2～3天后根部也能布满菌丝，但根表变褐且颜色浅，3～4天后即有大量新的不定根长出，这些新发出的白色新根，发生软化和腐烂的根仅占6%～10%；PGmⅡ接种后，棉苗根部变化与PGmⅠ接种的相似，但发生软化或腐烂的比例较高，达10%～20%。在测定的病指方面，PGmⅠ接种后的病指高于PGmⅡ接种的，但这种差异在统计学分析上并不显著，而这两个突变菌株的病指都显著低于母菌株（表3-2）。可以看出，突变菌株PGmⅠ产生endo-PG能力完全丧失，致病力也大大降低；PGmⅡ菌株虽有微弱的endo-PG活力，而这种微弱的endo-PG活性可能在一定程度上对病菌的致病过程起一定作用，但这微弱的酶活性却不足以使菌株像母菌株接种那样达到高的病指。说明endo-PG参与了枯萎病菌的致病过程。Endo-PG主要通过降解植物细胞壁的果胶聚合物，使果胶胶体物质堵塞导管，影响棉株的水分运输，造成萎蔫。棉花枯萎菌的致病过程是酶和毒素协同作用的结果。菌株病指重复A重复B平均病指差异显著性*母菌株53.656.054.8aPGmⅡ22.419.621.0bPGmⅠ8.816.012.4bc表3-2 各菌株接种棉苗一个月后病指的比较由于寄主与病原菌之间的关系极为复杂，综合因素构成了棉花的凋萎。水分运输被阻塞或枯萎病原菌产生某种毒素可能只是导致棉株萎蔫的主要原因，有些因素的作用尚有待于进一步研究证实。棉花对枯萎病菌的抗性是一个非常复杂的系统性问题。它涉及寄主（棉花）、病原菌、环境以及它们各自内部的生理代谢变化和相互作用。就寄主来讲，其抗病性可以分为组织结构抗性、生理生化抗性和生态抗性3个方面。但这3个方面的抗性又都可以归结到抗病基因上，即无论是组织结构抗性还是生理生化抗性和生态抗性都是由寄主的抗病基因所决定的。组织结构抗性是以物理的屏障阻止病菌的侵入和扩展。生化抗性是以植株体内所固有的或受到病菌侵染后新合成的抗生性化学物质对病菌的抑制作用。生态抗病性是指棉花根系所处土壤环境中，微生物和棉花根系分泌物对枯萎病菌侵染的影响。这3种类型的抗病性综合起来就决定了棉花是抗病的、耐病的、还是感病的。寄主植株的器官组织结构在抗病性中的作用占有重要的位置。若根、茎表皮细胞厚，根、茎木质部结构坚实，导管腔、木质纤维素腔直径较大，并且有多列髓和较厚细胞壁的棉花品种，均不利于枯萎病菌的侵入。所有品种的根、茎结构都是相同的，均具有初生保护组织的表皮，形状较大。排列较紧密，位于表皮与中柱之间的皮层，由维管束和髓、髓射线组织构成的中柱组织。由于棉花枯萎病系维管束病害，因此，与维管束、髓射线所存在的结构空间或关系密切。解剖测定已经明确，品种抗病性与维管束组织结构有直接关系。前苏联的一些学者研究认为，抗病品种基部具有坚实的木质部和含有大量淀粉贮藏物的多列髓射线，同时木质部的细胞间隙较小，细胞壁较厚。Bugbee（1970）的研究也认为，抗性品系的木质部导管比感病品系形成的多。对髓射线的研究各学者的意见较统一，即髓射线越多抗萎蔫病越强。这是因为在髓射线细胞中有一类称为类黄酮贮藏细胞（Flavarol-storing cell）的特殊细胞，这些细胞散布在髓线中，能阻止菌丝在各导管之间的扩展（Mace等，1981）。王正芬（1984）报道，棉花在6～7片真叶期，枯萎病的病指与茎导管细胞数之间有较强的正相关性。但对3～4片真叶期幼苗的研究却表明，病指与导管细胞数量的相关性很差。贺运春（1984）观察到棉株导管中的枯萎病菌菌丝壁由胞壁和胞膜两层组成，其厚度分别为0.14μm和0.10μm。枯萎病菌菌丝沿寄主导管壁生长时，菌丝细胞壁与导管壁紧密接触，在接触的菌丝细胞壁上产生顶端膨大、扁平、基部粗壮、不具有细胞壁的吸胞，并伸入寄主导管壁内。在菌丝的同一部位有时可以产生并排的两个相同的吸泡。在产生吸泡的菌丝部位，菌丝细胞加厚，厚度可达0.22μm。棉株导管中的枯萎菌丝无色，有分隔和分枝，并着生有小型分生孢子，但未见大型分生孢子及厚垣孢子。Shi等（1992）利用组织化学方法，检测了继发性受阻导管和相邻不受阻导管的交联细胞的超微结构后发现，表现出细胞质成分及活性的增加，接触细胞能够产生脂类物质及其他化合物，所形成的分泌物通过纹孔进入导管。分泌物覆盖导管壁，并且以变态物形式沉积在导管腔，无定形泡状结构聚合在一起，形状、大小不一，导管逐渐被分泌物所包埋覆盖，累积的分泌物完全堵塞了导管腔。在抗病品种中，随着导管腔的分泌物积累以及管壁的增厚，被膜更集中，抗病品种中接触细胞中这种更集中的分泌物活性导致了屏障的形成，从而阻止了导管内病菌的扩展。雷江荣等（2010）利用农杆菌介导法将克隆自拟南芥的抗病基因SNC 1转入棉花中，接种棉花枯萎病菌后，和非转基因棉相比，转基因棉的抗病性得到提高，是非转基因棉的2倍左右。通过石蜡切片技术研究发现，具有抗病性的转SNC 1基因棉花和非转基因棉花均有导管堵塞现象，即形成胼胝体和侵填体等物质，只是转基因棉花的堵塞程度较严重，并且转基因棉花韧皮部细胞排列整齐，细胞间隙小。另外，受体抗病品种“中35”和受体感病品种“军棉1号”相比，它发生茎导管堵塞现象也多于感病品种。表明在棉花枯萎病菌侵染和其代谢物刺激下抗病品种堵塞导管的能力强，是品种抗病机制之一（图3-1，图3-2）。图3-1 棉株根茎木质部石蜡横向切片（胼胝质）图3-2 棉株根茎木质部导管石蜡切片（×255）（侵填体）维管束组织以外的细胞与抗枯萎病性也有一定的关系。史金瑞（1986）对枯萎病抗、感棉花品种根部早期侵染的组织和细胞进行观察发现，侵染菌丝在高抗的亚洲棉品种（石系亚）上局限在表皮细胞及外围1～2层皮层细胞中，而陆地棉中植86-1（抗）、徐州142（感）和高感的海岛棉品种中，菌丝能在皮层中扩展，并能进入中柱。研究中还发现，亚洲棉石系亚的根部表皮层外有一层物质，在菌丝与表皮细胞接触处这层物质被消解之后才能进行侵染，而在其他几个供试的陆地棉、海岛棉中则无此现象。石系亚对棉枯萎病表现较强的抗病性，可能与其表皮层外这层物质有关。棉花抗枯萎病的生理生化机制是个比较复杂的问题，枯萎病菌侵染棉花后，棉株体内的生化物质和生理代谢均会发生变化，反映了棉株抗、感病性的内在原因。抗病性是植物的遗传潜能，其表现受寄主与病原的相互作用和环境条件的共同影响。根据“基因对基因”假说，植物抗病性是植物本身所具有的抗性基因（Resistance Genes）和与之相对应的侵染病原物所具有的无毒基因（Avirulencegenes）结合时所表现出来的（Hammond等，1997）。不同的植株对同一病原物，同一植株对不同种的病原物可具有不同的抗病性（鲁明波等，1998；Heath，2000）。因此，植物不同的抗病性反映在植物生理上就表现出一系列复杂的生理生化变化，包括植物细胞内活性氧的积累与清除、抗病信号的产生与转导、防卫反应的表达与调控等。在这一复杂过程中，一些相关酶类起着很重要的调控作用，如超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD），过氧化氢酶（Catalase，CAT）和过氧化物酶（Peroxidase，POD）等。许多研究都表明，植物病害的发生与这些酶活性变化有着密切关系，并且非亲和性互作（抗病反应）和亲和性互作（感病反应）两者在SOD等酶活性变化方面有着显著不同。近年来研究发现，植物受到病原物侵染后，与抗病性有关的一些主动防卫反应，包括细胞过敏性坏死、植保素、酚类、醌类物质等次生产物的合成、寄主细胞壁的加强和修饰（如木质素的积累）等。寄主的主动防卫反应常与苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine Ammonialyas，PAL）、多酚氧化酶（Polyphenoloxidas，PPO）及POD活性密切相关。（1）活性氧清除酶类近十几年来，活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）因在生物体内广泛存在并具有多种生理功能而引起人们的极大关注。通常所指的ROS仅指氧自由基，如超氧阴离子（O-2）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（·OH）等。ROS通常被认为是植物正常代谢过程中的有毒副产物，随着对其研究的深入，发现其在植物与病原物互作的防卫反应中具有重要作用。首先，ROS具有直接的抗微生物功能，其存在本身就可对病原菌造成伤害；其次，ROS还可以触发植物受侵染点的细胞死亡导致过敏性坏死反应（HR）；再次，ROS还参与细胞壁木质化及富含羟脯酸的糖蛋白的交联，这有利于抵御病原菌侵染；另外，ROS很可能作为第二信使调控抗病相关基因的表达，并启动植物抗毒素合成基因的转录。但是，当植物体内ROS积累过多，就是ROS与其清除酶类之间的动态平衡被打破时，植物就会受到伤害（膜脂过氧化和膜差别透性丧失）。因此，植物在长期的进化过程中，在利用氧的同时也形成了一系列清除活性氧为害的机制，这些机制中有些是通过酶促反应实现的，有些则是由非酶物质如抗坏血酸、维生素E、β-胡萝卜素等来实现的。为了早日弄清植物的抗病机制，许多病理学家就活性氧清除酶活性的变化与植物抗病性之间的关系进行了大量的研究，但目前仍未得到一致结论。不过，研究不同抗病品种感病后棉花体内的防御酶活性变化，有利于探明棉花抗病性机制。①POD 过氧化物酶（POD）及其同工酶在植物机体防御体系中起重要作用。POD不仅参与了木质素的聚合过程，也是细胞内重要的内源活性氧清除剂，因此，POD活性与植物抗病性有着密切的关系。目前，植物抗感病品种POD活性变化与抗病性间的关系观点不一。一种观点认为，植物感病后，抗感品种POD活性均升高，并且抗病品种POD活性比感病品种增加幅度快。Joseph等（1998）的研究结果表明，抗病品种的POD活性较感病品种高，而且在病原菌侵染的早期阶段，其POD活性会迅速升高，从而限制了病原菌的扩展。在棉花上沈其益等（1978）报道，POD与棉花对枯萎病的抗性有关。田秀明等（1991）的研究结果表明，在人工接种枯萎菌后，抗病品种和感病品种POD的活性都显著加强，但感病品种POD同工酶的反应比抗病品种强烈得多，而且感病品种比抗病品种多1～2条酶带，且颜色较深。无论是抗病品种还是感病品种，单株病指越高，POD同工酶带数越多，颜色也越深。从海岛棉、亚洲棉和陆地棉三大棉种接菌后POD同工酶谱来看，也同样有以上趋势。胡小月等（1993）指出，苗、蕾期，在未感病的情况下，抗、感病品种间POD酶带无显著差异；在感病情况下，蕾期不同抗性品种POD酶带数均增加，而且酶带颜色加深，说明病害发生后，抗、感品种酶活性均加强，植株体内代谢旺盛，但不同品种间POD酶带存在差异。在健株中，供试品种均具有P5、P6、P7、P8、P9、P11 6条酶带，感病后抗病品种增加P1、P2、P3、P4、P10、P12、P13 7条酶带，比感病品种鄂荆1号增加4条（图3-3）。不同抗枯萎病类型品种和同一品种内感病株和健株POD活性变化不尽一致（图3-4）。由图3-4可以看出，同一品种（系）内感病株和健株比较，健株叶片内POD的变化幅度很小（差值6个单位），曲线变化比较平稳，而感病株POD变化幅度较大（差值69个单位），曲线表现陡直。对于不同抗病类型的品种（系）来看，感病品种叶片内POD活性的变化幅度最大（差值64个单位），耐病品种次之（差值45个单位），抗病品种变幅最小（差值5个单位）。由此说明，品种的抗病性能越差，过氧化物酶活性的变化幅度也越大。抗病基因SNC 1来自拟南芥。雷江荣等（2010）应用农杆菌介导法将SNC 1基因转入中35和军棉1号两个品种，通过选择鉴定育成转基因棉中35和军棉1号。对转基因中35和军棉1号及其相应授体品种（对照）接种枯萎病菌后，转入SNC 1基因的中35，POD酶活性呈逐渐增强的趋势，明显高于对照中35，并且在接菌第4天达到峰值，由14.706U/（mg·min）迅速增加至76.18U/（mg·min），是对照7.234 U/（mg·min）的10倍多，而后随着时间增加酶活性下降。而转基因军棉1号同样在接菌第4天达到峰值，其POD酶活性变化趋势与转基因中35相同，但仅接菌当天酶活性高于对照军棉1号，随后低于对照军棉1号，并且酶活性变化不大（图3-5）。图3-3 不同抗性品种间健株与病株蕾期叶片POD酶带图3-4 同一品种感病株和健株POD活性变化（李妙等，1995）图3-5 棉株叶片接菌后过氧化物酶活性测定分析POD广泛存在于植物体内的不同细胞定位，这些不同细胞定位的POD在植物抗病性中可能有不同的作用。有研究表明，受病原菌侵染或诱发物处理后，可导致植物叶片细胞间隙POD活性的增加，且与植物抗病性抗性有关。细胞壁中存在着丰富的POD，有人观察到在经诱发处理并产生有系统诱导抗性的植物叶片中结合于细胞壁上的POD活性明显上升，这些POD参与木质素在细胞壁上的沉积，从而与系统诱导抗性的产生相关。（Hammerschmidt等，1982；Ye等，1990）。宋凤鸣等（1997）观察到接种枯萎病菌后第8天的棉苗叶片和根茎部组织中的总可溶性POD、胞内POD和细胞间隙POD活性（表3-3）。由表3-3可知，未接种病菌的棉苗组织中3类可溶性POD活性抗病品种均高于感病品种，但根茎部组织中的总可溶性POD和胞内POD活性差异不明显；枯萎病菌侵染后，3类可溶性POD活性均有明显的提高，其中，胞间POD活性增加最大。这说明POD在棉花对枯萎病的抗病性中起到重要作用。品种处理过氧化物酶活性[△OD179/（mgpro·min）]叶片组织根茎组织总POD胞内POD胞间POD总POD胞内POD胞间POD中棉所12（抗病）不接种30.8121.3125.008.697.4818.47接种70.1332.14145.0038.0321.6439.806037（感病）不接种25.2716.3519.707.907.5010.89接种47.4434.6735.0028.2421.2624.26表3-3 枯萎病侵染后棉苗叶和根茎组织中总可溶性POD、胞内POD和细胞间隙POD活性②SOD 超氧化物歧化酶（SOD）是植物细胞内防御酶系统的重要成员之一，它的生理作用是歧化O-2产生H2O2和O2，在植物与病原物互作过程中，植物体内SOD活性发生变化，不同的植物病害系统或不同的互作类型其SOD活性变化是不同的。植物受到病害侵染后，SOD活性会升高，说明病害的侵染产生的O-2会激发植株体内SOD合成酶基因的表达，表现为SOD活性上升。而感病品种的酶活性低于抗病品种可能是因为感病品种受到病原物侵染后积累的O-2过多造成受害植株SOD防御酶体系崩溃，导致SOD活性降低。至于接种后感病品种SOD活性快速上升而高于对照，可能是因为这种高水平的酶活性可以清除植物—病原物亲和性互作产生的超氧阴离子，使感病品种受到病原物侵染后不发生过敏性反应，病原物可以在寄主内扩展，从而表现为感病。在棉花上，吴小月等（1993）报道，超氧化物歧化酶在健株中均仅有3条酶带：P4、P7和P11。感病后，抗、感病品种增加的酶带数均较多，其中，抗病品种酶带数又多于感病品种。酶带P12在抗病品种中颜色较深，而在感病品种鄂荆1号中却难以见到（图3-6）。在棉花发病高峰期，不同抗病类型品种中，感病类型SOD活性最高，耐病品种次之，抗病类型表现最低。这说明SOD活性与品种在田间感病的程度存在着内在相关关系（表3-4）。对SOD活性与田间病指进行相关分析得出，相关系数r=0.9802。图3-6 不同抗病品种间病株和健株蕾期叶片SOD酶带抗病类型品种名称SOD活性[mg/（pro·min）]抗病中棉所1226.65石抗15524.17石30856.99石310423.79邯32212.77平均值18.87耐病冀8913535.13美861531.47美861639.16冀92.6134.66平均值35.11表3-4 不同抗病类型棉花品种（系）的SOD指标比较（李妙等，1995）抗病类型品种名称SOD活性[mg/（pro·min）]感病邯89s9347.43冀92.10363.22选148142.83选155148.35平均值50.46表3-4 不同抗病类型棉花品种（系）的SOD指标比较（李妙等，1995）（续）-1受病原物侵染后植物体内SOD等保护酶活性的变化在亲和性互作引起的感病反应中SOD酶活性升高，且与病害症状的表现有关，但在非亲和性互作引起的抗病反应中，SOD酶活性无明显变化甚至下降。宋凤鸣等（1999）研究结果指出，健康棉苗中，抗病品种和感病品种间SOD酶活性无明显差异，试验期间酶活性无显著变化；枯萎病菌接种后棉苗组织中SOD酶活性明显升高。感病品种6037在接种病菌后3天时SOD酶活性就显著高于对照，此后呈直线上升，而抗病中棉所12的SOD酶活性在接种病菌后7天才开始上升。雷江荣等（2010）报道，转SCN 1抗病基因中35品种接菌后，在病程早期SOD随时间的增长酶活性增高，与棉花枯萎病抗性呈正相关，抗病品种的酶活高于感病品种；SOD在接菌后第2～6天酶活性达到最高值，其酶活性高低以及达到峰值时间的迟早与棉花对枯萎病的抗性密切相关，活性高、峰值到来得早有利于抗病性的充分发挥。植物受病菌侵染后可选择性地刺激SOD同工酶活性的变化，如亲和性锈菌侵染后菜豆组织中Mn-SOD酶活性大幅度增加，而非亲和性锈菌侵染后Cu、Zn-SOD酶活性明显提高（Montalbin等，1986）。受TMV侵染的烟草叶片中SOD酶活性的增加主要来自于Cu，Zn-SOD（Buonario等，1987）。宋凤鸣等（1999）研究的结果证明，枯萎病菌侵染后棉苗组织中POD酶活性的升高主要是由Cu、Zn-SOD活性的增加引起的（表3-5，表3-6）。叶片组织根茎部组织SOD活性[U/（mg·min）]抑制率（%）SOD活性[U/（mg·min）]抑制率（%）酶粗提液75.4080.63KCN0.01mmol/L74.601.0079.431.490.10mmol/L60.6819.5271.9019.950.20mmol/L40.4840.3162.5022.490.50mmol/L15.3779.0242.1747.701.00mmol/L6.2891.0719.4675.87氯仿乙醇（1∶2）70.935.9067.3416.48表3-5 KCN和氯仿对棉花SOD活性的抑制[U/（mg·min）]品种处理叶片组织根茎部组织总SODCu，ZnSODMnSOD总SODCu，ZnSODMnSOD中棉所12（抗病）不接种35.1833.281.9020.0017.202.80接种39.7037.302.992.8322.835.006037（感病）不接种30.8834.272.3124.2220.903.45接种60.8956.674.2850.2743.656.95表3-6 枯萎病菌接种后7天棉苗组织中总SOD，Cu，Zn-SOD和Mn-SON活性③CAT 在多种植物—病原物互作系统中都有H2O2的积累。过氧化氢酶（CAT）是植物细胞内重要的活性氧清除剂，其生理作用是将H2O2还原为H2O和O2。CAT活性升高或H2O2含量降低意味着活性氧对植物细胞伤害程度的降低。还有研究表明，植物体内H2O2可作为扩散的信号或作为在水杨酸（SA）介导的系统获得性抗性（SAR）信号转导过程中的第二信使，诱导邻近细胞或邻近组织防卫机制的启动。因此，维持植物体内H2O2的正常水平将是植物抗病反应所必需的，CAT在活性氧的清除和维持活性氧的正常水平过程中起着重要作用。在植物与病原物互作中，CAT活性发生变化，并影响植株体内活性氧的积累，最终影响到植物的抗病反应。一般地，植物感染病原菌后CAT活性降低，或抗病品种（非亲和性互作）活性降低，而感病品种（亲和性互作）活性升高。在棉花上，宋凤鸣等（1999）报道，健康棉苗中，两个供试品种组织中CAT酶活性无明显差异；接种枯萎病菌后，棉苗组织中CAT酶活性显著增加，与抗病品种中棉所12相比，感病品种6037的CAT酶活性上升早而显著。雷江荣等（2010）的研究结果指出，采用农杆菌介导法将来自拟南芥的抗病基因SNC 1转入中35和军棉1号两品种后，在受到棉花枯萎病菌侵染后，CAT的酶活性变化非常平缓，并呈现逐渐下降的趋势。而对照（受体品种）中35和军棉1号的CAT酶活性变化十分显著，尤其是军棉1号，随接菌后取样天数的增加，CAT酶活性呈逐渐降低的趋势，由14.989 U/（mg·min）迅速下降到0.865U/（mg·min），这期间相差14倍（表3-7和图3-7）。图3-7 棉株叶片接菌后过氧化氢酶活性测定分析第0天第2天第4天第6天第8天转基因中351.167±0.0291.012±0.0250.868±0.0210.663±0.0160.415±0.010转基因军棉1号2.1217±0.0531.835±0.0451.061±0.0260.645±0.0160.407±0.010表3-7 棉株叶片接菌后过氧化氢酶活性测定分析第0天第2天第4天第6天第8天中35对照5.769±0.1444.086±0.1022.188±0.0541.597±0.0390.611±0.015军棉1号对照14.989±0.3749.504±0.2374.820±0.1201.946±0.0480.866±0.021表3-7 棉株叶片接菌后过氧化氢酶活性测定分析（续）-1（2）抗病反应次生代谢酶类植物次生代谢产物（Secondary Metabolites）是指植物体中一大类并非生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常具有种属、器官、组织和生长发育的特异性；抗生作用是植物次生代谢的一个重要生理功能，也可视为自然选择的结果，参与植物防御的次生物质很多，包括酚类、植保素、木质素和其他一些次生代谢物。与这些次生代谢有关的主要酶类是多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）。①PAL PAL是植物苯丙烷类次生代谢途径总路第一步关键酶，是苯丙烷类代谢途径的关键酶和限速酶，它催化苯丙氨酸脱氨基后产生肉桂酸并最终转化为木质素，因此，它是与细胞内木质素生成和沉积有关的防御酶。当病菌入侵时，细胞受到刺激后启动PAL系统产生木质素并沉积在细胞壁周围，将病原物限制在一定的细胞范围内阻止其进一步扩散为害。自从1964年Minamiawkd和Uritain首次发现植物感病后PAL活性增强以来，陆续有许多研究证明植物受到不同病原体感染后PAL活性均有升高的现象。因为PAL活性的升高往往与植保素、木质素等抗性物质的产生和积累呈正相关。王敬之等（1982）提出，把PAL活性作为植物抗病的生理指标加以研究。在棉花上，冯洁等（1990）研究了棉花抗、感品种感染枯萎病后体内PAL的动态变化。结果表明，在根内，无论抗、感品种接菌后的PAL活性都始终高于未接菌的对照。抗病品种86-1、陕1155在接菌后24h，经病原菌的诱导出现一个酶活性峰，而感病品种在接菌后36h才出现PAL活性峰，比抗病品种晚12h。抗病品种的相对酶活值也明显高于感病品种，其幅度是感病品种的1.38～2倍（图3-8）。在叶片内，抗病品种在接种枯萎菌后分别于12h和24h出现了PAL活性峰（86-1在接种后36h又出现了一个相等的峰）。感病品种于接种后36h才出现PAL活性峰，晚于抗病品种（图3-9），并且相对酶活值也低于抗病品种。根与叶内的PAL活性加以比较，根内PAL活性显著高于叶内PAL活性，前者是后者的3～4倍，这可能是根与病原物的作用更直接的缘故。图3-8 抗、感品种接菌后根内PAL活性峰的相对酶活值图3-9 抗、感品种接菌后叶内PAL活动峰的相对酶活值袁章虎等（1995）报道，接种枯萎病菌后抗病品种的PAL活性迅速提高，并很快在24h到最高峰。而感病品种的PAL活性则相对上升较慢，在36h才达到最高峰。其峰值也比抗病品种低得多，前者最高峰值为5.68U/（g·h），而后者仅4.12 U/（g·h）。这说明品种的抗病性不仅与接种枯萎病菌后其PAL活性峰的高低有关，而且还与PAL活性上升的速度有关。转抗病基因SNC 1棉花中35和军棉1号酶活性均高于对照，在受病原菌感染后叶片内会立即产生反应，PAL活性开始迅速上升，接种后第4天时达到高峰，是此时对照的2倍。对照（受体品种）棉叶片内反应比较迟钝、缓慢，PAL酶活性初始时的变化很小，直到接种后6天才有所提高，且全过程变化幅度也较小（表3-8）。总之，棉株在受到枯萎菌侵害后能够在很短的时间内迅速提高PAL活性，从而合成较多的抗生性物质，抑制病菌在棉株体内的萌发和扩散，使棉株表现抗病性。反之，如果病菌顺利地在寄主体内萌发、定殖和扩散，就使棉株表现感病。[U/（g·h）]品种第0天第2天第2天第2天第2天转基因中353.485±0.0874.685±0.1176.007±0.1515.837±0.1454.835±0.120转基因军棉1号2.072±0.0513.887±0.0974.723±0.1184.091±0.1023.905±0.097中35（对照）2.838±0.0703.255±0.0813.885±0.0974.011±0.1003.778±0.094军棉1号（对照）1.928±0.0482.005±0.0502.394±0.0592.622±0.0642.210±0.055表3-8 棉株叶片接菌后苯丙氨酸解氨酶活性测定分析大量研究表明，多酚氧化酶（PPO）主要参与酚类氧化为醌以及木质素前体的聚合作用，与植物抗病密切相关。病原菌侵染能诱导植物体内PPO活性升高，促进酚类化合物在受侵染部位的合成和积累，大量的酚可由多酚氧化酶氧化成醌，醌类化合物能钝化病原物的呼吸酶，阻碍病原物的生长，醌的次生反应所产生的黑色素的痂可阻止感染的扩散；酚类化合物是细胞形成木质素的前体，可形成木质素，促进细胞壁和组织的木质化，以抵抗病原的侵染。在人工接种枯萎病菌后，感病品种PPO活性的初期受到一定的抑制。直到48～72h才超过对照，而抗病品种PPO活性从24h就明显增强并超过对照（袁章虎等，1995；宁凤鸣等，1997）。这说明抗病品种在受到病菌的侵害时，能迅速以高活性的PPO配合体内的免疫系统形成抗病反应。从而使枯萎病的发展受到抑制，相反，感病品种在受到病菌的侵害时，体内的PPO活性被病菌所抑制，不能产生抗病生理功能。在研究转抗病基因SNC 1棉接种枯萎病菌后酶活性变化时，雷江荣等（2010）发现，接种当天，不管是转基因还是非转基因棉（受体）PPO酶活性没有明显变化，只在接菌1天后，才有明显差异。从图3-10可以看出，转基因中35的PPO酶活性较对照中35的酶活性显著增高，并且在第4天接近峰值，由276.571U/（mg·min）迅速增加至1019.020U/（mg·min），是此时对照的2倍。转基因军棉1号的PPO酶活性比对照军棉1号（受体）略有增加，在第6天出现高峰，对照军棉1号PPO酶活性变化不明显。图3-10 棉株叶片接枯萎病菌后多酚氧化物酶活性测定分析从总体上看，抗病品种和感病品种在接种枯萎病菌后都相继出现不同程度的PPO活性高峰。其区别是抗病品种出现的早，峰值高，而感病品种出现的晚，峰值低，抗病品种的PPO活性不受病菌的抑制，而感病品种则在受侵染的初期受到一定的抑制。研究棉花感病后防御酶活性变化，有助于深入研究棉花抗病机理，为培育和筛选抗病品种提供理论基础。棉花的抗病生理生化机制很复杂，植物体内正常情况下保护酶系处于平衡状态下，而受病原物侵染后活性大大改变。这表明棉花体内保护酶系都是在与病原物的互作中，主要是经病原物诱导而起抗病作用的。因而，在病原物侵染初期测定保护酶活性的相对变化可以作为一个选育指标；而正常棉株酶活性的高低也可作为品种筛选的指标之一。故研究棉花抗感品种接种病原物前后几种酶系的活性变化，优化酶系统选择指标，建立综合选择指标体系，将会提高选择准确性，提高育种效率，同时也将推动与棉花对该病原物抗性有关的其他生理生化指标的研究。而且，可以将防御酶活性的检测作为棉花抗病性鉴定的一个辅助手段。在染病的植物中，糖不仅是植物各类代谢的基础，而且也可以作为病菌的营养。糖代谢能为蛋白质、脂肪、核酸及次生代谢提供碳骨架和能量来源。陈其煐等（1990）以采自河南、湖北、辽宁、江苏、新疆等棉区棉花枯萎菌对具抗枯萎病性的陆地棉品种86-1、陕1155，感病品种岱15、徐州142和鲁棉1号接菌，鉴定品种对枯萎病菌的抗病性及其与含糖量的关系。试验结果表明，含糖量愈高，感病愈重；含糖量愈低，抗病性愈强，其分界值还原糖含量约为样品干重的12%，水溶性总糖为样品干重的15%（表3-9）。棉花枯萎病是一种高糖病害。品种含糖量（%）（干重）抗、感枯萎病表现*还原糖水溶性糖病指反应型鲁棉一号15.12117.8535.07S（感）岱字棉1513.24917.2234.62S徐州14212.11015.2129.44S陕115512.01713.739.69R8618.95812.377.92R（抗）表3-9 不同棉品种苗期含糖水平与抗枯萎病性表现冯洁等（1991）报道，抗病品种（86-1、陕1155）和感病品种（岱字棉15、徐州142）接菌后，果糖、蔗糖含量均为上升趋势。接菌后抗、感病品种在葡萄糖、核糖含量上存在差异，前者接菌后葡萄糖、核糖含量明显上升，分别为26.8%～58.6%和11%～26.9%，后者则下降，分别为-40%～-27.6%和-57.9%～-22.2%（图3-11）。图3-11 棉花叶内糖分含量变化吴小月等（1993）和宋凤鸣等（1996）的研究结果也表明，感病品种棉苗体内的含糖量高于抗病品种（表3-10，表3-11）。品种泗棉2号岱红岱盐棉488618311中棉所12子叶0.4330.4040.3870.2970.2620.259蕾期叶片0.7580.7430.5750.6400.6130.515抗病性SSMRRRR表3-10 不同抗性的陆地棉品种间可溶性糖含量比较（吴小月等，1993）品种处理叶片中葡萄糖含量（mg/g鲜重）根茎部中葡萄糖含量（mg/g鲜重）总糖可溶性糖还原糖总糖可溶性糖还原糖中棉所12（抗病）不接种17.599.332.577.974.141.98接种25.5213.315.5718.5410.432.646037（感病）不接种16.2010.922.7710.004.452.44接种24.8214.827.1520.7110.344.07表3-11 棉苗组织中糖含量的变化（宋凤鸣等，1996）受病原物侵染后，植物体内可溶性酚类物质会大量积累，大量的酚类物质通过延缓入侵病原物的生长而在植物抗病性中起作用。细胞壁上存在大量的酚类物质，这些不溶性胞壁结合酚及细胞壁的快速木质化与植物抗病性有密切关系。棉花体内含有丰富的酚类（主要是多元酚）物质，随着棉苗生长其酚类物质含量增加，同时，可提高对病害的抗性。多酚类物质在棉花抗病性具有重要的作用。刘发敏等（1993）报道，在不接枯萎病菌的条件下，棉花中多酚类含量是感病品种高于抗病品种，但抗、感病品种的多酚类含量都是随着生育期进程由低到高。抗病品种86-1在1叶期为1.41%，开花期为2.99%；感病品种鲁棉1号在1叶期为3.25%，开花期为4.02%。鲁棉1号在各生育期均高于86-1。但在接枯萎病菌的条件下，86-1多酚类含量几乎是直线上升，1叶期为1.62%，开花期为4.38%，开花期为1叶期的2.7倍。鲁棉1号相反，多酚类含量从1～3叶期下降较大，以后下降减缓。1叶期为3.65%，开花期为2.91%，开花期仅为1叶期的4/5。86-1和鲁棉1号相比，从5叶期开始，86-1高于鲁棉1号，到开花期为鲁棉1号的1.5倍。袁章虎等（1995）指出，各品种无论是抗病的还是感病的，接种枯萎菌后体内多酚的含量都有明显提高。抗、感病品种主要差异有以下两点：一是抗病品种多酚的累积高峰出现的早；二是抗病品种在接菌后多酚增加的灵敏量比感病品种高许多。这表明品种所固有的组成性多酚含量是品种间的差异，在一定范围内与抗病性没有关系，而棉株遭受枯萎萎菌侵染后所合成的多酚类物质才是抗病性增强的根本所在。病原物侵染后，植物体内常有大量酚类物质的积累，这些酚类物质主要由苯丙烷类代谢途径合成，其中，绿原酸和阿魏酸是主要的酚类物质。作为苯丙烷类代谢途径的主要产物，在受病菌侵染或诱发物处理后，植物体内绿原酸和阿魏酸的积累是一种常见的现象。在一些植物的抗病反应中绿原酸含量增加快，发生早，而感病反应中则相反。在绿原酸方面，冯洁等（1990）试验结果表明，不同抗病类型品种接种后绿原酸含量存在差异。抗病品种中棉所12、86-1在接菌后24h绿原酸含量迅速上升，最高含量0.47～0.51mg/g干重，48h后又迅速下降，以后又有所回升。感病品种岱字棉15、豫棉1号在接菌初期（24～72h）绿原酸含量始终低于未接菌的对照，直到96h才迅速增加，最大含量为0.49～0.55mg/g干重。在接菌初期感病品种体内酚类植保素积累很慢，到后期含量虽然超过了抗病品种，但已错过了杀伤病菌的时机。抗病品种则不然，在接菌初期绿原酸含量就迅速积累，对病菌的侵入起到阻止和杀伤作用。可见接种枯萎菌后，抗、感品种都可以产生酚类植保素——绿原酸，关键在于产生的量和速度不同。宋凤鸣等（1996）的研究结果也表现了这种特点。Friend等（1973）研究表明，绿原酸可抑制某些病原菌的生长和产孢。阿魏酸虽然无直接的杀菌活性，但它是木质素的前体，其含量的增加可为木质素合成提供更多的底物，促进木质素的积累，导致细胞壁的木质化，从而在植物抗病性中起了间接作用。冯洁等（1990）研究结果表明，抗病品种中棉所12、86-1在接菌后48h均出现了一个阿魏酸增加峰，显著高于对照水平，最大量可达4.27～6.68mg/g干重，86-1在接菌后96h又出现一个增加峰，含量可达5.01mg/g干重。而感染病品种岱字棉15、豫棉1号在接菌后24～72h，阿魏酸含量始终低于未接菌的对照，直到96h才略高于对照，最大量为2.17～3.48mg/g干重。接菌后阿魏酸含量的变化与棉花抗枯萎病性呈正相关。宋凤鸣等（1996）报道，在不接种枯萎病菌条件下，抗、感品种棉苗体内阿魏酸含量明显差异，但接菌后，抗病品种棉苗体内阿魏酸含量的增加幅度更大（表3-12）。处理中棉所12（抗病品种）6037（感病品种）接种后7天接种后11天接种后15天接种后11天接种后15天不接枯萎病菌0.5820.5450.7520.5720.692接枯萎病菌1.3021.7592.1130.8031.201表3-12 棉苗根茎部组织中阿魏酸的含量（OD350/gDW-ml）由于病原真菌和细菌感染，在受损害的植物细胞内或细胞周围高浓度地积累植保素，这些小分子化合物许多是黄酮类化合物。黄酮类化合物以糖苷的形式广泛分布在植物界。它们的合成和转化可能彼此独立地加以调节。刘发敏等（1993）指出，在不接枯萎病菌的条件下，抗、感病品种黄酮类含量随着生育期进程变化较大。抗病品种86-1每克干重在一叶期为10.5473mg，三叶期是高峰为14.0084mg，开花期为9.3064mg；感病品种鲁棉1号每克干重在一叶期为9.3272mg，现蕾期为高峰是12.5100mg，开花期为11.6401mg，86-1在1～3叶期高于鲁棉1号，其余各期都低于鲁棉1号。在接菌的条件下，86-1黄酮类含量每克干重在一叶期为10.7138mg，到五叶期降到最低点为7.2778mg，然后急剧上升，开花期为12.2706mg，曲线呈现“V”字形。鲁棉1号黄酮类含量每克干重在一叶期为9.8407mg，三叶期达到高峰为11.5603mg，现蕾期为10.2887mg，开花期为10.446mg，变化较平缓，曲线略呈“S”形。86-1和鲁棉1号相比，在三叶期和五叶期86-1黄酮类含量低于鲁棉1号外，其余各生育期都高于鲁棉1号（图3-12）。宋凤鸣等（1996）也报道了类似的研究结果。接种枯萎病菌的抗病品种棉苗叶片和根茎部组织中黄酮类物质含量略高于感病品种，枯萎病病菌侵染后，棉苗组织中黄酮类物质含量明显提高，抗病品种棉苗组织中黄酮类物质含量的增加幅度略大（表3-13）。品种处理叶片组织根茎部组织中棉所12号（抗病）不接枯萎病2.041.212.12接枯萎病3.622.643.546037（感病）不接枯萎病1.691.091.68接枯萎病3.031.802.70表3-13 棉苗组织中黄酮类物质的含量（OD509/g·ml min）图3-12 棉花不同生育时期黄酮类含量的变化植物细胞壁上存在着众多的酚类物质。在一些植物病害系统中已经证实植物受侵后组织中不溶性胞壁结合酚类物质在其对抗病性中起重要作用。Glazener等（1982）认为不溶性胞壁结合的简单酚类物质可能参与植物的某些防卫反应过程，且与抗病性有关。Nieman等（1991）和Bonello等（1993）报道，胞壁结合的复杂酚聚合物主要是木质素，其含量的增加，表明细胞壁的木质化，因而在植物抗病性中起到作用。宋凤鸣等（1997，2001）研究结果表明：①抗病品种棉苗组织中胞壁结合的简单酚、酚聚合物及黄酮醇含量高于感病品种棉苗组织中的含量。根茎部组织中胞壁结合酚含量相对较高；②枯萎病菌侵染后棉苗组织中不溶性胞壁结合酚含量有明显的提高（表3-14）。因此认为，受枯萎病菌侵染后棉苗组织中可溶性酚及不溶性胞壁结合酚的积累与棉苗对枯萎病的抗性有关。品种处理叶片组织根茎部组织简单酚复杂酚聚合物黄酮醇简单酚复杂酚聚合物黄酮醇中棉所12号（抗病）不接枯萎病菌0.1900.1132.890.3150.2384.72接枯萎病菌0.3640.1964.810.5610.4357.506037（感病）不接枯萎病菌0.1570.0882.610.2990.1984.20接枯萎病菌0.2440.1443.530.4290.3386.31表3-14 棉苗接种后11天时单位干细胞壁组织[m（DW）]中不溶性胞壁结合酚类物质的含量儿茶素（Catechin）是棉花植株中最主要的多元酚（Howell等1976），随着棉苗生长，组织中儿茶素的含量增加，同时也提高对立枯病的抗性（Hunter等，1974）。在离体条件下，儿茶素可抑制立枯病菌（Rhizoctonia solani）和黄萎病菌（Verticillium dahilae）的菌丝生长及黄萎病菌的产孢（Howell等，1976；Hunter等，1974）；而且儿茶素或其氧化产物可使立枯病菌的多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）失活（Hunter等，1974，1978）。因此，Hunter认为儿茶素可通过抑制真菌生长和PC活性而在棉花抗病性中起重要作用。宋凤鸣等（1996，1998）就儿茶素对棉枯萎病菌的影响以及在棉花抗枯萎病中的作用进行了研究。研究结果指出，抗病品种棉苗组织中儿茶素的含量较高，受侵后其含量明显增加，而感病品种棉苗受侵后儿茶素仅有少量增加（表3-15）；纯培养条件下儿茶素对枯萎病菌菌丝生长、产孢及孢子萌发具有明显的抑制作用（表3-16）；棉苗组织中酚类物质对PG和PL活性有抑制作用，而且证明这种抑制作用主要是由儿茶素引起的（表3-17，表3-18），其抑制作用的强弱与棉苗组织中的儿茶素含量呈显著的正相关。总之，儿茶素通过对病菌生长、产孢和其胞壁降解酶（如PG、PL等）的抑制而阻止病菌在棉花体内的侵入、繁殖和扩展，从而提高棉花对枯萎病菌侵入和扩展能力，由此在棉花抗病性中起作用。品种处理叶片组织根茎部组织中棉所12号（抗病）不接枯萎病菌0.5170.582接枯萎病菌1.4521.172不接枯萎病菌0.6790.706接枯萎病菌1.7681.6056037（感病）不接枯萎病菌0.4050.528接枯萎病菌0.8520.771表3-15 棉苗组织中儿茶素的含量（mg/g 鲜重）儿茶素浓度（mg/ml）菌落直径（cm）菌丝干重（mg）C+S（1）C+NaPP（2）C+SC+NaPP产孢量（%）（×107/ml）孢子萌发（%）0.14.073.47307220757.995.350.053.703.17273199646.790.380.103.773.37257197584.477.680.503.432.67210177553.267.371.002.371.3711384130.551.802.001.120.7797611.433.58EC501.341.121.151.180.791.36表3-16 离体条件下儿茶素对棉花枯萎病菌的影响品种处理对PG的抑制作用*（%）对PL的抑制作用（%）叶片组织根茎部组织叶片组织根茎部组织中棉所12不接枯萎病菌30.3423.0819.5518.91接枯萎病菌54.1855.3451.7548.62不接枯萎病菌24.3819.2016.0712.77接枯萎病菌42.7645.3835.4543.57表3-17 棉苗组织提取液中酚类物质对多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶活性的抑制作用处理PG活性PG（μgglucose/mgprot·h）PL活性PL（△OD550/mgprot·h）对照CK50%926.3091.0含儿茶素部分抽提液673.00（27.32%）*40.3（55.71%）其余部分抽提液874.00（5.62%）86.7（4.76%）表3-18 组织提取液经TLC后含儿茶素部分硅胶抽提液及其余部分硅胶抽提液对多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶活性的影响棉酚是棉花体内主要的酚类物质，在离体条件下，棉酚可抑制黄萎病菌和枯萎病菌某些专化型的菌丝生长和产孢（Bell，1967；Davis，1964），棉花受病原菌侵染后，其体内棉酚含量有明显的增加，因而推测，棉酚及单宁在棉花抗病性中起到作用（Bell，1967；魏守军等，1992；沈其益等，1992；Harrison等，1982）。魏守军等（1992）观察到在棉花受到枯萎菌侵染后，棉酚在棉株木质部和叶柄维管束导管细胞内大量累积（图3-13），并且抗病品种中棉所12和86-1中，染病后根系游离棉酚含量分别提高112%和96%；而感病品种冀棉11号和鄂荆92中，染病后根系游离棉酚含量只分别提高8%和4.8%。宋凤鸣等（1997）也观察到在未接种枯萎病菌的健康棉苗中，抗病品种的游离棉酚含量均显著高于感病品种相应组织中的含量，根茎组织内的含量又高于叶片；接种棉枯萎病菌引起发病并导致棉苗组织中游离棉酚含量明显提高，抗病品种增长显著高于感病品种。图3-13 棉株茎与叶柄横切片图棉花枯萎病是重要的土传病害，枯萎菌由根系直接侵入，根系细胞壁是它需要克服的第一道防线。蛋白质是病原菌赖以生存的重要营养来源，寄主植物细胞壁蛋白质含量十分丰富，一些蛋白质组分（如天冬氨酸、谷氨酸等）经过脱氨后的碳骨架可以直接进入病原菌的代谢系统，合成病菌所需要的蛋白质，因此，对寄主细胞内蛋白质组成成分的氨基酸进行研究的重要意义是显而易见的。冯洁等（1991，1994，1995）在这方面做了较系统的研究，取得了具有科学意义的研究结果。（1）棉花根、叶内的蛋白质含量在感染枯萎病菌后，叶内蛋白质含量，抗病品种接菌后36h以前的蛋白质含量都低于未接菌的对照，36h后则高于对照的水平，表现为先低后高；而感病品种则恰恰相反，出现先高后低的现象。在根内，抗病品种接菌后24h始终保持低于对照品种中蛋白质的水平，直到36h后才有所上升。而感病品种接菌后蛋白质浓度均高于对照。另外，达到高峰时的蛋白质含量感病品种高于抗病品种。（2）棉花细胞壁氨基酸含量用不同致病力的棉花枯萎病菌7号和3号小种接种棉花，对抗、感品种根部细胞壁氨基酸含量进行分析。结果表明，感病品种在接种7号小种后，根内细胞壁氨基酸含量增加了32.3%，抗病品种增加了4.4%；接种3号小种后抗病品种氨基酸含量下降了14%，感病品种上升了19.8%（图3-14）。感病品种受枯萎菌诱导后细胞壁氨基酸的积累明显高于抗病品种，为枯萎病菌的生长提供了较多的氮源，易与枯萎菌建立寄生关系，这表明细胞壁氨基酸含量与棉花对枯萎病的抗性具有一定的相关性。（3）棉花细胞壁富含羟脯氨基酸糖蛋白含量脯氨酸是一种非常重要的氨基酸，它经过羟化形成的羟基脯氨酸，是细胞壁伸展蛋白的原料。有些研究结果表明，细胞壁富含羟脯氨酸糖蛋白的积累与植物抗病性关系密切（Mayad，1986；Benhamou，1990）。冯洁等（1995）研究结果表明，不同品种间细胞壁富含羟脯氨酸糖蛋白（HRGP）的积累量存在差异，抗病品种细胞壁内HRGP含量明显高于感病品种。棉花叶内的HYP（羟脯氨酸）含量与其他氨基酸相比含量最低，只占总量的1.0%～1.2%。根内细胞壁HYP与其他氨基酸相比含量最高，占氨基酸总量的19.1%～19.6%，是其他氨基酸的2～10倍。根内HYP含量大约是叶内的10倍，这可能是由于根与病原菌直接接触，长期作用进化的结果。根内HYP的高含量对棉花自身抵抗病菌侵染有利。在棉花细胞壁HRGP含量增加及细胞壁木质素沉积与抗枯萎病性的关系上，接种枯萎病菌后根、叶内细胞壁木质素沉积与HYP含量变化规律相似，抗病品种86-1接种7号、3号小种后，细胞壁木质素的累积量均高于感病品种邯14，枯萎菌7号小种诱导后细胞壁的木质化程度比接种3号小种要高（表3-19）。可见，HRGP含量及细胞壁木质化程度与棉花抗枯萎病性呈正相关。图3-14 接种枯萎病菌对棉花根内细胞壁氨基酸含量的影响处理861（抗病）邯14（感病）根叶根叶木质素增长率（%）木质素增长率（%）木质素增长率（%）木质素增长率（%）健株2.882.402.802.477号小种3.5623.62.6811.73.2415.72.673.13号小种3.2613.22.566.73.079.62.553.2表3-19 不同处理对细胞壁木质素沉积的影响至于HRGP在抗病反应中的作用机制主有以下3方面（宋凤鸣，1992）。（1）作为凝集素的作用许多植物凝集素是糖蛋白，其中，有一些就是HRGP。这种具凝集活性的HRGP定位于能与病原菌相互作用的位点，HRGP可能与病原菌相互作用并把病原菌固定在细胞壁中，从而阻止病原菌的侵入或在细胞间的扩散。HRGP还在寄主—病原菌相互作用的专化性识别机制中起到重要作用。（2）作为木质素的沉积位点寄主与病原菌相互作用中，细胞壁在病原菌侵染后的木质化是寄主抗病反应的特性之一。木质素的形成与苯丙氨酸代谢形成的松柏醇有关，松柏醇的脱氢多聚物（DHP）与HRGP结合形成一种对酸稳定的复合物。在初生壁的木质化过程中，由松柏醇产生的甲基化醌与HRGP之间形成共价交错连接，从而导致了木质素在细胞壁中的沉积。（3）作为结构屏障的作用高等植物细胞壁中，HRGP填充在纤维素骨架的间隙中，又与细胞壁的其他成分共价结合形成更为致密、不可穿透的结构屏障。而且，HRGP具有结构性多聚物的功能，从而提高了细胞壁的强度。在侵染穿透过程中，病原物分泌的纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶等都能分解纤维素、半纤维素等细胞壁成分。但这些酶不能分辨HRGP，而且HRGP包围在纤维素和半纤维素的周围，从而把病原物分泌的酶与其底物分开，使纤维素和半纤维素等胞壁物质免受分解。继续保持细胞的正常结构，阻止病原物的侵入。但目前尚没有这方面的直接证据。病原菌的侵染可破坏寄主植物体内活性氧产生与清除之间的动态平衡，引起活性氧（主要是超氧阴离子O-2和过氧化氢H2O2）的积累，同时激活脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）基因的表达，LOX酶活性升高。活性氧和LOX酶通过非酶促和酶促方式直接攻击膜系统中的不饱和脂肪酸，启动膜脂过氧化的发生。活性氧的积累及膜脂过氧化的发生直接与植物的过敏性抗病反应有关，因而被认为是植物抗病防卫反应的组成部分之一。活性氧及膜脂过氧化的产物在植物抗病防卫反应中起的主要作用是：①对入侵病菌的抑制；②诱导植保素合成、细胞壁木质化及富含羟脯氨酸糖蛋白的沉积；③与信号传递有关并激活植物防卫反应相关基因的表达。宋凤鸣等（2001）研究结果表明，未接种枯萎病菌的健康棉苗中，抗病品种中棉所12棉苗的活性氧水平略高于感病品种6037，接种病菌后，棉苗叶片和根茎组织的活性氧水平显著升高，中棉所12的活性氧积累早，积累水平高于6037（表3-20）。健康棉苗的茎与根组织中LOX酶活性，在抗与感病品种间无明显差异，接种枯萎病菌后，2个供试品种棉苗组织中LOX酶活性有明显的升高，但表现不同的变化动态。抗病品种中棉所12接种后茎与根组织中，LOX酶活性快速增加，在接种后5～8天达最高，之后缓慢下降。感病品种6037棉苗接种后茎与根组织中，LOX酶活性增加缓慢，8天后才有较大幅度的增加，而后逐步下降。处理O-2产生速率（μmolO-2/t（gFW·min）H2O2积累（μmolH2O2/gFW）3天7天3天7天中棉所12（抗病）不接枯萎病菌0.320±0.0050.381±0.037103.9±4.486.3±8.8接枯萎病菌0.922±0.0351.086±0.066163.0±3.5159.6±4.56037（感病）不接枯萎病菌0188±0.0010.253±0.00661.5±7.852.9±4.6接枯萎病菌0.336±0.0180.725±0.00685.6±3.1127.5±5.3表3-20 枯萎病菌接种后棉苗茎与根组织中活性氧的积累丙二醛（MDA）是膜脂过氧化产物，未接种枯萎病菌的健康棉苗的茎与根组织中，MDA含量在抗与感病品种间无显著差异，但枯萎病菌接种后，棉苗组织中MDA的含量有明显的增加，抗病品种中棉所12棉苗MDA的含量在接种后3天就明显增加，此后直线上升，而感病品种6037棉苗中MDA的含量在接种后7才开始积累，增加速度相对较慢。接种枯萎病菌后，抗病品种棉株体内膜系统中，不饱和脂肪酸含量下降明显，而感病品种无显著变化。膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）含量上升，膜系统中，不饱和脂肪酸含量下降，表明有膜脂过氧化的发生（宋凤鸣等，2001）。上述这些结果说明，枯萎病菌侵染后棉苗体内活性氧的积累、LOX酶活性的上升以及由此引起的腆脂过氧化，可能在棉苗对枯萎病的抗性中起作用。棉株感枯萎病后显示的病症是由于一系列不正常的生化和生理活动的结果。脂肪酸是细胞质膜的主要组织成分，具有极重要的生物功能，棉花叶片中的脂肪酸主要由两种饱和脂肪酸和3种不饱和脂肪酸所组成。感染枯萎病棉株叶片中亚麻酸含量下降，而油酸和亚油酸含量增加，总的来看是不饱和成分降低，这说明叶片膜脂中脂肪酸的组成分发生了变化、加之其他生理代谢的影响，导致病株呈现皱缩（宋晓轩等，1992）。郭金城等（1990）测定结果指出，子叶中油酸和亚麻酸含量与品种的抗枯萎病性有一定的相关性。品种的抗病性越强，其子叶中油酸含量越高。高抗枯萎病品种52-128子叶中油酸含量比感病品种鄂沙28高16.99%，表明品种的抗病性与子叶中油酸含量呈正相关；而子叶中亚麻酸含量与品种抗病性呈负相关趋势，子叶中亚麻酸含量越低，其品种的抗病性越强。高抗枯萎病品种52-128子叶中亚麻酸的含量比感病鄂沙28低10.55%。枯萎病对棉株光合作用和呼吸作用有明显的影响。丁钟荣等（1988）测定结果表明，无论感病品种还是抗病品种，感病植株的光合作用均显著降低。感病品种的光合强度降低了37.2%，总光合强度降低30.5%；抗病品种的光合强度降低28.5%，总光合强度降低21.3%。说明感病植株生长矮化和产量降低都与光合下降有关。净光合速率表明叶片吸收固定二氧化碳的能力，受叶龄影响较大，反映在主茎叶上即是受不同叶位的影响。健株叶片的净光合速率最大值均出现在第五叶位叶片，而病株叶片则无此规律，这是由于其各叶位叶片发病程度和发病时间的不同所致。相同叶位的主茎叶片的净光合速率，病株均明显低于健株。病株叶片的净光合速率平均比健叶下降了58.7%～62.8%。这表明，病叶的同化二氧化碳能力大为降低。棉株感病后呼吸强度均明显下降，抗病品种下降更甚。抗病品种的病株呼吸强度比健株下降23.7%，而感病品种的病株只比健株下降13.1%。气孔是二氧化碳和水气进出叶片的通道，气孔导度表明气体通过气孔传导的能力，直接影响着气体交换的进程。棉花感染了枯萎病后，各主茎叶位叶片的气孔导度明显降低，病叶的气孔导度分别比健叶的平均降低了64.4%～88.7%。因此，影响叶片水气的交换能力，使蒸腾速率下降，病叶的蒸腾速率分别比健叶减少46.7%～68.2%（宋晓轩等，1992）。丁钟荣等（1988）报道，感枯萎病植株的叶片蒸腾强度、叶水势和细胞汁浓度分别比健株下降22.48%～30.91%、14.75%～11.81%和13.43%～18.11%，而下降幅度蒸腾强度和细胞汁浓度抗病品种明显高于感病品种，叶水势，则反之。Nain （1985）报道，棉株感染枯萎病后，蒸腾作用的强度发生变化，并受到抑制。对离体叶片的蒸腾作用进行测定发现，充分展现症状的叶片其蒸腾强度要比健康叶片低1/2～2/3；同时，叶片中的水分含量也低约1/2。温度是维持正常新陈代谢的重要因素之一。宋晓轩等（1992）测定结果表明，感染枯萎病后，各节位主茎病叶叶片的叶温均高于健叶，最多能高出5.5℃；健叶叶温比其周围环境的气温低2.51～3.13℃，叶温与气温温差较大，而病叶的叶温与气温温差较小，最多相差-1.29～1.24℃，负值说明叶温超过了气温，最高可超出2℃。这种差异与棉株发病程度有直接关系，对病叶外表健康的部分和发病部分的测量，坏死组织部分的温度要比绿色组织部分的温度高。在幼茎和幼铃上也表现了同一规律。在棉株体内糖、氮代谢方面，病株的硝态氮含量显著减少。感病品种硝态氮含量比健株减少1/2；抗病品种减少1/3。感病株可溶性蛋白质含量显著降低（图3-15）。可溶性糖含量感病植株比健株减少一半左右。同样，抗病品种比感病品种高出1/3以上（丁钟荣等，1988）。张海娜等（2011）报道，感病株体内可溶性糖含量高于正常株（图3-16）。表明抗病品种的营养积累要比感病品种优越得多。图3-15 可溶性蛋白质含量的变化（张海娜等，2011）图3-16 可溶性糖含量的变化（张海娜等，2011）已有的研究结果表明，根际微生物和棉际分泌物等生态因素与植物抗病性有密切关系。植物的分泌物主要包括糖、氨基酸、蛋白质、维生素、有机酸、无机离子等。这些分泌物中的某些物质能在抵御病菌侵入中起作用。显然植物的分泌物中存在着某些物质，由于它们的存在使植物体本身具有抗病的潜在活性，这是植物体自身防御作用的机理之一。冯洁等（1991）研究了棉花抗、感品种的病、健株根分泌物中氨基酸及糖分含量的变化及其对枯萎菌孢子萌发的影响。结果表明，抗病品种健株根分泌物中，含有7～8种氨基酸，总量分别为1.40nmol和1.33nmol。感病品种根分泌物中，含有1～4种氨基酸，总量分别为0.43nmol和1.02nmol。接种枯萎菌后，棉花抗、感品种根分泌物中，氨基酸种类均达到17种，抗病品种根分泌物中，氨基酸总量为152.40～160.30nmol。感病品种为216.10～239.98nmol。感病品种根分泌物中氨基酸总量明显高于抗病品种。丙氨酸（Ala）在氨基酸总量中所占的比例最大，其次是谷氨酸 （Glu）和缬氨酸（Val），三者之和在氨基酸总量中所占的比例抗病品种为60%～75%，感病品种为59%～64%。天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）是植物及病原物体内代谢的重要氮化物。感病品种接菌后根分泌物中，这两种氨基酸的含量比抗病品种高，这可能对病原菌利用它们构建体内其他重要化合物是有利的。枯萎菌孢子在抗病健株根分泌物中，萌发率在22.4%～26.3%，接近清水对照，没有刺激孢子萌发的作用，在感病健株根分泌物中，孢子萌发率在34.9%～57.7%，比对照高10.2～33个百分点，说明感病品种健株根分泌物可刺激孢子萌发。接枯萎病菌后，抗、感品种根分泌物均可刺激孢子萌发，萌发率在65.4%～72.0%，比对照高40.7%～47.3%。孢子在不同氨基酸溶液中萌发，在Gly.Ala、Ser、Ghl中，孢子萌发百分率最高（61.0%～74.5%），其次是Asp、Phe，Thr、Pro、Val、Cys萌发率在30.2%～58.4%，也具有刺激孢子萌发的作用，在Arg、Met、Leu中，萌发率接近清水对照（22.6%～27.7%），只有His具有抑制孢子萌发的作用（17.2%）。棉苗健株根分泌物中，总糖含量很低，用薄层层析法检测不到果糖和葡萄糖。接菌后总糖含量与健株相比有大幅度增加，并可检测到果糖和葡萄糖。抗病品种的果糖含量分别为23.70%～25.7%和2.69%～3.02%；而感病品种果糖和葡萄糖的含量分别为25.20%～25.60%和1.82%～1.92%。抗病品种的葡萄糖含量略高于感病品种（冯洁等，1991）。由于棉花根分泌物的成分非常复杂，其作用在土壤中又受其他诸多因素的影响，进一步研究这一问题，对探明枯萎病生态抗性机制是必要的。棉枯萎病菌主要存活于土壤并从根部侵入，根际则是病菌侵入根系的必然通道。而根际微生物是一个极其庞大的群体，其区系各成员对病菌的反应也各不相同，有些表现为抑制作用（包括营养竞争、拮抗、寄生、捕食等），有些表现为促进作用（包括促进萌发，促进生长，协助侵入等），有些则表现关系不大，根际微生物区系的组成不同，对病菌总的反应也就不同。因此，弄清根际微生物的区系组成（包括种类、种数、优势种等），对于抗病机制的研究及生物防治都具有十分重要的理论意义，对于开发土壤微生物资源也有较为重要的作用。李洪连等（1990、1991、1992）对棉花抗、感枯萎病品种根际微生物种类、数量及其抑菌作用进了研究。研究结果指出：①棉花抗、感枯萎病品种根际微生物数量存在着明显差异。抗病品种根际微生物数量显著多于感病品种，其中，又以根际真菌数量更为明显，两类品种之间的差异达到极显著水平，两类品种之内无明显的差异。在根际细菌数量方面，根际放线菌数量，均为抗病品种的数量多于感病品种。这个结果表明，棉花品种对枯萎病的抗性与根际微生物数量之间存在着密切的关系，抗性愈强，根际微生物群体数量愈大（表3-21）。②棉花抗、感枯萎病品种根际真菌区系组成十分复杂，且差异十分明显。抗、感病品种的各类真菌中，以青霉属（Penicillum）、曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）等种数较多。不同的棉花品种其根际真菌属数、种数、种类及优势种均不相同，每个品种都有自己独特的根际真菌区系组成。一般来说，抗病品种根际真菌种数较多，抗病品种86-1和豫棉7号分别共分离出19属35种和14属30种根际真菌，其根际真菌优势种多为曲霉（Aspergillusspp.）、青霉（Penicillumspp）、疣孢漆斑菌（Myrithecium verracaria），而感病品种冀棉7号和河南69分别共分离出14属30种和13属27种根际真菌，其优势种则为粉红粘帚霉（Gliocladium roseum）、双胞镰刀菌（Pusarium dimerum）、黑根霉（Rhizopus nigicans）等。播期品种生育期真菌平均值及差异比较放线菌平均值及差异比较细菌平均值及差异比较春播861（抗病）冀棉7号（抗病）河南69（感病）鲁棉1号（感病）2～3叶期11.886～7叶期28.34现蕾期13.152～3叶期12.566～7叶期23.95现蕾期13.002～3叶期6.036～7叶期6.99现蕾期6.362～3叶期7.496～7叶期5.36现蕾期5.6017.79aA16.50aA6.46bB6.15bB7.6323.3228.846.2813.4412.444.4913.3010.873.7910.367.9619.93aA10.72bB9.55bB7.37bB13.2719.39102.134.2312.8092.022.986.4656.936.0514.2759.2744.93aA36.36abAB22.12cB26.53bcB表3-21 棉花抗、感枯萎病品种根际微生物数量（106个/克土）播期品种生育期真菌平均值及差异比较放线菌平均值及差异比较细菌平均值及差异比较夏播861（抗病）冀棉7号（抗病）河南69（感病）鲁棉1号（感病）2～3叶期22.556～7叶期27.11现蕾期36.392～3叶期18.376～7叶期29.07现蕾期28.172～3叶期10.146～7叶期15.88现蕾期19.842～3叶期8.666～7叶期9.44现蕾期13.7328.68aA25.20aA15.59bB10.61bB13.6914.7016.508.7012.8912.034.146.065.624.944.624.4714.96aA11.21bB5.27cC4.68cC21.7478.45141.658.4751.5998.0612.1537.8590.936.4254.3993.0780.61aA52.71bB46.98bB51.29bB表3-21 棉花抗、感枯萎病品种根际微生物数量（106个/克土）（续）-1棉花抗、感枯萎病品种在相同条件下根际微生物种类和数量明显不同，其原因可能是由抗、感品种根系分泌物和脱落物的不同而导致的。如果根际内微生物数量较多，就会对枯萎病菌的侵入产生较大的抑制作用，使病菌难以侵入，从而使棉株表现为抗病。当然，这种影响除决定于根际微生物的数量外，还与微生物的种类及对枯萎病菌的抑菌作用强弱有关。综上所述，棉花枯萎病的抗病机制是一个非常复杂的问题，涉及的因素众多。如果强调某一方面的作用，难免有一定的局限性。抗病、耐病和感病品种不仅在受到病原物侵入前就存在差异，而且更重要的是染病后抗性与其产生抗性机制的速度和程度的差异。如果将有关联的作用有机地联系起来，开展综合研究，可能更有助于深入地认识棉花对枯萎病的抗病机制。