产业集群是在某个特定区域内以一个主导产业为核心，大量产业联系密切的企业及相关支撑机构在空间上集聚并形成强劲、持续竞争优势的现象。高新技术产业是由处于时代前沿的先导性技术发展起来的产业。与传统产业相比，高新技术产业是一种具有高技术、高投入、高风险、高附加值特征的产业，知识和技术是其投入要素，技术创新能力的形成是决定其生存和发展的关键。高新技术产业集群是指在高技术领域内具有相互关联的企业和机构在一定的地域内聚集，形成上、中、下游机构完整、外围支持产业体系健全、充满创新活力的有机体系。目前，高新技术产业集群有两种基本形式：与大企业共生的中小企业聚集网络和依靠技术合作与创新形成的企业聚集网络。高新技术产业的国际通行做法是根据R&D（研究开发）投入在总产出中所占比例来界定高新技术产业，科学技术的创新和转化将直接影响着高新技术产业的发展。实践表明，高新技术企业往往以“集聚”的方式集中布局，形成高新技术产业集群。与传统意义上的产业集群相比，高新技术产业集群有许多新的特征。高新技术产业集群中的企业主体以相当数量的技术为依托，以创新为基础，企业间联系以知识、信息为核心。集群中的环境因素有利于技术的创新、传播。技术的创新是高新技术产业最重要的竞争手段，企业集聚就是为了利用区域中的创新资源，提高创新效率。高新技术产业集群的产品附加值高，产业带动性强，可迅速成为区域经济的主导。高新技术产业集群一旦形成，可以带动本地区的经济快速发展。例如中关村科技园区虽然只有20多年的历史，其新增国民生产总值已经占到北京市新增产值的一半，成为北京经济发展的重要支柱。另外，与传统产业集群还有不同的是，新型人力资本因素和区域产品链和产业链的配套能力已经成为决定高新技术产业集群优势高低的主要因素。技术创新的研究经历了一个从“线性范式”到“网络范式”的转变。在熊彼特创新理论的影响下形成了创新研究的“线性范式”。该范式认为技术创新一般经历发明—开发—设计—中试—生产—销售等简单的线性过程，研究局限于单个企业内部的技术过程。后来的研究发现外部的信息交换及协调对于创新具有重要的作用，它可以有效克服单个企业技术创新时的能力局限，降低创新活动中的技术和市场不确定性。此后，创新研究的视野从单个企业内部转向企业与外部环境的联系和互动，导致“网络范式”的兴起。“网络范式”最初应用在国家层面，形成了“国家创新系统”理论。随着全球化的发展，经济意义上的“国家状态”日益让位于“区域状态”，区域成为了真正意义上的经济利益体，关键的商业联系集中于区域范围内。进一步的研究发现创新网络的成效似乎跟创新主体的空间分布有很大的关系，地方化的创新网络似乎比跨国技术联盟更能持久。区域发展理论和国家创新理论构成了区域创新系统理论。当创新系统研究发展到区域创新阶段，已经开始与产业集群的研究结合起来了。产业集群与技术创新的关联性也日益密切。技术创新是企业整合创新资源进行创新的过程，技术创新资源包括专业化人才、资金、信息、公共服务等等，其中，专业化人才是企业技术创新活动中最重要的创新资源。在高新技术产业集群内，一方面，有为企业提供人才供给的大学、科研机构、培训机构等；另一方面，高新技术产业集群本身对人才的强烈吸纳能力造成大量人才慕名而来，也形成专业化人才的供给。高新技术产业集群内激烈的竞争为企业技术创新提供了动力。竞争是企业进行技术创新的基本推动力，而竞争会随着市场上参与企业个数的增多而加剧。在产业集群的相对狭窄的地理范围内通常聚集着几十家甚至上百家企业并进行着同类或相似产品的生产，集群内的竞争非常激烈。由于集群内的企业之间在资金、技术等方面的竞争优势差异很小，从而迫使企业必须通过不断地技术创新来获取竞争优势。不管是走低成本路线还是走产品差异化路线，企业都必须通过技术创新来确立自己的独特地位。因此，迫于生存压力，集群内的企业与集群外的企业相比，更具有实施技术创新的动机。另一方面，在集群内，企业进行创新的可见度较高，创新者的领先效益和示范效应突出，率先进行技术创新的企业所取得的超额垄断利润，无形中给其他的企业以很大竞争压力和利润驱动力，从而推动所有企业重视技术创新。技术创新是由市场的需要引起，企业通过组合各种创新资源，运用科学的方法与手段创造出新产品、新工艺，并进行生产，最终进行商业化，当它商业化成功、企业取得利益时，这项技术创新才算成功（也有人认为企业技术创新的过程还包括技术扩散）。在高新技术产业集群中，比邻而居的企业之间由于频繁的交往和经常性的合作，产生了面对面的观察与学习的便利性，一项技术创新很容易为其他企业所发现，其他企业通过对此项技术创新的消化、吸收与模仿，在此基础之上进行技术改良，又导致渐进性的技术创新不断发生，从而形成强大的挤压效应。另外，在产业集群中各行动主体因地域的接近、交往的频繁、亲友的情缘等因素形成与积累了丰厚的社会资本，减少了学习与交流的交易费用。企业只有进行技术创新，才能不断降低成本，不断提高产品质量和服务水平，从而更好地适应市场需求的变化，最终才能在激烈的市场竞争中生存和发展。企业发展了，由企业组成的高新技术产业集群才能生存、发展。同时企业只有进行技术创新才能实现产品、工艺的升级和换代，这也推动了高新技术产业集群技术水平和产业结构的优化和升级，从而增强了高新技术产业集群的活力，延长了高新技术产业集群的生命周期。企业技术创新能力是一个产业集群长久地保持竞争优势的关键。在产业集群内，企业的竞争力决定了产业集群的竞争力。在开放式市场经济条件下，企业面临的不仅仅是区域内、国内同行的竞争，而是全球同行的竞争，其中不乏本行的佼佼者。面对这么激烈的竞争和自身拥有资源的不足，企业要想生存下去的最好方法就是从我做起，提高自身的竞争能力——进行技术创新就是众多方法中较好的一个。无数公司成功、失败的经验教训已经证明了这一点。以市场需求为导向，进行技术创新，在提高企业竞争力的同时，也提高了以企业为基础的产业集群的竞争力。使高新技术产业集群在竞争中能生存下来，并不断发展，使技术创新成为高新技术产业集群竞争力的源泉。技术创新是一个极其复杂的过程，单个企业是难以支配创新的全过程的，因而企业与外部环境的联系就显得十分重要。在创新过程中集群企业不是孤立的，他们处于由客户、供应商、竞争者、大学、科研机构以及其他机构构成的社会网络中。企业技术创新是一个系统过程，在这个系统中，企业是技术创新的主体，也是创新投入、产出以及收益的主体，是创新体系的核心。但需要大学与研究机构、其他企业、政府、中介机构以及金融机构五大行动主体构成的技术创新支持系统。这种企业技术创新系统的发展很大程度上得益于产业集群。产业集群的技术创新网络反映了集群中创新行为主体之间的关系，通过横向、纵向的联结，信息、技术、资源在网络内部不断流动和优化配置，从而促进了集群中企业的技术创新行为。不仅产业集群内的同类企业之间要形成一种网络关系，更重要的是还要与非同类企业之间也要结成一定的网络关系。产业的区域集聚就为形成创新的产业网络奠定了基础。企业技术创新是一个动态的系统过程。首先，在产业集群内，由于有大量相关企业的存在，以及中介服务机构和消费者，需求信息流量大、快而且集中，使企业在感知市场动向方面比较方便，能够迅速抓住市场需求，把握市场机会，进行技术创新，以填补市场需求空白。在研发阶段，创新资源大量积聚，如人才、资金等，同时大家对彼此又十分了解，合作的可能性更大，这也降低了创新的风险。面对竞争的压力、利益的驱动力，各个企业必然积极主动地进行技术创新；在产品化阶段，由于集群内集聚了大量相关企业，以及由此形成的交易、技术、社会网络，各个企业通过分工与合作方式进行生产，既降低生产成本，又节省了创新时间，同时相匹配的创新也会在先创新企业的带动下进行起来，这种创新的波动效果会使新产品的相关配套设施迅速完备，加快新产品商业化的过程；最后，在商业化阶段，由于产业集群内已经形成了完善而发达的各种渠道和中介服务机构，加上产业集群本身已经形成的品牌效应，使商业化的时间更短，商业化成功的可能性也更大。集群呈现繁荣景象，完整的创新链形成。成熟的企业技术创新系统是一个高度动态的有序的自组织的创新系统，大量的渐进创新不断涌现出来，产品和工艺不断被更新，它们之间或是互相竞争、互相替代或是互相协同、互相促进。成熟的企业技术创新系统的根本动力来自多样化的市场需求、规模扩张以及子系统之间的竞争和协同。技术创新的真正意义和实际价值，不在于创新本身，而在于这种创新的扩散。技术创新对一个国家或地区经济的影响取决于创新成果在整个经济系统中的扩散效果。技术创新扩散是技术创新通过一定的渠道在潜在使用者之间传播采用的过程。技术创新通过技术扩散系统在潜在使用者之间传播、推广和应用，从而提高产业集群内各企业的技术水平，高集群内企业的经济效益和竞争能力。事实上，产业集群内并非每个企业都有能力和条件进行技术创新，少部分企业的技术创新对产业集群的经济增长、效率提高、竞争能力增强等多方面的影响，绝大部分是通过技术创新扩散形式实现的。也就是说，产业集群内技术创新的成功并不仅仅依靠技术的深度和创新的先进性，更大程度上还要根据市场的接受程度，即技术创新的扩散程度来判断。因此，从某种意义上讲，作为技术创新的后续过程，产业集群内技术创新扩散比技术创新更为重要。培育高新技术产业集群，需要加强技术创新能力与政府的相关政策作用。政府在高新技术产业集群技术创新能力提高的进程中应该积极制定培育政策，采取相关措施推进技术创新的顺利进行。第一，政府在扶植高新区发展时，一方面应增加R&D的投入，另一方面还应积极制定R&D优惠政策，给予积极创新的企业以一定的补偿。由于技术的非独占性，社会希望技术溢出越多越好，而从企业出发，创新的技术溢出越少越好，所以政府必须在二者之间保持一种平衡，使创新的私人受益率与社会受益率趋于协调。政府应建立健全知识产权保护法和完善的产权交易制度，保护创新主体的正当权益，并通过使创新者享有某种特定的津贴，比如税收优惠、利率优惠等政策，调动创新者的积极性。第二，制定有利于高新技术产业集群发展的人才培养和吸引政策，积极引进国内外发展高新技术企业的各种人才。鼓励大学和科研院所的科技人员、研究生以各种形式直接参与高新产业集群的技术创新活动，加强产学研的合作机制。政府通过建立和完善技术入股制度，科技人员持股经营制度、技术开发奖励制度等符合高新技术产业发展的分配形式，鼓励科技人员的技术创新。第三，完善风险投资机制，吸引风险投资机构参与到高新技术产业集群的技术创新中来，转化和扩大企业投资主体，解决高新技术产业发展中的资金“瓶颈”，以便有充足的资金投入给优秀的项目和有很大潜力的高技术项目，从而得到资金保障。积极寻求相匹配的国外直接投资，引进先进的技术、设备和先进的管理经验，为风险投资基金提供规范化的运作经验，从而有利于集群质量的改善和集群稳定地发展。高新技术产业集群是区域产业组织的一种形式，产业的空间集聚对产业创新起到了至关重要的作用。现实的经济发展表明，一个国家的经济增长越来越多地依赖于技术和信息，技术的进展已经成为经济增长的主要推动力，依靠科技进步，实现经济增长方式的明显转变。由于外部经济对高新技术产业发展的特殊意义，外部规模经济使得集聚区内的技术信息增加和共享，为创新提供了更多容易捕捉的机会，企业能更方便地接近市场，了解顾客的消费倾向，减少企业的学习成本，促进技术进步，加速企业的技术创新，推动社会经济的快速发展。

在自然界，植物、微生物和环境之间的关系是极其复杂的。只有详细了解生防微生物在植物根际或叶围与病原物及其他生物、植物及其分泌物、土壤及各种环境因子之间的相互作用及其变化规律，才能有效地调控无机、有机环境，更好地发挥生防微生物的防病功能[1]。国内外在探索环境因素在植物与微生物互作过程中的影响方面，已经开展了较多工作，包括温度、湿度、降雨、光照等气候条件，土壤理化性质，作物栽培条件等。在纳米技术出现之前，人们很难认识到自然环境中的纳米颗粒物对微生物的影响。近年来，大气等环境中纳米颗粒（超细颗粒物）的生物效应已开始深入研究[2，3]，如光催化纳米二氧化钛对很多微生物都具有杀菌作用[4，5]。这样对于暴露在自然条件下的细菌尤其是叶围微生物，适应这种较为苛刻的环境将是细菌生存的一个重要考验。蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus 905菌株是本实验室从植物上分离获得的生防细菌，具有促进植物生长，增强农产品品质和防治多种植物病害的功效[6]，并已开发应用于农业生产，取得了预期的经济、生态及社会效益。前期研究发现，离体条件下该菌株在纳米颗粒光催化作用的影响下存活率明显降低。二氧化钛表面产生的·OH和其他如H2O2、O·2等活性氧都参与了灭菌作用[7]。鉴于光催化纳米二氧化钛具有广谱的杀菌作用，我们必须考虑到它对于自然界中有益微生物的影响。本研究以已在生产中应用的有益芽孢杆菌（Bacillus cereus 905）为研究对象，分析纳米TiO2作用下，该细菌在黄瓜叶围存活能力的变化，有助于阐明纳米颗粒对植物叶围微生物的影响。分别称取适量的纳米TiO2（P25，Degussa Co.），高压灭菌，保存于暗处。使用前加入无菌磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH 7.0），超声波水浴振荡30min使纳米TiO2均一地分散于溶液中。Bacillus cereus 905（GFP），由中国农业大学植病系生防室分离保存并用GFP标记[8]。将B.cereus 905（GFP）接种至含有相应抗生素的LB培养基，30℃160 r/min悬浮振荡培养过夜，1000×g离心收集菌体，用无菌磷酸缓冲液洗涤菌体两次，收获的菌体重新悬浮于磷酸缓冲液中，菌体浓度由平板活菌计数法来确定。所有试验选择在日光温室生长的，4片真叶龄的健康黄瓜植株（Cucumis sativus cv.CAU NO.32）上进行。用B.cereus 905（GFP）菌悬液（108CFU/mL）喷雾接种叶面，或直接将叶面浸润菌悬液3s钟接种。这样的接种程序可以达到107CFU/叶的接种量。接种1h后用美术喷笔（Airbrush，HD-470，台湾）将TiO2悬浮液（0.2mg/mL）均匀喷雾在接种过的叶面上。使用美术喷笔是为了使TiO2以极小的雾粒（平均体积750μm3）覆盖叶围，既不蘸湿叶面也避免了叶围微生物的空间移动[9]。处理后的植株继续在日光温室内培养一定时间后，取样进行原位观察或平板回收。每个处理，随机取5片叶子，每片叶子随机切割6个1cm×1 cm的组织用以原位观察，用激光共聚焦扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope，Nikon EZ-C1）迅速扫描叶的上表面，寻找发绿色荧光细菌，操作要求熟练，防止荧光淬灭。每个取样点，每个处理随机取5片叶子，每片叶子置于预装30mL无菌缓冲液（0.1mol/L磷酸缓冲液，0.1%Bacto-Peptone，pH 7.0）的离心管或灭菌袋中，超声波水浴振荡7min，充分洗脱叶围微生物[10]。叶围洗脱液梯度稀释后，涂布至含有相应抗生素的LB平板上，30℃培养1～2天，通过菌落计数估计B.cereus 905的群体数量。对于纳米二氧化钛光催化杀菌作用机制的研究表明，二氧化钛吸收波长≤387.5nm近紫外光的光能，产生·OH，以及H2O2、O2等活性氧，从而起到杀灭B.cereus 905的作用，纳米二氧化钛本身对于B.cereus 905没有暗毒性[7]，则实验中同时设一个低水平的光照条件作为参比。由于是利用太阳光作为光源，能穿透玻璃到达植物叶面并被纳米二氧化钛所吸收利用的光波绝大多数为UVA（320～400nm），在日光温室的一角通过设遮阳网来创造低UVA剂量的光照条件。纳米二氧化钛处理后的植株继续在日光温室内培养8h，立即取样进行原位观察或平板回收。8h内低UVA剂量的光照条件和正常日照条件下的平均UVA辐射强度分别为0.2mw/cm2和1.3mw/cm2。图1 纳米二氧化钛对B.cereus 905（GFP）在黄瓜叶围存活能力的影响Figure 1 The impact of nano-TiO2 to the survival of B. cereus 905 on the cucumber phyllosphere如图1所示，两种不同UVA剂量光照8h后，在纳米二氧化钛的影响下，B.cereus 905的残余量分别降低为对照（纳米二氧化钛浓度为零）的52.4%（0.2mw/cm2）和11.6%（1.3mw/cm2）。对照处理B.cereus 905的存活能力保持在106CFU/叶的水平，甚至在低UVA剂量的光照条件下，纳米二氧化钛处理的B.cereus 905的存活能力也能维持与对照同一数量级的水平；而在高UVA剂量的光照条件下，B.cereus 905的存活能力明显下降，甚至发生数量级的变化，群体数量比对照下降了88.4%。原位观察结果也与平板回收的结果保持一致（见图2）。对每个叶片随机切取组织块扫描观察发现，在所有的处理中不论是单个细菌还是细菌聚集体，它们在叶围的存在位置与叶表面的结构特征有关。叶表面对于细菌来说是一个非常不平坦的生活环境。它实际上是掩藏有许多不同结构的区域的集合体，包括腺毛、钩毛、气孔、表皮细胞和纹理等。大多数观察到的细菌位于叶的纹理或腺毛处，也有一部分位于表皮细胞上或气孔附近。在纳米二氧化钛处理的叶面，观察到的细菌数量较少，并且很难观察到单个细菌，大多数细菌以聚集体的形式存在。Monier J-M和 Lindow SE也发现菜豆叶面菌Pseudomonas syringae以单个细胞的存在形式比以聚集体的形式对于环境的干燥胁迫更为敏感[11]。图2 Bacillus cereus 905（GFP）在黄瓜叶围存活情况（原位观察）Figure 2 The survival of Bacillus cereus 905 on the cucumber phyllosphere（Microscopy of Bacteria in Situ）本研究表明，在正常日照情况下，B.cereus 905的存活能力明显下降，群体数量比对照下降了88.4%。无论是原位观察还是传统的平板回收结果说明，受二氧化钛光催化杀菌作用的影响，有益微生物B.cereus 905在黄瓜叶围的存活能力明显降低，这与在离体条件下得到的结论[7]相一致。鉴于光催化纳米二氧化钛广谱的杀菌作用，我们必须考虑到它对于自然界中有益微生物的影响。对纳米颗粒物生物效应的研究，是一个急需研究的领域。空气及植物表面等许多地方都存在许多纳米级颗粒，对于暴露在自然条件下的细菌，适应这种较为苛刻的环境将是细菌生存的一个重要考验。尤其是随着纳米包膜肥料、纳米土壤改良剂、二氧化钛光合作用促进剂等的产业化，以及农业生产中的投入使用，会使越来越多的人们注意到这一问题。目前对于纳米颗粒作为环境因素对植物、微生物影响的研究并不多见，本文探讨了有益微生物在植物表面受纳米颗粒影响而产生的存活能力问题，但如何创造生防微生物的适宜环境，或改进其对环境的适应能力以提高生防制剂效果的稳定性，还需要进一步深入的研究。

番茄早疫病菌（Alternaria solani）是保护地和露地番茄生产的重要病害之一，为真菌性病害，为害植株后出现慢性枯萎，植株矮小，果实膨大等，可大幅度降低番茄的产量和品质。我国自20世纪80年代开始发生以来，已经成为番茄设施栽培的限制性障碍[1]。在防治上由于长期大量的化学农药使用，使病菌产生了抗药性，防效逐年降低，同时造成了一定的农药污染[2]。随着环境保护呼声的日益高涨，高毒农药的负面影响已引起世界范围的广泛关注，以高效，低毒农药逐步替代传统的高毒农药是农药发展的必然趋势。植物源农药可在环境中迅速分解，对环境无任何影响，是符合环境保护，农业持续发展方向的[3]。细辛（Asarum siebotdii）是多年生草本植物，据中华临床中药学（上卷）记载，根能入药，具有祛风，散寒，风湿弊痛，抗炎等功效，在中药学上有广泛的用途[4]。本实验用中药细辛的根提取物对番茄早疫病菌的菌丝生长及分生孢子萌发的抑制作用进行了室内活性测定，旨在为开发出一种经济、安全、有效的新型杀菌剂提供理论依据。1.1.1 供试样品 试验所用细辛采自山西省历山自然保护区，将采集的植物材料洗净后在室内阴干（约25℃），放入恒温箱内（40～45℃）烘干，磨碎，过60目筛，备用。1.1.2 供试菌种 番茄早疫菌（Alternaria solani），由山西农业大学农学院植物病理实验室提供。1.2.1 细辛提取物的制备 准确取3份细辛根粉50g，分别装入500ml小烧杯内，加入干粉5倍量的有机溶剂甲醇、氯仿、石油醚。室温下（30±2）℃浸泡3～5天后，过滤并浓缩至稠膏状，称取一定量的提取物，加2～3滴吐温80做乳化剂，并依次配成实验所需的浓度，4℃下保存。1.2.2 细辛提取物对番茄早疫病菌菌丝生长的抑制作用 采用生长速率法[5]，用打孔器取6mm菌落边缘生长旺盛的菌种，放在加药的PDA平板上培养，以培养基内加等量无菌水作对照，每次重复3次，置25℃下培养。用十字交叉法测每个菌落的直径，以其平均值代表菌落的直径，以下式求出抑制菌丝生长率：抑制菌丝生长率%=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-0.6）×100%1.2.3 细辛提取物对孢子萌发的抑制作用 分别将3种有机溶剂的细辛提取物制成最终浓度为1mg/ml的细辛提取液的PDA培养基。待培养基冷却后，取预先配置好的孢子悬浮液10μl，接种到直径为9cm的培养皿中央，用涂布器涂抹均匀，在25℃培养箱中培养48h，观查记录孢子萌发数量。每处理设5个重复，取平均值。计算孢子萌发率和抑制率。孢子萌发率（%）=已萌发孢子数/镜检孢子总数×100%抑制率（%）=（对照萌发率-处理萌发率）/对照萌发率×100%1.2.4 细辛氯仿提取物对番茄早疫病菌菌丝抑制中浓度（MIC）的测试 将细辛氯仿提取物稀释成5个浓度（4mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml），测试不同浓度的提取物对番茄早疫病的病原菌菌丝生长的抑制作用，计算毒力回归方程及抑制中浓度（MIC）。细辛提取物对番茄早疫病菌菌丝生长的抑制作用实验结果如表1。在48h时，石油醚提取物的抑菌率为28%，氯仿提取物的抑菌率为66.67%，而甲醇提取物的抑菌率达到了50%。并且随着时间的推移，3种溶剂提取物的抑菌率都有所下降。同时与对照相比，处理的菌丝在培养皿中出现气生菌丝减少，变粗，向上生长现象。这一结果说明，3种不同溶剂的细辛提取物在浓度为2mg/ml时对番茄早疫病的病原菌均有不同程度的抑制作用。溶剂menstruum菌落直径（mm）与抑制率（%）ColonyRadiusandInhabitingrate48h抑制率Inhabitingrate96h抑制率Inhabitingrate144h抑制率Inhabitingrate甲醇methanol1.8550.002.9051.584.5748.82氯仿chloroform1.4366.672.5060.002.7359.57石油醚Petroleumether2.428.004.2024.216.918.71CK3.10—5.35—8.35—表1 细辛提取物对番茄早疫病菌丝生长的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of Asarum siebotdii extract against mycelia Growth of Alternaria solani细辛提取物对番茄早疫病菌孢子萌发的影响见表2。48h后，石油醚和氯仿提取物表现出了显著的抑制率，对分生孢子萌发抑制率分别为91.48%和88.79%，甲醇提取物表现出了较强的抑菌率，达到53.81%。实验过程中发现，对照皿在接种后32～48h即开始陆续萌发，而提取物各处理均不同程度地表现出萌发推迟的现象。溶剂menstruum孢子萌发率（%）Rateofgerminationofconidia萌发抑制率（%）Percentageofinhibition甲醇methanol42.8253.81氯仿chloroform10.4288.79石油醚Petroleumether7.9291.48CK92.92—表2 细辛提取物对番茄早疫病菌孢子萌发的抑制作用Table 2 Inhabiting effect of the different menstruum of Asarum siebotdii extract against conidiao production of Alternaria solani由表1可见，3种不同溶剂的提取物中氯仿提取物的抑菌效果最好，为了进一步确定其生物活性，求出MIC，将细辛氯仿提取物稀释成5个不同浓度，对病原菌进行测定。结果见表3、表4，6天后，浓度在4mg/ml时，氯仿提取物表现出了显著的抑菌率，达到77.14%，而浓度为0.25mg/ml时，抑菌率显著下降，只有9.5%。这一结果说明，细辛氯仿提取物对番茄早疫病菌菌丝的抑制作用与浓度成正相关，随着浓度的下降，抑菌效果也随之下降。同时在96h时求得毒力方程和氯仿提取物的抑制中浓度（MIC）为1.57mg/ml。病原菌Pathogen浓度（mg/ml）concentration菌落直径（mm）与抑制率（%）ColonyRadiusandInhabitingrate48h抑制率Inhabitingrate96h抑制率Inhabitingrate144h抑制率Inhabitingrate番茄早疫病菌Botrytiscinerea4.00001001.9573.622.2577.142.0001.2364.682.9354.404.1251.271.0001.6243.303.4344.634.7342.730.5001.8530.304.2329.045.7229.130.2502.0419.505.307.507.139.50CK2.39—5.72—7.82—表3 不同浓度的细辛提取物对番茄早疫病菌菌丝生长的抑制作用Table 3 Inhibitory effect of the different concentration of Asarum siebotdii extract against mycelia Growth of Alternaria solani处理Treatment毒力方程?RegressiveequationMIC??相关系数r番茄早疫病菌AlternariasolaniY=2.0910+1.6950x1.570.9707表4 细辛提取物对番茄早疫病的毒力Table 4 Virulence of the extracts of Asarum siebotdii seeds against Alternaria solani植物源农药活性物质主要来源于植物体内产生的次生代谢产物，据Swain于1977年报道，次生代谢产物已超过400000种，如有机酸、萜烯类、生物碱、类黄酮、甾体、酚类、蛋白质、单宁和多糖等[6]。据文献报道，苦参中含有苦参碱（Matrine）和氧化苦参碱（Oxymat-rine）等17种化学结构相似生物碱，其中以苦参碱为其最主要的活性成分，对病原菌有较强抑制作用[7]。另外，毛蒿植物中的毛蒿素，南欧丹参中的硬尾醇，苜蓿根部的苜蓿酸以及海红豆中的紫檀素，黄连体内的小孽碱等均具有很强的抗真菌作用[8]。本实验研究表明，3种溶剂的细辛提取物对番茄早疫病菌菌丝和分生孢子萌发都有不同程度的抑制作用，但它们之间的抑制作用存在差异，在抑制菌丝生长方面，氯仿提取物效果最好，甲醇提取物次之，石油醚提取物效果最差。在抑制分生孢子萌发方面，石油醚提取物效果最好，氯仿提取物次之，甲醇提取物效果较差。由于3种溶剂的极性不同，从以上实验结果初步推断细辛体内抑制番茄早疫病菌的活性物质不止一种，而且极性大小在石油醚和氯仿之间。今后的研究方向是探索分离细辛提取物中的活性成分，为进一步产品开发奠定基础。至于细辛提取物是否对其他病菌有抑制作用，有待在以后的实验中证明。

木霉菌（Trichoderma spp.）广泛存在于土壤及其他基物中，作为生防菌以其生长速度快，产孢量大、作用谱广、作用机制多样、能在植株、土壤中增殖并形成有效群体等诸多优势而备受关注。我们针对蔬菜上常见病害，从土壤中分离、筛选获得对蔬菜病原菌具有较强抑菌活性的绿色木霉菌株Tr9701，通过对其产几丁质酶活性等对其抗病机理进行了初探，同时试验了其在黄瓜叶片、根部的定殖能力，为今后开发可替代某些化学农药的微生物杀菌剂做了基础性工作，现将初步研究结果记述如下。1.1.1 供试菌株 绿色木霉Tr9701（Trichderma viride），由天津市植物保护研究所生防室筛选、鉴定。供试病原菌立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、番茄灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea），由天津市植物保护研究所病害室分离、鉴定。1.2.1 绿色木霉菌制剂几丁质酶检测据Harman等的方法[1]，在胶体几丁质培养基中培养绿色木霉菌，进行产几丁质酶预试验，然后将绿色木霉菌分生孢子液接种到合成诱导液体培养基中诱发几丁质酶产生，以不加胶体几丁质为阳性对照，在28℃，150r/min振荡培养，连续提取培养液制备几丁质酶粗提液。检测采用还原糖法[2]处理，在试管中加入几丁质酶粗提液、10g/L胶态几丁质各1ml，37℃恒温水浴30min，加入DNS10ml，混匀后沸水浴10min，用水冷却至室温，观察颜色变化，以100℃高温灭活处理15min几丁质酶粗提液为对照，试验重复3次。1.2.2 绿色木霉几丁质酶粗提液对病菌的抑菌活性测定 将黄瓜立枯丝核菌、番茄灰葡萄孢霉菌菌丝块转移到平板上，每平皿接种4块，分布于4角，平皿中心放滤纸片并加入100μl几丁质酶粗提液或阳性对照液，重复3次，空白加入等量无菌水，定期观察抑菌圈大小。1.2.3 绿色木霉菌对立枯丝核菌重寄生作用的显微观察 将灭菌赛璐玢膜置于直径90mm的水琼脂培养皿上，在平板两侧各植入经活化培养的绿色木霉和立枯丝核菌菌丝块，25℃下对峙培养，待菌丝接触后置于光学显微镜下观察。1.2.4 绿色木霉菌在黄瓜叶片和根部的定殖 取菜田表层10cm深处土壤，混腐熟的猪粪和蛭石（按3：1：1比例），过筛后，用150倍甲醛液消毒，边喷边混，喷匀后堆起，盖塑料布闷5天，然后晾晒14天，待残药挥发后铺于苗床待用。同时将冰箱保存的绿色木霉菌活化，转接到小麦粉培养基上，在25℃温度下培养7天，培养基上长满菌丝和孢子后，在组织捣碎机中捣碎、过滤，配成绿色木霉菌孢子悬浮液（5×106个孢子/ml）备用。木霉菌叶面定殖：将培养制成的孢子悬浮液用消过毒的手持喷雾器喷雾，均匀喷至黄瓜叶面正反两面，直到叶面上均匀布满一层细微水珠而不流淌为止。喷雾后1h取第一次样，以后每隔一周取一次样，共4次。每次每处理取的叶片剪成0.5cm见方小片，称量取样叶片加入10倍无菌水中振荡（120r/分）15min。取稀释液0.1ml涂布于木霉选择性培养基上，25℃下培养3～4天，5皿重复，计菌落数。以第一次取样所检测到的菌量为接种量，菌量以cfu/g叶表示。木霉菌根际定殖：将培养制成的孢子悬浮液，均匀浇灌至黄瓜根部，直至黄瓜苗根部土壤全部浸润为止。浇灌后1h取第一次样（地下1～2cm处根围土壤），以后每隔3天取一次样，共4次。检查时，分别称取根围土壤1g，加入无菌水20ml中振荡（120rpm）15min。取稀释液0.1ml涂布于木霉选择性培养基上，25℃下培养3～4天，5皿重复，计菌落数。以第一次取样所检测到的菌量为接种量，菌量以cfu/g叶表示。通过预试验，绿色木霉菌Tr9701在胶体几丁质培养基上生长可以形成显著几丁质酶解透明圈，因此进行了绿色木霉菌几丁质酶的诱导试验。诱导条件下几丁质酶粗酶液加入DNS后变为深棕红色，与阳性对照相比有显著差异，说明绿色木霉菌菌株产生几丁质酶，且经诱导处理的绿色木霉菌几丁质酶产生量明显提高，经检测，在培养第5d时达到最大值。绿色木霉菌Tr9701几丁质酶粗提液对立枯丝核菌、灰葡萄孢霉的抑菌活性在平皿接种后2天内，立枯丝核菌、灰葡萄孢霉菌丝生长迅速，但菌丝接近木霉几丁质酶粗提液接种点周围时，生长缓慢，最后停止，从而形成明显抑菌圈。空白对照无抑菌圈，立枯丝核菌菌丝长满平皿，灰葡萄孢霉菌丝长满平皿并形成大量菌核。试验表明，绿色木霉Tr9701的几丁质酶粗提液对立枯丝核菌、灰葡萄孢霉的抑菌圈直径分别为28mm和15mm，比阳性对照的抑菌圈直径大，其差异达到了显著水平。显微观察显示绿色木霉菌对立枯丝核菌具有较强的寄生能力，绿色木霉菌丝与立枯丝核菌菌丝接触后并列生长或缠绕，有时以钩状结构入侵立枯丝核菌菌丝。在接触后期则观察到被寄生的立枯丝核菌菌丝断裂和消解的现象。2.4.1 绿色木霉菌在黄瓜叶面的定殖 绿色木霉菌在叶面上的定殖动态见表1。由结果可知，绿色木霉菌在叶面环境中由于各种条件的影响，第一周内的菌量比初始菌量降低。此后绿色木霉菌适应了叶面环境，菌量逐渐回升，第14天检测菌量为1.02×104cfu/g叶片。21天后菌量持续下降，尤其是第28天菌量降至0.12×104cfu/g叶片。镜检观察绿色木霉菌Tr9701在叶面喷雾后，主要定殖于叶面气孔周围、腺毛基部及叶面凹陷处。这些位点或是分泌物产生处，或是叶面水分分布较多处，能为绿色木霉菌的生长繁殖提供适宜的条件。同时，这些位点也是其他病原菌的竞争位点，通过绿色木霉菌的人工接种，相比病原菌具有种群数量大，出现早的特点。因此，绿色木霉菌对这些位点的抢先占领，不仅有利于本身的生存，而且使黄瓜叶面受到保护，免于病原菌的侵染。重复调查时间1h3天7天14天21天28天11.241.210.941.150.830.1820.960.950.810.920.660.0831.151.080.860.980.790.1441.371.400.951.030.720.10平均1.181.160.891.020.750.12表1 绿色木霉菌孢子在黄瓜叶片上定殖情况（孢子着生量×104个孢子/g）2.4.2 绿色木霉菌在黄瓜根际的定殖 绿色木霉菌在黄瓜根际土壤中定殖结果见表2。由结果可知，第一周内土壤的菌量比初始菌量降低，可能是在根际土壤环境中，由于各种因素的影响，木霉菌受到一定抑制，此后绿色木霉菌适应了土壤环境，菌量逐渐回升，第14天检测菌量为2.64×104cfu/g叶片。21天后菌量持续下降，尤其是第28天菌量降至0.68×104cfu/g叶片。在调查中发现，绿色木霉菌定殖黄瓜根部能力受水分含量和pH值影响明显，水分偏高或偏低都影响绿色木霉菌菌株在黄瓜根部的定殖，pH偏酸性条件下的定殖量明显高于偏碱性条件下的定殖。重复调查时间1h3天7天14天21天28天12.432.371.852.521.090.6422.692.592.032.731.240.7232.362.321.892.611.080.6542.842.561.942.701.110.71平均2.582.461.922.641.130.68表2 绿色木霉菌孢子在黄瓜根部定殖情况（孢子着生量×104个孢子/g）木霉菌腐生性强，适应性广，生长和繁殖快，可迅速利用营养和占据空间，是当前微生物菌剂控制病害的研究热点[3]。本试验结果表明，我们所筛选的绿色木霉菌Tr9701有较强的产几丁质酶活性，且经诱导处理酶产量明显提高，其酶粗提液经试验对立枯丝核菌、灰葡萄孢霉有显著抑制作用，通过诱导产生的木霉几丁质酶在对于抑制病原菌的生长具有重要意义。经显微观察发现，绿色木霉Tr9701对于立枯丝核菌是通过趋向生长、识别、接触缠绕和穿透，寄生于病原真菌之上，对立枯丝核菌具有较强的寄生能力。此现象证明，当绿色木霉菌遇到立枯丝核菌等病原菌时，受到刺激和诱导，产生溶菌酶，抑制立枯丝核菌等的生长，并可降解菌丝。生防菌在植物表面的定殖能力反映了生防菌在植物表面与病原菌竞争空间和营养的能力。本研究表明，绿色木霉菌可以在黄瓜叶面和根部定殖。据Darah（1991）报道，根圈微生物的分布与沿根的可溶性碳的分布距离有关，微生物量的积累有赖于根分泌物的释放，因此添加一定的营养可以促进绿色木霉Tr9701的定殖。本研究进一步证明，绿色木霉Tr9701产几丁质酶、寄生、定殖能力强，是较好的生防材料。当前由于生防微生物控制植物病害具无污染、价格低廉的优点，具有广阔的应用前景。因此对绿色木霉菌Tr9701的发酵工艺、田间应用范围等有待进一步研究。