美国白蛾主要通过包装材料、苗木等借助交通工具传播，因此，通过检疫检查防止美国白蛾传入或传出，是防治美国白蛾的主要手段之一。在发生区，根据美国白蛾的生物学特性，通常选择幼虫期作为进行产地检疫的关键时期。踏查时对栽植美国白蛾寄主的防护林、果园、公园及四旁树等进行仔细目测检查，是否发现美国白蛾的幼虫、蛹、成虫和卵。在非发生区，选择与疫情发生区有货物往来的交通要道、货物集散地周围进行目测检查，是否发现有美国白蛾的幼虫、蛹、成虫和卵。由于美国白蛾能适应多种不同的生态环境，但更喜欢生活在阳光充足、温暖潮湿和气味腥臭的地方，所以踏查的重要地点应是道路两侧、城市街道、旅游景点和公园的厨房、餐厅、厕所及家禽家畜养殖场、海鲜产品加工点、捕捞渔具存放地、庭院树木与林地边缘。发现美国白蛾疫情需要进一步掌握危害情况时，要设立标准地进行详细调查。标准地通常选取50～100株样树，根据需要也可增补样树，调查每株树的幼虫网幕数，并将调查结果进行发生程度统计分级。一般地：虫株率2%以下为轻度发生，虫株率2.1%～5%为中度发生，虫株率5.1%以上为重度发生。对来自疫情发生区的林木、果树、灌木等活体、木材、果品、海产品、草制品、植物性包装材料（含铺垫物、遮阴物、新鲜枝条）及装载容器、运载工具、堆放场地、仓库及其周围500m范围内场所进行全面仔细检查，是否发现各虫态的美国白蛾。重点对寄主植物活体表面、植物性包装材料（含铺垫物、遮阴物）的表面进行检查，查看表面是否有成虫、卵、幼虫、蛹及被害状。对木材（原木）的裂缝或树皮开裂处进行检查，对运载工具的缝隙处进行检查，对堆放地和仓库周围树木、房屋屋檐角落进行检查，查看是否有成虫、卵、幼虫、蛹、排泄物、蜕皮物或被害状。对苗木等繁殖材料，抽取货物总量的5%，原木抽取货物总量的10%进行检查。苗木等繁殖材料采取分层抽样方法，原木等采取表层或分层抽样。产地检疫发现疫情时，要根据不同虫态、不同时期的除治方法限期除治。调运检疫发现疫情时，对于数量大又不便拆开的应检物发现疫情应采用溴甲烷熏蒸处理，在15～20℃时用药量为20g/m3，熏蒸时间为24小时。对于植株上检出的美国白蛾幼虫网幕、蛹、成虫等要对染疫物进行销毁。田间检验的重点时期要放在春、夏、秋季。通常幼虫期是检验的关键时期。首先仔细检查美国白蛾寄主植物的枝条、叶片是否缀合网幕，或叶片仅留主脉和叶柄并呈网状，或整体叶片被吃光，然后仔细对网幕、叶片及整株植物进行仔细检查，是否有美国白蛾幼虫危害。对越夏代美国白蛾，仔细检查美国白蛾寄主树皮裂缝、树洞、居民点建筑屋檐缝隙、柴堆里美国白蛾蛹。对越冬代美国白蛾，仔细检查树冠下的石头、瓦块下墙缝中、柴堆里或地表枯枝落叶中是否有美国白蛾蛹。仔细检查寄主叶背面或周围草丛中是否有美国白蛾成虫。还可在田间悬挂诱虫灯诱虫，检查是否有美国白蛾成虫。仔细检查美国白蛾寄主叶片背面是否有美国白蛾卵块。检查调运的寄主植物活体上是否有美国白蛾幼虫、蛹、成虫及被害状。检查运载工具表层和隐蔽处、包装物（铺垫物、遮阴物、新鲜枝条）等是否有美国白蛾幼虫、蛹、排泄物、蜕皮物或被害状。此外，在美国白蛾田间和调运现场检验过程中，发现各虫态的美国白蛾或疑似美国白蛾都要采集标本，并进行进一步的实验室室内检验确定。将田间和调运现场检验过程中采集的各虫态美国白蛾或疑似美国白蛾需制作标本进行识别鉴定。鳞翅目的鉴定一般要以成虫鉴定为准，成虫鉴定最基本的是要制作翅脉标本。翅脉标本制作：取完整成虫的前、后翅，浸入80%的酒精溶液中1～2分钟，然后将翅移入10%稀盐酸液中1～2分钟，用吸水纸吸去稀盐酸，移入10%～15%的漂白液中。如此反复多次，直到翅上的鳞片被完全脱净为止，将无色透明的翅浸入品红溶液中染色，用酒精溶液脱去浮色后浸入二甲苯中1分钟，然后取出放到玻片上，在显微镜或放大镜下观察。室内鉴定：根据美国白蛾各虫态的识别特征进行一一对照，确定是否为美国白蛾。

根癌病是根癌土壤杆菌（Agrobactium spp.）引起的一种顽固性病害，此菌寄主范围广，可侵染93科331个属643个种的植物，包括果树、林木、花卉等多种双子叶植物和部分裸子植物，在生产上造成非常大的损失。调查表明在我国多数种植根癌病寄主植物的地区根癌病均有不同程度的发生。目前生产上明显出现为害的有樱桃、桃树、李子、杏树、葡萄、苹果、梨树、海棠、山楂、核桃、杨树、樱花、玫瑰、月季、啤酒花等果树、林木和花卉，不同地区发生情况不同。根癌病的症状表现是在植物的根部（有时在茎部，所以也称冠瘿病）形成大小不一的肿瘤，初期幼嫩，后期木质化，严重时整个主根变成一个大肿瘤。病树树势弱，生长迟缓，产量减少，寿命缩短，甚至死亡，影响苗圃苗木的质量和成树的生长。重茬苗圃发病率在20%～100%之间不等，发病重的甚至造成毁园。根癌病菌可较长时间的存活在土壤中，从植株的伤口侵入，随苗木的调运进行远距离传播，是土壤传播加苗木传播的细菌性病害。此病菌的致病方式是将其致病质粒上的一段DNA整合到植物的染色体DNA上，随着植物本身的生长代谢来刺激植物细胞增生形成肿瘤，而病原细菌的细胞并不进入植物的细胞。鉴于根癌菌来源于土壤，所以防治的时间应选择在种子或植株接触未消毒的土壤之前进行种子或苗木的处理，从根本上阻止根癌菌的侵入。伤口是根癌菌唯一的侵染途径，所以保护伤口是最好的防治切入点。根癌菌具有非常特殊的致病机制，一旦有根癌症状表现就证明T-DNA已经转移到植物的染色体上，再用杀细菌剂杀细菌细胞已无法抑制植物细胞的增生，更无法使肿瘤症状消失。目前，利用抗根癌菌剂对植物根癌病进行生物防治是非常实用可行的方法。中国农业大学植物病理学系细菌课题组利用引进的国外K84菌株研制成抗根癌菌剂1号，已经成功用于防治我国多种果树根癌病；并且，分离、筛选到一些具有自主知识产权的根癌病生防细菌，可以弥补国外K84菌株的抑菌谱缺陷。本项目以其中一株高效菌株AE进行研究，以形成可以防治多种植物根癌病的抗根癌菌剂2号，解决国外K84菌株只对核果类果树根癌病有效的问题和局限。以活菌量和抑菌活性为指标，通过单因子和正交试验，从18种液体培养基筛选得到1种相对最适的发酵培养基，明确了在小型发酵罐的发酵条件：温度26～29℃，接种量1.5%～2.5%，罐压0.03～0.05MPa，通气量0.6～0.8（V/V·min）。在发酵培养时，0～6h为迟滞期，6～13h为对数期，13～22h为稳定期，22h以后为衰退期。培养21h细胞数量最多，达到1.6×1012cfu/ml；24h时发酵物对根癌菌的抑制作用最强。通过筛选，确定草炭可作为吸附剂，甲基纤维素和黄原胶可作为防护剂和稳定剂，并将发酵终产物制成了10×108 cfu/g的菌剂。该菌剂在室温（20～25℃）保质期约为100天。在不同地区的田间应用示范证明该菌剂对根癌病的防治效果在70%以上，并且防治效果与菌剂的应用方法有密切关系。

番茄灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）侵染引起的一种在我国乃至全球分布的重要病害。尤其是保护地番茄，其高湿条件为该病流行创造了有利的发病条件。目前番茄生产由于缺少抗病品种，防治番茄灰霉病仍主要依靠化学防治，多采用速克灵等化学药剂喷雾，但在连续使用的情况下，病菌逐渐产生了抗药性，防效逐年下降。此外，大量使用化学药剂也造成了严重的农药残留问题和环境污染问题。近年来人们通过大量筛选和利用抗灰霉病的有益微生物及其代谢产物，使生物防治日益成为番茄灰霉病控制中的一条重要而有效的途径。作者研究了本实验室筛选的拮抗放线菌B1菌株对番茄灰霉病的生防效应，并对其分类地位进行了初步鉴定，为该菌株的应用与开发提供基础。B1菌株是从北京番茄温室土壤中筛选得到的一株拮抗菌，平板抑菌试验结果表明，它对多种植物病原细菌和真菌有较强的抑制作用，其中对灰葡萄孢的抑制能力最强，抑制率达86.3%。B1代谢产物对番茄灰霉菌的菌丝有扭曲、膨大等致畸效应。室内离体检测表明B1菌株对番茄离体叶片和果实的灰霉病均有较好的防治效果。温室试验证实B1菌株对番茄苗期的灰霉病的防治效果在60%以上。根据B1菌株的形态特征、培养特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析结果，将其鉴定为链霉菌属淡紫灰类群（Streptomyces lavendulae）。

木霉菌（Trichoderma spp.）广泛存在于土壤及其他基物中，作为生防菌以其生长速度快，产孢量大、作用谱广、作用机制多样、能在植株、土壤中增殖并形成有效群体等诸多优势而备受关注。我们针对蔬菜上常见病害，从土壤中分离、筛选获得对蔬菜病原菌具有较强抑菌活性的绿色木霉菌株Tr9701，通过对其产几丁质酶活性等对其抗病机理进行了初探，同时试验了其在黄瓜叶片、根部的定殖能力，为今后开发可替代某些化学农药的微生物杀菌剂做了基础性工作，现将初步研究结果记述如下。1.1.1 供试菌株 绿色木霉Tr9701（Trichderma viride），由天津市植物保护研究所生防室筛选、鉴定。供试病原菌立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、番茄灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea），由天津市植物保护研究所病害室分离、鉴定。1.2.1 绿色木霉菌制剂几丁质酶检测据Harman等的方法[1]，在胶体几丁质培养基中培养绿色木霉菌，进行产几丁质酶预试验，然后将绿色木霉菌分生孢子液接种到合成诱导液体培养基中诱发几丁质酶产生，以不加胶体几丁质为阳性对照，在28℃，150r/min振荡培养，连续提取培养液制备几丁质酶粗提液。检测采用还原糖法[2]处理，在试管中加入几丁质酶粗提液、10g/L胶态几丁质各1ml，37℃恒温水浴30min，加入DNS10ml，混匀后沸水浴10min，用水冷却至室温，观察颜色变化，以100℃高温灭活处理15min几丁质酶粗提液为对照，试验重复3次。1.2.2 绿色木霉几丁质酶粗提液对病菌的抑菌活性测定 将黄瓜立枯丝核菌、番茄灰葡萄孢霉菌菌丝块转移到平板上，每平皿接种4块，分布于4角，平皿中心放滤纸片并加入100μl几丁质酶粗提液或阳性对照液，重复3次，空白加入等量无菌水，定期观察抑菌圈大小。1.2.3 绿色木霉菌对立枯丝核菌重寄生作用的显微观察 将灭菌赛璐玢膜置于直径90mm的水琼脂培养皿上，在平板两侧各植入经活化培养的绿色木霉和立枯丝核菌菌丝块，25℃下对峙培养，待菌丝接触后置于光学显微镜下观察。1.2.4 绿色木霉菌在黄瓜叶片和根部的定殖 取菜田表层10cm深处土壤，混腐熟的猪粪和蛭石（按3：1：1比例），过筛后，用150倍甲醛液消毒，边喷边混，喷匀后堆起，盖塑料布闷5天，然后晾晒14天，待残药挥发后铺于苗床待用。同时将冰箱保存的绿色木霉菌活化，转接到小麦粉培养基上，在25℃温度下培养7天，培养基上长满菌丝和孢子后，在组织捣碎机中捣碎、过滤，配成绿色木霉菌孢子悬浮液（5×106个孢子/ml）备用。木霉菌叶面定殖：将培养制成的孢子悬浮液用消过毒的手持喷雾器喷雾，均匀喷至黄瓜叶面正反两面，直到叶面上均匀布满一层细微水珠而不流淌为止。喷雾后1h取第一次样，以后每隔一周取一次样，共4次。每次每处理取的叶片剪成0.5cm见方小片，称量取样叶片加入10倍无菌水中振荡（120r/分）15min。取稀释液0.1ml涂布于木霉选择性培养基上，25℃下培养3～4天，5皿重复，计菌落数。以第一次取样所检测到的菌量为接种量，菌量以cfu/g叶表示。木霉菌根际定殖：将培养制成的孢子悬浮液，均匀浇灌至黄瓜根部，直至黄瓜苗根部土壤全部浸润为止。浇灌后1h取第一次样（地下1～2cm处根围土壤），以后每隔3天取一次样，共4次。检查时，分别称取根围土壤1g，加入无菌水20ml中振荡（120rpm）15min。取稀释液0.1ml涂布于木霉选择性培养基上，25℃下培养3～4天，5皿重复，计菌落数。以第一次取样所检测到的菌量为接种量，菌量以cfu/g叶表示。通过预试验，绿色木霉菌Tr9701在胶体几丁质培养基上生长可以形成显著几丁质酶解透明圈，因此进行了绿色木霉菌几丁质酶的诱导试验。诱导条件下几丁质酶粗酶液加入DNS后变为深棕红色，与阳性对照相比有显著差异，说明绿色木霉菌菌株产生几丁质酶，且经诱导处理的绿色木霉菌几丁质酶产生量明显提高，经检测，在培养第5d时达到最大值。绿色木霉菌Tr9701几丁质酶粗提液对立枯丝核菌、灰葡萄孢霉的抑菌活性在平皿接种后2天内，立枯丝核菌、灰葡萄孢霉菌丝生长迅速，但菌丝接近木霉几丁质酶粗提液接种点周围时，生长缓慢，最后停止，从而形成明显抑菌圈。空白对照无抑菌圈，立枯丝核菌菌丝长满平皿，灰葡萄孢霉菌丝长满平皿并形成大量菌核。试验表明，绿色木霉Tr9701的几丁质酶粗提液对立枯丝核菌、灰葡萄孢霉的抑菌圈直径分别为28mm和15mm，比阳性对照的抑菌圈直径大，其差异达到了显著水平。显微观察显示绿色木霉菌对立枯丝核菌具有较强的寄生能力，绿色木霉菌丝与立枯丝核菌菌丝接触后并列生长或缠绕，有时以钩状结构入侵立枯丝核菌菌丝。在接触后期则观察到被寄生的立枯丝核菌菌丝断裂和消解的现象。2.4.1 绿色木霉菌在黄瓜叶面的定殖 绿色木霉菌在叶面上的定殖动态见表1。由结果可知，绿色木霉菌在叶面环境中由于各种条件的影响，第一周内的菌量比初始菌量降低。此后绿色木霉菌适应了叶面环境，菌量逐渐回升，第14天检测菌量为1.02×104cfu/g叶片。21天后菌量持续下降，尤其是第28天菌量降至0.12×104cfu/g叶片。镜检观察绿色木霉菌Tr9701在叶面喷雾后，主要定殖于叶面气孔周围、腺毛基部及叶面凹陷处。这些位点或是分泌物产生处，或是叶面水分分布较多处，能为绿色木霉菌的生长繁殖提供适宜的条件。同时，这些位点也是其他病原菌的竞争位点，通过绿色木霉菌的人工接种，相比病原菌具有种群数量大，出现早的特点。因此，绿色木霉菌对这些位点的抢先占领，不仅有利于本身的生存，而且使黄瓜叶面受到保护，免于病原菌的侵染。重复调查时间1h3天7天14天21天28天11.241.210.941.150.830.1820.960.950.810.920.660.0831.151.080.860.980.790.1441.371.400.951.030.720.10平均1.181.160.891.020.750.12表1 绿色木霉菌孢子在黄瓜叶片上定殖情况（孢子着生量×104个孢子/g）2.4.2 绿色木霉菌在黄瓜根际的定殖 绿色木霉菌在黄瓜根际土壤中定殖结果见表2。由结果可知，第一周内土壤的菌量比初始菌量降低，可能是在根际土壤环境中，由于各种因素的影响，木霉菌受到一定抑制，此后绿色木霉菌适应了土壤环境，菌量逐渐回升，第14天检测菌量为2.64×104cfu/g叶片。21天后菌量持续下降，尤其是第28天菌量降至0.68×104cfu/g叶片。在调查中发现，绿色木霉菌定殖黄瓜根部能力受水分含量和pH值影响明显，水分偏高或偏低都影响绿色木霉菌菌株在黄瓜根部的定殖，pH偏酸性条件下的定殖量明显高于偏碱性条件下的定殖。重复调查时间1h3天7天14天21天28天12.432.371.852.521.090.6422.692.592.032.731.240.7232.362.321.892.611.080.6542.842.561.942.701.110.71平均2.582.461.922.641.130.68表2 绿色木霉菌孢子在黄瓜根部定殖情况（孢子着生量×104个孢子/g）木霉菌腐生性强，适应性广，生长和繁殖快，可迅速利用营养和占据空间，是当前微生物菌剂控制病害的研究热点[3]。本试验结果表明，我们所筛选的绿色木霉菌Tr9701有较强的产几丁质酶活性，且经诱导处理酶产量明显提高，其酶粗提液经试验对立枯丝核菌、灰葡萄孢霉有显著抑制作用，通过诱导产生的木霉几丁质酶在对于抑制病原菌的生长具有重要意义。经显微观察发现，绿色木霉Tr9701对于立枯丝核菌是通过趋向生长、识别、接触缠绕和穿透，寄生于病原真菌之上，对立枯丝核菌具有较强的寄生能力。此现象证明，当绿色木霉菌遇到立枯丝核菌等病原菌时，受到刺激和诱导，产生溶菌酶，抑制立枯丝核菌等的生长，并可降解菌丝。生防菌在植物表面的定殖能力反映了生防菌在植物表面与病原菌竞争空间和营养的能力。本研究表明，绿色木霉菌可以在黄瓜叶面和根部定殖。据Darah（1991）报道，根圈微生物的分布与沿根的可溶性碳的分布距离有关，微生物量的积累有赖于根分泌物的释放，因此添加一定的营养可以促进绿色木霉Tr9701的定殖。本研究进一步证明，绿色木霉Tr9701产几丁质酶、寄生、定殖能力强，是较好的生防材料。当前由于生防微生物控制植物病害具无污染、价格低廉的优点，具有广阔的应用前景。因此对绿色木霉菌Tr9701的发酵工艺、田间应用范围等有待进一步研究。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是土壤和植物微生态的优势种群，内生芽孢，抗逆能力强，繁殖速度快，营养要求简单，对农作物安全。作为植物根际有益微生物，通过分泌抗生物质和生长竞争，在防治植物病害方面发挥多种有益作用[1]。剂型以活体芽孢为主，田间施用可以较长时间的发挥抑制病菌作用[2～3]。枯草芽孢杆菌Xi-55是本课题组从水稻植株上分离、筛选出来的一株活性较强的生防菌株，研究发现对多种植物病原菌具有良好的防治作用[4]。芽孢杆菌的发酵培养是工业化大规模生产芽孢杆菌制剂的前提。本文对所筛选出的枯草芽孢杆菌的发酵条件进行优化，进行20L发酵罐的放大培养研究，以提高其发酵水平，为芽孢杆菌制剂的工业化生产提供参考依据。1.1.1 供试菌株 枯草芽孢杆菌Xi-55，四川省农业科学院植物保护研究所分离获得。1.1.2 培养基 斜面培养基（LB培养基）：酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH值7.0。种子培养基（BPY培养基）：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，酵母膏 5g，葡萄糖 5g，蒸馏水1000ml，pH值7.0。基础发酵培养基（KB培养基）：蛋白胨 20g，甘油 10ml，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，蒸馏水1000ml，pH值7.0。1.2.1 培养方法 将保存在斜面上的菌种用接种环以划线形式接入LB平板上，28℃恒温培养24h活化。将活化的菌株接入装有100ml种子培养基的250ml三角瓶中，在28℃，180rpm条件下，振荡培养36～48h，制备液体种。按1%的接种量接入发酵培养基（100ml/250ml三角瓶），摇床振荡培养，测定发酵菌数量。1.2.2 生长量的测定 采用平板菌落记数法。培养液用10倍梯度稀释法稀释6～7个梯度（101，102，103，……，107）后，选择3个稀释度较高的梯度稀释液，分别吸取50μl在LB平板上，然后用灭菌的L形玻棒将菌液涂匀，每梯度重复3次。28℃恒温培养24～36h后，调查平板上的菌落数，然后计算活菌数（cfu/ml）[5]。1.2.3 培养基的优化 采用正交表L9（34）[6]，四因素三水平安排试验。1.2.4 发酵条件的优化 采用优化培养基通过单因子试验，测定不同时间、温度、初始pH值、接种量和装液量对发酵菌数的影响。1.2.5 扩大培养 采用德国产Biostat C 20L全自动液体发酵罐，配制发酵培养基10L，添加消泡剂CXX-910 0.5‰。种子培养及接种量均同摇瓶试验。发酵技术参数设为：发酵温度28℃±0.5℃，通气量10L/min，搅拌转速180rpm，溶氧控制设定为以通气量为主、转速为辅，罐压0.05～0.06MPa，初始pH值为7.2。每隔4h取样，测定发酵菌数和观察芽孢形成情况，同时记录罐体内pH值变化。分别以培养时间为横坐标，菌数和pH值为纵坐标，绘制枯草芽孢杆菌在发酵罐中培养的生长曲线和pH值曲线。采用L9（34）正交设计方案，分四因素三水平对Xi-55发酵培养，测定高峰期菌数，正交试验因素水平见表1，正交设计及结果见表2，极差分析见表3。结果表明：4种营养成分对其菌数影响的顺序是A＞C＞D＞B，培养基成分优化组合为A3B2C1D3，即蛋白胨3%，甘油1.0%，K2HPO4 0.05%，MgSO4·7H2O 0.15%。试验因素Experimentalfactor水平（Level）（%）123蛋白胨（Peptone）123甘油（Glycerine）0.51.01.5K2HPO40.050.100.15MgSO4·7H2O0.050.100.15表1 培养基优化正交试验因素水平Table 1 Orthogonal experimental factor levels for medium optimization试验号Experimentalnumble水平（Level）（%）A[蛋白胨]PeptoneB[甘油]GlycerineC[K2HPO4]D[MgSO4·7H2O]菌数（Bacteriumamount）（109cfu/ml）111117.01212225.25313331.834212318.585223110.92623129.927313211.428321325.259332123.00表2 培养基优化L9（34）正交设计及结果Table 2 L9（34） orthogonal design and results for medium opitizationA[蛋白胨]PeptoneB[甘油]GlycerineC[K2HPO4]D[MgSO4·7H2O]K14.7012.3315.6113.64K213.1413.8114.068.86K319.8911.588.0615.22R15.192.237.556.36优化组合Optimization-groupA3B2C1D3因素顺序FactororderA＞C＞D＞B表3 培养基优化L9（34）的极差分析Table 3 Range analysis of L9（34） for medium opitization2.2.1 时间对Xi-55发酵细菌数量的影响 每隔12h从摇床上取样，测定发酵液中细菌数量，绘制Xi-55生长曲线。结果显示（图1），在发酵0～12h 之间，菌体生长繁殖缓慢；12～36h 为菌体生长加速期，也为菌体繁殖高峰时期，发酵液内细菌数量明显增加；36～48h为稳定期，菌体数量基本稳定；60h以后为孢子衰亡期，活菌由于自身产生的分解物质而使菌体分解，发酵液变透明。根据该试验结果，36～48h为Xi-55适宜发酵时间。2.2.2 温度对Xi-55发酵细菌数量的影响 分别置于24℃、26℃、28℃、30℃和32℃摇瓶培养，测定不同培养温度的生长量，结果表明（图2），28℃细菌数量最高，28～30℃细菌数基本稳定，低于28℃和超过30℃菌数明显下降。所以28～30℃为Xi-55适宜发酵温度。图1 时间对发酵菌数的影响Figure 1 Effects of time on the bacteria amount图2 温度对发酵菌数的影响Figure 2 Effects of temperature on the bacteria amount2.2.3 初始pH值对Xi-55发酵细菌数量的影响 设定pH值分别为5，6，7，8，9的培养基摇瓶培养，测定细菌生长量。结果显示（图3），当pH值为7时，细菌数量最高，当pH值为 7～8时，细菌数量基本稳定；pH值低于7和超过8，菌数明显减少；且 pH值为9或5时，菌体数量急剧减少或为零，据此推断pH值高于9或低于5时，Xi-55生长可能严重受抑制甚至不能生长，有待进一步研究。所以发酵培养基的适宜初始pH值为7～8。2.2.4 接种量对Xi-55发酵菌数的影响 分别采用0.5%、1%、2%、3%、4%等5个接种量梯度摇瓶培养，测定细菌生长量，结果显示（图4），接种量在0.5%～2%范围内，菌量数随接种量的增加而增加，接种量为2%时，菌量数最高；接种量超过2%，菌数明显减少。总体上来看，菌体生长量并非随着接种量的增加而增加，而是有一个限度。所以，2%为最佳接种量。图3 初始pH值对发酵菌数的影响Figure 3 Effects of initial pH value on bacteria amount图4 接种量对发酵菌数的影响Figure 4 Effects of inoculation amount on bacteria amount2.2.5 装液量对Xi-55发酵菌数的影响 采用装液量分别为50ml/500ml、100ml/500ml、150ml/500ml、200ml/500ml锥形瓶摇床振荡培养，测定细菌生长量，试验结果表明，通过摇瓶装液量的不同来调节通气量对Xi-55发酵菌数有较大影响。一定范围内，装液量越少，则通气量越高，氧气供应越充足，那么细菌数量就越高。50ml与100ml装液量差别不明显，但从总生长量考虑，100ml/500ml锥形瓶为最佳装液量（图5）。图5 装液量对发酵菌数的影响Figure 5 Effects of pack amount on bacteria amount在摇瓶优化发酵条件的基础上，进行了20L发酵罐的扩大培养。从生长曲线（图6）可以看出，发酵罐扩大培养的发酵周期与摇瓶发酵周期基本一致。由于发酵罐的搅拌和通氧条件均优于摇瓶发酵，因此，菌体浓度和芽孢同步形成率都明显优于摇瓶发酵。36h菌体数量达到最高量，50.61×109cfu/ml；然后进入稳定期，开始大量形成芽孢，44h形成芽孢90%以上。分析pH值曲线（图6）发现，初始pH值7.2，随着菌体生长，pH值缓慢下降；对数生长期菌体迅速繁殖，pH值也急剧下降，表明菌体大量利用养分产生了酸性物质；稳定期随着芽孢逐渐形成，pH值回升，44～48h时，芽孢数量达到最大；52h以后pH值上升至7.4左右，可以看到菌体碎片，细胞自溶，表明生长和代谢受到抑制。因此，发酵终止应在52h前，最佳放罐时间应在44～48h。图6 20L发酵罐中的生长与pH值曲线Figure 6 The growth and pH curve in 20L fermentation tank从以上试验可以看出，培养基的组成和时间、温度、培养基初始pH值、接种量、通气量、摇床转速等培养条件均对菌株的生长有很大的影响。通过单因子试验和正交试验方法，确定枯草芽孢杆菌Xi-55优化培养基为：蛋白胨3%，甘油1.0%，K2HPO4 0.05%，MgSO4·7H2O 0.15%；优化发酵条件为：时间36～48h，温度28～30℃，初始pH值7～8，接种量2%，装液量100ml/500ml锥形瓶，摇床转速180～200rpm。并进行了发酵罐扩大培养，36h达到生长高峰期，最适放罐时间44～48h；此时所获得的菌体数量约为50亿个/ml，为大规模工业化发酵培养提供了有益借鉴。在发酵过程中发现，发酵液的黏度较大，很容易产生泡沫，必须用消泡剂来消除。而本试验中采用的发酵专用含硅消泡剂CXX-910对pH值有轻微影响，故添加消泡剂不宜过多。操作时可预先在培养基里添加少量消泡剂，然后通过发酵罐上的补料装置在发酵过程中自行控制补充，这样可以在满足消泡的同时尽量降低消泡剂的添加量，减少消泡剂对pH值的影响，比一次性添加或单纯通过补料装置添加效果要好。

水稻条纹叶枯病由灰飞虱传播的发生严重的水稻病毒病。该病2004年在浙江长兴突然发生，全县发病面积为663.3hm2，发病较重的田块丛病率达50%以上，株病率达17.6%，一般丛病率在10%左右，株病率在1%～5%，其中产量损失10%～30%为21.7hm2，损失30%以上为2.79hm2，涉及15个乡镇，个别严重田块颗粒无收。2005年水稻条纹叶枯病以较快的速度蔓延，6月中旬在长兴夹浦、洪桥、虹星桥、雉城等乡镇的单晚秧田和早播直播稻相继发病，部分严重田块株病率超过25%，7月10日左右，出现第二个症状表现高峰，移（抛）栽稻、直播稻不同程度发病，发病面积达1万hm2，其中66.67hm2损失产量20%以上。针对水稻条纹叶枯病流行的严峻形势，为了有效地控制病害暴发流行，确保水稻生产安全，从2005年起，我们对水稻条纹叶枯病及传毒媒介灰飞虱发生动态进行较为系统的监测，开展了防治技术的研究。现将调查试验结果综述如下：在前一年发病较重的田畈，选取有代表性的田块对水稻条纹叶枯的发生情况进行定期跟踪调查，以观察水稻条纹叶枯病的田间消长规律。从田间调查来看，秧田从6月上旬后期开始发病，6月15日出现第一个症状表现高峰；移栽到大田后，6月23日调查，丛病率为6%，株病率为0.89%，病情指数为0.08，至7月10日左右出现第二个症状表现高峰；以后随着发病株的枯死和分蘖的增加，丛病率和株病率都呈下降趋势，株病率下降相对较快，8月20日左右出现第3个症状表现小高峰（见图1、图2）。从田间发病调查情况看，发病程度最重在7月底，见图3。图1 水稻条纹叶枯病丛发病率增长动态（浙江长兴）图2 水稻条纹叶枯病株病发病率增长动态（浙江长兴）图3 水稻条纹叶枯病病情指数增长动态（浙江长兴）2005年灯下监测，5月中旬成虫开始上升，6月中旬出现了第2代成虫高峰，诱虫量大，诱虫量为2936头，7、8月出现了3、4代成虫的小高峰，9月出现了5代成虫高峰，9月中旬和下旬分别诱到成虫1522头和1722头，10月还有大量的成虫出现，见图4。图4 灯下灰飞虱成虫消长情况（浙江长兴，2005）2006年灯下监测，5月上旬灯下始见，下旬成虫开始上升，迁入水稻秧田为害，6月上旬后期至中旬出现了第2代成虫高峰，为全年虫量最高，诱虫达6337头，7月上旬、8月上旬又出现了3、4代成虫的小高峰，8月底至9月初后灯下虫量上升，出现了5代成虫高峰，诱到成虫1520头；10月灯下诱虫量减少，见图5。图5 灯下灰飞虱成虫消长情况（浙江长兴，2006）2005年4月22日麦田调查，越冬代虫量为5.4万头/hm2，6月16日秧田虫量为13.05万头/hm2，6月21日平均卵量480万粒/hm2，6月28日秧田虫量为4.05万头/hm2，7月下旬虫量为1.05万头/hm2，8月上中旬虫量为0.45万头/hm2，9月上旬虫量为1.5万头/hm2，9月15日虫量为4.05万头/hm2，9月20日虫量为7.5万头/hm2，9月26日虫量为16.5万头/hm2，9月30日虫量为25.5万头/hm2，10月5日虫量为33万头/hm2，10月10日虫量为27万头/hm2，10月15日虫量为10.95万头/hm2。2006年4月上旬麦田调查，越冬代虫量为15.9万头/hm2，6月30日秧田虫量为16.95万头/hm2，7月3日秧田虫量为8.55万头/hm2，7月中下旬田间虫量下降，8月1日虫量为8.55万头/hm2，8月14日虫量为19.95万头/hm2，8月25日虫量为17.25万头/hm2，8月28日虫量为20.1万头/hm2，9月8日虫量为24万头/hm2，9月下旬虫量上升，9月25日为153.45万头/hm2，9月29日虫量为28.55万头/hm2，10月虫量还比较高，10月8日虫量为48万头/hm2，10月12日虫量为31.5万头/hm2，10月17日虫量为30万头/hm2。田间灰飞虱消长曲线见图6。图6 田间灰飞虱发生消长情况（浙江长兴，2006）灰飞虱的发生量和带毒率对水稻条纹叶枯病的发生有着密切的关系，近年来，随着灰飞虱发生量增加和带毒率的提高，水稻条纹叶枯病发生面积扩大，发生程度加重。据测定，2005年长兴县灰飞虱带毒率斑点免疫快速测定为11.27%，2007年达18%。水稻灰飞虱生物法测定传毒率，2006年为6.7%，2007年为7.4%。田间观察，5月中下旬的1代灰飞虱成虫传毒造成秧田和部分早播直播田（5月下旬播种）发病，至6月中旬左右出现了水稻条纹叶枯病的第一个显症高峰；6月上旬后期至中旬的2代灰飞虱成虫高峰造成了7月中旬左右的水稻条纹叶枯病的第2个显症高峰，由于6月上旬后期至中旬的灰飞虱成虫高峰量较大，因此，7月10日左右水稻条纹叶枯病表现高峰来势凶猛，发病面积大，发病程度重；8月中旬在病情发展上有一个小高峰，如2006年8月7日左右个别失治田块出现了第3个症状表现高峰，株病率达20%以上。以后随着水稻的生长，抗逆能力增强，田间虽有大量的灰飞虱成若虫，但基本不发病。水稻条纹叶枯病的防治应立足于预防，采取“抗、避、断、治”的综合防治措施。在目前水稻对条纹叶枯病防治还没有高抗品种的情况下，重点要切断灰飞虱的传毒途径。为此，我们围绕灰飞虱的防治开展一系列的农业防治措施和药剂防治试验，根据水稻条纹叶枯病的感病期，强化药剂浸种、拌种处理和秧苗期、大田前期灰飞虱的防治，配合使用病毒钝化剂，水稻条纹叶枯病得到了有效地控制。在条纹叶枯病重发区，推广秀水63、秀水09等抗病性好的品种，压缩武运粳7号、加育991等感病品种种植。浙江长兴1代灰飞虱成虫迁移高峰期在5月中下旬，推迟至6月上旬播种的直播稻可避开大部分1代灰飞虱的迁入传毒，减少发病机率。水稻条纹叶枯病的感病期主要在秧苗期，水稻秧田期的灰飞虱防治尤其重要。因此，要及时清除农田周边杂草，5月上旬前冬闲田提前翻耕，减少灰飞虱中间寄主，恶化灰飞虱生存环境，抓好麦田灰飞虱的防治，麦田收割后及时灌水翻耕，并抓好“四边”杂草中灰飞虱的防治。同时抓好药剂浸种、拌种处理的秧田期和大田前期的灰飞虱防治。坚持“治杂草和麦田保秧田、治秧田保大田、治大田前期保大田后期”的策略。经过几年来的试验示范，防治灰飞虱以5%锐劲特45～50ml/667m2、40%毒死蜱100～120ml/667m2、50%稻丰散100ml/667m2，加水50kg喷雾防治为佳。在浸种灵浸种的基础上，催芽露白后每千克种子用35%丁硫克百威（稻拌成、稻伴）种子处理干粉剂5g拌种，混拌均匀后播种，随拌随用。在水稻发病前和发病初期，配合使用病毒钝化剂2%菌克毒克100～150ml/667m2防治1～2次，减轻水稻发病程度，减少水稻产量损失。

核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）所致的油菜菌核病是毁灭性的。抗病性鉴定方法是抗病材料筛选和育种的关键。本研究探讨了一种有效的田间病害圃鉴定筛选的方法，该方法中维持适中的病害压力是鉴定区别油菜品系抗性的关键。病害圃中每年连作油菜，在播种前每行施两粒菌核。在开花期利用喷雾系统喷雾保湿。于成熟期按0～4级分级调查病害。在两年的试验中，90个品系发病率在3.3%～100%。发病率和病情指数在重复之间显著相关。小区的病情指数和相对抗性指数基本为正态分布。研究结果表明该方法是有效的、有用的和灵敏的。Sclerotinia sclerotiorum causes a highly destructive disease in oilseed rape(Brassica napus).Methods for identification of resistance to S.sclerotiorum are crucial to screening and selection of resistance materials.In the study,we described a field disease nursery method efficient for resistance screening of breeding lines or germplasm of oilseed rape where maintaining of a suitable disease pressure is considered to be most important in order to differentiate levels of resistance existed in different lines.In the disease nursery,S.sclerotiorum inoculum had been maintained by growing oilseed rape consecutively and by placing two sclerotia in each row before sowing in each of the previous four seasons.During the flowering time,all plants were sprayed with water using a spray system.At maturity,disease severity was assessed on a 0~4 scale and disease index was calculated.In tests of two years,percent diseased plants of 90 lines(3 replicates in each year)ranged from 3.3%~100%.The percent of diseased plants and disease indices were significantly correlated between replicates(P<0.05).The frequency distributions of both disease indices(each plot)and relative resistance indices were in a normal form while the frequency distribution of percent diseased plants was negatively skewed.These data indicated that the method is efficient and useful to differentiate resistance of oilseed rape varieties.

Rice stripe(RSV)has been known to distribute in rice areas all over the world,and it is very hard virus,transmitted by insect vectors,small brown planthopper(SBPH),Laodelphax striatellus,Fallen.Once the rice is infested,there is still no very effective measures to control,even the chemicals.The chemicals'effect is not ideal and more or less they could cause some environmental risks,so there is the common opinion in the IPM system that the rice varieties having resistance to rice stripe is one of the basic and effective measures to control this disease.In 2006 and 2007 for finding the resistant rice varieties that could be used for large scale in the field,the evaluation and screening of rice varieties were conducted in Jiaxing,Zhejiang Province.In 2006,there were 40 varieties provided for the experiement,just like Chunjiang 050,Xiushui 63,Y1,Zheda 510,Tai 03126,HZ586 and so on,and Jia 991 was set to be the control.Similar to 2006 studies,in 2007,there were 20 varieties used in 2006,and newly introduced into 17 varieties,just like Leyou 2,Jiaheyou 261,Bing 04～123,Jiashao 3.The control was still Jia 991.In 2006,the experiment was conducted in the yard of Shuangqiao Academic of Agricultural Science,Xiuzhou,Jiaxing.Last year in this plot rice was planted,and in winter no crop was planted.The water and fertilizer condition was good.The rice was seeded in 2th June,and transplanted to the field in 1st July.Randomed blocking design,and the size of every plot is 30m2,with three replications.The field management was as usual,except for no chemicals use for controlling the SBPH and RSV.In 2007,the experimental field was chose to north suburb of Jiaxing,where last year the RSV occurred hard.The experimental field condition and design were familiar with 2006,and total 111plots.Investigated Methods In 2006,after 5d from 1st July when the rice were transplanted,the investigation was conducted every 5d in field,till the diseases was stable,at that time the total rice tiller and the diseased tiller amount were recorded.Num.VarietiesDiseasepercentageinthefield(%)SSRP=0.05P=0.011Jiahe2156.03aA2Y25.33bB3Jiajing36485.24bB4Y33.9cC5Shaojing04-463.49dD6Jia991(CK)3.07eE7Yongjing04683.02efEF8Y62.88fgEFG9Tai04-42.83gFG10Xiushui032.73ghGH11Qianghu9142.73ghGH12Y102.59hiHI1336You7482.52ijHI14Xiushui092.51ijHI15ZH2512.42jkIJ16Xiushui1102.27klJK17Jingzhi202.27klJK18Y42.23lmJKL19Jia04-332.14lmnKLM20Jiahua12.11mnKLM21Xiushui632.04nLM22Jiahe2182nM23Zheda5101.99nM24Bing01-1131.74oN25R41011.69oN26Y51.59oN27Jingzhi270.94pO28Chunjiang0500.91pO29Chunjiang0510.91pO30Bing03-1230.88pO31Jiaheyou28880.87pO32Zheda5320.86pO33Y80.86pO34Y10.81pO35Ning04-450.45qP36Tai031260.44qP37HZ5860rR38Y70rR39Y90rR40JiaheyouTR0rRTable 1In 2007,after 15th May,when the seeds were seminated,the investigation was conducted periodically in seedling stage till 20th June,when the rice was transplanted,the total rice tiller and the diseased tiller amount were recorded.And in field,30th July,when the disease was stable,the same indexes were recorded.By the total rice tiller and the diseased tiller amount,the disease percentage could be got,and by DPS software the resistance of different rice varieties could be made with ANOVA method.From table 1,we could get that in 2006 the RSV occurred softly in the experimental field,the CK,Jia 991'disease percentage was just 3.07%.Shaonuo 04~46,Y3,Jiajing 3648,Y2,Jiahe 215's were higher than CK;but there were four varieties,Jiaheyou TR,Y9,Y7,HZ586,which no typical RSV was found.By ANOVA analysis,the resisstance of rice varieties were obviously different.Jiaheyou TR,Y9,Y7,HZ586,which no typical RSV was found,the resistance were the highest;the Yongjing 0468,Y6 and CK were in the same level and at P=0.01 there were no obvious difference;and Shaonuo 04～46,Y3,Jiajing 3648,Y2,Jiahe 215 resistance were weak.In 2007,in the field the RSV occurred seriously in the experimental field,the CK,Jia 991'disease percentage was 19.12%(Table 2).Disease percentage of Shi 1 and Yongjing 0468 were 27.8%and 25.65%,respectively;there were 16 varieties,for example Jia 991,the disease percentage were above 10%;and the disease percentage of HZ586,Chunjiang 051,Jiahe 218,Jiaheyou 555 and Y9 were below 2%.By ANOVA analysis,the resistance of these rice varieties were seriously different.Disease percentage of Shi 1 and Yongjing 0468 were obviously higher than CK,their resistance were weak;the disease percentage of HZ586,Chunjiang 051,Jiahe 218,Jiaheyou 555 and Y9 were far below from other variety,their resistance were high;and others resistance were in the middle level.In 2007,in the seedling field the disease percentage of Bing 04～132,Zheda532,Xiushui 09,Xiuishui 110 and Bing 05～15 were all above 5%;the disease percentage of was just 0.07%,and in the Chunjiang 051 there was no RSV found;Other varieties percentage of disease were in the middle of 5%and 0.07%(Table 2).Num.VarietiesDiseasepercentageinthefield(%)SSRP=0.05P=0.01VarietiesDiseasepercentageintheseedlingfield(%)SSRP=0.05P=0.011Shi127.8aABing04-1325.68aA2Yongjing046825.65aAZheda5325.6aA3Bing04-0819.62bBXiushui095.39aAB4Jia991(CK)19.12bBXiushui335.24abAB5Xiushui11018.5bBXiushui1104.85abcABCTable 2 Evaluation of rice varieties resistance to RSV (Jiaxing, 2007)Num.VarietiesDiseasepercentageinthefield（%）SSRP=0.05P=0.01VarietiesDiseasepercentageintheseedlingfield（%）SSRP=0.05P=0.016Bing05-1517.83bBCShi14.34abcdABCD7Bing01-11317.76bcBCJiahua14.34abcdABCD8Y517.33bcBCYongjing04684.24abcdABCDE9Jiahua116.5bcdBCBing05-154.15abcdeABCDEF10Xiushui3316.4bcdBCY53.78abcdefABCDEFG11Ning04-4516.26bcdBCBing04-083.66abcdefgABCDEFGH12Bing04-13215.75bcdBCJia991（CK）2.9bcdefghABCDEFGHI13Zheda53215.69bcdBCY22.88bcdefghABCDEFGHI14Y215.18bcdBCDBing01-1132.81bcdefghiABCDEFGHI15Shi215.06bcdBCDNing04-452.77cdefghijABCDEFGHI16Xiushui0914.99bcdBCDY12.66cdefghijABCDEFGHI17Y112.96cdeBCDEQianghu1712.52cdefghijkABCDEFGHI18Qianghu17112defCDEBing05-1142.48cdefghijkABCDEFGHI19Bing03-019.22efgDEFShi22.26defghijkBCDEFGHI20Bing04-1138.25fghEFGBing03-012.14defghijkBCDEFGHI21Jiaheyou6127.18ghiEFGHBing04-1131.69efghijkCDEFGHI22Bing03-1235.76ghijFGHJiaheyou2611.39fghijkDEFGHI23Leyou25.42ghijFGHJiaheyou6121.23ghijkDEFGHI24Jiaheyou2615.23ghijFGHBing03-1231.11hijkDEFGHI25Jiaheyou16204.76ghijFGHY71hijkEFGHI26Shaonuo04-464.36hijFGHChunjiang0500.99hijkEFGHI27Jiashao34.3hijFGHJiahe2180.94hijkFGHI28Chunjiang0503.22ijFGHLeyou20.9hijkFGHI29Y73.18ijFGHJiaheyou62230.72hijkGHI30Jiaheyou62233.1ijFGHJiaheyou5550.7hijkGHI31台031262.97ijFGHJiaheyou16200.5hijkGHI32Bing05-1142.9ijFGHY90.38hijkHI33HZ5861.83jGHHZ5860.32ijkI34Chunjiang0511.81jGHShaonuo04-460.24jkI35Jiahe2181.78jGHJiashao30.24jkI36Jiaheyou5551.53jHTai031260.07kI37Y90.94jHChunjiang0510kI续表2By ANOVA analysis,the different resistance of these rice varieties also existed.the disease percentage of Bing 04～132,Zheda532 and Xiushui 09 were higher,and their resistance were weak;the disease percentage of six varieties,Chunjiang 051,Tai 03126,HZ586,Shaonuo 04～46,Jiashao 3 and Y9,were lower,and they had comparatively high resistance.Through the rice varieties screening for resistance to rice stripe virus(RSV)in the seedlingstage and in the field in Jiaxing,in 2006 and 2007,the difference of rice varieties resistance to RSV could be found,and the resistance trends between different developmental stage and different year kept in the same trends.Chunjiang 051,Y9,Jiahe218,Jiaheyou 555,Tai 03126 and Bing 03~123,and so on,had the high resistance to RSV.Though most of the results showed that the varieties resistance behave the same in different developmental stage and different year,we also should notice that few varieties did not obey this trends,for example,Shaonuo04～46,in 2006 in the field it showed very weak resistance,but in 2007 in the seedling field it showed high resistance.This perhaps tell us that just use the index of disease percentage is not enough,and at the same time we could ignore that there is still no very clear criterion to evaluate the varieties resistance to RSV.These factors could influence our evaluation.In 2006 the RSV occurred softly in the experimental field,the CK,Jia 991 disease percentage was just 3.07%,but in 2007 the CK,Jia 991's disease percentage was 19.12%,far higher than that in 2006.That is because in 2007 we chose the field where in year before the RSV occurred seriously,and advanced the seeding date and transplanted date accordingly,which the two steps could make the optimal RSV occurring conditions.On other hands,in the same cultivated condition,the disease percentage different varieties could behave 10-folder difference,it could show us clearly that the varieties resistance could exert important role in the RSV IPM system.Research was funded by a grant from Zhejiang province Science and Technology Bureau.