本研究首次开展了与抗炭疽病叶枯病基因 R gls位点紧密连锁的分子标记的筛选，并构建了第一张与抗性基因 R gls位点紧密连锁的分子标记遗传图谱。

培育和种植抗病品种是防控植物病害的重要途径之一。研究苹果对炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，对筛选与炭疽菌叶枯病抗性基因连锁的分子标记，利用分子标记辅助育种有着极其重要的意义。作者采用两个高抗苹果炭疽菌叶枯病品种 （系） ‘富士’和‘QF-2’ （‘秦冠’ב富士’ 杂交后代中的高抗品系）；两个高感病品种 ‘金冠’ 和 ‘嘎拉’ 为亲本配制了4个杂交群体，采用室内人工离体接种的方法对4个杂交组合的F1 单株进行了苹果炭疽菌叶枯病的抗性鉴定，以期揭示苹果炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，为发掘与抗性基因紧密连锁的分子标记，开展苹果抗炭疽菌叶枯病分子育种奠定基础。选择青岛农业大学苹果试验基地 （山东省胶州市） 2009—2014年种植的4个杂交组合的F1 群体及4个亲本作为室内人工接种鉴定的试验材料。4个群体分别是：‘金冠’ב富士’ F1 代 207 株、‘富士’ב金冠’ F1 代95 株、‘嘎拉’ב富士’ F1 代 262 株、‘富士’בQF-2’ F1 代198株。取样期间不喷施农药，其他管理正常。室内人工离体接种采用的病菌取自山东省莱西市南墅镇上庄村的‘嘎拉’ 苹果炭疽菌叶枯病病叶。经鉴定病原为围小丛壳 G. cingulata （Wang et al.，2012）。将收集到的 ‘嘎拉’ 苹果炭疽菌叶枯病病叶在25℃室内保湿培养3 d，从病叶上产生的分生孢子中，挑取单孢，在PDA培养基中培养，获得纯培养菌株，并在5℃冰箱中保存。接种前将保存的菌种转接到PDA培养基中，25℃活化，待菌落长满培养皿的2/3时，用接种环刮除气生菌丝，25℃继续培养2～3 d，直至培养基中长出橘黄色分生孢子角。用接种环挑取适量分生孢子角，放入盛有无菌蒸馏水的烧杯中摇匀，用血球计数板检测孢子悬浮液浓度，调至104 个/ml备用。孢子悬浮液现配现用，放置时间不超过1h。在洁净的单凹载玻片上滴一滴苹果炭疽病菌孢子悬浮液，然后盖上盖玻片，放入底面盛有少许水的培养皿中，盖上皿盖，放入 25℃培养箱中培养12 h。显微镜下观察孢子的萌发力。孢子平均萌发力在20%以上均为可用。从供试苹果树上剪取一年生健壮的新梢，每个材料取 4 个枝条（2个用于接种鉴定，2 个用作对照），剪除枝条两端，保留顶部4 个完全展开的叶片。用0.6%的次氯酸钠对叶片表面消毒，然后用无菌水冲洗，沥干，用小型喷雾器将摇匀后的分生孢子悬浮液均匀喷洒到叶片正反两面，至叶片刚刚开始流水为止。将接种及喷有无菌蒸馏水的枝条 （对照）均匀分插到两个孔穴盘上，置于装有适量蒸馏水的泡沫箱内，加盖密封保湿，置于25℃恒温培养箱内暗培养。4d 后进行抗性鉴定和数据记录，将叶片上无病斑的定为 “抗病”，记为 （R），把有病斑的定为“感病”，记为 （S）。卡方检验采用SPSS13.0软件进行分析。鉴于该病尚无有效防治措施，为防止病原传播，作者未进行田间接种鉴定。通过室内人工接种对4个杂交组合中的4 个亲本及1 个相关品种进行抗性鉴定 （表2-1）。‘富士’ 和 ‘QF-2’ 的叶片无病斑，表现为对炭疽菌叶枯病的高度抗性；‘金冠’ ‘嘎拉’ 和 ‘秦冠’ 的叶片均出现病斑，且病斑数均在20 个以上，表现出对炭疽菌叶枯病易感染性。亲本叶片平均病斑数抗病性富士0抗病（R）QF-20抗病（R）金冠21.1感病（S）秦冠22.8感病（S）嘎拉22.4感病（S）表2-1 不同苹果品种 （系） 对炭疽菌叶枯病抗性的室内接种鉴定离体接种鉴定结果 （附图 2-1） 表明，不同品种和 F1 杂交后代单株对炭疽菌叶枯病抗感表现差异明显。而且这一结果与田间抗性调查结果相符 （附图2-2）。在安徽砀山发病区，‘嘎拉’ （附图2-2 左图） 和 ‘秦冠’ （附图2-2右图） 苹果树干上嫁接 ‘富士’ 枝条，染病后，‘嘎拉’ 和 ‘秦冠’ 的叶片已经全部脱落，‘嘎拉’ 仅剩下光秃的枝干，‘秦冠’ 仅剩下果实，与 ‘富士’ 枝条上翠绿的叶片形成鲜明的对照。这充分显示不同品种 （系） 对苹果炭疽菌叶枯病的抗性差异明显，遗传性对苹果炭疽菌叶枯病的抗性起着主导作用，同时也证实了上述品种 （系） 可以作为苹果炭疽叶枯病遗传规律研究的典型材料。在 ‘金冠’ב富士’ 组合的F1 代群体中，共调查了207株，其中抗病株为 93 株，感病株为 114 株，经适合性检验， x20.05=1.07 （ P＞0.05）；在 ‘富士’ב金冠’ 组合的 F1 代群体共调查 95 株，其中抗病株为 40 株，感病株为 55 株， x20.05=1.20 （ P＞0.05） （表2-2）。二者卡方值均小于 x20.05=3.84， P 值均大于0.05，说明样本的抗病与感病的表型比值符合1∶1的理论分离比，初步判断该试验组合中苹果对炭疽菌叶枯病的抗性由单基因控制。计算 ‘金冠’ב富士’ 组合正反交之间抗感差异得卡方值0.21 （小于 x20.05=3.84），二者没有显著性差异，说明苹果抗炭疽菌叶枯病为细胞核遗传，不受胞质遗传物质影响，即不存在母性遗传效应。杂交组合株数总株数抗病感病抗感比抗感比期望值x2P金冠×富士207931140.82∶11∶11.070.30富士×金冠9540550.73∶11∶11.200.27嘎拉×富士26242580.02∶10∶1—0.12富士×QF-2198195365∶11∶0—0.25表2-2 杂交F1 代植株对苹果炭疽菌叶枯病的抗性表现在 ‘嘎拉’ב富士’ 杂交后代群体中，共调查了262 株，出现了4株抗病单株，经适合性检验， P值为0.12，大于0.05，无显著性差异，符合0∶1 的理论比值，表明该杂交后代抗病对感病呈隐性单基因遗传；‘富士’בQF-2’ 杂交后代群体中共调查了198 株，出现3株感病植株， P值为0.25，符合1∶0的理论比值 （表 2-2），说明该杂交后代抗病性受单基因控制。综合上述研究结果，可以确定苹果对炭疽菌叶枯病的抗性由隐性单基因控制。综合不同杂交组合的亲本及后代对苹果炭疽菌叶枯病抗性的表型性状分析结果，可以假设本试验群体中，对苹果炭疽菌叶枯病表现为抗病的植株基因型为rr，感病植株为 RR或 Rr，并由此推测出供试亲本品种 （系） ‘富士’ ‘金冠’ ‘嘎拉’ ‘QF-2’ 的基因型分别为 rr、Rr、RR和rr，‘秦冠’ 为Rr （附图2-3）。病害的发生是寄主与病原菌在一定环境条件下相互作用的结果。所以接种条件和病原菌的致病性对寄主的抗性鉴定结果有着重要的影响。根据Wang等 （2015） 的试验结果，25℃是苹果炭疽菌叶枯侵染的最适温度，自由水或高湿条件是分生孢子萌发的必要条件，接种后第4d病斑数达到最大值，特征最明显。本试验所采用的接种方法和试验条件是根据Wang等 （2015） 所得出的试验结论进行的，采用适宜的孢子浓度、温度、湿度和最佳病斑计数时间，使寄主与病原菌的互作关系得到充分体现。所用的病原菌是从 ‘嘎拉’ 感病叶片上采集、分离、纯化的，对 ‘嘎拉’ ‘金冠’ ‘秦冠’ 等具有强致病性，保证了鉴定结果的可靠性。目前对于苹果炭疽菌叶枯病的一些报道还仅限于对引起病害的相关因素、病原菌的生理学、致病机制、寄主响应及防治措施等方面的研究 （González，2006；Wang et al.，2012；Velho et al.，2014；Araujol and Stadnik，2013；Wang et al.，2015；王薇等，2015），对于抗性遗传规律、分子标记定位等研究少有报道。作者利用4个杂交群体的后代个体对炭疽菌叶枯病抗性表现进行了综合分析，得出苹果杂交后代中抗炭疽菌叶枯病受隐性单基因控制的结论，这与Dantas等 （2009） 研究认为 ‘嘎拉’ ‘富士’ 等苹果品种对炭疽菌叶枯病的抗性是由一对隐性基因控制的结果相一致。作者认为抗病基因型为rr，感病基因型为 RR或 Rr，由此推测供试杂交群体的亲本品种 （系） ‘富士’ ‘金冠’ ‘嘎拉’ ‘QF-2’ 的基因型分别为rr、Rr、RR和rr，‘秦冠’ 的基因型为Rr。由于苹果在遗传构成上高度杂合，又是自交不亲和植物，杂种树童期较长，对苹果树抗病遗传规律的研究很难采用和借鉴其他作物的遗传群体创建方法，如通过自交，回交，侧交等手段获得 F2、BC 等分离群体。本试验采用 4个不同的杂交群体后代对炭疽菌叶枯病的抗性进行表型鉴定，这一方法可以为类似的果树抗病性遗传研究提供参考。

棉花枯萎病抗性鉴定是病原菌致病性分化、寄主抗性遗传、抗病机制、抗病种质筛选、抗病品种（系）选育等研究中一项不可或缺的重要基础之一。因此，建立一套准确而快速的鉴定方法对于开展棉花抗枯萎病育种和提高枯萎病综合防治等具有重要的理论和实践意义。棉花枯萎病是寄主与病原菌在一定环境条件下相互作用的结果。因此，在研究菌系致病力分化和棉花抗枯萎病遗传育种规律过程中，必须使寄主与病原菌的互作关系得到充分体现，才会获得准确、可靠的试验结果。也就是必须使寄主（棉花）和病原菌（枯萎病菌）均处于良好的生长条件下；接种的病原物必须有适当的浓度和接种量；在寄主发育的适宜时期接种；供试验的寄主应有尽可能大的群体，保证寄主与病原菌的互作关系得以充分体现，还应尽最大可能地减少寄主个体间的互作和病原菌菌系间的互作，避免非接种病原菌的干扰，保证整套试验条件自始至终得以均一化。田间自然病圃鉴定，一般很难达到或满足上述鉴定条件的要求。人工病圃则是通过模拟自然病田的发病环境，设计成可添加接种病原物，又可调节水分，并限制病圃内水分流动，使研究者对鉴定条件的调控能力大为增强，所以，从理论上讲，人工病圃鉴定可获得较为准确可靠的结果。在棉花枯萎病区选择地势平坦、肥力均匀、灌排方便、土质适合植棉的病地或重病地，按照植物检疫要求，采用两种接菌方法建立人工诱发病圃。有条件的地方可建立长20m，宽2m，深0.5m的水泥池，将土壤用氯化苦或氨水进行灭菌处理。人工接入带有棉花枯萎病菌的棉籽或麦粒培养物（菌）。一种方法是在冬耕前，收取感病80%以上的棉秆和残枝落叶，铡成4～6cm长的小节，250～300 kg/亩，均匀地撒于地面，冬耕时翻入耕作层内接菌。若冬耕误了接种时机，可将带病接种用的茎枝，按上法铡成小节后，一层带病茎枝一层土，灌水湿润堆沤，春耕撒于土面，翻耕在耕作层接菌。这种接种方法，我国在20世纪50～60年代的抗性鉴定筛选时普遍采用，效果较好。另一种方法是采用制备接种用的麦粒砂或棉籽菌载菌体，播种或移栽时，每穴接种培养好的棉籽菌载菌体20～30粒或麦粒砂载菌体5～8g，25～30 kg/亩。这种接菌方法，我国在70年代应用较多。两种方法接菌建立的大田人工病圃，第一年最好种植感病品种，以检测病圃的均匀性。鉴定应用时一定要种植感病对照，要求用高感品种，发病率达80%以上，病指60以上，以确保病圃鉴定的准确性。接种用的菌种，应选择致病力强的菌系，不仅棉花品种间抗性易于鉴别，而且鉴定出的抗病品种在病区适应性也广。谭永久等（1980）采用川F5（四川射洪）菌系，转接1～5代的菌种，寄主是洞庭一号，测定不同菌种的致病力（表4-1）。结果以选择1～2代菌种致病最强，3～4代菌种致病有所减轻。因此，抗性鉴定用的接种病菌来源，应选择本地区致病性强的菌系，采集当年大田发病3级以上的病株分离纯化制备成接种病原菌。菌种代数发病株率（%）病指病菌含量（%）1100.0093.083.02100.0093.185.9396.071.042.0497.078.046.0591.072.843.0表4-1 菌种转接代数与致病力在棉花枯萎病的盛发期间，采取感病3级以上的棉花枯萎病株，分离时用镊子（镊子在火焰上灭菌）扯去病棉茎表皮，剪成5cm左右的小段，用0.1%的升汞液（升汞1g、浓盐酸2.5ml、蒸馏水1000ml）表面消毒1～2min，或用10%的漂白粉表面消毒3～5min，再用灭菌水冲洗3次，用灭菌剪刀剪成约5mm的小块，放入马铃薯蔗糖琼脂（PDA）培养基上，在25～28℃的恒温箱中培养，3天后长出菌丝，7天后可镜检菌落，挑取典型棉枯萎病菌丝转入PDA培养基斜面试管，在恒温箱中繁殖培养成一级菌种。以8月中下旬制备为宜。实验室内宜用Zepek's培养液培养，大量培养采用浓淘米水加糖5%，装入500ml三角瓶内；或用按麦粒1份，砂2份配制的麦粒砂培养基，先将麦粒煮沸30mm，混合砂后装入广口瓶内。再经压力1.5kg/cm2灭菌1h，接种一级斜面棉花枯萎菌种每瓶1管，在25℃±1℃的恒温箱内培养10天。若采用浓淘米水培养基，每天必须摇振1～2次，以使病菌均匀加速生长，供制备三级菌种用。以8月中下旬至9月上中旬为宜。菌种培养基用棉籽或玉米，浸泡24h充分吸水，滤至棉籽稍干无滴水，再用麻袋装入棉籽，每袋装相当于棉籽5～6kg，在压力1.5 kg/cm2灭菌1h。取出后冷至50～60℃时，每5kg棉籽接种二级菌液100ml，在26～28℃室内培养7天。待菌丝长满表面后，才逐渐降温，让菌丝生长深透，供翌年土壤接菌用。谭永久等（1980）报道，用每平方米9g、45 g、90 g和450 g棉籽菌粉及每平方米1800g麦粒砂载菌体等5种菌量，以洞庭一号（感）、69-128（耐）、川73-27（抗）3个不同抗感类型的品种研究鉴定菌量。结果以每平方米接种棉籽菌粉45～90g的菌量能明显区分出不同品种的抗性，是达到早期鉴定的适合菌量；每平方米1800g麦粒砂接种土壤发病过重，病势发展快，把抗病品种鉴定成耐病品种，不能正确反映出品种的抗病性。一般品种的苗期抗枯萎病性鉴定，多在温室或纸钵或营养钵中进行，选用从未种过棉花的深层土壤，将培养出的麦粒沙病菌按土重量2%接菌，或用棉籽菌粉按土重0.5%接菌，充分拌匀，装入废报纸做成的营养钵内（纸钵用高10cm、直径7cm的铁皮卷成圆筒作模子，外面裹上旧报纸抽出后成纸钵），每个纸钵装接菌土250g。田间病床的苗期抗枯萎病性的鉴定筛选，育苗苗床，松土一次后，每平方米均匀撒上棉籽菌粉90g，再松土6～8cm深，灌水后将苗床抹平，划格播种。人工水泥槽接菌按纸钵接菌方法进行。温度对抗性鉴定的影响极大。朱荷琴等（1994）连续6年的鉴定试验表明，播种后1个月内日平均气温22℃左右，棉花出苗快，棉苗发病早，播种后20天见病株且病情发展迅速，播种后25～30天达发病高峰期，整个鉴定周期40天左右；在播种后1个月日平均气温低于20℃条件下，棉花发病缓慢，鉴定周期延长。综合诸多试验结果，在保持一定土壤湿度时，床温日平均20～25℃，经过25天后，感病品种发病病指达75以上；18℃以下发病最慢，25天的病指仅55.3，鉴定时间只好延长；26℃以上棉花长势快，高温高湿病指难升高，棉苗病症掩蔽，发病反而慢，25天的病指仅46.7，鉴定品种的抗性难区分。因此，鉴定中最适合的病床温度在23℃左右。早春播种气温偏低，可采用塑料薄膜盖病（苗）床以有利于提高床内温度。当气温在16～22℃时，盖上薄膜可提高床内温度4～8℃，对病菌侵染诱发病害有利，达到早期准确鉴定抗性。利用不同品种在一定鉴定时期内发病指数的差异，以确定不同程度的抗病类型。朱荷琴等（1994）报道，播种后30天的调查结果抗、感品种（系）差异明显，充分体现出了各品种（系）的抗性水平，且感病对照达鉴定要求（病株率80%或病指50左右）。播种后26天的调查结果鉴别力较差，播种后35天的调查结果掩盖了部分抗病性材料的抗性。因此，棉苗发病后每4天左右调查一次，密切注意棉苗发病情况，掌握好感病对照达鉴定要求时的调查是十分重要的。综合多数试验结果，采用早期病床鉴定方法，感病品种5～10天出现症状，20天达到发病高峰，发病率达95%以上，病指70以上；20～25天增长率不大，只是为害程度加重。耐、抗病品种10～15天见病症，20天内病指分别为48.5和34.4，鉴定25天病指达64.8。说明抗、耐、感病品种早期鉴定的历期以25天为宜。鉴定时间短了，会把耐病品种（系）认为抗病类型，达不到早期快速鉴定目的。苗期与成株期鉴定结果之间具有显著的相关性。1975～1979年四川省农业科学院棉花研究所对503个棉花品种（系）进行苗期鉴定和大田病圃成株期鉴定相关性的测定。其中，392个品种（系）相关性达极显著标准，79个品种（系）相关显著，这两者占93.7%，仅32个品种呈负相关，占6.3%。朱荷琴等（1994）对34个品种（系）同时进行苗期与成株期鉴定。并对鉴定结果进行相关分析，相关系数r=0.7819，达极显著水平。说明苗期鉴定与成株期鉴定的抗性趋势基本一致，苗期表现抗病的品种（系）蕾期仍然表现抗病，可利用早期（苗期）鉴定方法，鉴定品种（系）的抗病性。一般使用年限较长的老病圃棉花发病程度会逐渐减轻，病圃出现衰退现象。谭永久等（1980）于1976～1979年研究病圃连续种植抗病品种后病菌致病力的变异。结果表明，以连续种植抗病品种4年的病土，病菌致病力显著减轻；连续种植5年的病菌致病力减轻达极显著水准（表4-2）；在连续种植抗病品种8年后的病土，土壤中病菌的菌量减少显著。说明病圃长期种植抗病品种后，病土中病菌的致病力在逐年减弱，病菌数量逐年减少，致使发病程度逐年减轻。连续种植年数抗病品种（%）感病品种（%）236.441.4352.563.5439.573.5530.159.2625.670.0表4-2 病土连续种植抗感品种后病株率变化朱绍琳等（1985）经多年试验后指出，病田连续种植2～5年抗病品种后，换种感病品种，蕾期发病株率及病指均随抗病品种种植年数的增加而呈下降的趋势，种植年数与病株率及病指呈显著的负相关（P＜0.05），r值分别为-0.8571和-0.8358。1983年种植抗病品种2～4年的，换种感病品种后，病株率和病指均显著高于抗病品种；而种植抗病品种5年的，则无明显的差异。1984年在另一块种植抗病品种5年的病田上，重复进行对比试验，感病品种与抗病品种的病株率和病指也无明显的差异。1984年在上年种植抗病品种4年和5年的两块病田上，继续按上年试验地段进行对比试验，结果表明，连续换种2年感病品种，发病株率和病指上升幅度不大，两块病田种感病品种的发病株率仅比上年分别高0.82%和1.28%，病指分别高0.92和0.82。不仅如此，种植抗病品种5年的病田，连续换种两年感病品种，与抗病品种相比，病株率和病指差异仍不显著。据室内平板测定，病田的土壤含枯萎病菌数也随种植抗病品种年数的增加而有减少的趋势。1983年测定，种植抗病品种2年的土壤枯萎病菌量为5.84×103个/g，3年的为3.75×103个/g，4年的为4.50×103个/g，5年的为0.50×103个/g。同一块病田种植抗病品种的土壤菌量，显著少于种植感病品种。1987～1988年马存等（1992）在枯萎病田种植抗病品种86-1，连作10年后，再种感病品种，病指分别为27.2和6.8，抑菌效果为43.9%和76.2%。1990～1992年辽宁省农业科学院经济作物研究所试验，连作抗病品种10年以上病圃田间抑菌效果为56.2%，连作5年的抑菌效果为17.6%；测定土内菌量减少45.6%和59.2%。总之，为了防止病圃病菌致病力的减退，影响抗性鉴定的准确性，可采取每年施入一定量带病棉秆补充接菌。同时，也可在病圃中多种植感病品种（系），借以繁殖病菌。朱荷琴等（1994）于1991年在原病圃基础上进行了加生土（多年未种植棉花的生沙土）和再接菌试验，病圃加生土25%和再接菌与对照（不加生土不接种）相比，各品种（系）的病指没有明显差异，加生土45%处理与对照相比，中棉所12病指差异不明显，冀棉11病指下降14.59，再接菌处理严重影响出苗（表4-3）。由于每年大量种植感病品种（系），在连续使用5年9轮鉴定试验后，仍不需要接菌，未出现病圃衰退现象。品种（系）加生土25（%）45（%）对照接菌5g/m行长10g/m行长86127.83—28.42—×冀棉1172.2261.6176.2077.20×中棉所1230.8130.7328.3430.94×陕115528.74—26.26—×川732735.80—40.30—×北农878249.92—45.74—×表4-3 病圃加生土和再接种后病指（米荷琴等，1991）为减少因每年需大量枯萎病培养物接种于病圃所耗费的人力与物力，邵圣才等（1999）于1990～1995年在病圃进行了两种接种方法试验：①在病圃每年采用通气培养法生产二级枯萎菌种，再用棉籽培养物扩大培养后接种于病圃，每亩接种25kg棉籽（简称病圃1）；②在病圃的育种材料两行中间种1行感枯萎病品种，每亩用2.5kg感病品种种子，让枯萎病菌在感病棉株上扩大繁殖，待枯萎病发病达高峰期时，调查感病行和育种材料的病株率和病指后，将感病行棉株翻耕于土中，以扩大土中的枯萎菌量，称为活体繁殖枯萎菌（简称病圃2）。经过6年每年种植统一感病品种，比较两种不同接种方法后可看出，头两年病株率和病指差异不大，第三年后致病力的差异较明显地表现出来，种感病品种活体繁殖枯萎病的病圃，病株率和病指都高于棉籽培养枯萎病菌的病圃（表4-4）。证明生物活体繁殖比试管保存棉籽扩大培养物繁殖的枯萎菌生活力强，致病力高，对筛选抗病品种（系）有利。处理项目1990年1991年1992年1993年1994年1995年活体接种（病圃2）病株率（%）63.471.293.593.5100.0097.6病指29.526.739.755.860.458.4培养物接种（病圃1）病株率（%）72.168.576.484.379.665.7病指31.227.632.940.839.730.6病圃2比病圃1病株率（%）-7.82.717.19.220.431.9病指-1.7-0.96.8*15.0**20.7**27.8**表4-4 不同接种方法病圃致病力1995年在两种病圃中，均于两行育种材料中间种1行感病品种。6月23日枯萎病发病高峰期调查结果，两种病圃的中间感病行平均发病率和病指差异显著，与种植感病品种地段的表现一致。感病品种活体繁殖枯萎病的病圃致病力强，且发病均匀，病株率53.7%～100.0%，平均89.4%；病指22.3～71.7.平均57.4。而棉籽培养菌种接种的病圃病株率7.2%～100.0%，平均63.4%；病指1.2～53.7平均29.7。中间行种感病棉株繁殖枯萎菌，可以克服土壤枯萎病菌的不均匀性。这是因为每年可将发病重地段的病株在翻耕时移至病轻地段，使之逐渐均匀，而培养物接种无法均匀病圃。1991～1995年分别将上年两个病圃当选的抗病株行（基本无枯萎病）上升为株系，随机种放在两个病圃中继续鉴定抗病性。每年调查结果表明（表4-5），病圃2中筛选出的抗病株行在株系抗性鉴定时有97.3%～100.0%达到抗枯萎病标准，而病圃1筛选出的抗病株行，在株系抗性鉴定时只有82.5%～93.396%达到抗枯萎病标准。由此可见，用活体繁殖病菌的病菌对抗枯萎病鉴定的准确率高。这也与在枯萎病发病高峰时，对材料的抗性选择参照了中间感病行的发病程度有关。处理项目1991年1992年1993年1994年1995年从病圃2中筛选的株行株系份数110.083.076.065.087.0达标率（%）97.398.8100.0100.098.9从病圃1中筛选的株行株系份数113.094.087.060.075.0达标率（%）82.392.685.193.388.0表4-5 两种病圃对抗病性鉴定的准确率与人工病圃法相比，苗期室内鉴定的优点是比较灵活、易搬动，可人为地控制发病条件，适合于种质资源材料和大批新品种（系）的抗枯萎病性筛选。研究结果表明，室内用毒素检测棉苗的致萎度能反映棉花成株期在田间病圃对棉花枯萎病的抗性程度，即室内用毒素检测棉苗为抗的品种（系），在病圃内也为抗病型，室内为感病反应的品种（系），在病圃内也为发病重的感病型。用旧报纸或牛皮纸卷成10cm×7cm纸钵，每钵放入菌土250g（棉枯萎菌棉籽或麦粒培养物按土重0.08%～1.0%预先接入经消毒的沙壤土中），将钵放在铁皮框盘内然后播种。种子经温汤浸种并用杀菌剂消毒，每个品种（系）播种15个钵，每钵留苗5株。白天温度要求20～25℃，夜间15～18℃，土壤湿度保持在60%～70%。调查方法、分级标准和抗病类型的划分与人工苗床病圃法相同。人工病圃诱发筛选抗病或耐病的品种（系）资源，都需要有一个适宜发病的环境条件和发病过程，需要较长时间，且往往受到自然条件的影响，有可能使本来感病的试验材料不能充分表现其感病性，又需较多的人力、物力投入田间鉴定工作。在室内人工控制条件下，用凝集素检测棉苗的抗病性，就可克服上述问题，加快育种进程。自1888年StillmarK首次从蓖麻籽中发现凝集素以来，人们从植物及动物中陆续发现了凝集素。凝集素是一类具有糖专一性，可促使细胞凝集的蛋白质或糖蛋白。20世纪70年代以来，凝集素的研究在各个方面进展迅速，用途日益广泛，逐渐成为生物学研究中的一类重要物质。一些研究表明，在生物体中，凝集素在寄主与寄生物相互关系的作用中，可能作为对病原微生物的一个防御因素。如草藤（Rleia Cracca）凝集素能抑制土壤中分解其种皮的微生物生长；麦胚凝集素通过与绿色木霉（Trichoderwa viride）和腐皮镰孢（Fusarium solani）的菌丝尖端结合抑制其菌丝生长，孢子萌发和壳多糖合成，起到保护幼苗免被霉菌侵袭的作用。刘士庄等（1984）研究表明，抗枯萎病棉花品种种子磷酸缓冲液（PBS）抽提液对兔血球的凝集作用明显高于感病品种，且其对兔血球的凝集力与品种抗枯萎病呈显著正相关。随后，刘士庄等（1987、1989、1996），张久绪等（1989、1990）和李琼等（1991、1992）进行了这方面研究，在理论与应用两方面均取得重要成果。因为凝集素能使血红细胞凝集，所以，将棉籽或棉株有关部位浸提液与兔血红细胞发生反应，使兔血凝集。在室温25℃左右，湿度不低于70%的条件下，用显微镜检查兔血球的凝集情况。凝集力强度用正、负符号分以下六级记录（图4-1）。①“-”。血球基本分散（图4-1-1）。②“+-”。血球基本分散，但有2～5个血球凝集（图4-1-2）。③“+”。血球5～10个凝集在一起者较多，但分散血球仍居多（图4-1-3）。④“++”。血球20个以下凝集在一起者较多，分散血球减少（图4-1-4）。⑤“+++”。血球20个以上凝集在一起者较多，分散血球很少（图4-1-5）。⑥“++++”。血球30个以上凝集在一起者较多，基本无单个血球（图4-1-6）。棉花品种（系）对枯萎病抗性强、病指低，其棉浸提液对兔血球的凝集力强，血球分散度低。109个品种（系）蕾期调查的病指与室内棉种浸提液对兔血球的聚集力测定比较，选用部分品种列于表4-6。从表4-6可知，高抗枯萎病的代表性棉花品种（系）86-1、52-128、57-681、73-27、陕836、鲁抗1号的田间病指较低，平均为1.8、5.4、8.9、9.8、7.4和4.2，其棉籽浸提液对兔血球凝集力都强，血球凝集程度达到+++，血球分散度均在1.0以下；高度感染枯萎病的代表品种岱字棉15号、达棉1号、豫棉69、邯郸14的田间病指很高，平均为82.2、65.0、43.6、71.1，其棉籽浸提液对兔血球的凝集力都很弱，凝集程度仅+-或-，血球分散度很高，均在3.5或4.0；对枯萎病抗性一般的棉品种（系）其病指多介于高抗和高感品种之间，其棉籽浸提液对兔血球的凝集力亦介于高抗和高感品种（系）之间。图4-1 血红细胞凝集力强度划分（刘士庆等，1984）棉花品种（系）病指分散度凝集力冀合30185.861.5++～++晋B65.782.5+～++鲁抗1号4.22.0++晋72.82.5+～++中3812.02.0++冀3558.93.0+临汾402310.92.0++表4-6 棉种凝集力与田间病指比较（刘士庄等，1987）棉花品种（系）病指分散度凝集力陕8367.41.5+++川41427.21.0+++521285.41.0+++576818.93.0+73279.83.0+8611.81.0+++C724.73.0+邯郸1471.13.5±豫棉6943.63.5±达棉1号65.04.0-岱棉15号82.23.5±珂31073.73.5±苏344635.83.5±表4-6 棉种凝集力与田间病指比较（刘士庄等，1987）（续）-1李琼芳等（1992）对4个中棉品种，3个海岛棉品种及6个半野生棉品种进行血凝活性测定与田间病圃抗枯萎病性的相关性分析结果说明，陆地棉中，抗、感品种间血凝活性有明显差异，中棉及半野生棉均有明显的血凝活性，具有一定的抗枯萎病性，海岛棉血凝活性弱，田间表现不抗枯萎病（表4-7）。种子类型血凝活性病指数幅度平均等级幅度平均病指陆地棉～++++0～4.02.40.3～82.227.24中棉+～++2.0～3.02.525.2～45.730.45海岛棉～±3.5～4.03.7545.2～56.655.40半野生棉+～++2.0～3.02.510.7～17.913.23表4-7 棉花种子凝集素的血凝活性与田间枯萎病指数的相关室内测定血凝活性及田间抗性鉴定的相关系数为0.6716（李琼芳等，1992）、0.4937（刘士庄等，1989），均达1%极显著水准。这表明，室内棉籽浸提液对兔血球的凝集力测定，在鉴定棉种抗病性实践中，具有与田间病圃抗性鉴定同样的效果。张久绪等（1990）报道，凝集素对枯萎病菌孢子萌发具有明显的抑制作用，其抑制效果与凝集素浓度呈正相关，浓度为4mg/ml、2mg/ml、1.25 mg/ml和0.5 mg/ml抑制效果分别为90.61%、991.98%、80.22%和36.67%。（1）苗期棉花子叶期和1～3片真叶期，抗、感品种各行凝集素的活性有明显差异。抗病品种凝集活性物质主要存在于根、茎内，子叶和真叶含量相对较少，感病品种的根、茎血凝活性弱，子叶和真叶无血凝活性。随着棉株生长，4～6片真叶期凝集素分布于全株，抗病品种根、茎、叶均表现血凝活性强，感病品种根、茎、叶的血凝活性均较弱，表明感病品种凝集素的形成较迟（表4-8）。抗病类型品种子叶期1～3片真叶期4～8片真叶期根茎子叶根茎子叶真叶根茎子叶真叶抗861+～++±++～+++++～+++±～±+++++～+++～++7327+～++±++～+++++～+++±～±++～+++++～++++～+++～++感达棉1号±～+—+±——+±±±726870±—±——±±±±表4-8 棉花苗蕾期各组织凝集素的活性比较（李琼芳等，1991）（2）花铃期在花铃期，抗、感品种间血凝活性差异不很显著，整个棉株各组织均表现明显的血凝活性。感病品种在这一生长发育阶段，凝集物质有逐渐增多的趋势，尤其是主根和中下部茎皮层，表现出较强的血凝活性。抗、感品种间血凝活性差异逐渐缩小，此时也正值棉田感染枯萎病的棉株在蕾期以后病情开始恢复时期，看来棉花生育过程中凝集素的形成，对感染枯萎病病株有促进恢复的作用（表4-9）。抗病类型品种须根主根中下部茎皮层木质部皮层木质部皮层木质部上部茎皮层真叶抗861+++++++++++++++++++～+++～+++7327+++++++++++++++++++～+++～+++～++感达棉1号+++～++++～++±～+±～++726870+++～++++～+++++表4-9 棉花花铃期各组织凝集聚的活性比较（李琼芳等，1991）（3）吐絮期棉花吐絮至拔秆，几次取样测定结果表明（李琼芳等，1991），皮层、叶、枝、铃柄和铃壳的血凝活性均强，无明显差异。收获时，测定抗、感品种健株的种仁血凝活性，两者有明显差异，抗病品种种仁的血凝活性强，感病品种种仁的血凝活性弱。收取抗病品种73—27棉株不同部位的自交铃种子，测定其血凝活性结果显示，不同部位的棉铃种仁浸提液的血凝活性有明显差异，以中部（3～8台）内围棉铃种子血凝活性强且稳定。棉花凝集素广泛存在于陆地棉、中棉、海岛棉的3大棉种中。抗病品种的根和种仁凝集素粗提物，对棉枯萎病菌孢子萌发具有明显的抑制作用，棉花种子内凝集素活性程度与品种的抗枯萎病性呈正相关，血凝活性强的品种，抗性好，反之抗性差。至于棉花凝集素对自身的保护抵抗病原菌的生理功能，以及探索应用棉花凝集素导入组织细胞培育生物技术等，还有待进一步研究。镰刀菌酸（Fusaric Acid，FA）是Fusarium oxysporum中的几个专化型所产生的一种非专化型毒素。自1952年高又曼从F.oxysporum f.sp.lycopersice，F.oxysporum f.sp.vasinfectum和Gibberilla fujikuro首次分离并作为致萎毒素报道以来，先后发现镰刀菌酸可以使棉花、番茄、香蕉、亚麻和西瓜等萎蔫（Mace等，1981）。仇元等（1963）报道，棉花枯萎病病菌的培养滤液的50%稀释液，处理棉苗可使其萎蔫。丁正民（1979）和徐孝华（1984）用棉花枯萎病原菌培养滤液的粗提物，同样可使棉苗萎蔫。王贺祥等（1988）认为，棉花抗镰刀菌酸与抗枯萎病有一定的相互关系。李成葆等（1990）用单一的镰刀菌酸纯品处理棉花，研究了它与棉花抗枯萎病性的关系。结果认为，镰刀菌酸可以用致萎性作为棉花品种抗枯萎病性鉴定的参考指标。棉株根系吸收的FA运输到叶片后，具半透性的原生质膜被破坏，叶片的蒸腾作用所失去的水分远大于根系吸收的水分，破坏了水平衡，造成植株萎蔫。从表4-10可以看出，FA对感病品种的致萎性大于抗病品种。棉苗在100μg/ml浓度的FA溶液中处理6h后，抗病品种中，5173的茎萎蔫率和叶萎蔫率分别为41.2%和20.6%，而感病品种鄂荆92却达99.5%和94.7%。50μg/ml的FA对抗病品种作用小，中棉所12的茎、叶萎蔫率仅分别为5.9%和21.2%，感病品种冀棉11已达31.6%和52.6%。FA处理10h后，高浓度（100μg/ml）下，抗、感品种的茎、叶均已全部萎蔫，这表明，此时FA的作用已超过抗病品种所能忍受的范围，抗、感品种均表现出高敏感性，掩盖了其抗性差异。但低浓度（50μg/ml）下，抗病品种中棉所12的茎、叶萎蔫率分别为14.7%和53.7%，感病品种冀棉11已达68.4%和81.6%。由此可见，在一定的条件下，不同抗性品种对FA的致萎性反应差别很大，且与品种抗枯萎病性呈正相关性。时间100μg/ml50μg/ml中5173鄂荆92中12冀棉11茎萎蔫（%）叶萎蔫（%）茎萎蔫（%）叶萎蔫（%）茎萎蔫（%）叶萎蔫（%）茎萎蔫（%）6h41.220.589.594.75.921.231.6对照0.00.00.00.00.00.00.010h100.0100.0100.0100.014.753.768.4对照0.00.00.00.00.00.00.0表4-10 FA对棉苗的致萎性作用（李成葆等，1990）病圃鉴定是评价新品种抗病特性必须经过的程序，其结果对反映该品种在自然情况下的抗病性具有很好的代表性。但因所需时间长和占据空间多，不适于大批材料的抗病性鉴定，而且，受环境条件影响较大，常常会影响鉴定结果的一致性和准确性。此外，还受季节限制。探寻和建立高效、快速、准确的鉴定方法，以满足棉花枯萎病的抗病性鉴定的需要，实属必要。彭姗等（2008）在总结和吸收以往棉花苗期抗枯萎病鉴定方法优点的基础上，研究了病圃鉴定法和液体培养棉花苗期孢子悬浮浸根法鉴定棉花枯萎病抗性的效果。结果表明，液体培养棉花苗期孢子悬浮液浸根法（接种浓度为107个分生孢子）鉴定枯萎病抗性，全周期只需要30天。运用这种方法，不仅可以鉴定出棉花品种对枯萎病菌的抗、感病性，还可以鉴定不同枯萎病菌菌株的致病力。对比不同浸根接种时间（10min、20min、30min、40min、50min、60min）对结果的影响，发现浸根接种40min可加快发病，鉴定结果和田间病圃鉴定的比较一致。棉花品种的抗性鉴定，主要是棉花品种或棉株受病菌侵染后不同程度发病的表现，通过发病率及发病强度的调查进行比较鉴别。病害发病高峰期不同，对抗性鉴别时间也有不同要求。成株期鉴定枯萎病一般在花蕾期（6月下旬至7月中旬）进行田间调查，7～10天一次，连续调查3次。11月下旬拔秆时再进行剖秆考察，结合各次调查结果对棉花的抗病性进行综合评价。苗期鉴定在棉苗开始发病后调查，7天1次，连续调查3次。依棉株的发病程度将其划分为0～4级，共5级，其中，0级为健株，1级发病最轻，4级发病最重，棉株发病分级标准列于表4-11。病级苗期蕾铃期剖秆0健苗、无病状健株、叶片无病状健株、茎秆木质部无病变症状表4-11 棉花枯萎病株分级标准病级苗期蕾铃期剖秆1子叶边缘呈黄色网状或子叶变黄发紫，真叶未显病状病株25%以下叶片表现叶色加深皱缩，叶脉呈黄色网状或叶片变黄，变红紫色等症状茎秆木质部病变（褐色）部分占棉株高度的25%以下2子叶和少数真叶变黄或发紫，叶脉呈黄色网状，株形出现矮化病状病株叶片26%～50%表现病状，株形明显矮化茎秆木质部病变部分占棉株高度的26%～50%3子叶和大部分真叶呈现典型病状，病叶变黄或发紫，叶脉呈黄色网状，株形矮缩或出现萎蔫51%～75%的叶片表现病状，株形矮缩茎秆木质部病变部分占棉株高度的51%～75%4棉苗萎蔫，青枯死亡76%～100%的叶片表现病状，严重时枯焦脱落，枝茎枯死，有时整株出现急性凋萎死亡茎秆木质部病变部分占棉株高度的76%～100%表4-11 棉花枯萎病株分级标准（续）-1根据病圃调查结果，可依次求出以下指标。发病株率能较好反映棉花群体中棉株发病的频率，人工病圃中，以感病对照品种的发病率在75%左右为宜。由于1级病株与4级病株所造成的为害有较大差别，棉花发病率相同，如果棉花发病程度（级别）不同，棉花受病害损失差别较大，所以，发病株率不宜作为抗病鉴定的唯一指标。病情指数，又称病指，能够同时反映棉株发病率和发病程度，较为准确反映出棉花病害对其产量和品质造成的为害。但棉株发病程度会因病圃菌量、气候因素和发病条件的不同而出现较大差异，抗病鉴定中，很难控制使感病对照的病指正好在50左右，这样，易造成同一品种在不同地点或不同年份因棉株发病程度不同而所得的抗病鉴定结果不一致，重演性差，故病指仍然不宜作为抗病鉴定指标。由于以IR或ER作为抗病鉴定指标，其比较标准的对象是感病对照品种，因为对照品种和鉴定材料所处的环境条件完全一致，这样，可以最大限度排除鉴定条件对鉴定结果的影响，有效提高了棉花抗病鉴定结果的准确性和可比性，大大减少了因鉴定地点或鉴定年份不同而造成的误差，重演性较好。所以，相对抗性指数（IR）和相对抗病效果（ER）最适合作为棉花抗枯萎病的鉴定指标。据吴征彬等（2000）研究结果，用IR和ER作为抗病指标所得抗病鉴定结果完全一致，说明这两种指标的抗病分级标准是合适的，两种指标可在抗病鉴定中选择应用。以IR和ER为抗病指标，根据棉花的抗枯萎病程度可将棉花的抗病性分为免疫（I）、高抗（HR）、抗病（R）、耐病（T）和感病（S）5级（表4-12）。指标IHRRTSIR0.00.1～5.05.1～10.010.1～20.0≥20.1ER100.099.9～90.190.0～80.180.0～60.1≤60.0表4-12 棉花对枯萎病的抗性分级标准中文名：棉花枯萎病拉丁学名：Fusarium oxysporum schl.f.sp.vasinfectum（Atk.）Snyder et Hansen英文名：Cotton Fusarium wilt或Fusarium wilt of cotton棉花枯萎病是棉花生产的重要病害之一，广泛分布于世界各主要产棉国家，对棉花生产造成严重威胁。该病在我国各棉区均有发生。据1982年全国普查，病田面积达2223万亩，占当年棉花种植面积的1/3。20世纪90年代，枯萎病在新疆维吾尔自治区各主产棉区呈扩展蔓延的趋势。1995年在新疆维吾尔自治区莎车县、和田地区因该病绝产3.3万亩，1996年又在新疆维吾尔自治区和田地区大面积流行为害。棉花枯萎病可在棉株整个生长季节侵染为害，田间棉苗现蕾出现发病高峰。主要症状有5种。病株子叶和真叶的叶脉褪绿变成黄白色，但叶肉不变色；叶片局部或全部变色，呈现黄色网纹状。这是枯萎病最常见的症状。病株在5～7片真叶期，上部叶片发生皱缩、畸形，叶色深绿，叶片变厚；棉株节间缩短、矮化，表现为皱缩状。这种症状在现蕾期，气候条件适宜的情况下，田间可经常见到。病株子叶或真叶首先从叶缘开始，局部或整个叶片变黄，但不呈现黄色网纹，严重时叶片脱落。这种症状在温室抗性鉴定中最常见，也是苗期（三片真叶以前）枯萎病的主要症状。病株的子叶或真叶突然失水萎蔫，叶片变软，下垂，严重时棉株呈青枯干死，但叶片不脱落。这种症状在气温变化较大，尤其是大雨之后，气温突然升高的情况下，经常出现。病株的子叶或真叶局部或全部变成紫红色，随着病情的发展，叶片从边缘开始凋枯，致使叶片枯萎、脱落，棉株死亡。这种症状较少见，只有在棉花苗期遇较长时间的低温条件下才发生。棉花枯萎病的症状并不是固定不变的，有时以一种症状为主，有时几种症状混合发生，有时前期是这种症状，后期又发展为另一种症状。其症状类型与品种及气候条件更为密切，尤其是气温和降雨。棉花枯萎病的抗性鉴定采用温室苗期纸钵土壤接菌法鉴定，可在任何具有温室（可保证温度在20～25℃）的地区进行，生育期以三片真叶以前的苗期为宜。鉴定中选用一个感病对照和一个抗病对照。抗病对照选择标准：在常规接菌量下病指小于10；感病对照选择标准：在常规接菌量下病指大于50。鉴定材料种植于温室，采用纸钵土壤接菌盆栽法。纸钵为直径6cm，高8cm，随后装入30cm×20cm×9cm的塑料盆中，3次重复，每重复6钵，共18钵，装入一盆中。每个鉴定材料1盆。将经160℃干热灭菌的无菌土与棉花枯萎病菌混匀，枯萎病病菌量为土重的2%～3%。随后装入钵中至2/3高度，放入盆中。播种前先浇300ml自来水，使钵中的土吸足水分，随后将已催芽的种子先拌杀菌剂，再摆放于钵中，每钵6～8粒棉籽。最后用无菌土盖上（高度与钵平齐），再浇入200ml自来水。在我国由于棉花枯萎病菌7号小种分布最广，为此宜选用7号小种，但各地可根据当地的优势小种，选择所用菌系。菌种采用麦粒沙培养（麦沙比为3比1，先将麦粒用水煮涨为止，沥干水分后拌入细沙，装入罐头瓶，湿热灭菌2h；在超净台上将已培养好的枯萎病菌平板或斜面接入其中，随后置25℃温箱培养7～10天。播种后将塑料盆置温室中，进行育苗。温室温度保持在25～28℃之间，切勿超过30℃，进行精心管理。棉苗拱土前，只要钵中土壤不会太干，一般不要再浇水。棉苗出土后，注意保持盆中的干湿度。土壤湿度保持在60%～90%为宜。早晚注意温度变化，防止温度太高和过低。在棉苗第一片真叶长出后，棉花枯萎病陆续开始发生，在播种后1个月左右开始调查各品种的枯萎病发生情况。调查采用V级分级法。可进行数次调查，当感病对照病指达50左右时，即可全面调查各品种的发病率，求出病情指数，进行校正后，评判各品种的抗病水平。温室苗期棉花枯萎病的主要症状为青枯型和黄色网纹型，真叶和子叶发生萎蔫，叶片变软，下垂，叶缘开始凋枯，叶脉变黄色，以致叶片枯萎，棉株死亡。各病级分级标准如下。0级 棉株健康，无病叶，生长正常；Ⅰ级 1～2片子叶变黄萎蔫；Ⅱ级 2片子叶和1片真叶变黄萎蔫，叶脉呈黄色网纹状；Ⅲ级 2片子叶及1片或1片以上真叶变黄萎蔫，叶脉呈黄色网纹状；棉株矮化或萎蔫；Ⅳ级 棉苗所有叶片发病，棉株枯死。根据调查的结果，计算各品种的发病率和病情指数（简称病指）。由于地区间的鉴定存在差异，即使同一地点，年度、批次间，由于鉴定的外界条件不可能完全一致，鉴定结果可能有轻重不同。为此，必须对鉴定结果进行校正，即采用相对病指（简称相对病指）进行校正，方法为鉴定中必须设感病对照，在感病对照病指达50.0左右时进行发病调查。由于感病对照病指不可能刚好为50.0。为此，采用校正系数K来进行校正。K值的求法：感病对照标准病指50.0除以本次鉴定感病对照病指。用K值与本次鉴定中被鉴定品种的病指相乘，求得被鉴定品种的相对病指（IR）以K值在0.75～1.25（相当于病指40.00～66.67）的鉴定结果为准确可靠。根据被鉴定品种的相对病指的大小评定品种的抗性级别。各级别评定标准如表4-13所示。序号抗病类型英文缩写病指标准相对病指标准1免疫I002高抗HR0～5.00～5.03抗病R5.1～10.05.1～10.04耐病T10.1～20.010.1～20.05感病S＞20.0＞20.0表4-13 棉花品种抗枯萎病性评定标准鉴定地点：鉴定时间：年月日K=品种名称总株数0级病株数Ⅰ级病株数Ⅱ级病株数Ⅲ级病株数Ⅳ级病株数发病率（%）病指相对病指表4-14 鉴定结果调查表

SNP （单核苷酸多态性） 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的 DNA 序列多态性，包含单个碱基的转换、颠换等。InDel是指插入/缺失 （Insertion/Deletion） 基因组中小片段的插入和缺失序列，个体重测序中特指1～50 bp 的小片段插入和缺失。在生物的进化进程中，生物全基因组水平上积累了大量的微小变异，主要包括SNP 和InDel。这些微小变异的变异程度决定了物种之间在表型和生理结构等方面的差异，为新物种的形成提供了最原始的动力，是物种多样性的本质体现。SNP 标记是基因组DNA序列中分布最广泛的一类标记，植物基因组中平均每数百bp就存在着一个SNP （Huang et al.，2010；Qi et al.，2013）。InDel标记也是一种重要的遗传标记，已被广泛应用于图位克隆、基因定位、动植物遗传多样性的鉴定、分子标记辅助育种等领域（Jander et al.，2002；Schnabel et al.，2005；王岩等，2009；王明军等，2010）。随着高通量测序技术的快速发展，利用全基因组重测序（whole genome re-sequencing，WGR） 技术结合混合分组分析法（bulked segregate analysis，BSA） 可高效检测出通过双亲杂交建立的后代群体中导致表型变异的 QTL和突变位点 （Abe et al.，2012；Takagi et al.，2013），并且可以识别大量的 SNP 和 InDel 位点，从而进行SNP 及InDel标记的开发，获得基因区间的SNP 及InDel标记。本研究利用WGR技术及 BSA法相结合，获取与抗炭疽菌叶枯病基因相关的SNP 和InDel位点，并通过对△ （SNP-index） 图谱分析，快速锁定抗病区域，再通过ANNOVAR软件分析，提取注释信息，筛选出候选的抗病基因。并利用实时荧光定量 PCR （qRT-PCR） 技术对候选基因经过炭疽叶枯病病原菌侵染后的不同时间段基因表达量的变化进行分析，寻找响应炭疽叶枯病病原菌侵染的抗病相关基因并对其进行详细的功能分析，以期揭示苹果抗炭疽菌叶枯病的分子机制。用于全基因组重测序的材料为 ‘金冠’ ‘富士’ 及第三章中经过抗病鉴定的 ‘金冠’ב富士’ 的 F1 代群体中极端抗炭疽菌叶枯病的20个单株和极端感炭疽菌叶枯病的20 个单株。取其嫩叶3～5 片，液氮速冻，置于-70℃冰箱保存，用于提取DNA。用于qRT-PCR 分析的材料为 ‘富士’ 和 ‘金冠’ 带嫩叶的一年生健壮新梢各30 枝，用于室内人工离体接种。接种方法同第二章，分别于接种后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h七个时间点采集叶片，液氮速冻后，用于提取RNA，检测基因表达。参考Doyle和Doyle （1987） 及 Cullings （1992） 提取基因组DNA的CTAB法，并加以改进，详见第三章。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的纯度和完整性。条带单一、清晰明亮、无降解、无污染的DNA样品作为合格样品用于后续研究。运用NanoPhotometer ? 分光光度计 （IMPLEN，CA，USA） 对DNA的纯度进行检测。DNA经过 Qubit ? DNA Assay Kit in Qubit ? 2.0 Flu-rometer （Life Technologies，CA，USA） 进行浓度的精确定量。将DNA浓度调整为100 ng/μl。苹果嫩叶总RNA的提取方法如下。（1） 将500 μl裂解液RLT Buffer、50 μl PLANTaid、5 μl β-巯基乙醇，依次加入灭菌的1.5 ml离心管中，混匀，待用。（2） 将冻存于-70℃下的苹果嫩叶0.2 g置于预冷的研钵中，加少量液氮快速研磨成细粉状后转入上述待用的的离心管内 （样品容易褐化，动作要迅速，并保证液氮挥发完全）。（3） 56℃温育5～10 min，期间不断剧烈震荡混匀，以保证充分裂解。（4） 12000 r/min 离心10 min，将离心管缓慢从离心机中取出，将上清液转到新离心管中 （吸取上清液时一定要缓慢，尽量不要吸到底部沉淀）。（5） 较精确估计上清液体积，加入 0.5 倍体积的无水乙醇，盖盖，上下颠倒混匀，此时可能会出现沉淀，但是不影响提取的过程。（6） 将混合物 （每次上样应小于800 μl，可分两次加入） 加入吸附柱中，12000 r/min离心60 s，弃废液。（7） 在吸附柱中加700 μl去蛋白液 RW1，室温下放置5 min （可稍延长时间，去除吸附柱上的蛋白污染），12000 r/min 离心30 s，弃废液。（8） 在吸附柱中加入 500 μl 漂洗液 RW （加过无水乙醇），12000 r/min离心 30 s，弃废液。再加入 500 μl 漂洗液 RW，重复1遍。（9） 将吸附柱放回空收集管中，12000 r/min空离心2 min，尽量除去吸附柱中残留的漂洗液。（10） 将吸附柱放入一个 RNase free 离心管中，在吸附膜上加40 μl RNase-free water （最好事先在 70～90℃中水浴加热），室温放置2 min，12000 r/min 离心1 min，如需RNA浓度较高，可重复离心1次。（11） 取4 μl RNA加入6×RNA Loading Buffer，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取的质量与纯度，并估测提取浓度。（12） 将检测质量好的RNA放入-70℃下保存备用。参照 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time） 试剂盒 （TaKaRa）。具体操作步骤如下 （全程冰上操作）。（1） 基因组 DNA 的去除。在 0.2 ml 灭菌的离心管中依次加入1 μg 总 RNA，2 μl 5×gDNA Eraser Buffer，1 μl gDNA Eraser，用RNase-Free水补足10 μl，42℃，2 min （或者室温5 min）；4℃。（2） 反转录反应。在0.2 ml灭菌的离心管中依次加入10 μl步骤1的反应液，1 μl PrimerScript RT Enzyme Mix I，1 μl RT Primer Mix，4 μl 5×PrimerScript Buffer 2 （for Real Time），用 RNase Free 水补足20 μl。37℃，15 min；85℃，5 s；4℃。（3） 质量检测。用 β-actin 基因的引物对反转录的 cDNA 进行PCR扩增，并用1%的琼脂糖电泳检测，选取质量好的样品在-20℃下保存备用。将 ‘金冠’ב富士’ 的F1 代群体中选取出的 20 个极端抗病的单株和20个极端感病的单株DNA等量混合构建成两个表型池。检验合格的4 份 DNA 样品每份取1.5 μg进行基因文库的构建。通过Covaris破碎机将DNA样品随机打断成长度为350 bp的片段。采用TruSeq Library Construction Kit 进行建库，严格使用说明书推荐的试剂和耗材。DNA 片段经末端修复、加 ployA 尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。构建好的文库通过 illumina HiSeqTM PE150进行测序 （附图4-1）。文库构建完成后，先使用 Qubit 2.0 进行初步定量，稀释文库至1 ng/μl，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段 （insert size） 进行检测，符合预期后，使用Q-PCR 方法对文库的有效浓度进行准确定量 （文库有效浓度＞2 nM），以保证文库质量。4个文库检验合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行 Illumina HiSeq TM PE 150 测序。围绕350 bp的片段进行双末端 125 bp 测序。表型差异的两个亲本测序深度为10 X，抗感池测序深度为20 X。信息分析的主要步骤如下 （附图4-2）。步骤一：对下机得到的原始测序数据 （Raw data） 进行质控得到有效测序数据 （Clean data）。步骤二：将Clean data比对到参考基因组上。步骤三：根据比对结果，进行 SNP、InDel 的检测，分析 SNP、InDel的分布情况并进行注释。步骤四：对子代SNP 频率差异进行分析。步骤五：根据分析结果对目标性状区域进行定位。步骤六：确定候选基因。测序得到的原始测序序列 （Sequenced Reads或者 raw reads），里面含有带接头的、低质量的 reads。为了保证信息分析质量，必须对raw reads过滤，得到有效测序序列 （clean reads），后续分析都基于clean reads。数据处理的步骤如下。一是去除带接头 （adapter） 的reads pair。二是当单端测序read中含有的N的含量超过该条read长度比例的10%时，需要去除此对paired reads。三是当单端测序read中含有的低质量 （Q≤5） 碱基数超过该条read长度比例的 50%时，需要去除此对paired reads。有效测序数据通过 BWA （http：//bio-bwa.sourceforge.net/） 软件 （Li and Durbin，2009） 与 ‘金冠’ 苹果的基因组 （ https：//www.rosaceae.org/data/download） 进行比对，确定reads在基因组上的位置。比对结果使用 SAMTOOLS （ http：//samtools.sourceforge.net/）软件进行SNP-calling （Li and Durbin，2009），发掘 reads 与参考序列以及 reads 之间的 SNP 位点，利用 SAMtools 软件中的 “rmdup” 指令去除序列文件中的重复。人们采用GATK3.3软件 （McKenna et al.，2010） 的UnifiedGeno-typer模块进行多个样本 SNP 和 InDel的检测，使用 VariantFiltration进行过滤，SNP 的过滤参数为：cluster Window Size 4，filter Expression“QD＜4.0 ‖ FS＞60.0 ‖ MQ＜40.0”，G filter “GQ＜20”。InDel的过滤参数为：cluster Window Size 4，filter Expression “QD＜4.0 ‖ FS＞200.0 ‖ ReadPosRankSum＜-20.0 ‖ InbreedingCoeff＜-0.8”。利用ANNOVAR软件 （Wang et al.，2010） 对 SNP 和 InDel 检测结果进行注释。SNP 频率的统计：SNP 频率是指所检测到的总的SNP 数与参考基因组序列的总长度的比值，是衡量一个物种变异程度和多态性的指标。转换颠换率的统计：分别统计发生转换和颠换的SNP 数目。子代 SNP 的频率 （Takagi et al.，2013），即 SNP-index，是与SNP 位点的测序深度相关的参数，是指某个位点含有 SNP 的 reads数与测到该位点的总 reads数的比值。以参考基因组作为参照，分析计算两个子代在每个 SNP 位点的 SNP-index。SNP-index计算方法如附图4-3所示。若该参数为0，则代表所有测到的reads都来自作为参考基因组的亲本，即 ‘金冠’。参数为1则代表所有的reads都来自另一个亲本，即 ‘富士’。参数为0.5，代表此混池中的 SNP 来自两个亲本的频率一致。为减少测序错误和比对错误造成的影响，对计算出 SNP-index后的亲本多态性位点进行过滤，过滤标准如下。（1） 两个子代中 SNP-index 都小于0.3，并且 SNP 深度都小于7的位点，过滤掉。（2） 一个子代SNP-index缺失的位点，过滤掉。计算△ （SNP-index），即两个子代 SNP-index 作差：△ （SNP-index）=SNP-index2 （极端抗病性状）-SNP-index1 （极端感病性状）。为直观反映△ （SNP-index） 在染色体上的分布情况，对其在染色体上的分布进行作图。默认选择1 Mb 为窗口，1 kb 为步长。进行1000次置换检验，选取95%置信水平作为筛选的阈值。为了不忽略掉微效QTL的影响，在全基因组范围内挑选两个子代在SNP-index差异显著的SNP 位点，即挑选子代2 （极端抗病性状） SNP-index大于0.7，且子代1 （极端感病性状） SNP-index小于0.3的位点，并与亲本 ‘富士’ 为纯合及亲本 ‘金冠’ 为杂合的位点取交集，做为候选的基因位点。提取ANNOVAR的注释结果，优先挑选使基因获得终止密码子的变异 （stop loss） 或者使基因失去终止密码子的变异 （stop gain） 或者非同义突变 （missense） 或可变剪接的位点（Splicing） 所在的基因作为候选基因。从网站 https：//www.rosaceae.org/gb/gbrowse/malus_x_domestica/下载候选基因的 mRNA，从基因编码区核苷酸序列的近3’端位置设计引物，PCR产物长度在150～250 bp，引物序列见表4-1，内参基因为β-actin基因。荧光定量 PCR 在罗氏 LightCycler 480 系统上进行，反应体系配制按 SYBR Green PCR Master Mix 说明书进行操作，具体如下：10.0 μl SYBR Premix Ex Taq Ⅱ （2×），0.8 μl正反向引物，2.0 μl cDNA，去离子水补足20 μl。反应程序为95℃ 预变性5 min，95℃ 10 s变性，55℃ 10 s退火，72℃ 10 s延伸，扩增45 个循环。循环结束后进行熔解曲线分析：95℃ 15 s，60℃ 20 s，然后缓慢升温至95℃。基因的相对表达量用公式：F=2-ΔΔCt，ΔΔCt=（待测组目的基因 Ct值-待测组内参基因 Ct值）-（对照组目的基因 Ct值-对照组内参基因Ct值）。Illumina HiSeqTM PE150 测序平台，四个样本共产生 47.115 G的测序原始数据 （Raw data），通过对原始数据中的接头序列，低质量碱基以及未测出的碱基 （用 N 表示） 进行过滤后，得到有效数据 （Clean data） 46.974 G，各样本的 Raw data 在 7774.247～17017.174 Mb，Clean date 在7751.990～16969.215 Mb，过滤后获得的有效数据比率在99.64%～99.72%，碱基错配率低于0.05%。测序质量 Q20 ≥ 95.08%、Q30 ≥ 88.97%，GC 含量在 39.04%～39.16%。这表明所有样本的数据量充足，测序质量很高，GC 分布正常，建库测序成功，保证了后续数据分析的准确性 （表4-1）。样本原始数据/bp有效数据/bp有效率/%错误率/%Q20/%Q30/%GC含量/%富士7774246500775199010099.710.0395.4389.6339.16金冠7900566600787192650099.640.0395.5589.8839.05BR（基因抗池）170171739001696921590099.720.0395.4489.6239.04BS（基因感池）144234894001438116750099.710.0495.0888.9739.15表4-1 测序数据质量概况将四个样品的有效数据与已经发布的金冠苹果参考基因组序列（https：//www.rosaceae.org/data） 进行比对，计算出比对到参考基因组 （参考基因组大小为609314018 bp） 上的 reads条数、测序深度及碱基覆盖率。结果表明，四个样品的比对率均在87%以上，两个亲本的测序深度达到15×以上，抗感池样品的测序深度达到 30×以上。在参考基因组中至少有1个碱基覆盖的位点占基因组的比例达到95%以上，至少有 4 个碱基覆盖的位点占基因组的比例 “富士” 为88.3%，“金冠” 为91.26%，其他两样品达到96%以上。这进一步的说明，本试验测序的数据质量很高，可用于后续的变异检测及相关分析 （表4-2）。样本比对到reference上的reads条数①有效测序数据的reads总条数比对率/%②平均测序深度/x③参考基因组中至少有1个碱基覆盖的位点占基因组的百分比/%参考基因组至少有4个碱基覆盖的位点占基因组的百分比/%富士455966535167993488.2315.9595.9588.3金冠459536665247951087.5615.6798.0991.26BR（基因抗池）10045340711312810688.834.4298.896.67BS（基因感池）8962925610163794888.1830.8898.7896.44表4-2 测序深度及覆盖度统计通过全基因组重测序技术共获得3399950个 SNP 位点，苹果参考基因组总长度为 609314018 bp，据此计算出 SNP 出现的频率为3399950/609314018=0.56%。转换 （T/C、C/T） 和颠换 （T/G、T/A、C/A、C/G） 发生频率 （附图 4-4） 的统计结果显示，T/C 和C/T转换发生的频率分别为 32.5%和 34.1%，T/G、T/A、C/A和C/G颠换发生的频率分别为 9.2%、9.4%、9.4%、5.4%。转换/颠换率为2.0。利用测序获得的有效数据，比对苹果参考基因组序列，经 ANN-OVAR软件分析共得到 SNP 位点 3399950个，InDel 位点 573040个，SNP 位点位于内含子上的465317个，位于外显子上的436309个，其中同义变异 210404个，非同义变异 220539个，InDel 位点位于内含子上的 108996个，位于外显子上的 19957个，其中插入或缺失3 或 3 的整数倍的碱基，不改变蛋白质的编码框的有 6928个。这表明绝大部分变异位于非编码区，或不会导致基因编码的改变，这有利于维持植物体正常的生长发育，保证品种特性的稳定遗传 （表4-3）。类别SNP数量基因上游184156获得终止密码子4837失去终止密码子529外显子同义变异210404非同义变220539内含子465317剪接位点2196基因下游177312基因上游/基因下游12750基因间区2105122转换2265734颠换1134216转换/颠换/%1.997合计3399950表4-3 SNP及InDel检测及注释类别InDel数量基因上游51816获得终止密码子376失去终止密码子68Frameshiftdeletion①7330外显子Frameshiftinsertion5255Non-frameshiftdeletion②3843Non-frameshiftinsertion3085内含子108996剪接位点598基因下游44305基因上游/基因下游3896基因间区342800插入262868缺失310172合计573040表4-3 SNP及InDel检测及注释（续）-1△ （SNP-index）=SNP-index B （极端抗病性状）-SNP-index A （极端感病性状）。进行1000次置换检验，选取95%置信水平作为筛选的阈值。一般情况下，在苹果 F1 群体中，由于每个位点的碱基均来源于双亲中的一个，所以在基因组中大部分区域的 SNP-index都在0.5附近。如果某个SNP 位点与抗性相关，那么在该处的 SNP-index就会显著偏离0.5，△ （SNP-index） 就会显著大于此处的阈值。从抗感池中△SNP-index值在染色体上的分布可以看出，在第15 条染色体2～5 Mb区间内△SNP-index值显著的大于阈值，预示着该区域内可能存在着与抗炭疽菌叶枯病基因相关的位点 （附图4-5）。这与第三章SSR标记所确定的抗性基因所在的区域吻合。在全基因组范围内挑选在两个子代池中 SNP-index 差异显著的SNP 位点，即挑选在抗池中 SNP-index 大于 0.7，在感池中 SNP-index小于0.3，△ （SNP-index） 大于 0.5 的 SNP 位点，并与亲本‘富士’ 为纯合，亲本 ‘金冠’ 为杂合的位点取交集，共得到258 个候选的多态性标记位点 （表4-4）。这258 个 SNP 位点中位于基因上游1 kb的19个，基因下游1 kb 的12 个，位于基因上游1 kb 区域，同时也在另一基因的下游1 kb区域的2 个，位于基因间区的173 个。位于外显子上非同义变异的13 个，同义变异7 个，位于内含子上的31个。其中位于第15条染色体上的有123 个，占整个候选 SNP 位点的47.7%。类别SNP数量基因上游19获得终止密码子0失去终止密码子0外显子同义变异7非同义变13内含子31剪接位点1基因下游12基因上游/基因下游2基因间区173转换161颠换97转换/颠换/%1.659合计258表4-4 候选多态性标记位点的注释提取ANNOVAR的注释结果，优先挑选能引起基因获得终止密码子、失去终止密码子的变异，或者非同义突变，或者可变剪接的位点所在的基因作为候选基因。经筛选后得到33 个 SNP 位点及所对应的29个候选基因 （表4-5）。这些SNP 位点中发生转换的 （G/A、C/T、T/C、A/G） 共 16 个，占 48.5%，发生颠换的 （G/C、C/G、G/T、A/C、A/T、T/G、T/A、C/A） 共17 个占51.5%，其中有21 个位于第15条染色体上。基因ID类型染色体SNP位点参考基因组碱基型Ref突变碱基型AltMDP0000294705nonsynonymous24029182TCMDP0000311597upstream26560007TCMDP0000335197upstream238255166CTMDP0000481284nonsynonymous511687941TCMDP0000266783nonsynonymous516570950ACMDP0000223383upstream814935907CTMDP0000203531upstream918259400TGMDP0000265695upstream919790733GAMDP0000224187nonsynonymous1034991229ATMDP0000226279upstream1123158805AGMDP0000480608upstream123704417TGMDP0000504610upstream1229472316TCMDP0000292279upstream151396770CTMDP0000686092nonsynonymous153955717AGMDP0000686092nonsynonymous153955724AGMDP0000686092nonsynonymous153955738TAMDP0000205432nonsynonymous154094431TAMDP0000120033upstream154236293AGMDP0000864010nonsynonymous154257246GAMDP0000945764nonsynonymous154336468CAMDP0000149107splicing154970310CTMDP0000609131upstream156771435CAMDP0000169753upstream157074724ACMDP0000296372upstream157704309CT表4-5 候选基因ID基因ID类型染色体SNP位点参考基因组碱基型Ref突变碱基型AltMDP0000199827upstream157710714TAMDP0000194508nonsynonymous157757532GAMDP0000320004upstream158084422ATMDP0000320004upstream158084636TCMDP0000320004upstream158084637ACMDP0000148808upstream158365795GTMDP0000133266upstream1533862275AGMDP0000157213nonsynonymous1549031042CGMDP0000169687nonsynonymous1552444208TC表4-5 候选基因ID（续）-1结合 SSR标记定位及全基因组重测序中对△ （SNP-index） 值分析的结果，从这29 个候选基因中筛选出位于第15 条染色体3.9～4.9 Mb距离内的5个基因 MDP0000686092、 MDP0000205432、MDP0000120033、 MDP0000864010、 MDP0000945764 做为抗炭疽菌叶枯病的最终候选基因。通过对5个候选基因进行 GO 功能富集分析发现，5 个候选基因中有3个功能未知。基因 MDP0000120033 具有核酸绑定功能，锌离子结合分子功能，参与 RNA 剪切生物过程，调节基因产物的表达。蛋白结构上具有CCHC型结构域的锌指结构，是丝氨酸精氨酸富集剪接因子。进一步同源比对该基因为 SR基因家族 RSZ亚家族基因，与拟南芥AtRSZ21蛋白的序列一致性达到60%，与花生AdRSZ21蛋白的序列一致性达到79%。基因 MDP0000864010 具有辅酶绑定功能，蛋白结构上具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 （磷酸盐） NAD （P） 绑定区域，属于NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族，进一步的同源性比对，该蛋白与鼠李糖生物合成酶 1 （rhamnose biosynthetic enzyme 1，RHM1） 有较高同源性 （表 4-6）。候选基因编码的氨基酸序列见附录五。基因ID基因功能注释MDP0000686092功能未知蛋白MDP0000205432功能未知蛋白质。MDP0000120033核酸绑定功能，锌离子结合分子功能，参与RNA剪切生物过程，调节基因产物的表达。具有锌指结构，CCHC型结构域，丝氨酸精氨酸富集剪接因子。MDP0000864010辅酶绑定功能，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸盐）NAD（P）绑定区域，NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族，可能与鼠李糖生物合成酶1有关。MDP0000945764功能未知蛋白表4-6 抗炭疽菌叶枯病候选基因的功能注释利用TMHMM2.0软件对候选基因进行跨膜结构分析，基因MDP0000686092和MDP0000120033具有跨膜结构。基因MDP0000686092具有1个跨膜区，基因MDP0000120033具有3个跨膜区，位置分别在153～172、187～209、214～236的区域内（附图4-6）。引物名称引物序列MDP0000686092基因荧光定量PCR引物P1-FP1-RF：5′-CAGGCTGGAGCGAAGTTTA-3′R：5′-CCTTTCTGTGATGGCATTGTT-3′MDP0000205432基因荧光定量PCR引物P2-FP2-RF：5′-GAAAAGCCAGCACCAGAAAC-3′R：5′-CGTATTCGTGGGGTTATAGAGC-3′MDP0000120033基因荧光定量PCR引物P3-FP3-RF：5′-TCTGGGAATGCTGCTAAAACTC-3′R：5′-GCAGGGCAGTAGTGAAGCAC-3′MDP0000864010基因荧光定量PCR引物P4-FP4-RF：5′-CGTGACCAATCGCCTAATA-3′R：5′-GGACGTGAGTGCCGTAGAC-3表4-7 荧光定量PCR引物引物名称引物序列MDP0000945764基因荧光定量PCR引物P5-FP5-RF：5′-TTTGCCAGCCTGTCAGAAGT-3′R：5′-AGTTGTAGAGGGAGGAGGAAGA-3′β-actin基因荧光定量PCR引物P6-FP6-RF：5′-CACTGCTTCTATGACTGGTTTTGA-3′R：5′-CTGGCATATACTCTGGAGGCTT-3′表4-7 荧光定量PCR引物（续）-1对接种炭疽菌叶枯病病菌后 0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h的 ‘富士’ 和 ‘金冠’ 枝条进行采样，提取 RNA，反转录成cDNA后，对5个候选基因的表达进行实时荧光定量分析。结果显示，5个基因均不同程度响应病原菌侵染 （附图4-7、 表4-7）。除了基因MDP0000864010在 ‘富士’ 叶片中的表达量表现为下调外，其余 4个基因均为上调表达。在 ‘富士’ 叶片中，基因 MDP0000205432、MDP0000120033和MDP0000945764 的表达量在接种后 24 h 均达到最高值，48 h降到最低值，然后又缓慢提高。在 ‘金冠’ 叶片中的表现不同于 ‘富士’，三个基因表达量的最高值出现在36 h，但最低值同样出现在48 h，这说明在这3个基因在抗病植株中对病原菌的应答要早于感病植株。尽管基因 MDP0000686092 和 MDP0000945764 在‘富士’ 和 ‘金冠’ 叶片中也均表现为上调表达，但是在 ‘金冠’ 叶片中的表达变化更为显著，基因 MDP0000945764 在 ‘金冠’ 叶片中的表达量达到最高值时为接种前的60 倍，而在 ‘富士’ 中的提高量为接种前的10倍。以上结果说明，5个候选基因均受炭疽菌叶枯病病菌的诱导，是苹果炭疽菌叶枯病抗病相关基因。SNP 标记的开发主要依赖于含有大量测序序列的数据库。通过全基因组测序，不仅可以获得大量的 SNP 标记，还可以了解到 SNP 标记在整个基因组中的分布情况，有利于我们进一步了解不同物种的生物学特性，以及利用标记进行不同需求的生物学研究。在葡萄的基因组测序中发现，SNP 位点的密度高达7%（Jaillon et al.，2007）；2010发表的金冠苹果全基因组序列中，SNP 标记的频率约为 4.4 kD/SM，即227 bp/SNP （Velasco et al.，2010）；梨的全基因组序列中共检测到3402159个 SNP 位点，约占基因组序列的 1.02%（Wu et al.，2013）；柑橘中得到的 SNP 位点数量为106 万个 （Xu et al.，2013）。对于有参基因组，通过全基因组重测序手段进行大量 SNP 标记开发，也是研究不同品种间差异的有效途径之一。通过对6 个玉米自交系的进行全基因组重测序，在非重复序列区域内共获得了 1272134个SNP 标记 （Lai et al.，2010）；对葡萄的230个基因片段重测序，数据统计结果显示，每64 个碱基中就存在着一个 SNP 位点 （Lijavetzky et al.，2007）；在水稻中，水稻籼稻恢复系 7302R 通过全基因组重测序，检测到307627个SNP 位点，其中有30239个位于mRNA序列中（Li et al.，2012b）；通过对苹果品种 ‘金冠’ 和 ‘红玉’ 进行全基因组重测序，在 ‘金冠’ 中得到了 2222816个 SNP 位点，在 ‘红玉’中得到了 4950346 个 SNP 位点，密度分别为 293 bp/SNP 和210 bp/SNP （孙瑞，2015）。SNP 变异从理论上来看主要包括转换、缺失、颠换和插入四种形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2∶1。并且SNP 在CG序列上出现的最为频繁，而且多是 C 转换为 T，主要原因为CG中的胞嘧啶常被甲基化，而后自发脱氨基形成胸腺嘧啶 T （Johnson and Told，2000；Mullikin et al.，2000）。从本实验中对 SNP转换/颠换频率统计结果来看，转换/颠换比为2.0，发生转换的频率为66.6%，发生颠换的频率为 33.4%，C/T 转换发生的频率最高为34.1%。这与前人研究的结论相符。通过重测序技术可以获得海量SNP 标记，利用这些标记构建高密度遗传连锁图谱为不同群体的进化分析，不同性状基因的遗传定位，分子标记辅助育种等提供有效信息。‘M.27’בM.116’ 的高密度遗传图谱是由306个SSR标记和2272个 SNP 标记组成，图谱密度达到了每 0.5 cM 一个标记 （Antanaviciute et al.，2012）。Khan 等（2012） 利用2875个分子标记构建了苹果的整合遗传图谱，其中包含了2033个 SNP 标记和 843 个 SSR 标记，总长为 1991.38 cM。Clark等 （2014） 利用3个不同的F1 杂交群体和SNP 芯片分型技术构建了包含1091个 SNP 标记的苹果品种 ‘Honeycrisp’ 的整合遗传图谱，标记间的平均距离为1.36 cM。基于高通量基因组重测序技术能够更加准确、全面的对测序物种进行全基因组水平上的位点进行评估，可以精确的完成单核苷酸多态性位点的检测，分子标记的开发，遗传图谱的构建，不同群体间的进化分析，与表型变异相关基因的挖掘以及快速定位等等。本研究通过运用全基因组重测序的方法对有着明显抗感性状分离的 ‘金冠’ 和 ‘富士’ 及其由 F1 代极端表型个体组成的抗感池进行全基因组范围内的遗传变异检测，共筛选得到 SNP位点3399950个，InDel位点573040个。通过对△SNP-index图谱的分析发现，在第15条染色体的2～5 Mb的区间内，△SNP-index显著的大于阈值，存在着明显的连锁不平衡，意味着该区域可能存在着抗炭疽菌叶枯病基因位点。这一结果与SSR标记所定位的抗炭疽菌叶枯病基因位点位置相吻合。SNP 广泛分布于基因组DNA中，且数量巨大。因为任何碱基均有可能发生变异，因此SNP 既有可能出现在基因的编码区，也有可能在基因的非编码区，或者两个基因之间的序列上。总的来说，位于基因内编码区的SNP 比较少，且该部分的 SNP 有可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此位于编码区 SNP 的研究更受关注。本试验对可能引起基因获得终止密码子、失去终止密码子、非同义突变、可变剪接的变异位点进行重点筛选，将其所在的基因作为候选基因。通过筛选共得到33个候选SNP 位点和29个候选基因。结合第三章SSR标记对炭疽叶枯病抗性基因的定位，最终锁定了 5 个候选基因： MDP0000686092、 MDP0000205432、 MDP0000120033、 MDP0000864010、MDP0000945764。锌指结构是一类在很多蛋白中存在的具有指状结构的模体，是具有识别特定碱基序列的一种转录因子结构。锌指的典型功能是作为互作的组件与核酸、蛋白质和小分子等多种物质相结合，参与多种细胞过程，如DNA的复制与修复、RNA 转录与翻译、物质代谢与信号转导、细胞的增殖与凋亡等 （Krishna et al，2003）。可变剪切 （Alternative splicing，AS） 是重要的转录后调控机制，在动物中对其在不同的生理以及病程条件下的可变剪切的调控作用研究的较多 （Garcia-Blanco et al.，2004；Nilsen and Graveley，2010）。据报道在拟南芥中超过 42%的外显子基因存在可变剪切现象（Filichkin et al.，2010）。在植物可变剪切数据库中有很大比例的 AS参与逆境响应基因的表达，这进一步强调了可变剪切在逆境响应中的重要作用 （Wang and Brendel，2006；Duque，2011）。在生物胁迫中，有许多试验证明AS参与植物的抵抗和防御机制。例如，在一些 R 基因中如番茄的N 基因，拟南芥的SNC1、 RPS4基因，发现可变剪切的存在 （Dinesh-Kumar and Baker，2000；Zhang and Gassmann，2003）。SR蛋白，丝氨酸/精氨酸富集剪切蛋白 （serine/arginine-rich proteins，SR protein） 是RNA绑定蛋白家族中功能和结构高度保守的一类因子，参与可变剪切过程。例如， AtSR30在高盐碱以及过氧逆境中被上调表达 （Tanabe et al.，2007）。SR在不同的环境条件下的表达量的差异说明了SR蛋白在逆境响应中的调控作用。基因MDP0000120033具有核酸绑定，锌离子结合分子功能，参与 RNA 剪切生物过程，调节基因产物的表达。具有CCHC型锌指结构和丝氨酸/精氨酸富集剪接因子，属于SR 基因家族 RSZ 亚家族基因。丝裂原活化蛋白激酶 MPK6 和MPK3在植物的防御反应中起着重要作用，而拟南芥基因 AtRSZ21 在体外试验中被发现能够被MPK6/MPK3磷酸化 （Feilner et al.，2005），这就意味着 AtRSZ21 也可能参与了植物的防御应答。Kumar 和 Kirti （2012） 报道了花生的一个属于 SR 亚家族基因 RSZ 蛋白基因AdRSZ21，在植物的超敏反应和抗逆反应中起着重要的作用。NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族是真菌病原体镰刀菌致病机制中的一个关键酶 （Srivastava et al.，2014）。细胞壁是植物细胞进行正常的生命活动不可缺少的重要组成部分。其不但在维持细胞形态、细胞间黏结、细胞壁的强度和调控细胞伸长等方面起着重要的作用，还参与了细胞的分化、抗病、细胞识别及信号传导等一系列生理、生化过程。细胞壁主要成分包含纤维素、半纤维素、果胶和少量的结构蛋白等。基因MDP0000864010属于依赖差向异构酶/脱氢酶家族，并且与鼠李糖合成酶Ⅰ （ RHMⅠ） 有较高的同源性。可能参与合成鼠李糖，而鼠李糖是细胞壁果胶多聚糖的重要组分之一。所以该候选基因有可能在细胞的组成层面增加个体的抗性。基因的相对表达量分析也表明，五个基因都不同程度的响应了病菌的诱导，是与抗炭疽菌叶枯病相关的候选基因。但是其参与抗病的机理和途径仍不清楚，深入的研究将继续展开。

本文以甘蓝型油菜一个抗病毒品种和一个感病毒品种为试材，利用转基因手段进行了油菜抗病毒病相关研究。利用乙烯、甲基茉莉酸、水杨酸类似物苯丙噻重氮3种化学物质诱导处理油菜叶片，提取处理前后各材料的RNA，标记探针后与拟南芥芯片进行杂交，通过对基因表达谱的分析，获得与抗病性相关的基因，从中选择3个与病毒抗性相关的基因BNP5、BNP7和BNP10。其中BNP7和BNP10为全长序列，BNP5 5'端部分序列缺失，通过5'-RACE的方法获得该基因全长序列，分别构建3个植物过表达载体pGA5、pGA7和pGA10和3个RNAi载体pGR5、pGR7和pGR10（过表达和RNAi载体均带有除草剂抗性基因bar）。采用本实验室发明的高通量花蕾原位转化法分别对所选材料进行转化。转基因当代植株收获的种子播种以后，幼苗期喷施除草剂进行筛选，并经PCR鉴定，存活幼苗80%以上为阳性植株。目前正在进行阳性植株T1代幼苗病毒抗性鉴定及相关的后续实验。

农抗120是一种广谱内吸型抗真菌病害的农用抗生素生物杀菌剂，对白粉病、枯萎病、炭疽病等多种作物病害具有较好防效。它与多种化学杀菌剂混配具有增效作用，但存在着施药量大，成本偏高的不足。

生产实践业已证明，应用抗病品种是枯萎病综合防治技术体系中的核心技术，也是防治枯萎病最经济、有效的技术途径。据1984年的全国棉花枯、黄萎病综合防治研究协作组的统计，全国种植棉花面积约8800余万亩，而黄、枯萎病的发病面积近2200万亩，占调查面积的31.3%，年损失皮棉75万～100万t，折合人民币2亿～3亿元。可是推广了以种植抗病品种为中心的综合防治技术以后，枯萎病的发病率压低到5%以下，挽回了皮棉损失。同时，由于节省了农药等开支，极大地降低防治费用，杜绝了人畜中毒事故和环境污染，保护了棉田生态环境，取得了显著的经济、生态、社会效益。而抗枯萎病育种的成效取决于对病原菌与寄主（棉花）的互作关系和枯萎病抗性遗传规律的认识，抗源的获取以及科学的育种方法。了解病原菌与寄主（棉花）之间的交互作用，是选育抗棉花枯萎病品种的重要理论依据之一。这里包括两方面内容：一是垂直抗性与水平抗性；二是基因对基因假说。这一理论观点由Van Der Plank（1963）提出。寄主对某些病原生理小种具有免疫或高抗性，可是对另一些生理小种则是高度感染的。表明了同一寄主品种对同一病原菌的不同生理小种具有“专化”反应，寄主品种的抗病力与病原菌小种致病力间有特异的相互作用。它通常受单基因或几个主效基因所控制。杂交后代一般按孟德尔定律分离。这类抗性的遗传行为简单，抗、感差别明显。在一般情况下，抗病对感病为显性，易于识别，常被育种家所重视。垂直抗性多表现为过敏性反应。它能把病原菌局限在侵染点和具有抗定殖的作用；同时，由于它能抵抗某些对它不能致病的小种，因而在发病初期，它有减少接种体数量的作用。但这类抗病性常会随病原菌生理小种的变化而丧失。如果在大面积生产上，单一地推广具有该类抗性的品种时，容易导致侵染它的生理小种上升为优势小种而被感染淘汰。这在小麦条锈病和稻瘟病抗病品种大面积连年推广种植上已有惨重教训。要保持其抗性的稳定，必须是寄主为异质群体，或寄主群体在时、空分布上呈不连续性，否则，抗性难以持久稳定。在遗传上，小种专一化抗病性通常表现为单基因性状，这种抗病性对感病性往往是显性的。一个单基因能抵抗病原的一个小种或多个小种。在垂直抗病性中，寄主是垂直抗性的差别，而病原菌致病性的差别则是毒性差异。亦可称为非专化抗病性（non-specific resistance）。水平抗性指寄主品种对各个病原生理小种的抗病反应，大体上接近于同一水平，它对病原菌的不同小种没有“特异”反应或“专化”反应，几乎在同一水平线上。它的作用主要表现在能阻止病原菌侵入寄主后的进一步扩展和定植，表现为潜育期较长，病斑小而少，病原菌繁殖体的数量相对较少。因而病害发展的速度较缓慢，程度较轻。在农业生产中，人们长期利用水平抗性，但因其抗、感症状表现不如垂直抗性明显，鉴别较难，过去在抗病育种中往往忽视了具有水平抗性的品种。由于它对病原菌生理小种不形成定向选择的压力，因而不致引起生理小种的变化，也不会导致品种抗性的丧失。所以，在抗病育种中，人们越来越重视具有一定水平抗性品种的选育。现阶段，我国已经推广种植的抗枯萎病品种，几乎多属于此类型，故能比较长期地、并在不同生态地域均保持着较高的抗病性，如川52-128。自Van Der Plank（1963）提出垂直抗性与水平抗性概念以后，也存在着不同看法。如Wolfe（1972）认为寄主的抗病性从感病到免疫是一个连续的统一体，病原菌的致病性，从无致病力到强致病力，也是一个连续的统一体。寄主和病原物的相互作用，可有各种各样的表现形式。Arnold等（1968）认为垂直抗性和水平抗性并没有根本的区别，只不过是总抗病性系统中的特殊情况。Zadoks等（1977）则认为，在垂直抗性和水平抗性的情况下，寄主的抗病力和病原菌的致病力间都有相互的特异作用。在与农作物病害的斗争中，有80%以上是靠抗病品种来防治或减轻其为害的。但实践表明，抗病品种在生产上应用若干年后，常会丧失抗病性。为了克服品种抗病性过早丧失，有些学者提出持久抗病性（durable resistance）或稳定抗病性（stable resistance）的概念。这是指适于某种病害发生流行的环境条件下，某一个抗病品种在大面积生产上推广多年后，抗病性仍较长期保持而不丧失，当然不意味着永久不变异。这一理论观点由Flor（1974）提出。病原物与寄主植物的关系，即现在所提的互作关系，就是在一定条件下，植物发病过程中寄主和病原物相互作用，由一系列的生理、生化和遗传调控过程而决定病症表现的类型。Flor（1947）曾以亚麻锈病（Melampsora lini）为代表进行研究寄主和病原物之间的相互关系认为，寄主中有一个调节抗病性的基因，而病菌中也有一个相应的基因调节病菌的致病性。如寄主有2个或3个基因决定抗病性，于是病菌中也有2个或3个相应的决定无毒性的基因。基因组合表示寄主的抗病性表达需要寄主中决定抗病性的基因和病菌中决定无毒性的基因互作，即寄主的抗病性不亲和性是病菌和寄主特异性互作的结果。由此抗病性被认为是主动过程，而寄主的感病性则是由于缺乏抗病基因或病菌缺乏无毒基因而表现出的被动显症。此论点认为，寄主与病原菌长期共存于自然界，实际上正因为寄主存在着抗性基因，才能使其世代延续，而不被病原菌所毁灭。所以，物种间的抗性或不同程度的抗性，是长期自然选择和人工选择的结果。棉花抗枯萎病育种的基本程序包括4个环节：①发现和创造变异；②稳定和选择变异；③鉴定和比较变异；④保持变异。所有环节都是围绕着变异进行的。棉花的性状变异可分为两种：一种是可遗传变异，即这种变异性状可以传递给以后的世代；另一种是不可遗传变异，即这种变异性状只在当代表现，不能传递给以后的世代。可遗传变异又可区分成两种类型：一类是有益性状变异，即符合育种目标的遗传性状变异，也叫符合人类栽培利用目标，能够提高经济利用价值的变异；另一类是有害性状变异，即不符合育种目标的遗传性状变异，是同人类经济利用的目标方向相反的变异。育种所需要的仅仅是可遗传的有益的性状变异。棉花育种的任务是将现有推广品种还不具有的而生产上又迫切需要的一些新的经济或农艺性状引入新品种中，或将尽可能多的有益的经济或农艺性状集中到一个新品种中。育种的创新意义即在此。这些有益的经济或农艺性状，须是可遗传的有益的性状变异，这是育种的前提。如果没有这些变异，就不会有育种。这些有益的变异可能存在于现有品种或过时品种群体中，但更多地存在于极为丰富的种质资源中，拥有大量丰富的种质资源材料是棉花育种的基础。因此，卓有成效的育种一般需要形成一个丰富的种质资源库，育种家们深入细致地研究这些种质资源，从中寻找、发现和发掘与育种目标相符的新的性状变异。如局限在已有材料中，则很难发现符合育种目标的性状变异。棉花育种可利用的变异主要来自两种途径：一是自然变异；二是人为变异。自然变异的引发，大多数是由于天然杂交，但也有少数来自偶然的某种外力或个别棉株自身某些不明原因诱发的自然突变。人为变异主要是通过有目的的人工杂交，但也可利用物理化学等手段，或自然界其他条件进行人工诱变。从广义上讲，将非棉花及其近缘植物或其他生物的某些性状，运用特殊技术手段引入棉花中，也属于人为变异的范畴。棉花是常异花授粉作物，存在一定的异交率。异交率的高低取决于传粉媒介——昆虫的种类和种群的大小。田间的传粉媒介多，棉花的天然异交率就高，容易引发较多具有变异性状的变异株，就提供了育成具有优良性状新品种的机会。这是棉花系统选择取得成功的原因。但随着棉花生产的发展，棉花害虫种类日趋繁多，为害程度日益严重，种植棉花不得不频繁地采用杀虫药剂。在防治害虫的同时，也杀死了棉田传粉媒介，大大减少了棉花异交的机会，从而降低了性状变异几率、包括优异性状变异和优异株出现的频率。这也许是多年来单纯依靠系统选择难以育成有突破性新品种的主要原因。棉花群体中也常会出现个别的自然突变体。这主要是由于染色体畸变或某些基因位点突变而产生的变异性状。其中，有有利的，也伴有不利的经济性状变异。但发生这类突变的几率一般很低，且以质量性状为多。人为变异主要是通过人工杂交，引起基因交换、重组而发生新的性状变异。从本质上讲，这是天然异交的延伸和扩大，弥补了自然杂交几率日益低下的现状。它比之自然杂交的优点是：一能有目的地选择性状变异的方向；二能主动掌握性状变异的频率。但它的不足之处：一是不能确保有较高的成功率；二是仅限于在现有种质基因库范围内引发变异。所以，必须加强种质资源的收集、扩大和研究等基础工作，并进行较大量的杂交。人为变异的另一途径是通过物理或化学等手段诱发新的性状变异。其优点可超越现有的棉花种质基因库，创造出新的性状变异；但缺点是：①难于诱发有利经济性状的变异，而更多的属于不利经济性状；②诱变的频率低。因此，棉花育种利用这类性状变异的难度较大。应用生物技术，导入外源DNA，是定向诱发棉花产生新的性状变异的现代高新技术。优点是使常规人工杂交所不能跨越的亲缘障碍成为可能，在棉花染色体上不仅可导入与棉花非一个属、科、目的植物DNA，甚至可导入节肢动物等其他动物的基因。如报道的培育手感柔软胜似棉花的转兔角蛋白基因棉花。外源DNA导入，是创造变异的一种技术手段，是育种过程中的一个环节，在创造变异后的大量工作，仍需按常规育种环节进行。随着中国宇航技术的发展，已多次运用太空卫星，搭载棉花种子，通过太空失重、宇宙线照射、温度和时律的变化等因素引发基因变异。但其变异方向与遗传性正在进一步研究中。不管是自然变异或人为变异，其中，有符合育种目标需要的变异，也有不符合育种目标的变异。一般是在发现有利变异的同时，也可能相伴产生一些不利变异。这种变异，有的只是表现型的，其遗传性尚未稳定，还不能作为育种目标性状固定下来。所以，在发现或创造变异之后，育种的第二个环节就是稳定和选择变异。稳定变异是为了保证变异的有效选择，是选择变异的前提。稳定变异的主要手段是加代。随着世代的增加，杂合体变异性状得到分离和表现型变异性状得到纯合，使所有的变异，不管是有利的还是不利的，其遗传性相对稳定下来。棉花经济性状的遗传率高低不一。一般地，遗传率高的性状，如单基因控制的质量性状，低世代时就能达到相对稳定；遗传率低的性状，如多基因控制的数量性状，只有在较高世代时才能达到相对稳定。变异性状只有达到相对稳定，不再出现明显分离时，选择才有效。不同变异性状选择的最适宜世代并不一样。为了增进加代速度，缩短育种年限，在我国，利用18°N上下的海南岛南端冬季气温较高，又是旱季的有利条件，进行秋播、冬长、春收。这样，棉花就能在一年内完成两个世代周期。但海南岛与大陆棉区的气候、生态等条件差别很大，一般在海南加代期间不进行选择，但也有加代选择成功的例证。有条件的也可在当地，冬季利用大型可控温室进行少量材料的加代。随着生物技术的发展，可利用单倍体培养技术，将变异性状的染色体加倍，或克隆复制变异株的体细胞，经组织培养，形成再生植株，获得较为稳定的变异材料。选择变异是贯穿新品种选育始终的重要环节。棉花育种的创造性，主要是通过选择来实现。对已相对稳定的性状变异材料，紧接着就是一系列的选择过程。选择变异，既是技术，也是艺术。要紧紧瞄准育种目标，运用科学的试验方法和测试手段，层层筛选，尤其要依赖于育种家的丰富经验和高超的业务素质。要重视田间选择、室内选择和生长前期选择，更要重视生长后期和多方位的反复选择。要自始至终贯彻精益求精、优中选优的原则，在众多的个体中，不遗漏一株优异的变异株，也不滥竽充数多留一株劣变株，以保证育成高质量的新品种。根据确定的育种目标，选择已经相对稳定的变异后，需根据留优汰劣的原则，通过科学的鉴定和比较，才能确认某些优异变异性状成为育成新品种的属性，这是选择的继续。鉴定是在特定条件下，对某一变异性状进行有效性的直接鉴别和确认。例如，抗枯萎病性、抗黄萎病性、抗棉铃虫性、抗棉蚜性、抗旱性等。抗枯、黄萎病性鉴定，原则上是在人工接种、发病均匀的病圃中进行，也可在重发病区选择发病均匀的自然病圃中进行。抗虫性鉴定需在人工隔离环境中接种一定量的害虫数。抗旱性鉴定需设置遮雨和防止地下水浸入等设施。有些性状也可利用生物、理化反应法进行间接鉴定，但最后仍需进行直接鉴定。鉴定时要求设置抗性和感性两个对照，还需要多点、多年或多次重复，尽量减少误差，以避免年份和环境引发的影响干扰。纤维品质测定，是确保棉花新品种纤维品质必不可少的鉴定内容。利用HVI系列测试仪器，由于每份测试样本量小，要求用随机法抽取皮棉样本，以增加样本的代表性。育种材料的比较这一程序既重要，也繁复。随着育种进程，对照育种目标，全面考虑丰产性和有关经济、农艺性状的要求，从初级到高级，进行比较试验和鉴定，并根据结果进行逐级淘汰。对保留的材料要求要高，必须重视性状的综合表现；淘汰材料要慎重。过去的育种实践中，从原来因疏忽被淘汰的材料中，后来又选育出较突出的新品种的育种事例也有。棉花育种材料的比较，一般从株行试验，到株系试验、品系试验、区域试验和生产试验，逐级进行。从株系试验开始进行有重复的比较试验；从区域试验开始进行多点、多年有重复的比较试验。优良变异性状的稳定是相对的，而得到的稳定性状发生再变异则是绝对的。再变异的方向不能确定，往往是优变的几率较少，而劣变的几率更多。这就是品种的退化。棉花良种退化是困扰棉花生产的一大难题。常常是一个良种推广不久就发生退化，削弱了良种的作用。所以，重视和切实采取有效技术，保持育种目标所要求的变异性状，就显得十分重要。这就是良种繁育。良种繁育的任务是保持住优良品种的种性、纯度，即保证良种的品种品质。纯度是指品种纯度，并非遗传纯度。从农业生产的实际需要出发，并不要求品种在遗传上的纯化。品种本来就是一个遗传复合体，诸多性状不需要、也不可能达到遗传上100%的纯度。但必须保证主要经济性状表现型的相对一致性和稳定性。要达到这一目的，在技术上必须最大限度地避免育成的新品种发生生物学混杂和机械混杂。因为混杂的发生，必然会导致主要经济性状的退化。棉花品种的退化，往往会出现绒长变短、衣分下降、纤维变粗、铃重变轻、营养生长过旺等非人们植棉所企求的性状。在棉花进化过程中，存在着两种选择的激烈竞争。一是自然选择，另一是人为选择。自然选择的方向是按照有利于棉花物种自身的生存和繁衍更多的后代进行的。人为选择的方向是按照人们植棉所企求的经济性状进行的。两者虽有共同点，而在经济性状方面多数是反方向的。若竞争结果是前者超过后者，即出现“退化”现象。所以，“退化”是人们从植棉目的的角度给予的评价。但从棉花物种发展的角度评价，这种“退化”恰恰正是棉种自身需要的“进化”。生物学混杂和机械混杂给人们认为的“退化”创造了条件。所以，只有一方面尽量限制生物学混杂和机械混杂的机会，另一方面当人为的选择压超过自然选择压时，才能保持种性，即保持住育种目标所企求的变异性状相对稳定，不发生劣变，不发生“退化”。这就是良种繁育的功能。棉花对枯萎病抗性的遗传，国内外的研究报道较多，但结论不完全一致，多数认为，抗枯萎病性是由多基因控制的。Fahmy（1927）用免疫品种与感病品种杂交，F1是免疫的，F2分离出75%的免疫株、15%的耐病株和 10%的感病株。免疫株可固定不再分离，说明它是纯合的；耐病类型可再分离出免疫株、耐病株和感病株3种类型都有；而感病株一般在苗期便死去。他在以后的试验中，Fl、F2也出现类似情况。而在海岛棉中，他认为，是由一个显性基因和几个微效基因所决定的。Kelkar等（1947）也指出，海岛棉的抗枯萎病性是由1个显性基因和1个到多个修饰基因所控制的。在亚洲棉中，他发现了2个互补显性抗病基因和第三个具有抑制作用的基因。Jones等（1957）在用具有半半棉血统的珂字棉100GA与德字棉425的研究表明，在枯萎病和肾形线虫并存的情况下，其抗性由2～3个基因控制。Smith等（1960）认为，陆地棉对枯萎病的抗性是受一个主效显性基因和一些修饰基因所控制；而海岛棉的抗性是受2个具有加性效应的显性基因控制。Jobes（1961）以抗病的德字棉425、珂字棉100GA与感病的半半棉杂交，F2、F3群体中，抗、耐、感病植株数量呈连续变异，故认为是数量性状遗传，其抗病性是由2～3个基因所控制。Kappelman （1971）用P1、P2、F1、F2、BC1F1、BC2F2 6个世代在6种不同条件进行试验后指出，在42个试验中，有34个的抗枯萎病性的加性效应是显著的，有2个的显性效应是显著的，有8个的上位性效应是显著的。在这10个非加性效应为显著的实例中，除1个外，加性效应也是显著的。所以，他认为，对他所研究的材料而言，加性基因效应最能说明棉花枯萎病抗性的遗传。Aibeles（1978）也认为，棉花对枯萎病抗性遗传的基因作用，加性效应大于显性效应。Singh等（1988）在亚洲棉的完全双列杂交后代研究中认为，抗病性是显性，而且一般配合力方差大于特殊配合力方差，说明对抗性遗传的基因作用，也是以加性效应为主。但Rird （1973）认为，棉花对枯萎病的抗性属于显性基因效应。Megahed等（1984）在不同类型海岛棉的双列杂交中发现，对枯萎病抗性表现明显的杂种优势，说明基因效应是非加性的。在F1和F2中，一般配合力和特殊配合力都显著，但特殊配合力比一般配合力更强，说明其遗传的基因效应是非加性的显性效应，抗性受微效多基因所制约。Campagnaco（1971）认为，大多数杂交组合的抗枯萎病性是单基因的不完全显性遗传，F2可分离出抗病和感病类型。但是，有的研究结果认为，棉枯萎病抗性是显性单基因遗传的。Netzer （1985）用陆地棉与海岛棉杂交也认为，棉花枯萎病抗性是一个显性基因控制的。冯纯大等（1996）报道，16个抗×感组合的F2代抗、感植株出现3∶1分离比例，亦证实抗枯萎病性受一对基因控制。20世纪70年代，陕西省棉花研究所、原北京农业大学（现中国农业大学）、江苏南通地区农业科学研究所等从大量杂交后代的分析中认为，杂种后代对枯萎病的抗性，与亲本的抗性水平密切相关。在感×感组合中，后代的抗性差；双亲抗性中等或在抗×感组合中，后代多为耐病；在抗×耐或抗×抗组合中，后代的抗性强等。并从育种实践中，总结出一些抗枯萎病性遗传的趋势。据王远等（1980）研究，陆地棉抗枯萎病受显性基因控制，双亲之一具有抗枯萎病性，其后代则表现抗病，因此，采用耐病、丰产、优质品种作母本，高抗枯萎病品种作父本，以培育优质、丰产、抗病品种。校百才（1985、1988、1992）多年采用不同组合的试验表明，抗枯萎病性的一般配合力方差大于特殊配合力方差，说明抗枯萎病性的遗传中，加性效应是主要的。其狭义遗传率分别为42.6%、19.5%和46.5%；广义遗传率127121分别为72.5%、35.2%和76.98%。李俊兰（1987）用4个抗病×感病的陆地棉组合后代分析后表明，各组合抗病性遗传中的加性成分达到了极显著水平；有一个组合的显性效应及加性×加性、显性×显性上位效应和另一组合的加性×加性上位效应也达到了显著水平。各组合的广义遗传率127121平均为66.32%。王振山等（1989）在抗×感、抗×耐和抗×抗等类型组合的P1、P2、F1、F2、B1和B2各世代的平均数分析中指出，所有组合的抗枯萎病性的加性效应均达显著水平；但也还存在显性和上位效应，如在抗×感组合中，抗病性的加性效应、显性效应、加性×显性上位效应都有作用；而在抗×耐组合中，主要是加性和显性效应。并认为抗枯萎病性是受多基因控制的。张凤鑫等（1990）用44个品种做试验的结果表明，陆地棉抗枯萎病的广义遗传率为86.7%，属遗传率高的性状。张金发等（1994）在发病严重而均匀的田间病圃中，对4个抗病品种和4个感病品种的8个亲本及其28个Fl（无反交）进行抗枯萎病性鉴定发现，亲本的抗性水平与其配合力效应、显性作用大小是基本一致的，以苏棉3号、中棉所12和鄂62-1的抗性最高，配合力最好，显性作用最大，是较好的抗病亲本。Hayman-Jinks法分析表明，抗病性为部分显性，以加性效应占优势，显性效应较小，无上位性。广义和狭义遗传率均很高，分别为91%和83%，至少有一组显性抗病基因控制棉花枯萎病抗性的遗传。校百才（1985、1988、1992）多年采用不同组合的试验表明，抗枯萎病性的一般配合力方差大于特殊配合力方差，说明抗枯萎病性的遗传中，加性效应是主要的。其狭义遗传率分别为42.6%、19.5%和46.5%；广义遗传率127121分别为72.5%、35.2%和76.98%。李俊兰（1987）用4个抗病×感病的陆地棉组合后代分析后表明，各组合抗病性遗传中的加性成分达到了极显著水平；有一个组合的显性效应及加性×加性、显性×显性上位效应和另一组合的加性×加性上位效应也达到了显著水平。各组合的广义遗传率127121平均为66.32%。王振山等（1989）在抗×感、抗×耐和抗×抗等类型组合的P1、P2、F1、F2、B1和B2各世代的平均数分析中指出，所有组合的抗枯萎病性的加性效应均达显著水平；但也还存在显性和上位效应，如在抗×感组合中，抗病性的加性效应、显性效应、加性×显性上位效应都有作用；而在抗×耐组合中，主要是加性和显性效应。并认为抗枯萎病性是受多基因控制的。张凤鑫等（1990）用44个品种做试验的结果表明，陆地棉抗枯萎病的广义遗传率为86.7%，属遗传率高的性状。张金发等（1994）在发病严重而均匀的田间病圃中，对4个抗病品种和4个感病品种的8个亲本及其28个Fl（无反交）进行抗枯萎病性鉴定发现，亲本的抗性水平与其配合力效应、显性作用大小是基本一致的，以苏棉3号、中棉所12和鄂62-1的抗性最高，配合力最好，显性作用最大，是较好的抗病亲本。Hayman-Jinks法分析表明，抗病性为部分显性，以加性效应占优势，显性效应较小，无上位性。广义和狭义遗传率均很高，分别为91%和83%，至少有一组显性抗病基因控制棉花枯萎病抗性的遗传。校百才（1985、1988、1992）多年采用不同组合的试验表明，抗枯萎病性的一般配合力方差大于特殊配合力方差，说明抗枯萎病性的遗传中，加性效应是主要的。其狭义遗传率分别为42.6%、19.5%和46.5%；广义遗传率127121分别为72.5%、35.2%和76.98%。李俊兰（1987）用4个抗病×感病的陆地棉组合后代分析后表明，各组合抗病性遗传中的加性成分达到了极显著水平；有一个组合的显性效应及加性×加性、显性×显性上位效应和另一组合的加性×加性上位效应也达到了显著水平。各组合的广义遗传率127121平均为66.32%。王振山等（1989）在抗×感、抗×耐和抗×抗等类型组合的P1、P2、F1、F2、B1和B2各世代的平均数分析中指出，所有组合的抗枯萎病性的加性效应均达显著水平；但也还存在显性和上位效应，如在抗×感组合中，抗病性的加性效应、显性效应、加性×显性上位效应都有作用；而在抗×耐组合中，主要是加性和显性效应。并认为抗枯萎病性是受多基因控制的。张凤鑫等（1990）用44个品种做试验的结果表明，陆地棉抗枯萎病的广义遗传率为86.7%，属遗传率高的性状。张金发等（1994）在发病严重而均匀的田间病圃中，对4个抗病品种和4个感病品种的8个亲本及其28个Fl（无反交）进行抗枯萎病性鉴定发现，亲本的抗性水平与其配合力效应、显性作用大小是基本一致的，以苏棉3号、中棉所12和鄂62-1的抗性最高，配合力最好，显性作用最大，是较好的抗病亲本。Hayman-Jinks法分析表明，抗病性为部分显性，以加性效应占优势，显性效应较小，无上位性。广义和狭义遗传率均很高，分别为91%和83%，至少有一组显性抗病基因控制棉花枯萎病抗性的遗传。对棉花枯萎病抗性的遗传研究，以前多采用Griffing的配合力模型及其分析方法估算配合力效应，再用Hayman（1954）的双列分析方法估算遗传方差分量和遗传率。由于这是两个不同的遗传模型和分析方法，对一组资料分析的结果可能不尽相同，对多世代材料也不能同时进行综合分析。为此，韩祥铭等（2001）采用朱军（1997）提出的混合线性模型ADM遗传模型和ADAA遗传模型估算遗传方差和遗传率并对估算的参数进行显著性检验，从而可对亲本和组合的遗传表现进行评估。结果表明，棉花枯萎病抗性遗传，加性方差占表现型方差的49.9%，显性方差占表现型方差的13.1%，母体方差占表现型方差的0.8%，母体效应很小，主要是加性效应和显性效应，显性和环境的互作效应占表现型方差的27.0%，差异极显著，表明显性效应易受环境因素影响。广义遗传率为63.0%，狭义遗传率为49.9%，棉花枯萎病抗性遗传以加性效应为主，遗传率较高，在重病地连续选择抗病株，有利于提高枯萎病抗性。由于不同试验所用材料、鉴定方法和技术的不同，加之棉花受多种枯萎病菌生理小种侵染，抗病基因对病菌不同生理小种的抗性不同，不同的生理小种要有不同的抗病基因，不同的生态环境，有不同的生理小种。在自然生态条件下，枯萎病菌多种生理小种可能同时存在，这样就造成了棉花枯萎病抗性遗传研究结果的多样性。但多数研究结果表明，枯萎病抗性遗传以加性效应为主。育种实践也证明，在发病均匀的重病地，连续选抗病株能选育成抗病品种。因此，进行枯萎病抗性遗传研究，对棉花育种工作有指导意义。棉花对枯萎病抗性与对其他病害抗性的关系，赵俊兴等（1991）对多个品种，通过线性相关分析指出，棉花品种对枯萎病和黄萎病的抗性为高度正相关，也说明品种对两种病害的抗性间有显著的相关关系，这证实选育兼抗枯、黄萎病品种的可能性。马存等（1992）的鉴定指出，抗枯萎病的陆地棉品种，也能抗苗病。Shepherd（1986）报道，棉花枯萎病的发病率与根结线虫的产卵量呈高度正相关（r=0.73**），并指出，具有抗根结线虫基因的棉株，其根际或根部所渗出的物质，可特意地诱导对枯萎病菌有抑制作用的微生物，因而表现出抗病性。关于抗枯萎病性与其他农艺性状间的相关关系，也有不同的试验结果。Patel等（1950）认为，新百万棉（NewMillion Dollar）品种的抗枯萎病性，似与不利的农艺性状相连锁，Sappenfield （1963）报道，棉花品种对枯萎病的抗性与皮棉产量呈负相关等。由此认为，抗病品种的农艺性状较差。中国在选育、推广抗枯萎病品种的初期，也有类似的观点，但后来的试验和实践证明，这种现象不是普遍规律。马存（1985）的研究指出，无论在中水肥或高水肥条件下，枯萎病越重，对皮棉产量和多数纤维品质的损失越大。在中水肥条件下，枯萎病病指每增加1，皮棉产量的损失0.94%。李俊蓝（1987）的试验也指出，枯萎病的病级与籽棉产量、皮棉产量、单株结铃数、铃重、纤维断裂长度间的r依次为-0.3285，-0.2990，-0.2991，-0.2441和-0.046，即发病越重，产量和纤维强度越低。周雁声等（1985）用参加全国抗病区试的品种资料进行分析，研究结果显示，枯萎病的病株率与铃重、衣指、籽棉产量、皮棉产量、纤维强力呈极显著的负相关，病指与单株结铃数、衣指、籽棉产量、皮棉产量、纤维强力也呈显著的负相关，说明品种的抗病性越差，对产量和纤维品质的损失越大。另外，从20世纪80年代以来在黄河流域进行生产试验的品种进行分析表明，抗病的中棉所12比感病的鲁棉1号、冀棉8号的产量和品质都要好，证明抗枯萎病性和农艺性状间并不存在遗传上的负相关。高永成等（1985）用感病的原徐州142（病株率44.0%，病指35.9）和经过4年在病地连续选择的抗病徐州142（病株率3.9%，病指2.9）于1979年在无病地上进行了农艺性状的比较，抗病的徐州142比感病的徐州142农艺性状略有提高，如皮棉每亩增产2.75kg，衣分提高0.5个百分点，纤维强力提高0.09g，主体长度增加0.19mm。因而他们也认为，抗枯萎病性与农艺性状间并不存在遗传上的负相关。种质资源或称遗传资源，是指决定各种遗传性状的基因资源。棉花种质资源包括推广品种、过时品种、引进品种、突变体材料、野生种和陆地棉种系，以及棉属近缘植物。是进行棉花品种遗传改良的物质基础，也是研究棉属遗传、起源、进化和分类的基本材料。因此，广泛、持续收集、保存、研究和利用种质资源，是棉花遗传育种研究领域中的一项基础性工作。抗原是抗病育种的决定因素，而种质资源则是棉花抗枯萎病育种中抗原的来源地。我国在20世纪50年代就开始收集棉花品种和种质，并进行抗枯萎病性鉴定。1952～1953年四川省棉花枯萎病防治研究工作组收集了珂字棉8个品系及福字棉6号、鸡脚德字棉、狄胜棉、赖德福阿金等陆地棉品种（系）共33个，海岛棉品种C3173、苏-2198 两个，中棉种质有遂宁土棉、威远土棉等21个，进行抗枯萎病性鉴定。海岛棉中，苏-2198表现耐病、C3173高度感病，发病率为100%，病指79.5；中棉中，抗性最好的是仁寿紫花、盐亭小白花、三台子花、仪陇小白花、余姚小树花、彰德土棉、遂宁28-507-47、威远土棉、宾川土棉，而玉溪中棉在田间未受棉枯萎病感染，表现高度抗枯萎病性；陆地棉发病高，但发病程度差异大，发病率为90%～100%，病情指数为59.3～71.5。20世纪70年代，我国的抗病育种发展较快，对棉花品种资源的收集、抗性鉴定更加重视。1976年，陕西省农业科学院植物保护研究所采用陕西泾阳菌系，第一次对中国2238个棉花品种资源进行了苗期抗枯萎病性鉴定，结果是，无症状免疫类型22个，占总数的0.98%；高抗类型137个，占6.12%；感病类型1724个，占77.03%；其余为耐病类型355个，占15.96%。陆地棉中，表现抗性强的品种有川52-128、川57-681、陕棉4号、陕棉401、陕棉9号、川62-200、川抗病洞庭棉、晋68-389、晋68-400、云112-3、86-1号、陕棉8号、陕棉10号、咸73-74和咸73-145。中棉的抗枯萎病性强、抗源丰富，经反复试验证明，赤木黑种、赤木白种、法库白子、中棉所6号的抗枯萎病性强而稳定。1975～1979年连续8批鉴定了中国棉花品种资源共3710个。根据病指划分为不同抗病性反应型，属免疫类型（无症状）的23个，占总数的0.62%；属高抗类型的164个，占4.42%；属抗病类型的187个，占5.04%；属耐病类型的351个，占9.46%，属感病类型的2385个，占80.46%。从不同棉种相比较，其中，以中棉抗病性较强，陆地棉次之，海岛棉、木棉抗病性最弱（表5-1）。中棉、陆地棉、木棉和海岛棉的平均病指分别为5.34、34.29、76.4和76.85。棉种名称供试品种（系）免疫高抗抗病耐病感病病指0病指0.1～10病指10.1～25病指25.1～50病指50.1～100个数%个数%个数%个数%个数%陆地棉3102130.42993.191374.422608.38259383.58海岛棉27841.4427498.57中棉308103.256521.104715.268627.9210032.47木棉1715.881694.11草棉5360.00240.00合计3710230.621644.421875.043519.46298580.41表5-1 不同棉种对枯萎病苗期抗性鉴定1993年，陕西省农业科学院植物保护研究所又对348个亚洲棉（即中棉）品种进行抗枯萎病苗期抗性鉴定，病指为1～25的有288个，占82.8%；病指为25.1～50.0的有34个，占9.8%；病指为50.1～100.0的为26个，占7.4%。其中，简中1号、浙江余姚黄蒂大部等抗性强。52-128和57-681是中国育成的第一批高抗枯萎病抗原种质。四川省棉枯萎病工作组自1952年在发病90%以上的大榆区紫云乡105亩（667m2）左右的德字531棉田中，初选抗病单株916株，1953年经病圃鉴定筛选出抗病性强的11个系，经反复比较鉴定筛选，1956年培育出高抗枯萎病品种52-128。1957年全省换种岱字棉15后，利用新品种农艺经济性状好的优点，又在三台、射洪县种植的岱字棉15号重病田中，选取剖秆未见病状的单株1015株；仍采用病圃筛选的方法，于1963年再次选育出高抗枯萎病的品种57-681。这两个抗源品种经试验鉴定，具有抗病性强、抗病力稳定、抗性适应广的特点。20世纪60年代中期至90年代中期，在四川省棉枯萎病协作组人工病圃中，52-128病指稳定在3.6～22.6，平均11.2，比感病对照种减轻77.8%；57-681病指2.0～3.1，平均2.3，比感病对照种减轻91.2%。1970～1982年，以52-128、57-681多代自交材料种植于人工接菌病圃和零星病地，连续3年自交仍种植于同一条件下的抗性鉴定表明，虽经长期种植，两个抗源品种的抗性一直保持很强，未出现衰退现象，即使在零星病地种植3年，抗性与人工病圃无明显差异。1981年选用有代表性的生理型Ⅰ号川F5（四川射洪县）、陕F9（陕西高陵县）、生理型Ⅱ号浙F2（浙江慈溪县）、冀F8（河北峦城县）、生理型Ⅲ号新Fl（新疆吐鲁番县）等不同生理型菌系对52-128、37-681及抗、感杂交组合后代作病菌与寄主互作关系的抗性鉴定表明，52-128、57-681对我国棉枯萎病菌3大生理型中的5个菌系间致病力分化性互作不显著。1972～1973年和1979～1980年，全国棉枯萎病生理型试验结果表明，52-128对18个省、市、自治区不同地区的129个棉枯萎病菌系中，属高抗类型的有12个，抗病类型72个，耐偏抗类型36个，合计120个，占参试菌系的93%，只有9个强致病菌系对52-128呈感病类型。这两个抗源品种育成后，于60年代初被陕西、山西等省引进试种，表现出抗性强、稳定性好，从而用作抗原进行杂交转育或取材，育出陕4号、陕401、晋68-420、运安1号等，分别在四川、陕西、河南等棉病区种植，防病增产效果良好。1972年后是我国抗病育种取得较大发展的时期，河南、江苏、云南、陕西、山东、浙江、河北、山西、湖南和江西等省先后引进52-128、57-681用作抗原进行杂交转育或系统选择，培育出21个抗枯萎病品种（系），分别在全国10个省推广种植，防病增产效果显著。据《全国农作物审定品种名录》（2005）、《中国棉花品种及其系谱》（1996）、《中国棉花品种系谱图》（2000）资料分析，以及中国农业科学院棉花研究所等50余家育种单位利用这两个抗原的应用证明统计，全国利用抗原52-128、57-681育成棉花抗病品种128个。在不同转育代次育成的抗病品种中，集中来源于第二代至第五代的有121个，占94.5%；被利用作母本、父本育成的品种分别各占有54.7%和31.3%（表5-2、表5-3）。利用52-128抗原品种作抗原，通过杂交或系统选育的抗病品种，在各地方推广应用都表现抗性良好（表5-4）。省份育种单位（个）80年代90年代2000～2004年总计河北765112山西33429辽宁244江苏9112720浙江111安徽1516江西111山东31427河南9812222湖北49211湖南21124四川5511319陕西29211新疆111合计503569128表5-2 不同时期不同地区利用抗原52-128、57-681育成的审定品种数抗原用途一代二代三代四代五代六代总计母本（♀）11029191170父本（♂）46917440系统选育15542118合计6214340171128表5-3 抗原种质52-128、57-681不同转育代次育成的品种数项目四川湖北新疆江苏云南山西陕西辽宁上海山东河南河北北京浙江甘肃安徽湖南江西合计供试菌系179985111466777552911129抗性反应高抗01600000020100020012抗病861327114546422151072耐病71043432110232110136感病2121000000100101009表5-4 52-128对不同地区菌系的抗性反应抗原种质在育种上应用成败的关键，一是抗原抗性稳定性。抗性稳定而持久的抗原，转育利用的抗性不易衰失，能持久保持利用；二是抗原种质的遗传效应，这是转育利用的基础；三是抗原种质经济性状的遗传效应，这对利用价值影响极大。针对这三个关键问题，叶鹏盛等（2007）对52-128和57-681的抗性遗传做了研究。结果证明，这两个抗原的抗性长期稳定（表5-5，表5-6），且抗性遗传效应好、遗传率高（表5-7），其他不良性状在杂种后代中的遗传不显著（表5-8），为我国利用两个抗原的抗性，选育抗病品种奠定了良好的基础。供试品种种植1年种植2年种植3年种植4年病圃无病地病圃无病地病圃无病地病圃无病地521284.504.504.503.502.752.750.752.75576816.003.507.254.502.252.251.253.25川73274.008.009.008.003.503.502.507.25川4149.005.755.758.001.001.001.250.75达棉1号30.7556.7523.556.7535.0035.0017.2536.50显著性（t值）0.53240.62710.06431.1214表5-5 在病圃和无病地筛选后抗原的病情指数世代52128×达棉1号57681×达棉1号达棉1号×52128达棉1号×57681病圃无病地病圃无病地病圃无病地病圃无病地显著性（t）F135.0019.2541.0024.5018.5023.7521.7524.502.5687F231.2519.2519.2524.5012.7517.2518.7516.252.3072F310.2519.7515.5025.507.7520.258.0025.508.6017**F42.0013.751.2524.508.7521.759.7520.509.0275**表5-6 在病圃和无病地筛选后抗原不同杂交后代的病指抗源及组合平均病指F1F2中亲值相对优势（%）广义遗传率（%）狭义遗传率（%）52128×达棉1号29.5039.2539.75-25.7968.952.157681×达棉1号25.5034.0040.50-37.0473.156.77329×达棉1号29.0037.2541.25-29.7070.548.2川414×达棉1号29.7539.7542.00-29.1767.443.6达棉1号×5212835.2535.0039.75-11.3272.953.7达棉1号×5768134.5034.5040.50-14.8175.452.4达棉1号×732737.0038.2541.25-10.3072.353.4达棉1号×川41437.2541.7542.00-11.3169.246.5521284.00576815.50川73277.00川4148.50达棉1号75.50表5-7 抗原种质52-128、57-681的抗性遗传效应抗源及组合株高（cm）单株铃（个）衣分（%）F1F2中亲值F1F2F1相对优势（%）F1F2中亲值F1F2F1相对优势（%）F1F2中亲值F1F2F1相对优势（%）52128×达棉1号99.3100.188.491.012.319.717.317.017.915.836.137.236.737.8-1.6表5-8 抗原种质52-128、57-681的主要经济性状的遗传表现抗源及组合株高（cm）单株铃（个）衣分（%）F1F2中亲值F1F2F1相对优势（%）F1F2中亲值F1F2F1相对优势（%）F1F2中亲值F1F2F1相对优势（%）57681×达棉1号93.897.685.186.010.221.018.916.118.930.438.438.337.538.8-2.4川7329×达棉1号86.790.083.483.83.823.220.320.119.715.440.340.239.840.31.3川414×达棉1号85.189.782.784.82.919.418.919.818.8-2.039.840.140.340.3-1.2达棉1号×5212898.996.388.491.011.923.218.817.217.952.837.839.636.737.8-3.0达棉1号×5768187.188.885.186.09.424.621.216.118.934.938.938.337.538.83.7达棉1号×732785.287.683.483.82.323.722.620.119.717.940.941.239.840.32.8达棉1号×川41490.385.182.784.89.221.719.819.818.89.640.140.040.340.3-0.4表5-8 抗原种质52-128、57-681的主要经济性状的遗传表现（续）-1磷作为植物生长发育的必需营养元素之一，不仅是植物体内许多重要化合物的组分，而且还以多种途径参与植物体内各种代谢过程，在人类赖以生存的生态系统中，起着不可替代的作用。植物吸收磷的主要形式是，它们在土壤溶液中的浓度很低，一般只有1.5μmol/L。因此，磷容易被土壤固定，在土壤溶液中的移动性很差。大多农业土壤因长期施用磷肥已成为潜在的磷库，磷肥效应与土壤有效磷含量呈负相关，磷酸盐的化学性质使其成为作物难以利用的固定态磷，造成土壤磷的“遗传学缺乏”而非“土种类之间和同一植物的不同品种之间的磷素营养利用效率存在差异”。陆文龙等（1999）研究表明，营养高效基因型是指在缺磷条件下，能够利用自身根系分泌的有机酸活化土壤中难溶性磷，协调生长代谢，维持正常的生长发育过程，最终形成较高产量的基因型。由于植物对磷素的利用能力具有模糊性，耐低磷基因型和非耐低磷基因型的表现特征是连续的，没有明显的界限，磷素的影响不仅表现在相对干物重上，而且与植株的地上部鲜重、叶绿素含量、总叶面积等性状也相关。王士杰等（2009）首次在确立的筛选指标基础上，从88个棉花抗枯、黄萎病品种中筛选出25个耐低磷基因型品种（包括中棉所9号、中棉所15、中棉所21、中6331、86-1、豫棉1号、豫棉8号、豫棉22、冀棉7号、冀棉20、冀合3028、鲁无401、鲁棉14号、陕棉11、苏棉12、徐261、泗棉3号、川棉109、绵阳83-21、辽棉12、皖棉11、GK1、Stoneville 603、Deltapine 61和渤棉抗4）和3个耐低磷极端基因型品种（中棉所21、中99和陕棉11）。这些品种可以作为培育耐低磷胁迫的棉花抗病品种以及开展棉花耐低磷QTL定位与克隆等研究的重要资源。鉴于新疆长绒棉枯萎病迅速蔓延，给长绒棉生产带来巨大威胁，生产上迫切需要长绒棉抗病品种来减轻枯萎病的为害。在长绒棉现有的品种和品系中很难找到抗源。为此，武刚等（2006）利用抗枯萎病的陆地棉品种作种间杂交选育，经病圃多年筛选、鉴定出4个高抗枯萎病，而纤维品质达到长绒棉标准的新种质。生育期143天，绒长36.5mm，比强度31.8cN/tex，马克隆值3.7，单铃重2.4g，衣分31.8%，皮棉产量85.7 kg/667m2，病指6.38，表现为高抗。生育期146天，绒长36.5 mm，比强度37.0cN/tex，马克隆值3.3，单铃重2.5g，衣分32.8%，皮棉产量90.6 kg/667m2，病指3.87，表现为高抗。生育期148天，绒长36.6 mm，比强度30.4cN/tex，马克隆值3.7，单铃重2.5g，衣分32.3%，皮棉产量82.3 kg/667m2，病指3.18，表现为高抗。生育期147天，绒长37.3 mm，比强度33.0cN/tex，马克隆值3.7，单铃重2.3g，衣分29.4%，皮棉产量78.6 kg/667m2，病指1.36，表现为高抗。刘泽辉等（2008）对上述4份新种质在进一步杂交转育研究后认为，所选育的新品系同抗病新种质的抗病性没有明显差异，年度间抗病性差异小，说明抗病性呈显性性状、能稳定遗传。这为今后长绒棉抗枯萎病育种提供了很好的抗源材料，为棉花产业发展奠定了基础。但同时也指出，长绒棉抗枯萎病新种质在田间长势旺、抗病性强，但铃重偏低，产量不太理想。此外，这些高抗枯萎病新品系种植在多年陆地棉黄萎病很重的棉田，偶尔发现一两株有黄萎病病症的棉株，也许是杂交后代具有一定的陆地棉基因。因此，新种质抗性基因遗传特性、抗性生理生化方面的研究以及产量的提高等还有待进一步加强。在制定抗病品种育种目标时，既要求选育的品种具有抗病性，同时又要丰产和纤维品质优良，即除抗病性外，其他性状应与当地推广的非抗病丰产品种要求相似。事实上，一个耐病而丰产优质的品种往往比高抗而低产劣质的品种更有实用价值。进行抗病育种时，要注意不仅培育只对某一种病害的某一生理小种具有特异性抗性的品种，而且要培育多抗（水平抗性）品种，因为具有特异性抗性品种在出现新的菌株和生理小种时，抗性即消失。棉田单一的枯、黄萎病区较少，多为混生病区，因此，培育具有兼抗特性的品种，在制定抗病育种目标时也应加以考虑。在自然界棉花群体中，个体间总是存在着微小或明显的性状差异，包括株形结构、结铃性状、抗逆性差异等。由于棉花的遗传背景比较复杂，在外界环境条件影响下，常表现出多样的变异。这些变异既有遗传性状决定的变异，也有受环境影响产生的差异。系统育种的关键，即是发现变异，如在感病株的群体中选择抗病变异株，继而优中选优，严格鉴定。系统选育方法能在抗病育种中取得一定效果的原因在于：①棉花是常异花授粉作物，由于经常的天然杂交，增加了遗传基础的复杂性。一个棉花品种，一般人们较重视的一些农艺性状和经济性状是相对一致的，而人们没有注意的或缺少一定条件暂时未表现的性状（如在无病地的棉花抗性），个体间存在差异，有时差异可能很大。如能为棉花创造一定的条件（如发病条件），就可使个体间抗病性差异表现出来。重病地提供了筛选的条件，因此，一次选择可能选出抗病的个体。②棉花对枯萎病的抗性遗传是由基因所控制，当一个品种处于一种复杂群体状态时，这些抗病基因可能分别存在于不同个体上。在经过一次抗性选择的基础上，由于天然杂交，杂合体抗性基因分离重组，必然会产生抗性基因积累，连续选择便有可能把具有多个抗性基因累加效应的个体选择出来，从而进一步提高了抗性。③根据Vidhyasekaran（1988）“几乎所有植物都存有抵御微生物入侵的防卫机制”的论断，寓意着植物的抗性是固有存在着的。从抗性的性质来看，植物的抗病机制包括预存性被动机制，以及被病菌侵染后激发产生的主动防卫机制。在主动抗病性中，有两套基因先后起作用，即抗病基因和防卫反应基因。抗病基因产物对病菌无毒基因产物有识别作用，从而可诱导防卫基因表达，产生一系列防卫机制，所以，抗病基因产物有识别作用。抗病基因是一种效应分子（抗病蛋白），本身无杀菌作用，真正起作用的是通过防卫机制产生的物质，在形态和生理生化上的许多改变，这些抗病变化包括，植物保护素的合成、细胞壁修饰（愈伤组织、木质素和酚类化合物在壁上沉积）、富含羟脯氨酸糖蛋白的积累、蛋白酶抑制剂和能抵御病原物细胞壁的水解酶（角质酶和葡萄糖酶）的产生。所以，在植物抗病性反应中包括两个阶段。第一阶段为决定阶段，通过病菌无毒基因产物和寄主抗病基因产物相互识别决定寄主抗病性表达；第二阶段是表达阶段，即上述一系列的防卫反应。在病菌的激发下，寄主内的抗病物质得到启动，表现出病株率显著下降，抗病性明显上升。而抗病性的识别机制与病原菌的无毒基因产物识别有一个过程，因而抗病性在连续选择中得以表现与提高。在中国棉花抗病育种史上，系统育种是20世纪80年代前所采用的主要育种方法。据1974年统计，全国育成的148个品种中，67.6%的品种是采用系统育种法育成的。70年代所育成的48个品种中，也有26个是采用系统育种法育成的。川52-128和川57-681是我国棉枯萎病的主要抗原，两者都是在重病田上经连续选择而育成的。川52-128选自古老的栽培品种德字531，川57-681选自岱字棉15，86-1来自陕65-141，陕3563、川73-27、鲁抗一号均选自陕4。中棉所3号选自乌干达3号。系谱选择法是系统育种中最常用的方法，它不仅用于从自然变异选择的系统育种，也应用于杂交、化学和物理方法诱变等人工方法产生的变异群体。在自然变异和人工创造的变异群体中选择单株或单铃种成株行或铃行，每株行或铃行为一个家系或“系统”，由于“系统”间差异比个体间差异大，故先选择优良系统，而后在当选系统内继续选株或选铃，种成下一代株行或铃行。选择连续进行数代，等系统内植株性状已趋一致时，选留符合育种目标的系统，按系统收获。翌年升入设有重复的鉴定圃比较产量，通过一年或多年、一地点或多地点产量比较，鉴定出产量高并具有育种目标要求的品质和抗性的系统繁殖成为品种。系统育种方法简便，收效快，是棉花育种的主要方法之一。但该法也有一定的局限性，表现在：①系统育种的效果主要决定于某品种群体的遗传变异性；而其遗传变异性，表现在天然杂交，基因突变及剩余变异等天然变异。一般地说，这种天然变异几率不会太高，而符合育种目标所要求的有利变异率更低，因而选择效率不高。②应用连续单株选择育成为品种是由一个单株繁衍而成的群体，其遗传基础较窄；对环境条件的适应力差，改进提高的潜力有限。前苏联育种家1978年的试验指出，由21个优良株系组成的品种C-4539群体，经一次选择后，其产量比未经选择的原始群体提高10.5%；而经4次选择的后代产量，虽比未经选择的原始群体提高了4.2%，但比一次选择的后代，降低了6.7%。用8个株系试验的结果表明，经一次选择的后代，其产量仅为未经选择的原始群体的96.7%～99.2%；经4次选择的后代，其产量比原始群体降低17.5%～2.1%。浙江省农业科学院（1974）从岱字棉15号选出浙棉1号，从浙棉1号中又选出协作2号，在协作2号中选出10个株系，其中，只有1个株系的产量超过了对照，增产的幅度较小，抗逆性也差。20世纪60～70年代江苏省徐州地区农业科学研究所在斯字棉2B中，实行优中选优，连续选出了4个丰产性较好的新品种，但这些品种的纤维品质都没有获得明显改进，如徐州1818和徐州142的纤维品质均不理想。为了提高系统育种的效果，可采用下述方法加以改进。①有重复的株行（系）试验。现代的育种方法应能保持和控制遗传变异，即能使育种家容易判明育种材料的遗传变异和由环境条件引起的非遗传变异；而且一个群体对选择的潜在反应的利用决定于所应用的技术方法的有效性。假如所应用的方法不是很敏感的，那么，大多数的遗传变异不仅不能被发现，而且会由于同质性的增加而丧失。由于一个单株后代的种子数量少，故对其后代进行试验鉴定时，增加重复次数比扩大小区面积更能充分利用有限的种子和提高选择的可靠性。②混系法。在改良品种时，为了保持其遗传可塑性，可按一定标准将若干个在形态上基本相似而又不完全相同的家系，合并成为混系品种，其效果比单一家系品种较好。用系统育种方法选育抗病品种，须注意以下一些问题：①整个试验从选择单株到品比试验，自始至终都应在发病均匀的重病地上或人工病圃上进行。以便在表现抗性程度的基础上比较株系间的丰产性和纤维品质。②以当地推广的品种作对照。③除进行一般生育期调查外，应在苗期、现蕾后、结铃盛期以及收获前（劈秆）等不同时期进行发病情况调查。④株行试验可侧重观察抗性，参考结铃性和其他农艺性状的表现。品系预备试验和品种比较试验，则应在表现抗性的基础上注意丰产性和纤维品质。表现较突出的材料可提前进行多点试验，同时进行纤维品质的鉴定，以加速育种进程。⑤已育成的品种在推广和良种繁育过程中，需要继续对抗性进行鉴定和提高。否则一个品种，在同一病区长期种植，由于品种本身抗性组成的变异，以及病原菌的适应性，这一品种的抗性将会有逐渐减弱的趋势。这一方法由高永成等（1995，1996）提出。应用这一方法，徐州地区农业科学研究所、中国农业科学院棉花研究所等单位，从国外新引进的原来感病品种，于5年时间内，改造成抗病品种获得成功。如从1979年开始试验，徐州地区农业科学研究所培育的徐州142、中国农业科学院棉花研究所培育的中棉所7号及西北农业大学培育的西农3195等原来都是高产感病品种，经过5年左右的病床病圃连续群体选择法，徐州142病床枯萎病病株率由原来的97.4%降低为8.5%，岱字棉16病床枯萎病病株率由原来的91.6%降低为8.5%，中棉所7号由原来的99.9%降低为11.3%，西农3195由原来的95.9%降低为7.5%。当选材料，不但由原来感病的转变为抗病的，并且由于连续群体选择，不仅仅着眼于抗性，同时兼顾产量、产量因素及品质性状的同步提高，因而，能将原来的感病品种有效地转变为抗病而综合优良性状的新品种。高永成等（1995）和张云青等（1997）对这一方法作了理论上的分析，认为：①棉花作为枯萎病病原菌的寄主确有在变异的生存条件下，即病茵连续侵入并增大压力条件下，逐渐而又明显地改变自身遗传性以适应新的环境能力。生物的适应变异现象确实存在。同时，棉花寄主确有通过后天获得性遗传累加作用，逐年逐代增强抗性。最终由原感病品种经强化成为高抗品种。没有适应性的变异和后天获得性遗传的累加相互作用，抗性增进不可能，这是抗性提高和定向培育的根本认识之所在。②原感病品种对毒素处理反应迟钝，出现萎蔫现象时间晚，但萎蔫指数高。抗性转化年代愈久、抗性愈高的品种对毒素处理反应愈敏感，出现萎蔫时间也愈早，但萎蔫指数愈低，甚至出现恢复现象。电镜解剖观察到原感病品种导管褐变时间晚，对毒素处理反应迟钝。导管褐变后出现保护性物质——侵填体少，比率小。增进抗性后，导管的褐变现象出现时间，随强化年限增加愈来愈早，褐变后保护性侵填物愈多，比率也愈高。病理学研究结果表明，抗性转化过程即寄主对病菌入侵的反应敏感度和迅速产生保护物质能力，即免疫功能逐年逐代加强的过程。③原感病品种过氧化物酶活性与多酚氧化酶活性高，而抗坏血酸氧化酶活性极低（0值）。定向培育年限愈长，抗性愈高的品种过氧化物酶活性和多酚氧化酶活性愈低，而抗坏血酸氧化酶活性愈高，表明感病品种和抗病品种的生化代谢型确有差别。前两种酶及活性与感病性有关，后一种酶及活性与抗病性有关。抗性转化的实质即代谢型的转化。④育成的抗病品种与感病品种棉籽粉用SDS电泳法进行蛋白质分析表明，感病型品种β组分色谱带量少色淡，抗病品种β组分带量多色深。β组分蛋白质估计为球蛋白。说明抗性转化过程中棉株生化代谢型转化，会影响到种子生化代谢型的变异，这是棉花抗性品种与感病品种生化物质成分的差异。种子球蛋白用SDS-PAGE法分析发现感病的岱字棉16种子球蛋白由10种分子量不等的蛋白质组成，而岱字棉16则由8种蛋白质组成，前者含有较多高分子量蛋白，后者含较多低分子量蛋白，表明抗性增进过程中，种子形成高分子量球蛋白质合成减少、低分子量球蛋白合成增多。抗性定向培育法的关键技术为：①培育的对象应是需要注入和强化抗性的农艺性状优良品种；②注重培育病床、病圃，强化菌种分离与培养；③病床、病圃发病高峰期，强化对棉苗（株）的选择、严格淘汰；④纤维品质测定、淘汰与选择；⑤经3～5年严格筛选，同时，择优进入继续强化抗性的良繁体制。为探讨定向培育法通过病圃加压筛选获得的抗病品种（系）提高抗枯萎病性的病理学机制，吕学莲等（2008）以病圃定向筛选抗枯萎病大幅度提高的棉花材料和原感病品种为对象，研究接种枯萎病菌后抗、感材料的病理学变化。结果表明，两者在宏观病理学方面存在差异，感病品种接种7天开始显症，25天严重发病，整株维管束变色；抗病材料生长健康或只有轻微症状，维管束变色部位仅局限在子叶节以下。在细胞和组织病理学方面，两者也存在差异，侵入前期，抗病材料被侵入细胞中，有细胞壁加厚现象；侵入中期，病菌可通过表皮层侵入感病品种的薄壁组织，但只能到达抗病材料的皮层组织中；侵入后期，抗病材料中，出现大量寄主细胞的降解物质或分泌物将菌丝包围，阻止病菌进一步扩展。抗病材料的抗侵入和抗扩展能力均较感病品种大幅度增强。杂交育种是指用基因型不同的品种（系）作亲本，通过有性杂交获得杂种，继而在杂种后代中进行选择，培育成符合生产发展需要的新品种的方法。在杂交育种中，通过人工有性杂交，可将不同亲本的优良基因组合在Fl的杂种个体中，由于这时的基因型是杂合体，Fl个体自交所形成的F2及其后代因基因分离重组而产生各种变异类型，即出现具有不同性状组合的变异个体，再经选择，自交纯化，就有可能获得综合性状优良一致的新品种（系）或超越双亲的新类型。经此法培育的品种属纯系品种类型。杂交育种是当前国内外作物育种中，应用最广、成效最大的育种方法，是现代作物育种最基本的方法。作物产量、品质、抗性等性状之间，常有负相关现象，已有许多研究者讨论过这一问题，并提出打破或缓解这种负相关的方法。Weikaivan等（1995）提出关于作物性状负相关的见解认为，这是育种上一个极为复杂的问题，比以往人们所提到的应给予更多的重视。据Donald等（1996）认为，许多与生长发育有关的性状都是相互联系的，稳定地保持正或负的相关关系。由于相互联系的性状之间的负相关，阻碍了育种的进展。认为不利性状的联系有3个主要来源，遗传连锁、一因多效，以及一定环境影响下的性状间的相互联系和补偿作用。由于遗传连锁的负相关势必延缓育种进程，但是，只要有充分大的杂交分离群体，并确切地鉴定重组型，遗传连锁是可以打破的。遗传连锁一旦打破，重组型将成为既持久又有利的遗传连锁了。与此相反，由于一因多效的负相关，既不受遗传也不受环境因子改变的影响，比较难以打破。由于环境导致互补而产生的性状间的负相关也难以打破。主要是与产量有关的性状，相互联系形成一个体系。在这个系统内，一个或多个性状必须在表现程度上有所递减，另一性状的表现程度才能有所提高。相互联系的性状应该看成一个有常数容量的生物学体系，选择的目的应该达到一个协调式的理想型，要达到这一体系中多数性状的每一个都能达到理想的水平。使这一体系能作为一个整体达到最大限度的功能，而不是去追逐极端的看起来似乎是最理想的每一个单一性状的水平。在理想的但负联系的性状之间的选择必须进行调和，使这一生物学体系的功能作为一个整体达到最大限度的作用，而不是选择个别性的极端水平。根据这一概念，不顾其他性状只选择单一性状是不合适的。一个符合育种目标的栽培品种应具有这样的基因型，即其体系成员（相互联系的性状）的比例能最好地适应于该品种所生长的环境。另外，必须具有有些独立性状，如对某种特殊病虫害的抗性，因为这种性状的基因较少牵涉到产量因素的负联系中去。通过何种育种方法才能有效地打破这种遗传上负的关联性，获得理想的重组体，育成符合育种目标要求的综合性状优良的新品种，这是国内外棉花遗传育种家一直在努力研究的课题。棉花育种大多采用杂交育种法，显然已取得了显著的成效，但这种方法存在显而易见的缺陷。首先是杂交次数少，不利于有利基因通过交换达到重组，不利于基因加性效应的积累，极大地限制了理想个体出现的几率；其次是难以打破皮棉产量与纤维品质、产量与抗病性性状遗传上的负相关性，难以选择出综合性状优良的个体。针对这些突出问题，国内外棉花育种家试验过多种育种方法。主要有：这个体系是张凤鑫（1987）等研制成功的。育种上不能把各种有益性状集合在一个基因型中，这是由于存在性状间的不利关系，这种关系来自连锁，或“多因一效”，或“一因多效”，但主要是连锁的作用。要从根本上解决这一问题，只有通过遗传信息序列的广泛重组才能改变其连锁状态。把育种群体作为一个动态基因库来处理，通过多个亲本多次的相互交配（含分裂交配）及随时根据需要输入新种质，通过遗传的高度杂合化，打破原有亲本的遗传系统，促成遗传信息序列的广泛重组；打破遗传连锁，释放出潜在有益变异，再按育种目标施以相应的（病、虫、逆境、产量、品质）选择压力，干涉遗传信息序列的分支方向，并通过不断的轮回选择，聚合大量有利基因及其重组体。如此，不但可在一个育种周期内基本实现其综合育种目标，而且，随其杂种库的丰富、改进、演化，可不断创造出新品种。张凤鑫等应用该体系进行育种验证，结果表明，该体系是行之有效的，一是抗性进展快，枯萎病病指较亲本均值降低90%左右，黄萎病病指降低59%，苗病死苗率降低80%，一部分材料还兼抗棉蚜、棉红铃虫、棉铃虫，如杂种优势利用新材料高柱头系102-1，高抗枯萎病，抗黄萎病、抗棉蚜、棉铃虫，高抗红铃虫。二是铃重、单铃子数、衣指、籽指、衣分、单铃皮棉重、2.5%跨距长度、比强度、马克隆值的遗传变异分别扩大2～3倍。抗性与皮棉产量的遗传关系得到改善，产量与苗病死苗率、枯萎病、黄萎病的病指遗传相关系数分别为rg=-0.5，-0.54，-0.13。纤维比强度与苗病死苗率、枯萎病、黄萎病病指的遗传相关系数分别为rg=-0.49、-0.29、-0.28；皮棉产量与纤维2.5%跨距长度、比强度、马克隆值的遗传相关系数分别为rg=+0.45、+0.36、+0.02。高衣分与高比强度的重组率提高到20%以上。皮棉产量与比强度的遗传相关系数由亲本间rg=-0.8变为-0.12。与杂交系谱法比较，相同亲本的入选后代，新体系入选后代的皮棉产量较常规法高12%，比强度高0.6%；第二轮选择则比常规法皮棉增产率达53.7%，比强度高11.3%。研究者利用该体系已育成一批优良新品种，其中，川碚2号曾推广75万亩，创造了166kg/亩的皮棉高产纪录。利用这些新品种还育成了洞A×B023-11、473A×川碚2号、101-l×川碚2号等杂优势新组合，创造了175.4kg/亩的高产纪录。育成的杂种优势利用新材料高柱头系101-1、102-1，同时抗耐枯萎病、黄萎病、棉蚜、棉红铃虫、棉铃虫，育种成效显著。该体系由马家璋等（1987）建立。其指导思想是，通过混交，打破育种性状间的不利遗传负相关；通过混选获得优良基因的重组体。其主要步骤是，以育成的遗传基础丰富的选系为共同亲本，同时与几个各具特色的目标性状亲本杂交。Fl代海南省异地加代。F2代种植在育种基地枯、黄萎病的重病土上；淘汰抗性差的不良组合；保留组合进一步淘汰劣变个体后混收其种子。F3代海南异地种植，进行不去雄的群内混交。每株收摘1～2个混交铃，混合留种，完成一轮混交——混选。按同样方法去完成第二、第三轮的混交—混选。各轮混交群体开放授粉1～2代，然后从群体中选拔优良个体，系统地进行家系鉴定和选择，决选出新品种。该体系的遗传改良效果也是比较好的，表现在：①显著提高产量、早熟性、2.5%跨距长度的平均数。枯、黄萎病的病指保持在高抗和抗的水平；②扩大遗传变异幅度；③改善性状间关系，加强了产量与铃数、铃重间正相关，降低株铃数与铃重、籽指与衣分率之间负相关，皮棉产量与纤维比强度的遗传相关系数由-0.397变为+0.494，株铃数与比强度相关系数由-0.901变为+0.71，衣分与马克隆值相关系数由+0.34变为-0.411，早熟性与皮棉产量相关系数由-0.282变为+0.797。马家璋等采用该体系育成兼抗品种中棉所23。山西省农业科学院棉花研究所采用这一方法也育成了晋棉11。该体系由潘家驹等（1990）建立。修饰回交（modificd backcross）就是回交后代选系间的彼此再杂交，可以培育棉花多系品种。在棉花抗病育种中，通过回交产生若干同质系，然后将各同质系按一定要求混合组成多系品种。通过修饰回交研究，将杂种品系间杂交与回交结合，综合两者特点，回交纯合快，缩短育种年限，后代只聚合回交亲本基因型，选择容易成功。其程序是：选用一个丰产品种作为轮回亲本（A），以优质品种（B）、抗病品种（C）为授予亲本，以品种A分别与品种B、C杂交，其后代分别以A作为轮回亲本回交，分别从回交后代中选拔优系，然后进行不同回交选系的杂交。其程序模式如图5-1所示。通过1980～1990年两轮试验结果表明，修饰回交法对削弱丰产与抗病、抗病与纤维比强度之间的负相关程度有一定效果。第一轮试验中，皮棉产量和病指的相关系数由原来的-0.51转变为-0.21。在第二轮试验中，无论抗病株率与皮棉产量或病指与皮棉产量的直线回归分析，4个修饰回交系均表现出以正效应方向偏离回归线。通过修饰回交使抗病株率与纤维比强度之间的相关系数由-0.4779变为-0.1183，病指与纤维比强度之间的相关系数由-0.5185变为-0.1933。图5-1 修饰回交体系MAR（Multi Adversity Resistance，多抗逆性）体系是Bird等（1980）通过研究种子状况、抗细菌性角斑病和抗性基因之间的遗传关系（图5-2）后提出来的。图5-2 MAR体系中抗病基因与其他性状基因之间的遗传关系从图5-2中可得知：①抗细菌性角斑病与枯萎病（根结线虫病复合体）之间有很强的相关关系；②抗细菌性角斑病与黄萎病、根腐病以及种皮抗霉菌之间的相关关系较小，但显著；③抗枯萎病（根结线虫病复合体）与黄萎病、根腐病之间也存在一定的相关性；④在低温（13～18℃）条件下，降低发芽速度与抗黄萎病、苗期病害有关；⑤种皮抗霉菌的特性与产量、早熟性之间有高度相关；⑥小种子与在低温下发芽快、易感黄萎病密切有关。根据以上研究结果，MAR体系育种方法的关键是：种皮抗霉菌，种子在13.3℃下处理8天后的发芽状况，以及子叶期对多种不同角斑病生理小种的抗性性状的选择。通过对这3种性状的选择，达到改良抗病性、提高产量和提早成熟的目的。具体的技术要点如下。①根据育种目标，选用具有抗性、高产和纤维品质好以及成熟早的材料用作杂交亲本，配制复式杂交组合。例如，品种SP21S是选自杂交组合（SP21F×SP33F）F1×（SP21V×SP37V）F1。②单株选择开始于复式杂交组合的F1代。当选单株的种子经硫酸脱绒，洗净，再用10%氢氧化钠溶液浸数秒钟，洗净后在41℃温度下烘干，以后置于常温下2周时间。③脱绒后的种子放入盛有1.5%洋菜培养基的培养皿内，每皿25粒。培养皿不加盖，让种子与培养基暴露在空气中，以自然的方式感染真菌孢子，主要是镰刀霉和交链孢霉。最后用带有小孔的塑料纸把培养皿封上，放进13.3℃的人工生长箱内历时8天。8天后检查种皮表面抗霉菌和发芽情况。当选种子的标准是：种子表面不带霉菌，且刚露白（胚根仅伸出种皮1mm左右）。由于不同材料抗种皮霉菌和种子发芽的能力有差异，因而在实际掌握这两个标准时，应尽可能选择种皮表面不带霉菌或少带霉菌，胚根伸出种皮尽可能短的种子。④当选种子在温室中播于用立枯病和猝倒病原菌接种过的土壤中，5天后检查发病情况。正常苗保留，感病苗淘汰。⑤当选的正常苗再用4种不同生理小种的细菌角斑病菌混合液在子叶背面中部接种，10天后检查发病情况。免疫的苗（接种伤口处不发黑或没有向附近健康组织蔓延）保留，其余的淘汰。同时，检查每个幼苗的下胚轴部分（茎与土面交界处），感病发黑的淘汰。⑥当选的幼苗即为MAR选系，把它移入较大的盆中，直至每株最后能结2～3个棉铃。这样产生的种子，供大田鉴定和选择之用。以上程序从F1代开始一直使用到F5或F6代产生品系为止。这一育种方法把作物品种、微生物群体、生态环境、病原物四者之间相互联系起来，这较只考虑作物、病原、环境三者的关系有了很大提高。有关主要病害的抗性遗传趋势研究已经肯定，对枯萎病，其F1代的抗性均倾向于抗性亲本。因此，抗感亲本的杂交，F1代至少可达到耐病水平；抗×抗的杂交，F1代的抗性将不存在任何问题。因此，生产抗性杂交种不存在技术上的障碍，利用杂种优势同样是一条抗枯萎病育种的有效途径。棉花杂种优势早在1894年，Mell首次描述了陆地棉与海岛棉种间杂交的杂种优势表现。1907年，Balls也报道了陆地棉与埃及棉种间杂种一代，在株高、早熟性、绒长和籽指等性状的优势现象。此后，世界各产棉国对棉花杂种优势利用进行了大量的试验研究。我国棉花杂种优势研究始于20世纪20年代。冯泽芳等（1923）研究并发现了亚洲棉品种间的杂种优势。奚元龄（1936）研究证明，亚洲棉不同生态型的品种间杂种一代的植株高度、衣指、单铃籽棉重、单铃种子重及纤维长度等性状都表现有显著或微弱的杂种优势。1947年，杜春培等以鸿系265-5与斯字棉2B杂交，开创我国陆地棉品种间杂种优势利用研究之先河。研究结果认为，杂种一代的多数性状有明显的优势，绒长、衣分和单铃重介于双亲之间，生育期偏向早熟亲本。50～60年代的研究工作以陆地棉与海岛棉种间杂种优势利用为主。70年代以后转入陆地棉品种间的杂种优势利用研究，直到20世纪90年代，棉花杂种优势利用才得到迅速发展。1990年中国杂交棉占全国棉田面积的0.3%，而后，基本呈直线上升趋势，到1999年全国杂交棉占全国棉田面积的10.8%。目前，我国杂交棉的面积仅次于印度，居世界第二位；从国内主要农作物杂交种的种植面积看，棉花仅次于玉米、水稻和油菜，列居第四位。大量的研究结果业已表明，不同亲本之间杂交，其F1所表现的优势有很大差异，就竞争优势的变幅而言，从强优势、无显著优势到负向优势。因此，有了优良的亲本，并不等于就有了优良的F1，双亲性状的搭配、互补以及性状的显隐性和遗传传递力等都影响F1的表现，因而，有必要研究亲本选配规律，以便有效地利用杂种优势。（1）研究亲子关系对于利用F1杂种优势的育种工作，由于双亲杂交直接决定了F1表现的好坏，没有后代的分离选择过程。所以，亲子相关研究至关重要。亲子关系的分析方法，一般是利用亲子数据进行相关分析，通过相关系数的大小及其显著性程度来判断亲子关系的密切程度，进而指导亲本选配。（2）研究亲本间遗传差异亲本选配是否合理与杂交亲本间的遗传差异有着密切的关系。如何衡量亲本间的遗传差异，通常认为，地理来源差异大的品种反映在形态、生态、生理和发育性状上的差异也大，也许可以用亲本地理上距离的远近代表它们的遗传差异的大小。但进一步研究表明，亲本的地理分布与其遗传差异并无直接联系。由于一个符合育种目标要求的组合（F1）往往是许多优良性状的综合结果。因此，在亲本选配时必须考虑多个性状，不能只局限于单一性状。而采用多元统计方法获得的遗传距离就可衡量亲本多个数量性状的综合遗传差异。（3）配合力分析配合力是在选育玉米自交系的工作中引出的概念，是指一个自交系与另外的自交系或品种杂交后，杂种一代的产量表现。表现高产的为高配合力，表现低产的为低配合力。目前，配合力的概念已引伸到其他作物的杂种优势利用和杂交育种中。配合力和杂种优势有密切联系，但两者含意并不完全相同。配合力专指杂种一代的经济性状，主要是指产量高低和品质优劣；杂种优势系指杂种在经济性状、生物学性状等方面超越其亲本的现象。因此，利用杂种优势时，既要注意亲本配合力的高低，又要注意它们的杂种在有利性状方面优势的强弱。配合力有一般配合力（GCA）和特殊配合力（SCA）两种。一般配合力是指一个被测系（自交系、不育系、恢复系等）与一个遗传基础复杂的群体品种（系）杂交后，产量与品质等经济性状表现的能力，或这个被测系与许多其他系杂交后，F1的产量与品质等经济性状的平均值；特殊配合力是指一个被测系与另一个特定的系杂交后，产量与品质等经济性状的表现的能力。因此，可以说，被测系的许多特殊配合力的平均值，就是一般配合力。在杂种优势利用的实践中，选配一般配合力高的品种（系）作杂交亲本，有可能获得高产与优质杂种，减少选配杂交组合的盲目性。所以，一般配合力高的品种（系）是选育高产优质杂种的基础。在棉花上，测定配合力用得最多的方法是双列杂交法，这一方法不仅有理论基础，而且，可同时测定一般配合力和特殊配合力。（4）外源基因及异常种质的利用所谓外源基因，指人工构建的或非棉属的其他物种的基因，目前主要是指转Bt等抗虫基因；所谓异常种质是指一般陆地棉品种不存在的一些质量性状种质，目前所涉及的主要是无腺体（即低酚棉）、无蜜腺、鸡脚叶、超鸡脚叶、芽黄及黄花粉等性状的种质。实际上，Bt等抗虫基因表达的也是一种异常质量性状。在20世纪90年代以前的20多年中，中国育成的陆地棉品种间杂交棉共13个，当时不存在外源基因参与的可能，也没有异常种质的亲本组成的杂交棉，杂交棉的杂种优势并不十分显著。在20世纪90年代的10年中，育成了23个杂交棉，其中，有转Bt基因抗虫棉为亲本的杂交棉15个，有异常种质即无腺体、鸡脚叶、芽黄、黄花粉等异常性状的种质参与的杂交棉5个（其中，3个同时具有Bt基因）。这些杂交棉优势明显，生产应用效果良好。据此，汪若海、李秀兰（2001）提出，Bt等外源基因及某些异常种质，很可能对杂交棉的杂种优势形成有着特殊的作用。鉴于外源基因及异常种质形成超常优势的现状，他们就杂交棉亲本选配原则提出了双亲遗传差异要“大同小异”的新观点。大同指双亲遗传基础基本相近，综合性状都较优良。小异指某项性状、某些遗传物质或某个遗传位点上确有明显差异。由此会形成显著的杂种优势；如果双亲间遗传基础“雷同无异”，相当于亲缘相近的品种（系）间杂交，常无优势可言；反之，双亲间的遗传是“大异小同”，则相似于种间杂交，变异大而很难获得可利用的优势。棉花杂种优势利用途径，实际上就是指杂交制种的方法。尽管杂交制种的方法各不相同，但去雄和授粉是任何杂交制种方法所共有的环节。根据去雄方式的不同，目前，杂种优势利用的途径主要分为人工去雄授粉法、雄性不育系（包括核雄性不育，即一系两用法和核质互作雄性不育，即三系法）、标记性状利用和花器官变异体利用。目前，生产上应用的杂交棉以人工去雄授粉法为主，占95%以上的杂交棉面积，其次是核雄性不育系的利用。（1）人工去雄授粉法人工去雄授粉法制种的最大优点就是父母本选配不受限制，配制组合自由，它的缺点是制种全部需要人工操作，工作强度大，种子生产成本高。为了提高制种效率，有关单位做了大量的制种方法研究。湖南澧县研究了冷藏花粉不去雄授粉法，原北京农业大学（现中国农业大学）研究了不去雄强制授粉法，江西省棉花所研究了麦秸套管授粉法，湖北南梓县研究了花冠直套法，河南研究了全株去雄法等，在一定程度上提高了制种效率。但降低制种成本问题仍然没有完全解决。（2）核雄性不育材料的一系两用法这种方法又称稳定系自交繁殖制种法。四川省农业科学院经济作物研究所采用这一方法先后选育出的组合有川杂1号、川杂3号、川杂4号、川杂6号等。采用一系两用法，需拔除50%以上的可育株，制种成本仍然较高，其不育系的不育性逐步失去稳定性，达不到1∶1的分离比率；加上不育材料的综合性状已大大落后于现有生产品种，在抗性上难以达到抗病水平；不育基因对杂种生产能力有负效作用等原因，该途径的利用已受到限制。国内外棉花杂种优势利用均存在制种成本高、优势不很强的共同困难，制种成本居高不下的原因除人工去雄外，各种雄性不育材料的制种环节多也是一个重要原因。核不育材料由于未能解决保持问题，制种过程中必须拔除可育株。核不育两用系仍然要通过系内可育与不育株的授粉来保存。利用核质互作不育材料时，转育恢复基因和育性强化基因周期长，使选拔优势组合大受限制，加大了研制成本。因此，在杂种优势利用上，研究新的技术途径，尤其是生物技术的应用，势在必行。随着分子生物学、植物病理学及基因工程技术的迅猛发展，运用基因工程手段提高植物的抗病性，为抗病育种开辟了一条崭新途径。分子育种目前主要包括分子标记辅助育种、转抗病基因育种和分子设计育种3部分内容。分子标记辅助选择（molecular marker-assisted selection，MAS）主要是指基于分子标记和作图技术，利用与目标性状紧密连锁的DNA分子标记对目标性状进行间接选择，以在更短代数内就能够对目标基因的转移进行准确而稳定的选择，聚合多种目标性状特别是对选择隐性基因控制的优良农艺性状十分有利，结合加代技术就可以大大缩短育种年限，缩小育种群体，提高育种效率，聚合选育出抗病、优质、高产的品种。目前，通常采用的分子标记技术主要有RFLP、RAPD、AFLP、SSR等。国内外一些学者正致力于棉花抗性基因分子标记的研究。一方面通过寻找与抗病基因紧密连锁的分子标记，能够直接或间接地定位抗病基因；另一方面用与抗病基因紧密连锁的分子标记，能够把多个基因聚合在同一个品种中，从而实现抗原积累，提高抗病品种的使用年限，并能把抗性与棉花的其他重要农艺性状结合起来，为分子标记辅助育种提供有力的工具，从而大大缩短育种年限。陈勋基等（2008）以高抗枯萎病的陆地棉品系（Gossypium hirsutumL.）98134和海岛棉（Gossypitum barbadenceL.）感病品种新海14号为亲本，构建98134×新海14的F2和F2∶3分离群体。运用SSR标记构建连锁图谱，用复合区间作图法对F2∶3家系的病指进行基因组QTL扫描，共检测到4个与棉花枯萎病相关QTL效应，分别位于3、15、23和26连锁群上。经标记值分析，该QTL能解释高值亲本的增效作用，分别解释F2∶3家系变异的12.4%、20.96%、4.7%和11.9%。虽然研究中的遗传图谱位点较少，密度不大，但是由于其作图群体是陆海杂交群体，所筛选出来的标记均在两个亲本间差异较大。构建群体所用的亲本为新疆棉区主栽品种，它们除了在抗病性状方面有差异外，其纤维品质性状具有互补性，试验所用作图群体的F2∶3株行，在均匀的枯萎病重病试验田种植，整个生育期内，进行了多次的病指统计鉴定，试验数据可靠，重复性好，对枯萎病QTL的定位比较可靠。研究结果为分子标记辅助选择抗枯萎病棉花育种提供了重要的理论依据。目前，国内外用于棉花转抗病基因育种的基因主要有两类：一类为病程相关蛋白（PR protein）基因，包括各种来源的几丁质酶基因（Chi）等；另一类为各种植物源的抗菌蛋白基因，已报道和利用的有萝卜抗真菌蛋白（AFP）、天麻抗菌蛋白（Afp-1）、商陆抗菌蛋白基因（Afp-2）等。在方法上，主要采用农杆菌介导法和花粉管通道法来获得转基因抗病的优良植株即育种材料，然后经过常规的杂交育种或者系统选育，最终培育出优良的棉花新品种。天麻抗真菌蛋白（gastrodia antifungal pratein，简称GAFP）是从我国传统中药天麻（Gastrodia elataBl.）中分离得到的一种具有广谱抗真菌活性的蛋白质，它对许多植物真菌病的致病菌离体具有很强的抑制作用。危晓薇等（2007）报道，将所获得的转gafp基因的陆地棉经Southern点杂交，证实得到了2株高抗枯萎病的转基因植株。其后代经过进一步的抗病性筛选、PCR鉴定、选育和扩繁，发现转基因陆地棉后代具有稳定的、较强抗枯萎病能力。从7月20日枯萎病发病高峰期调查枯萎病圃抗病性鉴定结果看（表5-9），对照军棉1号的枯萎病发病程度重，枯萎病病指54.59，受体对照新B-1的枯萎病病指为42.87。同时，对鉴定结果进行了校正并计算了各个株系的抗效来客观评价各株系的抗枯萎病水平，T3代5个转基因株系中，3个株系HB0204、HB0240和HB0254的枯萎病相对病指分别为8.14、9.03和5.18，均在5.1～10.0，抗效在80.1～90.0，为抗枯萎病类型，其余2个HB0208和HB0260相对病指均在10.1～20.0，抗效在60.1～80.0，为耐枯萎病类型。而陆地棉对照新B-1为感枯萎病类型。从转基因陆地棉后代株系与受体品种的抗效比较结果来看（表5-10），转基因陆地棉株系枯萎病抗效比受体品种的提高均在27.94%以上，其中，HB0254枯萎病抗效提高最为明显，为46.66%，说明转天麻抗真菌蛋白基因（gafp）的陆地棉后代具有较强的抗枯萎病能力。2003年，在库车试验站继续进行抗枯萎病鉴定试验，有8份转基因后代株系材料抗病性达到“抗”以上（当年10月28日进行的剖秆病指小于10）（表5-11）。株系发病率（%）病指相对病指抗效抗病类型HB020427.088.858.1483.79RHB020845.4513.6412.5575.01THB024032.919.819.0382.03RHB025412.505.635.1889.69RHB026018.7513.2812.2275.67T军棉1号（CK）86.9954.5950.000.00S新B1（CK）67.9742.8739.4421.47S表5-9 转基因陆地棉后代株系抗枯萎病鉴定结果株系HB0204HB0208HB0240HB0254HB0260枯萎病抗效提高（%）43.0831.9839.0046.6632.64表5-10 转基因陆地棉后代株系与受体品种的抗效比较编号总株数发病株数（剖秆10月28日）0级1级2级3级4级发病株率（%）病指0305421410400028.67.1030546139400030.87.70305521411300021.45.4030556149500035.78.90305571612400025.06.30305621210200016.74.20306011511400026.76.70306432200000.00.1表5-11 2003年枯萎病圃转基因抗病材料发病情况调查（10月28日）目前，研究较多的是以拟南芥为模式植物的系统获得抗性SAR（system acquired resistance），当植物受到病原菌侵染后局部的HR（hypersensitive resistance）会产生一类信号分子，这种信号分子能诱发整个植株的防卫基因表达，从而使植物对更多的病原菌产生抵制作用（王忠华等，2004）。而SNCl（suppressor of nprl-1，constitution 1）基因在植物的系统获得性抗性（SAR）发生中，起着重要的作用，它是从拟南芥中克隆出的，以水杨酸为信号传导的负调控子，有着组成型的高水平PR基因表达，具有广谱抗病性，此基因编码NB-LRR（nucletide-binding-leucine-rich repeats）蛋白（Li等，2001；Zhang等，2003）。将SNCI序列在NCBI上Blast，极少部分序列与已知的棉花序列相似，但功能不同。由于该基因尚未在其他植物中进行遗传转化。因此，雷江荣等（2010）以陆地棉中棉所35和军棉1号的茎尖为外植体，利用农杆菌介导法将含有拟南芥抗病基因SNCl（suppressor ofnprl-1，constitutive 1）转入棉花。对外植体培养时期、农杆菌侵染时间和共培养时间进行改良，试验结果表明，在外植体培养1天，菌液侵染20min，并且共培养保持在2天能够获得较高的遗传转化效率。PCR以及RT-PCR对再生植株T0代和T1代棉花的检测结果表明，SNC1基因已经整合到棉花的基因组中并得到表达。利用浸根法，对T1代转基因棉花接种棉花枯萎病菌强致病力菌株（Fusarium oxysporumf.sp.vasinfectum），与对照比较，T1代转基因棉花的枯萎病抗性明显提高（表5-12）。该项试验所选择的新疆棉花枯萎病菌是致病力较强的菌株，它对感病品种“军棉1号”的致病率为66.7%。采用培养钵伤根法，接种到转SNC1基因的T1代植株，转SNC1基因的棉花品种发病率较非转基因品种均有明显的降低。说明转化外源SNC1基因的棉株对棉花枯萎病具有一定的抗病性。但这仅是对T1代植株的室内接菌结果，仍须种植于大田病圃中，继续进行剖根鉴定。品种总株数第1天第6天第11天第16天第21天病株数发病率（%）病株数发病率（%）病株数发病率（%）病株数发病率（%）病株数发病率（%）转基因军棉1号128001612.52821.93225.04837.5转基因中棉所35153001711.12315.03422.23422.2军棉1号对照150003322.08456.010066.710066.7中棉所35对照150001510.04530.06040.07550.0表5-12 接菌后棉株培养钵伤根法接菌发病率统计利用分子生物学技术揭示抗性提高材料中相对于原感病品种中差异表达的基因，为后续克隆这些抗病相关基因和研究定向筛选抗病性提高的分子机制奠定了良好基础。Liang等（1995）发明的mRNA差异显示（mRNA differential display）技术是一种快速、简便、灵敏的能直接鉴定和克隆差异表达基因的方法。近年来，此方法已被广泛地运用到真核生物基因差异表达的研究中。吕学莲等（2008）以天九63棉花品种和其经过病圃定向筛选2年、3年分别对枯萎病菌7号生理小种表现高感、耐病和抗病的材料为研究对象，利用差异显示PCR技术对接种枯萎病菌前后的抗、感材料中差异表达的基因进行了初步研究，结果共得到62个差异条带。进一步通过反向Northern杂交验证，发现其中有8个是抗病诱导增强的阳性条带。经克隆、测序和同源性比对分析，结果表明，除14-3片段没有找到同源性外，其余的差异条带都可以找到同源性较高的序列。其中，10-5和22-11与盐胁迫下松科植物的抗菌素cDNA同源性达到100%，22-6达到96%，22-2与缺氮条件下松科植物cDNA的同源性为100%，推断其与植保素类物质的调控和生成相关；13-10与陆地棉纤维的cDNA同源性为100%，蛋白质序列比对发现它编码磷酸氧化酶相关的维生素类物质，推断其参与抗病相关酶类的合成途径；差异条带6-3与棉花根茎部幼嫩组织和纤维的cDNA同源性为99%，与陆地棉胚珠cDNA同源性为98%；10-7与假定的衰老相关蛋白mRNS同源性为98%。作物分子设计育种最初由荷兰科学家Peleman（2003）提出，其目的是通过各种技术的集成与整合，在育种家的田间试验之前，对育种程序中的各种因素进行模拟、筛选和优化，确立目标基因型、提出最佳的亲本选配和后代选择策略、提高育种过程中的预见性。分子设计育种一般包括以下步骤：①找到育种目标性状的基因/QTL或其紧密连锁标记；②利用QTL位置、遗传效应、QTL之间的互作、QTL与环境之间的互作等信息，模拟和预测各种可能基因型组合的表现型，从中选择符合特定育种目标的基因型；③进行目标基因型的途径分析，制定育种方案；④根据制定的育种方案进行育种，在此过程中，合理应用分子标记育种、转基因育种和传统育种技术，实现预期目标。由此看来，可把分子设计育种看成分子育种的高级形式。全基因组选择技术，也可认为是分子设计育种的组成部分。近20年来，随着分子生物学和基因组学等新兴学科的飞速发展，使育种家对基因型进行直接选择成为可能，作物分子育种因此应运而生。分子育种就是把表现型和基因型选择结合起来的一种作物遗传改良理论和方法体系，可实现基因的直接选择和有效聚合，大幅度提高育种效率，缩短育种年限，在提高产量、改善品质、增强抗性等方面已显示出巨大潜力，成为现代作物育种的主要方向。