洋葱伯克氏菌（Burkholderia cepacia）是一种广泛存在于土壤、水和植物根围、与医院感染病人密切相关的革兰氏阴性细菌。它最初作为植物病原菌被认识，后来发现它也是医院中重要的人体条件致病菌，由该菌引起患者洋葱伯克氏菌综合症的致死事件在国内外均有报道。同时它在农业领域中具有生物防治、生物降解和促进植物生长等多种功能。近年来，该菌被认为不是一个种，而是一组基因型不同、表型相近的复合物，称为洋葱伯克氏菌群（Burkholderia cepacia complex，简称Bcc）。因此，重新认识医院和自然环境中的Bcc菌对于Bcc生防因子的风险评估尤为重要。Bcc菌致病基因的发现和挖掘将有助于更好的认识病菌的致病机制。目前已证实的毒力基因有BCESM和cblA基因。这些毒力基因大部分存在于医院菌，以在基因型Ⅲ菌株中分布率最高。虽然大量与囊性肺纤维化患者致病相关的Bcc致病菌及生防菌已被用来风险评估，但其他来源Bcc菌的毒力研究相对较少。近年来研究表明，苜蓿可以作为评估Bcc基因型毒力因子侵染的植物模型。因此，本试验采用苜蓿植物模型对来源于中国自然环境和医院中的Bcc菌株进行了毒力测定，同时也对两个毒力基因BCESM和cblA进行了特异性PCR检测，以便为评价所获Bcc不同基因型菌株的安全性提供重要依据。研究结果表明，来源于医院的基因型Ⅰ和Ⅲ菌株均对苜蓿幼苗有较强的毒力，幼苗子叶黄化或白化，根短小、畸形，对苜蓿幼苗的平均发病率分别达到69%和68%。来源于自然环境的Bcc菌株中，基因型ⅢB也对苜蓿幼苗表现出强毒力，幼苗症状类似于医院致病菌的致病效果，幼苗平均发病率为55%；基因型Ⅰ菌株对苜蓿幼苗的毒力程度较轻，有的菌株没有致幼苗发病；基因型Ⅴ和Ⅸ的多数菌株对苜蓿幼苗发病率很低，部分菌株不致幼苗发病。这说明来源于自然环境的基因型ⅢB菌株与医院致病菌的基因型ⅢA和Ⅰ菌株具有相同的毒力，表明自然环境中的基因型ⅢB菌可能为潜在的人体条件致病菌。同时研究表明，在这些Bcc菌株中，未检测到BCESM和cblA这两个毒力基因。

茄科青枯菌[Ralstonia solanacearum（E.F.Smith）Yabuuchi et al.]是世界上最重要植物病原细菌之一。该病原菌的寄主范围很广，可侵染44科数百种植物。该病原菌种内存在明显的异质性和多样性，根据其寄主范围或对碳水化合物利用差异，分别划分为5个生理小种和5个生化变种。广东地处亚热带，气候温暖湿润，终年适合作物生长，这为茄科青枯菌侵染引起的作物青枯病发生与流行创造了条件，每年均造成较大的经济损失。以前的研究结果表明，广东茄科青枯菌存在明显的致病性分化。为了深入研究该病原菌种内分化，对采自广东各种作物上的茄科青枯菌菌株进行了分子分析。从200条随机引物中筛选出17条扩增带清晰且扩增结果稳定的随机引物，用这些引物分别对31株茄科青枯病菌DNA进行RAPD分析。结果显示，17条随机引物扩增带主要分布于0.35～3.5kb范围，共扩增出523条带，其中468条为多态性带，占89.5%，说明广东茄科青枯菌DNA存在较丰富的遗传多态性。RAPD结果的聚类分析可以将上述31株茄科青枯菌划分为4个簇群，这些簇群与寄主植物间存在较高程度的相关性，说明青枯菌的致病性分化是由于其DNA上的差异所致。对分离自广东各地番茄、茄子、烟草、辣椒、空心菜、沙姜、姜、马铃薯、花生、菊花、桑树和藿香等12种作物21株茄科青枯菌菌株16S rDNA和16S～23S ITS克隆和序列分析表明，这些菌株16S rDNA序列间同源率大于99%，ITS序列间同源率大于93%，说明广东茄科青枯菌16S rDNA序列高度保守，而16S～23S rDNA ITS序列也很保守。

大蒜（Allium sativum L.）为百合科葱属草本植物，别名胡蒜（崔豹《古今注》）、葫（《名医别录》）等，原产中亚，栽培历史悠久。味辛，性温；入脾、胃、肺经；有行滞气、暖脾胃、消癥积、解毒、杀虫之功效。近几年来，随着大蒜的市场需求越来越大，在湖北省当阳、广水等地已经开始大规模种植，并成为当地农业增效、农民增收的支柱产业。但随着种植面积的不断扩大，加上大蒜品种单一，为病害的发生创造了有利条件。2005～2007年在湖北省当阳市大蒜生产基地调查发现，大蒜白斑病发生十分严重，植株发病率在95%以上，均产损失超过2/3，部分田块绝收，严重影响了大蒜的产量与品质。大蒜白斑病主要为害叶片。叶片最初受侵染后，上部出现许多卵圆形或圆形小白斑，部分白斑湿度大时会演变成紫斑，后期叶片变枯黄。2006年4月从湖北省当阳市采集典型大蒜病叶，经分离、鉴定得到大蒜白斑病菌（Stemphylium solani），对其生物学特性进行研究。结果表明，在PSA培养基上，该菌菌丝在5～35℃均可生长，最适生长温度为20～30℃；pH值在4～10均能生长，最适pH值为6～8。在查彼克液体培养基中，病菌能利用多种碳、氮源，其中以淀粉为最佳碳源，谷氨酸为最佳氮源。菌丝的致死温度为55℃，10min。对9种供试杀菌剂采用菌丝生长速率法进行室内药剂筛选，研究表明，40%福星乳油对菌丝生长抑制效果最好，而75%百菌清可湿性粉剂对其抑制效果最差。

虫草属（Cordyceps）属于真菌门（Eumycota）、子囊菌亚门（Ascomycotina）、核菌纲（Pyrenomyceres）、麦角菌目（Clavicipitales）、麦角菌科（Clavicipitaceae）。本属真菌绝大多数能感染昆虫，并从其头部或体表长出子座体而构成虫、菌复合体——虫草。我国是世界上最早将虫生真菌——冬虫夏草进行药用的国家[1～6]，受我国对虫草传统药用的启发，加上微生物制药的诸多优点，近年来世界上许多国家都加强了虫生真菌的研究。初步研究已表明，虫草及相关真菌是最有潜力从中发现新型生物活性化合物或药物先导化合物的真菌类群[5～11]。根据寄生真菌和寄主的不同可以形成各式各样的虫草，虫草属作为药用真菌中的一个大类，目前报道虫草属真菌已达400多种，我国已记载的有90多种[12]。除冬虫夏草外，还有如霍克斯虫草、大团囊虫草、蛹虫草、珊瑚虫草、鳞翅目虫草等，其中冬虫夏草应用历史悠久，研究得最为深入[13]。尽管虫草在世界各地均有分布，但是相对集中地分布于亚欧大陆。研究表明，虫草可产生多种生理活性物质，这些物质分别具有抗菌、抗病毒、杀虫以及免疫调节等功能，它们在医药、农业、食品工业及现代生物技术的应用中皆有十分重要的意义。目前按其用途可将虫草资源分为3类：即药用、食用和害虫微生物防治资源。我国药用常用种有10余种，最多的是冬虫夏草（C.sinensis）群，其他还有蛹虫草（C.militaris）、亚香棒虫草（C.hawkesii）、大团囊虫草（C.ophioglossides）、凉山虫草（C.liangshanensis）、香棒虫草（C.barnesii）、古尼虫草（C.gunnii）、蝉花（C.sobolifera）等。对于虫草的认识，我国可追溯到公元前11世纪西周至秦朝。从出土的文物中就发现有以虫草作图案的玉雕饰品[14]。1578年成书的《本草纲目》中记载有雪蚕，根据其生活史、性味功效、形态、环境及产地判断，应当是冬虫夏草的古名。在1694年清朝汪昂的《本草备要》中也有关于冬虫夏草的论述，该书记载：“冬虫夏草，甘平，保肺益肾，止血化痰，止劳咳。四川嘉定府所产者佳。冬在土中形如老蚕，有毛能动，至夏则毛出土上，连身俱化成草”，这是冬虫夏草的最早文字记载[3]。赵学敏（1765）著的《本草纲目拾遗》把它的药用归之为“能治诸虚百损”[15～16]。在中华医药百味中，虫草正是以“治诸虚百损”、“阴阳平衡”、“保肺益肾、补精益气、专补命门”的神奇功效被认为是一种不可多得的中药之宝而蜚声华夏，饮誉海外，与人参、鹿茸齐名[14]，共称为中国的三大补品。虫草菌无性型种类包括20余属70余种，其中重要的有拟青霉属17种，头孢霉属6种，层梗孢属l1种，被毛孢属21种，葡萄穗霉属1种，小束梗孢属2种，刺束霉属3种，球束孢霉属1种，轮枝孢属3种，侧孢霉属3种及多头霉属的一些种，其中拟青霉、被毛孢霉、头孢霉及轮枝孢霉的许多种已用于害虫生物防治。早在20世纪50年代，前苏联科学家就用棒形虫草（Cordyceps clavulata）的性型蜡蚧被毛孢（Hirsutella lecanicola）人工培养后防治核桃介壳虫，并获得成功。Shimazu（1988）确证的布氏虫草（Cordyceps brongniartii）及其无性型布氏白僵菌（Beauveria brongniartii），是金龟子幼虫一种常见的病原，多年来日本、法国及我国利用该菌防治森林苗圃、牧场及农田的蛴螬均有较好的效果，在有些场合下可较长期地控制虫口。随着化学农药的大量使用对环境生态的严重影响，生物防治日益被人们所重视，利用昆虫病原微生物防治害虫是重要的手段之一。虫生真菌种类多，代谢类型复杂，以其安全有效，显著的流行潜力，容易大量生产等优点，在害虫的生物防治中占有越来越重要的地位。目前生物防治中应用最广的真菌杀虫剂是白僵菌、绿僵菌、汤普森多毛菌、蜡蚧轮枝菌、拟青霉等。据试验，白僵菌用于防治农、林、果、茶类30余种害虫，均取得良好的效果。国外对白僵菌研究较多的国家有前苏联、美国、日本、法国、德国等。前苏联在20世纪70年代批准登记为Boverin微生物杀虫剂，用作大面积防治马铃薯甲虫、苹果食心虫、小麦盾蝽、玉米螟和甜菜象甲等。我国利用该菌防治农林害虫每年达67万hm2 以上。绿僵菌仅次于白僵菌，目前美国、巴西已有绿僵菌商品制剂，主要用于防治沫蝉、蚊子等。国内应用其防治梨虎、天牛、梨心毛虫、菜青虫、蠹虫、蚊子等，其防效达30%～94%。有关资料显示，目前虫生真菌制剂的研究进展依然缓慢。至1996年，国外登记注册的只有27种剂型，40多种不同的虫生真菌制剂，其中主要为球孢白僵菌和金龟绿僵菌，而国内的商业产品均未形成[17]。因此，还有待于国内科研工作者进行广泛深入的研究。我国虫草资源主要用于药用，其次是食用，作为生物杀虫剂尚处在试验研究阶段。近年来由于人工滥采乱挖，以及生态环境的严重破坏，许多虫草菌面临灭绝的危险。研究人员已意识到这一点，从菌种分类、种类分布、生态、寄主、人工驯化与培养、化学成分、药理与临床等方面做了大量的研究，发现人工培养的菌丝体和发酵液，经化学、药理研究证明与天然虫草基本一致[18]，这无疑为虫草的获得开辟了一条新途径。总之，虫草属真菌的研究还有很多地方有待深入。虫草的药用价值和微生物防治还有很大的潜力可挖，只要广大真菌工作者不懈努力，这一古老的药用真菌必将为人类健康做出新的贡献。

马铃薯晚疫病是一种毁灭性病害，从20世纪在欧洲暴发引起大饥荒以来，在全球范围内绝大多数马铃薯栽培地区广泛传播。1996年，据CIP（国际马铃薯中心）估计，全球因晚疫病造成的直接经济损失达到170亿美元，发展中国家的损失53亿美元。晚疫病的危害性、防治难度及对社会的影响早已超过水稻稻瘟病和小麦锈病，被视为国际第一大作物病害。近几十年随着分子生物学技术的发展，各国科学家都对马铃薯晚疫病病菌的分子遗传学进行了深入的研究。本文仅对分子标记技术在晚疫病病菌研究中的应用进行简要的综述。限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，简称RFLP）。RFLP是出现最早，现在依然使用最普遍的DNA标记。RFLP技术的基本原理是：不同材料的DNA用已知的限制性内切酶消化后，产生许多大小不等的DNA片段，电泳分离、Southern印迹转移到硝酸纤维膜上，用放射性标记的探针与膜上变性的酶切DNA进行杂交，放射自显影，即可显示出不同材料的多态性图谱，即显示出所分析的DNA序列间的RFLP。目前，有两种方法可进行DNA的RFLP分析：①如原理中所述，其中用作RFLP的探针可以是特殊基因的DNA克隆、cDNA克隆、随机的基因组DNA克隆和合成的低聚核苷酸克隆。②对那些分子量较小的DNA样本（如线粒体DNA、核糖体DNA等），可在酶切后对其产物直接电泳，将不同大小的限制性酶切DNA片段分离，从而得到该DNA的RFLP图谱。RFLP反映了DNA水平上的差异，而差异往往是由变异造成的，变异分为单碱基突变型和结构重排型两大类。单碱基因突变发生在限制性内切酶的位点上，致使酶切位点增加或丢失而产生多态性，这称为点多态性。结构重排型是指DNA序列内部发生了较大的变化，如插入或缺失，从而使酶切位点间的长度发生改变，造成了片段长度的多态性。这些变异经酶切、分离、杂交、放射自显影就会使RFLP带的特征发生改变，由此对生物的变异进行分析。目前，在晚疫病病菌的研究中，RFLP技术主要用于病菌群体的遗传分化，如：分析一个国家或地区致病疫霉种群的基因结构及变化；有性生殖的发生情况等。1992年Stephen等利用RG57探针分析了墨西哥中北部的晚疫病病菌遗传结构，发现墨西哥中部病菌的遗传多样性非常明显，这也充分说明这个地区由于A2交配型的存在有性重组率高于其他地区[1]；1993年Drenth等将采自荷兰6个地区的153个菌株分为35个RG-57基因型，明确了荷兰不同地区基因型的分布情况[2]；1998年Lionel等利用RG57探针和同工酶基因型研究发现采自番茄和马铃薯上的晚疫病病菌基因型明显不同，说明晚疫病病菌有寄主专化作用[3]。目前利用该标记对来自全世界的成千上万的马铃薯晚疫病病菌建立了指纹图谱数据库。1990年Williams等人首次应用随机引物扩增寻找多态性DNA片段作为分子标记，并将此法命名为随机扩增多态性DNA（Random amplified polymorphism DNA，RAPD）[4]。RAPD技术是建立在PCR技术基础上的，利用随机的短的脱氧核苷酸序列作为PCR引物（通常为十聚体）以基因组DNA为模板进行PCR扩增。通过凝胶电泳分离得到扩增产物DNA片段的多态性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同，但对任一特定的引物，它同基因组DNA序列有特定的结合位点。如果基因组在这些有特定位点的区域发生DNA插入，缺失或碱基突变就可导致这些特定结合位点发生相应的变化。通过对PCR产物的检测可测出基因组DNA在这些区域的多态性。在RAPD分析中可用一系列的引物使检测区域扩大至整个基因组。因此，RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性分析，适于研究生物的遗传多样性及生物的遗传关系，进行遗传作图和基因定位等。在晚疫病病菌的研究中，RAPD技术一般多用于研究种内群体遗传分析。如：Mahuku[5]对1994～1996年采自加拿大的141个菌株进行RAPD分析，将其分为21个组，分析表明97%的变异来自于种群内，3%的变异来源于种群间。2001年朱杰华等利用RAPD方法研究了马铃薯晚疫病病菌DNA多态性与A2交配型的关系[6]。2005年侯淑英等使用178个10bp随机引物对晚疫病病菌的甲霜灵抗性性状进行RAPD分析，得到一个相对稳定的与甲霜灵抗性连锁或相关的标记S500，为晚疫病的有效防治和病原菌的抗药性治理提供了理论依据和实践方法[7]。AFLP是1993年由荷兰keygene公司科学家Zabeau等人发明的一种DNA分子标记技术[8]，该技术的基本原理是：对基因组DNA进行限制性酶切片段的选择性扩增。主要步骤是：将基因组DNA进行限制性酶切后，将特定的接头连接在DNA酶切片段的两端，从而形成一个带接头的特异片段，通过接头序列和PCR引物3'端的识别，进行PCR扩增，最终经过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，通过银染或放射自显影检测。AFLP技术实际上是将RFLP和PCR相结合的一种技术[9～10]。该技术既继承了RFLP的稳定性，又具有PCR反应快速、灵敏的特点，同时克服了RFLP和RAPD的缺点，且扩增的带纹多（50～100条）。AFLP的大多数扩增片段与基因组的单一位置相对应，实验重复性高，该标记为孟德尔式遗传。目前，AFLP 技术主要用于构建晚疫病病菌的基因连锁图谱，此外也被用来检测病菌的基因型。1997年，Van de Lee[11] 等完成了一张比较完整的致病疫霉基因连锁图谱，这张图谱包括183个AFLP标记，7 个RFLP 标记和交配型基因座，包括10个主要的连锁群和7个次要的连锁群，共827cm，并证明主要连锁群中的标记来自于两个亲本，而次要连锁群中的标记来自A1 交配型的亲本或来自A2 交配型的亲本。同时还证明了致病疫霉是同核型的二倍体[12]。Cooke[13]，Flier等[14]以及Knapova等[15]利用AFLP对来自墨西哥和欧洲的病菌研究发现，墨西哥的菌株几乎每个都具有其特异的AFLP基因型，而欧洲的菌株平均每两个就具有一个特异的AFLP基因型。AFLP带型在分裂中能够保持稳定，并遵循孟德尔遗传规律[16]。交配型及其所在的连锁群的其他标记均不遵循孟德尔遗传规律。AFLP技术用于构建基因连锁图谱，使我们可以从基因水平了解晚疫病病菌，为更好地研究晚疫病病菌、防治晚疫病提供理论依据。短序列重复即SSR（Short sequence repeat）、又称微卫星DNA或短串联重复（Short tandem repeat，STR），这是一类由1～5个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列[17]。同一类的微卫星DNA可分布于整个基因组的不同位置上，由于基本单元重复次数的不同以及重复程度的不完全而造成了SSR位点的多态性，这种多态性有比较丰富的信息量。由于在每个微卫星DNA两端的序列是相对保守的单拷贝序列，因而可根据两端的序列设计一对特定的引物，扩增每一位点的微卫星序列，再经凝胶电泳比较扩增产物的长度变化，即可显示不同基因型个体在微卫星DNA位点上的多态性[18～19]。SSR技术的特点是：呈共显性遗传；在数量方面没有生物学上的限制；其标记带型简单，记录的条带一致、客观、明确；采用PCR技术进行检测只需少量DNA样品，且质量要求不高，即使是部分降解的样品也可进行分析；每个位点均有许多等位形式；另外，它还具有多态性高、实验程序简单等优点[19～20]，所以自1989年SSR技术产生以来，被广泛应用于基因定位和QTLs分析、DNA指纹和品种鉴定、种质资源保存和利用、系谱分析和标记辅助育种[18]。2001年Knapova [21]等首次利用SSR技术研究了瑞士和法国的马铃薯和番茄的晚疫病病菌群体的遗传多样性，同时分析了致病疫霉有性杂交F1代的分离情况，结果发现被测菌株群体具有丰富的遗传多样性。试验中6个SSR位点被鉴定出来，其中的3个SSR位点具有多样性，他们又从3个SSR位点中选择了2个SSR位点的引物（Pi4G和Pi4B）对来源于瑞士和法国的176个菌株进行了鉴定，分别得到4种和6种不同长度的等位基因片段（共21个组合）。2002年G.Knappva [22]等再次报道了法国和瑞士的晚疫病病菌的表型和基因型结构，他们研究的马铃薯晚疫病病菌株中存在11个SSR基因型，其中以A-03和A-06为主，另有1/9的菌株是其他SSR基因型；但尚未发现SSR基因型与菌株的交配型、对甲霜灵的敏感性和菌株来源的地域性有相关关系。Knappva[21～22]等的研究揭示了SSR分子标记适用于分析晚疫病病菌的群体结构，同时也指出了SSR标记技术在病菌应用的潜力和存在的问题，如stutter bands、非特异扩增等。但同其他分子标记相比，SSR技术具有位点特异的优点，有利于分析全球马铃薯晚疫病病菌的种群结构。若能对SSR标记技术进行大量人力、物力的投入，获得更多理想的SSR标记，这种技术将具有巨大的应用潜力。2004年朱杰华用AFLP分子标记研究了河北、云南、四川及黑龙江省的50个晚疫病病菌株的DNA指纹，当欧式距离为10时，50个菌株被聚类为4组，分组情况与菌株来源的地理位置相关，表明马铃薯晚疫病病菌的DNA的AFLP分子标记多样性与病菌的地理来源及病菌对甲霜灵的抗性有一定相关性，但未发现和生理小种及交配型有相关性[23]。2004年魏长拴用RAPD分子标记分析了我国马铃薯主产区的晚疫病病菌的亲缘关系和遗传相关性[24]。2005年郭军等利用SSR、AFLP和线粒体DNA单倍型技术分析了内蒙古地区马铃薯晚疫病病菌的遗传多样性。2006年姚国胜等利用SSR技术测定出中国菌株中存在7种SSR基因型[25]。总的来说，分子标记技术在我国马铃薯晚疫病病菌的研究中应用还很少，今后应进一步将各种分子标记技术应用到马铃薯晚疫病病菌的研究中。综上所述，DNA分子标记技术在马铃薯晚疫病病菌遗传研究上具有重要应用价值，并已取得了可喜的进展，展现了广阔的应用前景。现已研究了晚疫病病菌发源和墨西哥以外地区A2交配型的来源，为晚疫病的防治提供理论基础；明确了一个地区不同菌株之间的基因结构变化，遗传结构差异。利用DNA分子标记技术绘制晚疫病病菌的连锁图谱，使两个标记间距离足够小；借助高密度标记对一些性状基因进行准确定位，从而为抗病育种研究提供科学依据；并运用分子标记找到与目的基因紧密连锁的标记，如在致病疫霉中找到与抗瑞毒霉基因连锁的标记，与毒力基因连锁的标记，从而指导晚疫病的防治。由于上述几种分子标记都各有优缺点，任何一种均不能满足晚疫病病菌遗传研究的所有要求。所以如何更好地利用各种分子标记研究马铃薯晚疫病病菌，预防和控制马铃薯晚疫病，仍需不断研究。

SNP （单核苷酸多态性） 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的 DNA 序列多态性，包含单个碱基的转换、颠换等。InDel是指插入/缺失 （Insertion/Deletion） 基因组中小片段的插入和缺失序列，个体重测序中特指1～50 bp 的小片段插入和缺失。在生物的进化进程中，生物全基因组水平上积累了大量的微小变异，主要包括SNP 和InDel。这些微小变异的变异程度决定了物种之间在表型和生理结构等方面的差异，为新物种的形成提供了最原始的动力，是物种多样性的本质体现。SNP 标记是基因组DNA序列中分布最广泛的一类标记，植物基因组中平均每数百bp就存在着一个SNP （Huang et al.，2010；Qi et al.，2013）。InDel标记也是一种重要的遗传标记，已被广泛应用于图位克隆、基因定位、动植物遗传多样性的鉴定、分子标记辅助育种等领域（Jander et al.，2002；Schnabel et al.，2005；王岩等，2009；王明军等，2010）。随着高通量测序技术的快速发展，利用全基因组重测序（whole genome re-sequencing，WGR） 技术结合混合分组分析法（bulked segregate analysis，BSA） 可高效检测出通过双亲杂交建立的后代群体中导致表型变异的 QTL和突变位点 （Abe et al.，2012；Takagi et al.，2013），并且可以识别大量的 SNP 和 InDel 位点，从而进行SNP 及InDel标记的开发，获得基因区间的SNP 及InDel标记。本研究利用WGR技术及 BSA法相结合，获取与抗炭疽菌叶枯病基因相关的SNP 和InDel位点，并通过对△ （SNP-index） 图谱分析，快速锁定抗病区域，再通过ANNOVAR软件分析，提取注释信息，筛选出候选的抗病基因。并利用实时荧光定量 PCR （qRT-PCR） 技术对候选基因经过炭疽叶枯病病原菌侵染后的不同时间段基因表达量的变化进行分析，寻找响应炭疽叶枯病病原菌侵染的抗病相关基因并对其进行详细的功能分析，以期揭示苹果抗炭疽菌叶枯病的分子机制。用于全基因组重测序的材料为 ‘金冠’ ‘富士’ 及第三章中经过抗病鉴定的 ‘金冠’ב富士’ 的 F1 代群体中极端抗炭疽菌叶枯病的20个单株和极端感炭疽菌叶枯病的20 个单株。取其嫩叶3～5 片，液氮速冻，置于-70℃冰箱保存，用于提取DNA。用于qRT-PCR 分析的材料为 ‘富士’ 和 ‘金冠’ 带嫩叶的一年生健壮新梢各30 枝，用于室内人工离体接种。接种方法同第二章，分别于接种后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h七个时间点采集叶片，液氮速冻后，用于提取RNA，检测基因表达。参考Doyle和Doyle （1987） 及 Cullings （1992） 提取基因组DNA的CTAB法，并加以改进，详见第三章。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的纯度和完整性。条带单一、清晰明亮、无降解、无污染的DNA样品作为合格样品用于后续研究。运用NanoPhotometer ? 分光光度计 （IMPLEN，CA，USA） 对DNA的纯度进行检测。DNA经过 Qubit ? DNA Assay Kit in Qubit ? 2.0 Flu-rometer （Life Technologies，CA，USA） 进行浓度的精确定量。将DNA浓度调整为100 ng/μl。苹果嫩叶总RNA的提取方法如下。（1） 将500 μl裂解液RLT Buffer、50 μl PLANTaid、5 μl β-巯基乙醇，依次加入灭菌的1.5 ml离心管中，混匀，待用。（2） 将冻存于-70℃下的苹果嫩叶0.2 g置于预冷的研钵中，加少量液氮快速研磨成细粉状后转入上述待用的的离心管内 （样品容易褐化，动作要迅速，并保证液氮挥发完全）。（3） 56℃温育5～10 min，期间不断剧烈震荡混匀，以保证充分裂解。（4） 12000 r/min 离心10 min，将离心管缓慢从离心机中取出，将上清液转到新离心管中 （吸取上清液时一定要缓慢，尽量不要吸到底部沉淀）。（5） 较精确估计上清液体积，加入 0.5 倍体积的无水乙醇，盖盖，上下颠倒混匀，此时可能会出现沉淀，但是不影响提取的过程。（6） 将混合物 （每次上样应小于800 μl，可分两次加入） 加入吸附柱中，12000 r/min离心60 s，弃废液。（7） 在吸附柱中加700 μl去蛋白液 RW1，室温下放置5 min （可稍延长时间，去除吸附柱上的蛋白污染），12000 r/min 离心30 s，弃废液。（8） 在吸附柱中加入 500 μl 漂洗液 RW （加过无水乙醇），12000 r/min离心 30 s，弃废液。再加入 500 μl 漂洗液 RW，重复1遍。（9） 将吸附柱放回空收集管中，12000 r/min空离心2 min，尽量除去吸附柱中残留的漂洗液。（10） 将吸附柱放入一个 RNase free 离心管中，在吸附膜上加40 μl RNase-free water （最好事先在 70～90℃中水浴加热），室温放置2 min，12000 r/min 离心1 min，如需RNA浓度较高，可重复离心1次。（11） 取4 μl RNA加入6×RNA Loading Buffer，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取的质量与纯度，并估测提取浓度。（12） 将检测质量好的RNA放入-70℃下保存备用。参照 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time） 试剂盒 （TaKaRa）。具体操作步骤如下 （全程冰上操作）。（1） 基因组 DNA 的去除。在 0.2 ml 灭菌的离心管中依次加入1 μg 总 RNA，2 μl 5×gDNA Eraser Buffer，1 μl gDNA Eraser，用RNase-Free水补足10 μl，42℃，2 min （或者室温5 min）；4℃。（2） 反转录反应。在0.2 ml灭菌的离心管中依次加入10 μl步骤1的反应液，1 μl PrimerScript RT Enzyme Mix I，1 μl RT Primer Mix，4 μl 5×PrimerScript Buffer 2 （for Real Time），用 RNase Free 水补足20 μl。37℃，15 min；85℃，5 s；4℃。（3） 质量检测。用 β-actin 基因的引物对反转录的 cDNA 进行PCR扩增，并用1%的琼脂糖电泳检测，选取质量好的样品在-20℃下保存备用。将 ‘金冠’ב富士’ 的F1 代群体中选取出的 20 个极端抗病的单株和20个极端感病的单株DNA等量混合构建成两个表型池。检验合格的4 份 DNA 样品每份取1.5 μg进行基因文库的构建。通过Covaris破碎机将DNA样品随机打断成长度为350 bp的片段。采用TruSeq Library Construction Kit 进行建库，严格使用说明书推荐的试剂和耗材。DNA 片段经末端修复、加 ployA 尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。构建好的文库通过 illumina HiSeqTM PE150进行测序 （附图4-1）。文库构建完成后，先使用 Qubit 2.0 进行初步定量，稀释文库至1 ng/μl，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段 （insert size） 进行检测，符合预期后，使用Q-PCR 方法对文库的有效浓度进行准确定量 （文库有效浓度＞2 nM），以保证文库质量。4个文库检验合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行 Illumina HiSeq TM PE 150 测序。围绕350 bp的片段进行双末端 125 bp 测序。表型差异的两个亲本测序深度为10 X，抗感池测序深度为20 X。信息分析的主要步骤如下 （附图4-2）。步骤一：对下机得到的原始测序数据 （Raw data） 进行质控得到有效测序数据 （Clean data）。步骤二：将Clean data比对到参考基因组上。步骤三：根据比对结果，进行 SNP、InDel 的检测，分析 SNP、InDel的分布情况并进行注释。步骤四：对子代SNP 频率差异进行分析。步骤五：根据分析结果对目标性状区域进行定位。步骤六：确定候选基因。测序得到的原始测序序列 （Sequenced Reads或者 raw reads），里面含有带接头的、低质量的 reads。为了保证信息分析质量，必须对raw reads过滤，得到有效测序序列 （clean reads），后续分析都基于clean reads。数据处理的步骤如下。一是去除带接头 （adapter） 的reads pair。二是当单端测序read中含有的N的含量超过该条read长度比例的10%时，需要去除此对paired reads。三是当单端测序read中含有的低质量 （Q≤5） 碱基数超过该条read长度比例的 50%时，需要去除此对paired reads。有效测序数据通过 BWA （http：//bio-bwa.sourceforge.net/） 软件 （Li and Durbin，2009） 与 ‘金冠’ 苹果的基因组 （ https：//www.rosaceae.org/data/download） 进行比对，确定reads在基因组上的位置。比对结果使用 SAMTOOLS （ http：//samtools.sourceforge.net/）软件进行SNP-calling （Li and Durbin，2009），发掘 reads 与参考序列以及 reads 之间的 SNP 位点，利用 SAMtools 软件中的 “rmdup” 指令去除序列文件中的重复。人们采用GATK3.3软件 （McKenna et al.，2010） 的UnifiedGeno-typer模块进行多个样本 SNP 和 InDel的检测，使用 VariantFiltration进行过滤，SNP 的过滤参数为：cluster Window Size 4，filter Expression“QD＜4.0 ‖ FS＞60.0 ‖ MQ＜40.0”，G filter “GQ＜20”。InDel的过滤参数为：cluster Window Size 4，filter Expression “QD＜4.0 ‖ FS＞200.0 ‖ ReadPosRankSum＜-20.0 ‖ InbreedingCoeff＜-0.8”。利用ANNOVAR软件 （Wang et al.，2010） 对 SNP 和 InDel 检测结果进行注释。SNP 频率的统计：SNP 频率是指所检测到的总的SNP 数与参考基因组序列的总长度的比值，是衡量一个物种变异程度和多态性的指标。转换颠换率的统计：分别统计发生转换和颠换的SNP 数目。子代 SNP 的频率 （Takagi et al.，2013），即 SNP-index，是与SNP 位点的测序深度相关的参数，是指某个位点含有 SNP 的 reads数与测到该位点的总 reads数的比值。以参考基因组作为参照，分析计算两个子代在每个 SNP 位点的 SNP-index。SNP-index计算方法如附图4-3所示。若该参数为0，则代表所有测到的reads都来自作为参考基因组的亲本，即 ‘金冠’。参数为1则代表所有的reads都来自另一个亲本，即 ‘富士’。参数为0.5，代表此混池中的 SNP 来自两个亲本的频率一致。为减少测序错误和比对错误造成的影响，对计算出 SNP-index后的亲本多态性位点进行过滤，过滤标准如下。（1） 两个子代中 SNP-index 都小于0.3，并且 SNP 深度都小于7的位点，过滤掉。（2） 一个子代SNP-index缺失的位点，过滤掉。计算△ （SNP-index），即两个子代 SNP-index 作差：△ （SNP-index）=SNP-index2 （极端抗病性状）-SNP-index1 （极端感病性状）。为直观反映△ （SNP-index） 在染色体上的分布情况，对其在染色体上的分布进行作图。默认选择1 Mb 为窗口，1 kb 为步长。进行1000次置换检验，选取95%置信水平作为筛选的阈值。为了不忽略掉微效QTL的影响，在全基因组范围内挑选两个子代在SNP-index差异显著的SNP 位点，即挑选子代2 （极端抗病性状） SNP-index大于0.7，且子代1 （极端感病性状） SNP-index小于0.3的位点，并与亲本 ‘富士’ 为纯合及亲本 ‘金冠’ 为杂合的位点取交集，做为候选的基因位点。提取ANNOVAR的注释结果，优先挑选使基因获得终止密码子的变异 （stop loss） 或者使基因失去终止密码子的变异 （stop gain） 或者非同义突变 （missense） 或可变剪接的位点（Splicing） 所在的基因作为候选基因。从网站 https：//www.rosaceae.org/gb/gbrowse/malus_x_domestica/下载候选基因的 mRNA，从基因编码区核苷酸序列的近3’端位置设计引物，PCR产物长度在150～250 bp，引物序列见表4-1，内参基因为β-actin基因。荧光定量 PCR 在罗氏 LightCycler 480 系统上进行，反应体系配制按 SYBR Green PCR Master Mix 说明书进行操作，具体如下：10.0 μl SYBR Premix Ex Taq Ⅱ （2×），0.8 μl正反向引物，2.0 μl cDNA，去离子水补足20 μl。反应程序为95℃ 预变性5 min，95℃ 10 s变性，55℃ 10 s退火，72℃ 10 s延伸，扩增45 个循环。循环结束后进行熔解曲线分析：95℃ 15 s，60℃ 20 s，然后缓慢升温至95℃。基因的相对表达量用公式：F=2-ΔΔCt，ΔΔCt=（待测组目的基因 Ct值-待测组内参基因 Ct值）-（对照组目的基因 Ct值-对照组内参基因Ct值）。Illumina HiSeqTM PE150 测序平台，四个样本共产生 47.115 G的测序原始数据 （Raw data），通过对原始数据中的接头序列，低质量碱基以及未测出的碱基 （用 N 表示） 进行过滤后，得到有效数据 （Clean data） 46.974 G，各样本的 Raw data 在 7774.247～17017.174 Mb，Clean date 在7751.990～16969.215 Mb，过滤后获得的有效数据比率在99.64%～99.72%，碱基错配率低于0.05%。测序质量 Q20 ≥ 95.08%、Q30 ≥ 88.97%，GC 含量在 39.04%～39.16%。这表明所有样本的数据量充足，测序质量很高，GC 分布正常，建库测序成功，保证了后续数据分析的准确性 （表4-1）。样本原始数据/bp有效数据/bp有效率/%错误率/%Q20/%Q30/%GC含量/%富士7774246500775199010099.710.0395.4389.6339.16金冠7900566600787192650099.640.0395.5589.8839.05BR（基因抗池）170171739001696921590099.720.0395.4489.6239.04BS（基因感池）144234894001438116750099.710.0495.0888.9739.15表4-1 测序数据质量概况将四个样品的有效数据与已经发布的金冠苹果参考基因组序列（https：//www.rosaceae.org/data） 进行比对，计算出比对到参考基因组 （参考基因组大小为609314018 bp） 上的 reads条数、测序深度及碱基覆盖率。结果表明，四个样品的比对率均在87%以上，两个亲本的测序深度达到15×以上，抗感池样品的测序深度达到 30×以上。在参考基因组中至少有1个碱基覆盖的位点占基因组的比例达到95%以上，至少有 4 个碱基覆盖的位点占基因组的比例 “富士” 为88.3%，“金冠” 为91.26%，其他两样品达到96%以上。这进一步的说明，本试验测序的数据质量很高，可用于后续的变异检测及相关分析 （表4-2）。样本比对到reference上的reads条数①有效测序数据的reads总条数比对率/%②平均测序深度/x③参考基因组中至少有1个碱基覆盖的位点占基因组的百分比/%参考基因组至少有4个碱基覆盖的位点占基因组的百分比/%富士455966535167993488.2315.9595.9588.3金冠459536665247951087.5615.6798.0991.26BR（基因抗池）10045340711312810688.834.4298.896.67BS（基因感池）8962925610163794888.1830.8898.7896.44表4-2 测序深度及覆盖度统计通过全基因组重测序技术共获得3399950个 SNP 位点，苹果参考基因组总长度为 609314018 bp，据此计算出 SNP 出现的频率为3399950/609314018=0.56%。转换 （T/C、C/T） 和颠换 （T/G、T/A、C/A、C/G） 发生频率 （附图 4-4） 的统计结果显示，T/C 和C/T转换发生的频率分别为 32.5%和 34.1%，T/G、T/A、C/A和C/G颠换发生的频率分别为 9.2%、9.4%、9.4%、5.4%。转换/颠换率为2.0。利用测序获得的有效数据，比对苹果参考基因组序列，经 ANN-OVAR软件分析共得到 SNP 位点 3399950个，InDel 位点 573040个，SNP 位点位于内含子上的465317个，位于外显子上的436309个，其中同义变异 210404个，非同义变异 220539个，InDel 位点位于内含子上的 108996个，位于外显子上的 19957个，其中插入或缺失3 或 3 的整数倍的碱基，不改变蛋白质的编码框的有 6928个。这表明绝大部分变异位于非编码区，或不会导致基因编码的改变，这有利于维持植物体正常的生长发育，保证品种特性的稳定遗传 （表4-3）。类别SNP数量基因上游184156获得终止密码子4837失去终止密码子529外显子同义变异210404非同义变220539内含子465317剪接位点2196基因下游177312基因上游/基因下游12750基因间区2105122转换2265734颠换1134216转换/颠换/%1.997合计3399950表4-3 SNP及InDel检测及注释类别InDel数量基因上游51816获得终止密码子376失去终止密码子68Frameshiftdeletion①7330外显子Frameshiftinsertion5255Non-frameshiftdeletion②3843Non-frameshiftinsertion3085内含子108996剪接位点598基因下游44305基因上游/基因下游3896基因间区342800插入262868缺失310172合计573040表4-3 SNP及InDel检测及注释（续）-1△ （SNP-index）=SNP-index B （极端抗病性状）-SNP-index A （极端感病性状）。进行1000次置换检验，选取95%置信水平作为筛选的阈值。一般情况下，在苹果 F1 群体中，由于每个位点的碱基均来源于双亲中的一个，所以在基因组中大部分区域的 SNP-index都在0.5附近。如果某个SNP 位点与抗性相关，那么在该处的 SNP-index就会显著偏离0.5，△ （SNP-index） 就会显著大于此处的阈值。从抗感池中△SNP-index值在染色体上的分布可以看出，在第15 条染色体2～5 Mb区间内△SNP-index值显著的大于阈值，预示着该区域内可能存在着与抗炭疽菌叶枯病基因相关的位点 （附图4-5）。这与第三章SSR标记所确定的抗性基因所在的区域吻合。在全基因组范围内挑选在两个子代池中 SNP-index 差异显著的SNP 位点，即挑选在抗池中 SNP-index 大于 0.7，在感池中 SNP-index小于0.3，△ （SNP-index） 大于 0.5 的 SNP 位点，并与亲本‘富士’ 为纯合，亲本 ‘金冠’ 为杂合的位点取交集，共得到258 个候选的多态性标记位点 （表4-4）。这258 个 SNP 位点中位于基因上游1 kb的19个，基因下游1 kb 的12 个，位于基因上游1 kb 区域，同时也在另一基因的下游1 kb区域的2 个，位于基因间区的173 个。位于外显子上非同义变异的13 个，同义变异7 个，位于内含子上的31个。其中位于第15条染色体上的有123 个，占整个候选 SNP 位点的47.7%。类别SNP数量基因上游19获得终止密码子0失去终止密码子0外显子同义变异7非同义变13内含子31剪接位点1基因下游12基因上游/基因下游2基因间区173转换161颠换97转换/颠换/%1.659合计258表4-4 候选多态性标记位点的注释提取ANNOVAR的注释结果，优先挑选能引起基因获得终止密码子、失去终止密码子的变异，或者非同义突变，或者可变剪接的位点所在的基因作为候选基因。经筛选后得到33 个 SNP 位点及所对应的29个候选基因 （表4-5）。这些SNP 位点中发生转换的 （G/A、C/T、T/C、A/G） 共 16 个，占 48.5%，发生颠换的 （G/C、C/G、G/T、A/C、A/T、T/G、T/A、C/A） 共17 个占51.5%，其中有21 个位于第15条染色体上。基因ID类型染色体SNP位点参考基因组碱基型Ref突变碱基型AltMDP0000294705nonsynonymous24029182TCMDP0000311597upstream26560007TCMDP0000335197upstream238255166CTMDP0000481284nonsynonymous511687941TCMDP0000266783nonsynonymous516570950ACMDP0000223383upstream814935907CTMDP0000203531upstream918259400TGMDP0000265695upstream919790733GAMDP0000224187nonsynonymous1034991229ATMDP0000226279upstream1123158805AGMDP0000480608upstream123704417TGMDP0000504610upstream1229472316TCMDP0000292279upstream151396770CTMDP0000686092nonsynonymous153955717AGMDP0000686092nonsynonymous153955724AGMDP0000686092nonsynonymous153955738TAMDP0000205432nonsynonymous154094431TAMDP0000120033upstream154236293AGMDP0000864010nonsynonymous154257246GAMDP0000945764nonsynonymous154336468CAMDP0000149107splicing154970310CTMDP0000609131upstream156771435CAMDP0000169753upstream157074724ACMDP0000296372upstream157704309CT表4-5 候选基因ID基因ID类型染色体SNP位点参考基因组碱基型Ref突变碱基型AltMDP0000199827upstream157710714TAMDP0000194508nonsynonymous157757532GAMDP0000320004upstream158084422ATMDP0000320004upstream158084636TCMDP0000320004upstream158084637ACMDP0000148808upstream158365795GTMDP0000133266upstream1533862275AGMDP0000157213nonsynonymous1549031042CGMDP0000169687nonsynonymous1552444208TC表4-5 候选基因ID（续）-1结合 SSR标记定位及全基因组重测序中对△ （SNP-index） 值分析的结果，从这29 个候选基因中筛选出位于第15 条染色体3.9～4.9 Mb距离内的5个基因 MDP0000686092、 MDP0000205432、MDP0000120033、 MDP0000864010、 MDP0000945764 做为抗炭疽菌叶枯病的最终候选基因。通过对5个候选基因进行 GO 功能富集分析发现，5 个候选基因中有3个功能未知。基因 MDP0000120033 具有核酸绑定功能，锌离子结合分子功能，参与 RNA 剪切生物过程，调节基因产物的表达。蛋白结构上具有CCHC型结构域的锌指结构，是丝氨酸精氨酸富集剪接因子。进一步同源比对该基因为 SR基因家族 RSZ亚家族基因，与拟南芥AtRSZ21蛋白的序列一致性达到60%，与花生AdRSZ21蛋白的序列一致性达到79%。基因 MDP0000864010 具有辅酶绑定功能，蛋白结构上具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 （磷酸盐） NAD （P） 绑定区域，属于NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族，进一步的同源性比对，该蛋白与鼠李糖生物合成酶 1 （rhamnose biosynthetic enzyme 1，RHM1） 有较高同源性 （表 4-6）。候选基因编码的氨基酸序列见附录五。基因ID基因功能注释MDP0000686092功能未知蛋白MDP0000205432功能未知蛋白质。MDP0000120033核酸绑定功能，锌离子结合分子功能，参与RNA剪切生物过程，调节基因产物的表达。具有锌指结构，CCHC型结构域，丝氨酸精氨酸富集剪接因子。MDP0000864010辅酶绑定功能，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸盐）NAD（P）绑定区域，NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族，可能与鼠李糖生物合成酶1有关。MDP0000945764功能未知蛋白表4-6 抗炭疽菌叶枯病候选基因的功能注释利用TMHMM2.0软件对候选基因进行跨膜结构分析，基因MDP0000686092和MDP0000120033具有跨膜结构。基因MDP0000686092具有1个跨膜区，基因MDP0000120033具有3个跨膜区，位置分别在153～172、187～209、214～236的区域内（附图4-6）。引物名称引物序列MDP0000686092基因荧光定量PCR引物P1-FP1-RF：5′-CAGGCTGGAGCGAAGTTTA-3′R：5′-CCTTTCTGTGATGGCATTGTT-3′MDP0000205432基因荧光定量PCR引物P2-FP2-RF：5′-GAAAAGCCAGCACCAGAAAC-3′R：5′-CGTATTCGTGGGGTTATAGAGC-3′MDP0000120033基因荧光定量PCR引物P3-FP3-RF：5′-TCTGGGAATGCTGCTAAAACTC-3′R：5′-GCAGGGCAGTAGTGAAGCAC-3′MDP0000864010基因荧光定量PCR引物P4-FP4-RF：5′-CGTGACCAATCGCCTAATA-3′R：5′-GGACGTGAGTGCCGTAGAC-3表4-7 荧光定量PCR引物引物名称引物序列MDP0000945764基因荧光定量PCR引物P5-FP5-RF：5′-TTTGCCAGCCTGTCAGAAGT-3′R：5′-AGTTGTAGAGGGAGGAGGAAGA-3′β-actin基因荧光定量PCR引物P6-FP6-RF：5′-CACTGCTTCTATGACTGGTTTTGA-3′R：5′-CTGGCATATACTCTGGAGGCTT-3′表4-7 荧光定量PCR引物（续）-1对接种炭疽菌叶枯病病菌后 0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h的 ‘富士’ 和 ‘金冠’ 枝条进行采样，提取 RNA，反转录成cDNA后，对5个候选基因的表达进行实时荧光定量分析。结果显示，5个基因均不同程度响应病原菌侵染 （附图4-7、 表4-7）。除了基因MDP0000864010在 ‘富士’ 叶片中的表达量表现为下调外，其余 4个基因均为上调表达。在 ‘富士’ 叶片中，基因 MDP0000205432、MDP0000120033和MDP0000945764 的表达量在接种后 24 h 均达到最高值，48 h降到最低值，然后又缓慢提高。在 ‘金冠’ 叶片中的表现不同于 ‘富士’，三个基因表达量的最高值出现在36 h，但最低值同样出现在48 h，这说明在这3个基因在抗病植株中对病原菌的应答要早于感病植株。尽管基因 MDP0000686092 和 MDP0000945764 在‘富士’ 和 ‘金冠’ 叶片中也均表现为上调表达，但是在 ‘金冠’ 叶片中的表达变化更为显著，基因 MDP0000945764 在 ‘金冠’ 叶片中的表达量达到最高值时为接种前的60 倍，而在 ‘富士’ 中的提高量为接种前的10倍。以上结果说明，5个候选基因均受炭疽菌叶枯病病菌的诱导，是苹果炭疽菌叶枯病抗病相关基因。SNP 标记的开发主要依赖于含有大量测序序列的数据库。通过全基因组测序，不仅可以获得大量的 SNP 标记，还可以了解到 SNP 标记在整个基因组中的分布情况，有利于我们进一步了解不同物种的生物学特性，以及利用标记进行不同需求的生物学研究。在葡萄的基因组测序中发现，SNP 位点的密度高达7%（Jaillon et al.，2007）；2010发表的金冠苹果全基因组序列中，SNP 标记的频率约为 4.4 kD/SM，即227 bp/SNP （Velasco et al.，2010）；梨的全基因组序列中共检测到3402159个 SNP 位点，约占基因组序列的 1.02%（Wu et al.，2013）；柑橘中得到的 SNP 位点数量为106 万个 （Xu et al.，2013）。对于有参基因组，通过全基因组重测序手段进行大量 SNP 标记开发，也是研究不同品种间差异的有效途径之一。通过对6 个玉米自交系的进行全基因组重测序，在非重复序列区域内共获得了 1272134个SNP 标记 （Lai et al.，2010）；对葡萄的230个基因片段重测序，数据统计结果显示，每64 个碱基中就存在着一个 SNP 位点 （Lijavetzky et al.，2007）；在水稻中，水稻籼稻恢复系 7302R 通过全基因组重测序，检测到307627个SNP 位点，其中有30239个位于mRNA序列中（Li et al.，2012b）；通过对苹果品种 ‘金冠’ 和 ‘红玉’ 进行全基因组重测序，在 ‘金冠’ 中得到了 2222816个 SNP 位点，在 ‘红玉’中得到了 4950346 个 SNP 位点，密度分别为 293 bp/SNP 和210 bp/SNP （孙瑞，2015）。SNP 变异从理论上来看主要包括转换、缺失、颠换和插入四种形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2∶1。并且SNP 在CG序列上出现的最为频繁，而且多是 C 转换为 T，主要原因为CG中的胞嘧啶常被甲基化，而后自发脱氨基形成胸腺嘧啶 T （Johnson and Told，2000；Mullikin et al.，2000）。从本实验中对 SNP转换/颠换频率统计结果来看，转换/颠换比为2.0，发生转换的频率为66.6%，发生颠换的频率为 33.4%，C/T 转换发生的频率最高为34.1%。这与前人研究的结论相符。通过重测序技术可以获得海量SNP 标记，利用这些标记构建高密度遗传连锁图谱为不同群体的进化分析，不同性状基因的遗传定位，分子标记辅助育种等提供有效信息。‘M.27’בM.116’ 的高密度遗传图谱是由306个SSR标记和2272个 SNP 标记组成，图谱密度达到了每 0.5 cM 一个标记 （Antanaviciute et al.，2012）。Khan 等（2012） 利用2875个分子标记构建了苹果的整合遗传图谱，其中包含了2033个 SNP 标记和 843 个 SSR 标记，总长为 1991.38 cM。Clark等 （2014） 利用3个不同的F1 杂交群体和SNP 芯片分型技术构建了包含1091个 SNP 标记的苹果品种 ‘Honeycrisp’ 的整合遗传图谱，标记间的平均距离为1.36 cM。基于高通量基因组重测序技术能够更加准确、全面的对测序物种进行全基因组水平上的位点进行评估，可以精确的完成单核苷酸多态性位点的检测，分子标记的开发，遗传图谱的构建，不同群体间的进化分析，与表型变异相关基因的挖掘以及快速定位等等。本研究通过运用全基因组重测序的方法对有着明显抗感性状分离的 ‘金冠’ 和 ‘富士’ 及其由 F1 代极端表型个体组成的抗感池进行全基因组范围内的遗传变异检测，共筛选得到 SNP位点3399950个，InDel位点573040个。通过对△SNP-index图谱的分析发现，在第15条染色体的2～5 Mb的区间内，△SNP-index显著的大于阈值，存在着明显的连锁不平衡，意味着该区域可能存在着抗炭疽菌叶枯病基因位点。这一结果与SSR标记所定位的抗炭疽菌叶枯病基因位点位置相吻合。SNP 广泛分布于基因组DNA中，且数量巨大。因为任何碱基均有可能发生变异，因此SNP 既有可能出现在基因的编码区，也有可能在基因的非编码区，或者两个基因之间的序列上。总的来说，位于基因内编码区的SNP 比较少，且该部分的 SNP 有可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此位于编码区 SNP 的研究更受关注。本试验对可能引起基因获得终止密码子、失去终止密码子、非同义突变、可变剪接的变异位点进行重点筛选，将其所在的基因作为候选基因。通过筛选共得到33个候选SNP 位点和29个候选基因。结合第三章SSR标记对炭疽叶枯病抗性基因的定位，最终锁定了 5 个候选基因： MDP0000686092、 MDP0000205432、 MDP0000120033、 MDP0000864010、MDP0000945764。锌指结构是一类在很多蛋白中存在的具有指状结构的模体，是具有识别特定碱基序列的一种转录因子结构。锌指的典型功能是作为互作的组件与核酸、蛋白质和小分子等多种物质相结合，参与多种细胞过程，如DNA的复制与修复、RNA 转录与翻译、物质代谢与信号转导、细胞的增殖与凋亡等 （Krishna et al，2003）。可变剪切 （Alternative splicing，AS） 是重要的转录后调控机制，在动物中对其在不同的生理以及病程条件下的可变剪切的调控作用研究的较多 （Garcia-Blanco et al.，2004；Nilsen and Graveley，2010）。据报道在拟南芥中超过 42%的外显子基因存在可变剪切现象（Filichkin et al.，2010）。在植物可变剪切数据库中有很大比例的 AS参与逆境响应基因的表达，这进一步强调了可变剪切在逆境响应中的重要作用 （Wang and Brendel，2006；Duque，2011）。在生物胁迫中，有许多试验证明AS参与植物的抵抗和防御机制。例如，在一些 R 基因中如番茄的N 基因，拟南芥的SNC1、 RPS4基因，发现可变剪切的存在 （Dinesh-Kumar and Baker，2000；Zhang and Gassmann，2003）。SR蛋白，丝氨酸/精氨酸富集剪切蛋白 （serine/arginine-rich proteins，SR protein） 是RNA绑定蛋白家族中功能和结构高度保守的一类因子，参与可变剪切过程。例如， AtSR30在高盐碱以及过氧逆境中被上调表达 （Tanabe et al.，2007）。SR在不同的环境条件下的表达量的差异说明了SR蛋白在逆境响应中的调控作用。基因MDP0000120033具有核酸绑定，锌离子结合分子功能，参与 RNA 剪切生物过程，调节基因产物的表达。具有CCHC型锌指结构和丝氨酸/精氨酸富集剪接因子，属于SR 基因家族 RSZ 亚家族基因。丝裂原活化蛋白激酶 MPK6 和MPK3在植物的防御反应中起着重要作用，而拟南芥基因 AtRSZ21 在体外试验中被发现能够被MPK6/MPK3磷酸化 （Feilner et al.，2005），这就意味着 AtRSZ21 也可能参与了植物的防御应答。Kumar 和 Kirti （2012） 报道了花生的一个属于 SR 亚家族基因 RSZ 蛋白基因AdRSZ21，在植物的超敏反应和抗逆反应中起着重要的作用。NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族是真菌病原体镰刀菌致病机制中的一个关键酶 （Srivastava et al.，2014）。细胞壁是植物细胞进行正常的生命活动不可缺少的重要组成部分。其不但在维持细胞形态、细胞间黏结、细胞壁的强度和调控细胞伸长等方面起着重要的作用，还参与了细胞的分化、抗病、细胞识别及信号传导等一系列生理、生化过程。细胞壁主要成分包含纤维素、半纤维素、果胶和少量的结构蛋白等。基因MDP0000864010属于依赖差向异构酶/脱氢酶家族，并且与鼠李糖合成酶Ⅰ （ RHMⅠ） 有较高的同源性。可能参与合成鼠李糖，而鼠李糖是细胞壁果胶多聚糖的重要组分之一。所以该候选基因有可能在细胞的组成层面增加个体的抗性。基因的相对表达量分析也表明，五个基因都不同程度的响应了病菌的诱导，是与抗炭疽菌叶枯病相关的候选基因。但是其参与抗病的机理和途径仍不清楚，深入的研究将继续展开。

主栽品种有八月鲜、扁匣榛、红壳、粉壳、大广眼、油潭本等。主栽品种有广眼、大乌圆、双孖木、粉壳、石硖、红核仔、乌龙岭、水南1号等。主栽品种有草铺种、福眼、白露、储良、立冬本。龙眼生长结果需充足日光：要求年平均气温18～26℃,最低温2～3℃,冬季12月至翌年1月要求有适当低温8～14℃,温度在0～2℃会遭受冻害使顶梢枯萎；3月平均气温较低，也难以成花。龙眼耐旱忌水浸，生长发育期间，要求有充足水分，年雨量1000～1200mm地区生长良好。龙眼对土壤适应能力强，除碱性土外的平地、冲积土以及山丘地，除碱性土外，沙壤土、红壤土、黏质土等各种土壤都能适应，瘠薄土壤宜增施有机肥或进行土壤改良。育苗一般有高压育苗和嫁接育苗两种。一般在2—8月均可进行，但以3—4月进行时发根良好，成功率高。操作方法是：选择生长良好的优良母株，在其上选2～4年生的健壮枝条进行环状剥皮，宽约4cm，刮净红色皮层至见白为度，7d以后，待剥口长出瘤状物用催根材料包扎，经过约100d以后待根长多后，再锯下假植。(1)砧木选用。共砧以及大乌圆、广眼等大核种子品种的实生苗。(2)嫁接方法。切接(含改良切接)、枝腹接、芽腹接、舌接。(3)嫁接时间。最好在每年的3—5月进行，嫁接后1个月可检查其成活与否，未成活者可进行补接，若已成活，则解绑，在10～15d后剪砧。一般选择土层深厚、疏松肥沃、排水方便的丘陵坡地建园。采用等高定点开坑或按等高线开垦成简易梯田后定点挖坑。龙眼种植前1～2个月要挖好种植坑，种植坑的规格为长1m、宽1m、深1m为好，挖坑时要将表土和底土分开堆放，定植前将土放回种植坑中，先放进杂草、绿肥，并撒上石灰与表土拌匀，再放入农家肥与松细土拌匀回至高出地面30cm。平地筑土堆，开浅穴定植。龙眼定植可分为春植和秋植。春植在3—4月进行，秋季在9—10月进行。一般采用的种植株行距为：行距5～6m、株距3～5m。种植株数平地为每667m2 20～35株，山地为每667m2 35～40株；也可进行矮化密植。栽植苗木应选择品种纯正、粗壮、直立的嫁接苗，以营养钵苗或者带土团的苗木为好。栽苗时在种植坑中心挖一个小坑，把苗放入坑中，种下回土以不盖嫁接节位为宜，轻压松紧适度。淋透定根水，并用稻草覆盖整个树盘。种后如果遇到干旱天气每隔2～3d要淋水1次，保持树盘湿润。下雨后要检查及时排去积水。结果树的施肥数量宜根据品种特性、树龄大小、树势强弱、果园土壤肥力状况、上年产量和当年的花果量多少等情况而定。周年施肥技术如下所述。(1)基肥。要求在1月上中旬施，株施麸肥0.25～0.5kg，磷肥1kg。同时，叶面喷施0.3%磷酸二氢钾和0.3%尿素溶液或根际淋施复合肥，促使花芽及时萌动。(2)壮花肥。一般在2月下旬至3月上旬花穗抽出后施；株施氯化钾0.3～0.4kg加复合肥0.3～0.4kg，麸肥0.25～0.5kg，对水或浅沟淋施，以促进花芽分化的数量和质量，提高抽穗率和增大花穗。(3)保花果肥。每年4月下旬至5月在谢花后至果实黄豆般大小时施下。株施腐熟人粪尿40kg加麸肥0.2～0.3kg，复合肥0.2～0.3kg，促进果实生长，减少生理落果每株施氮磷钾三元复合肥0.5kg。(4)促梢壮梢肥。一般于每年7—8月采果前后5d和9月下旬分两次施肥，结合灌水施速效肥，梢前以氮肥为主配合磷钾肥，恢复树势，促进采后第一次秋梢及时抽发并在9月下旬老熟、第二次秋梢在10月中旬抽发能在12月中旬老熟。根据种植地气候、树势和树龄的不同，通过采果前后的肥水管理和采果后的修剪，培养次年的结果母枝。防止植株在冬季抽生冬梢不能进行花芽分化导致次年无花或花量少。如只培养一次秋梢作结果母枝，结果母枝抽发期安排在9月下旬到10上旬。这种秋梢的结果母枝老熟后抽发冬梢可能性极小，次年抽穗率高；如要培养两次秋梢，并以第二次秋梢作次年主要的结果母枝。第一次秋梢抽发期安排在8月下旬到9月上旬，促使本次秋梢在9月下旬老熟，第二次秋梢抽发期安排在10月中下旬，促使二次秋梢在12月中旬老熟。(1)采果后适期培养次年结果母枝。(2)培养秋梢的追肥以速效性肥为主，并控制氮肥用量，加大钾肥用量，不宜施用大量的迟效有机肥，末次秋梢老熟后不再施入氮肥。(3)采后及时修剪，刺激新梢抽生。(4)壮旺树在11—12月对其一级枝和二级枝的树皮光滑处进行螺旋环割。环割宽度0.2～0.4cm，螺旋线间距为3～5cm。螺圈2～3个。(5)在末级秋梢老熟后沿树冠滴水线处深翻约4cm，锄断部分根系并晾根5～7d。(6)冬梢萌发时人工及时摘除。(7)喷药促控。在11—12月使用浓度200～400mg/L的乙烯利；浓度200～400mg/L的多效唑(注意只能间隔几年使用一次)，浓度800～1000mg/L的B9溶液等化学药剂控制。这些药剂喷雾一次能抑制枝梢生长期限约25d。也可试用花果灵、龙眼和荔枝杀梢促花素和龙眼丰产素等市场推广的控梢药剂。

草莓是多年生常绿草本果树。其浆果营养丰富，经济价值较高，具有一定的医疗保健价值。草莓浆果成熟较早，一般5—6月即可上市，对保证果品周年供应起一定作用。草莓除鲜食外，还可加工成草莓酱、草莓酒、草莓汁等，经济价值较高。草莓适应性也强，栽培管理容易，结果较早，较丰产。草莓属于多年生草本植物，植株矮小，呈半平卧丛状生长，根系属须根系，在土壤中分布较浅。草莓的茎呈短缩状，分地上和地下部分，地上短缩茎节间极短，节密集，其上密集轮生叶片，叶腋部位着生腋芽。地下短缩茎为多年生，是贮藏营养物质的器官，也可发育成不定根。匍匐茎是草莓的特殊地上茎，是其营养繁殖器官，茎细，节间长，一般坐果后期发生。叶属于基生三出复叶，呈螺旋状排列，在当年生新茎上总叶柄部与新茎连接部分，有两片托叶顶端膨大，圆锥形且肉质化。离生雄蕊20～35枚。雌蕊离生，呈螺旋状排列在花托上，数目从60～600不等。花序为二歧聚伞花序至多歧聚伞花序。果实为假果。果实成熟时果肉红色、粉红色或白色。草莓对温度适应性强。春季当气温达5℃时，开始生长。此时抗寒能力降低，遇到-9℃的低温就会受冻害，-10℃时大多数植株死亡。草莓根系在10℃时生长较快，最适宜生长温度为18～20℃。秋季气温降到2～8℃时，根生长减弱。地上部生长发育最适宜温度为20～26℃。开花期低于0℃或高于40℃，都影响授粉、受精和种子的发育。花芽分化应在低于17℃条件下进行，当降到5℃以下时，花芽分化停止。草莓生长发育过程中需要充足的水分。但在不同生长发育期，对水分要求量不一致。早春开始生长期和开花期，要求水分不低于土壤最大持水量的70%，果实生长和成熟期需要水分最多，要求在土壤最大持水量的80%以上，果实采收后植株进入旺盛生长期，要求土壤含水量在70%左右，秋季9月、10月植株要求水分较少，土壤含水量要求60%。不仅土壤含水量对草莓植株生长发育有影响，而且空气相对湿度也有影响。空气相对湿度过高或过低均不利于草莓花药开裂和花粉萌发。一般以空气相对湿度达40%左右最适宜花药开裂和花粉萌发。随着空气相对湿度增加，花药开裂率直线下降，当空气相对湿度达到80%时，花药开裂率和花粉萌发率均很低。草莓喜光，又比较耐阴，可在果树行间种植。草莓不同生育阶段对光照要求不同。在花芽形成期，要求每天10～12h的短日照和较低温度；花芽分化期需要长日照。在开花结果期和旺盛生长期，草莓需要每天12～15h的较长日照时间。草莓适宜在疏松肥沃、地下水位较低(1m以下)、通气良好的呈中性或微酸性的沙壤土上生长良好。沼泽地、盐碱地、黏土、沙土都不适于栽植草莓。一般黏土上生长草莓果实味酸、色暗、品质差，成熟期比沙土晚2～3d。草莓育苗方法有匍匐茎分株、新茎分株、播种、组织培养等，目前生产上主要以匍匐茎苗进行繁殖。匍匐茎分株繁殖草莓，生产上常有两种方式:一是利用结果后的植株作母株繁殖种苗，当生产田果实采收后，就地任其发生匍匐茎，形成匍匐茎苗，秋季选留较好的匍匐茎苗定植。该方法产生的茎苗弱而不整齐，直接影响第二年产量，一般减产30%以上。二是以专用母株繁殖秧苗，就是母株不结果，专门用以繁殖苗木。此方法可以培育壮苗，可在生产上大面积推广。繁殖田选择疏松、有机质含量在1%以上的土壤，排灌方便的地块。定植前整地作畦，每667m2施充分腐熟农家肥4～5t，尿素15kg，耕翻、耙平、清除杂草，做成平畦或高畦，畦宽1m。母株选择品种纯正、植株健壮、根系发育良好、无病虫害的植株。9月上中旬定植。在每畦中部定植1行，株距30～40cm。根据品种抽生匍匐茎的能力，抽生强的品种适当稀些，抽生弱的适当密些。栽植时植株根系自然舒展。培土程度为土覆平后既不埋心又不露根为宜。母株越冬后早春抽生花序，及时彻底摘除。匍匐茎抽生时期，加强土、肥、水管理。土壤保持湿润、疏松，每667m2适当追N、P、K三元复合肥10kg,施肥后及时灌水，松土除草。在6月匍匐茎大量发生时期，经常使匍匐茎合理分布，进行压土。干旱时选早晨或傍晚每周灌水一次。7—8月匍匐茎旺盛生长期，在匍匐茎爬满畦面出现拥挤时，及时间苗、摘心。8月底形成的茎苗可在8月上中旬各喷一次2000mg/kg矮壮素。匍匐茎抽生差的品种喷洒植物赤霉素(GA3)50mg/L。四季草莓品种在6月上、中、下旬和7月上旬各喷1次50mg/kg的GA3，每株喷5ml，结合摘除花序，效果明显。茎苗假植时间在8月下旬至9月上旬。假植地块要求排灌水方便，土壤疏松肥沃。在整地作畦时撒施足量的腐熟有机肥及适量的复合肥。在假植苗起出前一天对母株田浇水。茎苗起出后，立即将根系浸泡在70%甲基托布津可湿性粉剂300倍液或50%多菌灵液500倍液中1h。假植株行距(12～15)cm×(15～18)cm。假植时根系垂直向下，不弯曲，不埋心，假植后浇水。晴天中午遮阴，晚上揭开。一周内早晚浇水，成活后追一次肥，9月中旬追施第二次肥，追施N、P、K三元复合肥12～15g/m2。经常去除老叶、病叶和匍匐茎，保留4～5片叶。假植一个月后，控水促进花芽分化。草莓必须及早摘除匍匐茎。摘除匍匐茎比不摘除能增产40%。草莓一般只保留1～4级花序上的果，其余及早疏除，每株留10～15个果。为提高果实品质，在花后2～3周内，在草莓株丛间铺草，垫在花序下面，或者用切成15cm左右的草秸围成草圈垫在果实下面。适时摘除水平着生并已变黄的叶片，以改善通风透光条件，减轻病虫害发生。