RSV(Rice stripe virus)is a kind of viral disease transmitted by Laodelphax striatellus(LS).Once paddy rice infected with the virus,it is difficult to control the disease which would cause great loss of rice production.In recent years,as the cropping system changed and climatic conditions suited,the trend of Rice stripe virus RSV disease tend to go up acutely in north part of Zhejiang,especially in Jiaxing and Huzhou.The two cities became the most severe area Rice stripe virus RSV occurred.The RSV forecasting and prediction was the foundation to control and prevent the disease.From 2005 to 2007,we selected the key predict factors based on the study of RSV occurrence patterns established forecasting model and predicted the disease successfully in 2006 and 2007.The integrated results reorganized as following:In the observation area,investigate the quantity of LS in wheat field,the seedling field time and rice growth stage,analysis the RSV disease rate under the conditions of different pest amount.Determine the disease rate of the winter generation of LS with quick-detection method and biological assay,compare the conversion relation between the two methods,and investigate the disease condition in the steady-going periods,analysis the relation between the carrier rate and the occurrence of the disease.Sow the seeds in four stages equally in 2006 and 2007,the sowing time respectively be May 15,on May 22,on May 29 and on June 5.There is 7-days interval between every two stages,duplicates 3 times in each stage,and the field area is 333m2in each plot.Sow the seeds by stages,transplant the seedling in turn when they are 30-days-growing periods.In the steady disease occurring time,investigate cluster disease incidence and individual disease incidence,analysis the influence of sowing time did on RSV.In the steady disease occurring time,do a large-area survey of RSV disease on the main paddy rice variety in the whole city,observes the anti-(bears)degree of each variety to RSV.Collect historical materials including cultivation,planting,variety and meteorology,analysis the relations between them and the plant disease.Use has gradually regression and simulating model methods to set up forecasting model,and predict the disease trend.2.1.1 The carrier rate of LS In 2005,2006 and 2007 we determined the carrier rate of LS by biological assay in Xiuzhou area,the city of Jiaxing,Zhejiang province.The results were 0.0%,2.01%and 2.69%respectively.We had a survey in the unprevented field in the steady disease occurring time in the middle ten days of July,and the result showed that disease conditions among the fields were remarkably different.The carrier rate could not be tested in 2005,so the disease was not serious and the average diseased cluster rates of early planting field,middle time planting field,late planting field were 3.1%,1.2%and 0.0%respectively.The disease aggravated in 2006,the carrier rate increased to 2.01%and the average diseased cluster rates of early planting field,middle time planting field,late planting field were 18.5%,10.1%and 1.2%respectively.When the carrier rate was 2.69%,the disease continually aggravated and the average diseased cluster rates of early planting field,middle time planting field,late planting field were 21.5%,16.5%and 1.5%respectively.It showed that the carrier rate affected the prevalence of disease directly,and the relationship between the two was very close.The higher the carrier rate was,the greater the disease incidence would be,instead the disease incidence lighter.According to the Japanese experience,when the carrier rate(qick-detection method)is more than 3%,the prevalence of RSV is more likely to happen.If the carrier rate ＞12%,there would be a seriously epidemic trend.According to the comparison of carrier rate and biological assay in recent years,the results tested by the two methods were different.The result of biological assay was significantly lower than that qick-detection method,and the ratio was about 1:1.75.Therefore,we chosed biological assay for prediction.When the carrier rate ＞1.71%,the disease had moderate trend,when the carrier rate ＞6.86%,there was a pandemic disease trend.YearInfestingnymphes(%)Infestedhill(%)EarlysowingMidsowingLattersowing20050.003.11.20.020062.0118.510.11.220072.6921.516.51.5Table 1 The relatonship between the rate of viruliferous LS and the ccurrence of Rice stripe virus RSV (Xiuzhou Jiaxing,2005～2007)2.1.2 Amount of LS Under certain conditions of carrier rate,amount of LS is an important factor to determine whether the RSV would be prevail or not.The higher the volume of insects was,the greater the incidence was,instead the incidence lighter.In recent years,amount of LS continued increase.In years 2005,2006,2007,the amount of first generation LS per 667m2 in wheat field reached 2.98 million,2.877 million and 4.093 million.LS transferred to the nearby weeds or other crops after the wheat harvest.They moved to the seedling when rice is planting and caused RSV occurring.It has been observed that the first peak incidence(7/early) caused by the first genenration LS generation was more serious than the second peak incidence(8/early)caused by the second generation insect,because the first generation LS had a large amount a high rate of virus spreading.But as the second generation LS lived in high-temperature season,the insect amount of was small and rate of virus spreading was low,so the disease was lighter.2.1.3 Sowing date of paddy rice Paddy rice sowing date is an important factor to influence RSV.The incidence would be heavier when the sowing time was sooner,otherwise the incidence was lighter or even not onset.We had a investigation in a stable condition period(mid-July)among different rice sowing time in years 2005~2007,and found that sowing time were closely related to the occurrence of diseases.For example,in accordance with the four sowing times in 2006,the cluster disease rates were 18.5%,10.0%,5.67%and 1.5%in turn,the individual disease rates were 4.07%,2.69%,1.89%and 0.42%in turn.With the sowing time delayed,the disease lightened.Among the four sowing times in 2007,disease in early planting field was the most serious,the cluster disease rates were 16.2%and 16.67%respectively,the individual disease rates were 5.18%and 7.31%respectively.Disease in late planting field was light,the cluster disease rates were 2.7%and 1.5%respectively,the individual disease rates were 1.9%and 0.7%respectively.YearSowingdateInfestedhill(%)Infestedplant(%)Dup1Dup2Dup3Aver0.050.01Dup1Dup2Dup3Aver0.050.01200620075/1517.516.521.518.50aA4.163.164.884.07aA5/2210.510.59.010.00bB2.553.332.182.69bAB5/296.04.56.55.67cC2.021.072.571.89bBC6/52.00.52.01.50dD0.630.130.500.42cC5/1516.017.015.516.20aA6.225.214.115.18aA5/2218.015.516.516.67aA9.315.826.807.31aA5/293.03.02.02.70bB2.472.350.891.90bB6/52.01.01.51.50bB0.770.680.640.70bBTable 2 RSV occurrence in different sowing date (Nanhu Jiaxing,2006～2007)2.1.4 Cultivation and planting system In recent years,the wheat area has expanded,which wasconducive to the survival and reproduction of the overwintering generation and first generation LS.A wide range of weeds in the field create good conditions for the insects to transit to the rice.According to the observation in 2006,that disease rates of all rice seedling fields near the wheat field was evidently higher than fields away from the wheat field.In the directseeding fields,disease rates in the verge was evidently higher than that in the medial part of the field.As a result of the sowing time was early in the transplanting field,the seedlings were easily infected by massive LS and the disease arised heavily.2.1.5 Paddy rice varieties There are certain differences among different varieties of RSV,generally,disease of sticky rice was heavier than late rice,disease of hybrid Japonica ricewas heavier than ordinary late rice,disease of Late japonica rice was heavier than mid japonica rice,desease of indica rice was lighter.Speaking of the present Zhejiang Jiaxing paddy rice,the disease resistance of the main varieties are all poor. A general disease survey in 2006 showed that the disease of Show You No.5 was the heaviest,incidences of Xiushui 09,Xiushui 110,Jiahua No.1 and Jia 991 were also heavier,Jialeyou 2 was lighter,see Table 3.VarietyInfestedplotsInfestedplantInvest.plotsInfestedplotsRate%Infestedplant%Range%Xiusui09391743.61.290~6.23Xiusui11018738.91.130~4.15Jiahua1261038.50.890~4.36Jia99112866.71.520~7.32Xiuyou510990.03.780~11.20Jialeyou29333.30.310~3.11Table 3 The resistance of rice variety to RSV (Jiaxing, 2006)2.1.6 Climatic conditions Winter temperatures directly influence overwinter LS According to information from meteorological departments in Jiaxing City:the average temperature in February-March in 2007 was 10.2°C,1.8℃higher than the same period in 2006,3.6°C higher than 2005.Because the winter temperature continued high,the survival rates of winter generation LS is high and quantity of insect was large.The quantity of overwintering insects was significantly higher than that of 2006,but in 2006 the quantity was higher than that in 2005.The three-body interaction among virus source,media and susceptible.Varieties was the important factor in the prevalence of RSV.Based on the carrier rate and RSV disease rate in the virus-transmitting period,or the relation between the early and late disease rate,key predictors was screened and a forecasting model was established as following:Y=1.6893X-1.6935X-carrier rate of LS,Y-RSV disease rate.There were many key factors which were conducive to the transition and migration of LS,for example,a higher carrier rate,a large amount of LS,the poor resistance of the main variety,the coincidence of rice-sowing time with the first adult generation insect virus-transmitting peak,the expanding wheat area a wide range of weeds in the fields and so on.In 2006,we had a comprehensive analysis of these key factors,predicted RSV trend quantitatively with forecasting model on May,18.It predicted that RSV disease would be moderate biased towards popular while measured result was moderate pandemic,the incidence area of the whole city was up to 15500 hectares.Compared to the previous year,the carrier rate in 2007 declined slightly,but the quantity of LS increased largely,and the other factors did not change significantly.We had a comprehensive analysis over such factors and predicted RSV disease trend with the forecasting model in April,26.We predicted the RSV disease would be moderately popular in our city and measured moderate pandemic,the incidence area was 16400 hectares.Two years application of forecast indicated that the forecasting time could be earlier if we used this forecasting model and predictors to analysis and forecasting the trend of RSV disease.We can make out accurate prediction in late April and before late May.The predictions above were generally in line with the actual results and provided a scientific basis for"pest control and disease prevention".Using methods of the system investigation and stepwise regression analysis,we screened primary predictors including carrier rate,the LS insect quantity,paddy rice varieties and sowing time,cropping and cultivation system and meteorological forecasting factor.Among these factors,the carrier rate(X)related to the individual rice disease rate(Y)most closely.We established the following forecasting model:Y=1.6893X-1.6935.Using this model and predict factor-integrated analysis,the mid-long period trend of RSV in 2006 and 2007 in Jiaxing City,Zhejiang was predicted and was generally in line with the actual results.The prediction provided a scientific basis for decision making of disease control and the production application has obtained obvious socio-economic and ecology benefits.

苹果锈病在冀北地区历年来均属零星发生，但近2年来在部分果园突然开始大发生，其中，2007年部分果园发病株率达到100%、病叶率90%以上，苹果产量和质量急剧下降，经济效益损失接近100%。笔者于2007年对冀北地区苹果主产地的宽城、兴隆、承德等县的苹果园进行了系统调查，发现苹果锈病在该地区普遍发生，给当地苹果生产造成了较大损失。苹果锈病又名赤星病、羊胡子，有的地区俗称黄斑病、长毛病。该病可为害叶片、新梢、果实，叶片先出现橙黄色、油亮的小圆点，后扩展，中央色深，并长出许多小黑点（性孢子器），溢出透明液滴（性孢子液），此后液滴干燥，性孢子变黑，病部组织增厚、肿胀（也就是群众所称的叶子上长了黄疙瘩），病斑多呈纺锤形，以后叶背面或果实病斑四周，逐渐长出黄褐色丛毛状物（锈孢子器，即群众所称的长胡子、长毛毛），内含大量褐色粉末（锈孢子）；果实发病，多在萼洼附近出现橙黄色圆斑，直径10mm左右，后变褐色，病果生长停滞，病部坚硬，多呈畸形。苹果锈病病原菌（Gymnosporangium yamadai Mouabe）称山田胶锈菌或苹果东方胶锈菌，属担子菌亚门真菌。该菌是转主寄生菌，在苹果、梨树上形成性孢子和冬孢子，在桧柏上形成冬孢子，以后萌发产生担孢子[1]。转主寄主主要是桧柏，其次是括高塔柏、新疆圆柏、欧洲刺柏、翠柏、龙柏等[2]。该病每年只侵染1次，病菌以菌丝体在桧柏类植物上越冬，翌年春天在桧柏上形成冬孢子角，冬孢子角内的胶状物质遇雨吸水膨胀，其中的冬孢子产生大量的担孢子。担孢子不能侵染桧柏，而是随气流传到苹果树上，致使苹果树发病，开始在叶片正面出现性孢子器，以后在叶背面出现锈孢子器，产生的锈孢子再随气流传到桧柏上为害、越冬，从而完成一个侵染循环。从苹果锈病的侵染循环可以看出，如果没有桧柏类植物，苹果锈病就不能完成侵染循环，也就不能发生。据有关资料[3]介绍，桧柏类植物上的担孢子传播距离一般为2.5～5km，最远50 km。因此，苹果锈病的发生与否或发生轻重主要决定于周围5 km有无桧柏等转主寄主的存在。该病作为初侵染源的冬孢子角的萌发和冬孢子、锈孢子的侵染都需要适当降雨和相对湿度大于90%的条件。因此，该病的发生轻重和早晚与春季降雨早晚和雨量大小关系密切，降雨早则发病早，雨量大则发病重。据笔者调查，在冀北地区，一般春季4月下旬至5月上中旬降雨量达到15mm以上时，桧柏类植物上的菌瘿开始迅速吸水膨大，形成花瓣状的冬孢子角，冬孢子随即萌发形成担孢子，随气流传播至苹果树染病，一般从5月下旬叶片正面开始出现病斑，6月上旬大量发病，至8月份叶背面开始出现锈孢子器。冀北地区农村历来有翠柏栽植，但一般都长在较偏僻的陡峭山上，距离苹果园较远，而桧柏只是在城镇有少量栽植，即使偶尔有苹果锈病的担孢子飞散传播，数量也相当少。因此，该地区苹果锈病历年均零星发生或不发生，果农对该病也比较陌生。近3年来，各地大搞文明生态村建设，为了绿化和美化农村环境，开始在农村的路边、房前屋后、群众休闲活动广场等地大量栽植桧柏类植物，这些地点一般距离苹果园较近，给苹果锈病完成侵染循环提供了充分的条件，致使这些地区苹果锈病在2007年偏重发生或大发生。据笔者对冀北地区6个距离桧柏不同远近的果园调查，凡是附近栽植桧柏的果园，苹果锈病就发生重，反之则发生轻。一般建在路边距离桧柏近的果园，苹果锈病发生重，建在山坡上距离桧柏相对较远的果园则发生轻，而发生程度与距离桧柏远近呈明显的正相关。从表1可以看出，与桧柏距离50m以内的苹果树，全部感染苹果锈病，病叶达到90%以上，每个病叶上平均有病斑3.7个；与桧柏距离80～120m的苹果树，全部感染苹果锈病，病叶率略有下降，但仍达到70%左右，每个病叶上平均有病斑2.3个；与桧柏距离180～230m的苹果树，全部感染苹果锈病，病叶率为20%左右，每个病叶上平均有病斑1.6个；与桧柏距离500～630m的苹果树，病株率为58.5%，病叶率10%左右，每个病叶上平均有病斑1.15个；与桧柏距离2100～2250m的苹果树，感染率为20%左右，病叶率仅为1.2%，每个病叶上仅有1个病斑；与桧柏距离5100～5200m的苹果树，感染率急剧下降，仅为4.5%，病叶率仅为0.2%，每个病叶上仅有1个病斑。与桧柏距离（m）50以内80～120180～230500～6302100～22505100～5200病株率（%）100.0100.0100.058.519.64.5病叶率（%）91.571.622.610.51.20.2平均百叶病斑数336.2166.736.512.11.20.2表1 苹果锈病的发生程度与距离桧柏的远近关系调查表（2007年6月14日，河北宽城）苹果锈病虽然不是冀北地区果园新发病害，但是由于其具有需转主寄主才能完成侵染循环的特性，发生极少，不如腐烂病、斑点落叶病、轮纹病等常发病害那样清楚，绝大多数果农根本不认识，因此预防意识淡薄，盲目引进了桧柏类植物，而在春季又没有对其进行防范措施，导致了该病的重发生。切断苹果锈病的侵染循环是防治该病最有效的手段，新建果园时，应当远离桧柏、翠柏、龙柏类植物5km以上，对于5km之内已有桧柏等植物的，有条件的建议彻底清除。对于彻底清除5km之内桧柏等植物有难度的果园，必须采取综合措施控制冬孢子萌发。第一，可以在早春苹果萌芽前，剪除桧柏类植物上的菌瘿并集中烧毁或喷药抑制冬孢子萌发；第二，可以喷药清除菌源。应根据天气情况，在苹果萌芽期至幼果拇指大小时，尤其是4月下旬至5月上中旬遇有15mm以上且持续时间较长的降雨时，必须及时在桧柏类植物上及时喷洒波美3度的石硫合剂或三唑酮等药剂，清除越冬病菌；第三，苹果锈病发生重的果园，还应在秋季喷药保护桧柏类植物，防治锈病侵染。对于附近有桧柏类植物的果园，除了清除转主寄主的菌源以外，还应对果树进行树上喷药保护，一般在苹果花芽露红和落花后各施一次药，发病严重的还应在落花后10～15天施第三次药。常用的药剂有：15%三唑酮可湿性粉剂1500～2000倍液、12%烯唑醇可湿性粉剂2000～2500倍液、43%戊唑醇（好力克）悬浮剂3000～4000倍液、25%戊唑醇（富力库）水乳剂1000～2000倍液、25%丙环唑（敌力脱）乳油1000～4000倍液、40%氟硅唑（杜邦福星）乳油8000倍液等。苹果锈病的担孢子可飞散传播5km以上，但由于冀北地区属山区，自然屏障较多，因此，以200m以内传染为害较重，如菌量充足，可使该范围内绝大多数苹果树发病，对产量影响极大，200～500m之间发生程度中等；距离转主寄主5km以上的苹果树虽然也可以发病，但发病率较低，对产量一般不会造成严重损失。切断侵染循环是防治苹果锈病的根本所在，而喷施药剂是防治该病的重要措施。

玉米矮花叶病（Maize Dwarf Mosaic）和玉米粗缩病（Maize Rough Dwarf）是近十几年来为害我国玉米生产的两种主要病毒病害[1]。自20世纪90年代以来，玉米矮花叶病、粗缩病在山西流行严重[1，2，5]，给玉米生产带来很大损失，特别是1994～2000年连续严重发生的玉米矮花叶病和粗缩病，使山西省运城、临汾等地的晚播玉米颗粒无收，夏玉米因病害减产30%以上[2]。1998年全省发病面积45万hm2，占玉米种植面积的52%，全省损失粮食5亿多kg[3]。大面积种植感病品种是病害流行的重要原因。改良山西省常用玉米自交系和杂交种对病毒病的抗性，已成为玉米生产和育种单位急待解决的问题[3，7]。国内外研究表明：不同的玉米自交系和杂交种对玉米病毒病的抗性有明显差异[4]。选育和种植抗病品种是防治玉米矮花叶病和粗缩病最经济有效的措施[3，6，7]。本研究皆在通过田间自然发病初选，人工接种，病圃重复鉴定，筛选出对两种玉米病毒病具有抗性的种质资源。为有效地开展玉米抗病毒病育种提供参考依据。供试玉米种质资源材料共915份，其中常用玉米自交系276份，杂交种及新组合181份，热带改良新选系458份。热带改良新选系由本所种质改良课题组提供，其余的玉米资源由省内有关育种单位和种子公司提供。1.2.1 田间自然发病鉴定初选 田间自然发病鉴定初选：2001年和2002年对全部材料分2年在山西省玉米病毒病发生严重的地区运城、临汾和太谷3个点同时进行。每份材料种植2行，每行50株，行长15m，株行距0.3m×0.65m。以自然发病为主，授粉1～2周后调查病株率，发病率在15%以上的视为不抗病。对这批材料将不进行抗病复选。1.2.2 人工接种重复鉴定复选 2003～2004年，对经过田间初选的抗病材料同时进行矮花叶病人工接种和粗缩病自然重复鉴定。病圃设在山西省农业科学院小麦研究所实验场（临汾市区），历年发病较重的固定地块。供试材料田间顺序排列，每份材料种植2行，每行25株，行长7.5m，株行距0.3m×0.6m。玉米矮花叶病人工接种方法：采用蚜虫接种法，设自交系黄早4（R），Mo17（S）为抗、感对照种。玉米粗缩病重复鉴定方法：采用田间自然接种法，鉴定圃四周全部种植冬麦，利用灰飞虱发生规律，调节玉米播期（5月中旬）使幼苗与成虫羽化高峰期吻合，以达到传毒最佳效果，设自交系沈137（R），478（S）为抗、感对照品种。玉米授粉半个月后调查病情。玉米矮花叶病病株分级标准参照吴全安的方法[11]。即：0级全株无症状；1级，植株上部叶片1%～3%显症，有褪绿斑花叶；2级，植株中部叶片，1%～30%显症，植株略矮；3级，植株严重发病，2/3的叶片呈现花斑条纹，果穗弯小或不结实。病情指数按以下公式计算：依据病情指数划分抗病类型，0～5.0高抗（HR）；5.1～15.0抗病（R）；15.1～30.0中抗（MR）；30.0以上感病（S）。玉米粗缩病病害分级标准参照陈巽珍分级标准[8]，即：0级，健株，全株无症状；1级，比健株矮1/5，雄穗轴稍短；2级，比健株矮1/2，顶部略丛生，果穗长度为健株的1/2；3级，株高为健株的1/3，顶部叶小，上冲，穗小多畸形；4级，苗株死亡或极矮小，顶叶上冲丛生，绝收。病情指数计算公式同前。依据病情指数，划分抗病类型，0～5.0高抗（HR）；5.1～20.0抗（R）；20.1～40.0感（S）；40.1以上高感（HS）。2001～2002年，对915份玉米自交系和杂交种在重病区进了田间自然发病鉴定初选，淘汰了感病材料208份。2002～2004年，对初选的912份材料（自交系537份，杂交种142个），进行了矮花叶病、粗缩病人工接种，病圃重复鉴定。鉴定筛选结果见表1、表2和表3。种质类型Germplasmtype鉴定数量No高抗highResistant抗Resistant感Susceptible高感HighsusceptibleNo%No%No%No%自交系Inbredlines734253.411816.125334.533846.0杂交种Hybrids181168.96938.15832.03821.0合计Total915414.518720.431134.037641.1Table 1 Results of indentification for resistance of maize inbred lines and hybrids to SCMV-MDB种质类型Germplasmtype鉴定数量No高抗highResistant抗Resistant感Susceptible高感HighsusceptibleNo%No%No%No%自交系Inbredlines734334.512917.634547.022730.9杂交种Hybrids1812916.05128.26636.53619.9合计Total915626.817919.641144.926328.7Table 2 Results of indentification for resistance of Maize inbred lines and hybrids to MRDV种质类型Germplasmtype鉴定数量No双高抗双抗DoublehighNoResistant%DoubleNoResistant%自交系Inbredlines73470.967510.2杂交种Hybrids18195.05027.6合计Total915161.7512613.8Table 3 Results of indentification for resistance of Maize inbred lines and hybrids to SCMV-MDB and MRDV表1表明经过人工接病鉴定：筛选出抗矮花叶病自交系118份，占自交系鉴定总数的16.1%，杂交组合69个，占杂交种鉴定总数的38.1%，优良高抗病自交系有25份，占自交系鉴定总数的3.4%，它们是：选9、齐31、93选2、假B734、选78、选7、选141、选127、选301、选145、选151、选250、5081、改84-2、改99-1、改100-1、改113-1、改100-2、改474-1、改418-1、改377、改403、改426、沈137、99-5。表现为高抗病的杂交种有16个，占杂交种鉴定总数的8.9%，它们是：长单39、长单40、忻抗7号、太早单18号、98-1×5081、并单3号、齐319×98-3、并单4号、422×齐35、B734×93选2、H9-21×临京11-2、农大108、忻玉106、忻单108、晋单36、鲁单50。表2结果表明：供鉴定材料中，抗粗缩病自交系有129份，占自交系鉴定总数的17.6%；杂交种50份，占杂交种鉴定总数的27.6%；高抗病自交系有33份，占自交系鉴定总数的4.5%。它们是：选29、选41、选114、选125、选214、齐31、齐35、93选2、假B734、选331、选78、选184、选159、R选3、选50、选59、选2-2、选11-1、选46-2、选121-1、选132-1、选155-1、R10-2、R49-1、选90-3、海选36、改357-1、改474-1、改418、改408、改427、98-2、98-3。高抗病杂交种29个，占杂交种鉴定总数的16.0%，它们是：B734×93选2、422×齐35、并单4号、陕单971、新陕单1号、鉴35、齐31×98-3、并单3号、陕高农5号、临油1号、忻玉106、长单40、屯9902、同单4号、同早5号、春早单3号、运早1号、FL2、晋玉681、早利26、京单958、太早单20、太早单21、早玉2号、早玉4号、LD981、运单14、H9-2×临京11-2、H9-2×临京11-3。通过表3可以看出：被鉴定材料中，对两种病毒病同时都表现为抗病的自交系有75份，占自交系鉴定总数的11.6%，如：选41、选125、选214、齐35、选331选159、选50、选7、选141、选31、选211、选87、选14、选217、选301、选186、选102、选145、选151、选153、选250、改2-2、改11-1、改132-1、改155-1、R49-1、选90-3、海选36、改15-2、改16-2、改29-2、改50-2、改99-1、改100-1、改102-2、改111-2、改113-1、改116-1、改125-1、改134-2、改170-2、改357-1、改474-1、改418、改408、改427、改377、改403、改426、改404、改476、改406、改407、改416、改419-1、改420、改422、改430、改432、改433、改440等。双抗杂交种51个，占杂交种鉴定总数的29.8%，如：陕单971、新陕资1号、鉴35、陕单931、98-1×5081、4-18、临油1号、忻玉106、选66×308-2、忻5344、忻玉105、长单39、屯单9901、屯9902、屯9906、京玉8号、春早单1号、春早3号、太单早18、太单23、太单32、早利26、协玉2号、运单13号、晋玉681、晋玉751、科试7号、沈单10号、早玉3号、早玉2号、并单1号、太早单20、高油115、忻玉9704、忻抗13、LD981、DH3801、强盛17、并单2号、同单36号等。对两种病毒病同时都表现为高抗的材料共16份，占鉴定总数的1.96%，其中双高抗自交系有选29、齐31、93选2、假B734、选78、改474-1、改418，共7份，占自交系鉴定总数的1.1%。双高抗病杂交种有B734×93选2、422×齐35、并单4号、齐31×98-3、并单3号、陕高农5号、长单40号、H9-21×临京11-2、忻玉106，共计9个，占杂交种鉴定总数的5.3%。杂交种抗矮花叶病的比例为38.1%，自交系的为16.1%；杂交种抗粗缩病的比例为28.2%，自交系的为17.6%；杂交种同时抗这两种病毒病的比例为27.6%，自交系的为10.2%；杂交种同时高抗这两种病毒病的比例为5.0%，自交系的为0.96%；通过对杂交种和自交系材料抗病性比较，可以看出杂交种抗病的比例远高于自交系的。从表4看出被鉴定热带亚热带玉米改良自交系中，对两种病毒病同时都表现为抗病的有59份，占热带改良系鉴定总数的12.9%；对两种病毒病同时都表现为高抗的有5份，占热带改良系鉴定总数的1.1%。而国内温带自交系对两种病毒病同时都表现为抗病的有16份，占国内温带自交系鉴定总数的5.8%；对两种病毒病同时都表现为高抗的仅2份，占国内温带自交系鉴定总数的0.7%。从而可以看出热带亚热带玉米改良自交系抗病比例远远大于国内温带系。种质类型Germplasmtype鉴定数量No双高抗双抗DoublehighNoResistant%DoubleNoResistant%自交系Inbredlines73470.967510.2热带改良系Tropicalinbredlines45851.15912.9国内温带系Chinatemperate'sinbredlines27620.7165.8Table 4 Results of indentification for resistance of Tropical and China temperate's inbred lines to SCMV-MDB and MRDV采用蚜虫接种法，重病区病圃自然发病重复鉴定法，4年来，对816份不同类型玉米种质资源进行了玉米矮花叶病、粗缩病的抗病性鉴定。筛选出同时抗两种病毒病的自交材料75份，杂交种51个；双高抗病优良自交系7份；双高抗病杂交种9个；为玉米抗病毒病育种提供了一批抗病材料，为玉米生产上应用抗病品种提供了科学依据。在鉴定材料中双抗病材料所占比例较小，同时高抗两种病毒病的材料所占比例更小，鉴定材料的抗病性与其来源关系密切，不同的种质材料对两种玉米病毒病的抗病性有明显差异，杂交种和杂交组合的抗病性比例明显优于自交系；不同来源自交系的抗病性差异更大。利用热带、亚热带玉米种质改良的新选自交系，抗病比例远远高于没有热带血缘的常规系，这说明热带、亚热带玉米种质资源中有优良的抗病毒病基因，是改良我国温带玉米种质病毒病抗性的很有利用前景的抗源种质。本研究采用的矮花叶病蚜虫接种法，是我国多年来传统接种的方法，虽然由于养蚜、饲毒等工作量较大，但不失为一种可靠性强的接种方法。粗缩病的抗性鉴定方法国内现在一直采用田间自然发病鉴定方法，试验选择了利于病毒病发生的试验环境，把鉴定点设在山西省发病严重的地块进行，并进行了重复鉴定，使鉴定结果有了更强的可靠性。

马铃薯晚疫病是一种毁灭性病害，从20世纪在欧洲暴发引起大饥荒以来，在全球范围内绝大多数马铃薯栽培地区广泛传播。1996年，据CIP（国际马铃薯中心）估计，全球因晚疫病造成的直接经济损失达到170亿美元，发展中国家的损失53亿美元。晚疫病的危害性、防治难度及对社会的影响早已超过水稻稻瘟病和小麦锈病，被视为国际第一大作物病害。近几十年随着分子生物学技术的发展，各国科学家都对马铃薯晚疫病病菌的分子遗传学进行了深入的研究。本文仅对分子标记技术在晚疫病病菌研究中的应用进行简要的综述。限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，简称RFLP）。RFLP是出现最早，现在依然使用最普遍的DNA标记。RFLP技术的基本原理是：不同材料的DNA用已知的限制性内切酶消化后，产生许多大小不等的DNA片段，电泳分离、Southern印迹转移到硝酸纤维膜上，用放射性标记的探针与膜上变性的酶切DNA进行杂交，放射自显影，即可显示出不同材料的多态性图谱，即显示出所分析的DNA序列间的RFLP。目前，有两种方法可进行DNA的RFLP分析：①如原理中所述，其中用作RFLP的探针可以是特殊基因的DNA克隆、cDNA克隆、随机的基因组DNA克隆和合成的低聚核苷酸克隆。②对那些分子量较小的DNA样本（如线粒体DNA、核糖体DNA等），可在酶切后对其产物直接电泳，将不同大小的限制性酶切DNA片段分离，从而得到该DNA的RFLP图谱。RFLP反映了DNA水平上的差异，而差异往往是由变异造成的，变异分为单碱基突变型和结构重排型两大类。单碱基因突变发生在限制性内切酶的位点上，致使酶切位点增加或丢失而产生多态性，这称为点多态性。结构重排型是指DNA序列内部发生了较大的变化，如插入或缺失，从而使酶切位点间的长度发生改变，造成了片段长度的多态性。这些变异经酶切、分离、杂交、放射自显影就会使RFLP带的特征发生改变，由此对生物的变异进行分析。目前，在晚疫病病菌的研究中，RFLP技术主要用于病菌群体的遗传分化，如：分析一个国家或地区致病疫霉种群的基因结构及变化；有性生殖的发生情况等。1992年Stephen等利用RG57探针分析了墨西哥中北部的晚疫病病菌遗传结构，发现墨西哥中部病菌的遗传多样性非常明显，这也充分说明这个地区由于A2交配型的存在有性重组率高于其他地区[1]；1993年Drenth等将采自荷兰6个地区的153个菌株分为35个RG-57基因型，明确了荷兰不同地区基因型的分布情况[2]；1998年Lionel等利用RG57探针和同工酶基因型研究发现采自番茄和马铃薯上的晚疫病病菌基因型明显不同，说明晚疫病病菌有寄主专化作用[3]。目前利用该标记对来自全世界的成千上万的马铃薯晚疫病病菌建立了指纹图谱数据库。1990年Williams等人首次应用随机引物扩增寻找多态性DNA片段作为分子标记，并将此法命名为随机扩增多态性DNA（Random amplified polymorphism DNA，RAPD）[4]。RAPD技术是建立在PCR技术基础上的，利用随机的短的脱氧核苷酸序列作为PCR引物（通常为十聚体）以基因组DNA为模板进行PCR扩增。通过凝胶电泳分离得到扩增产物DNA片段的多态性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同，但对任一特定的引物，它同基因组DNA序列有特定的结合位点。如果基因组在这些有特定位点的区域发生DNA插入，缺失或碱基突变就可导致这些特定结合位点发生相应的变化。通过对PCR产物的检测可测出基因组DNA在这些区域的多态性。在RAPD分析中可用一系列的引物使检测区域扩大至整个基因组。因此，RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性分析，适于研究生物的遗传多样性及生物的遗传关系，进行遗传作图和基因定位等。在晚疫病病菌的研究中，RAPD技术一般多用于研究种内群体遗传分析。如：Mahuku[5]对1994～1996年采自加拿大的141个菌株进行RAPD分析，将其分为21个组，分析表明97%的变异来自于种群内，3%的变异来源于种群间。2001年朱杰华等利用RAPD方法研究了马铃薯晚疫病病菌DNA多态性与A2交配型的关系[6]。2005年侯淑英等使用178个10bp随机引物对晚疫病病菌的甲霜灵抗性性状进行RAPD分析，得到一个相对稳定的与甲霜灵抗性连锁或相关的标记S500，为晚疫病的有效防治和病原菌的抗药性治理提供了理论依据和实践方法[7]。AFLP是1993年由荷兰keygene公司科学家Zabeau等人发明的一种DNA分子标记技术[8]，该技术的基本原理是：对基因组DNA进行限制性酶切片段的选择性扩增。主要步骤是：将基因组DNA进行限制性酶切后，将特定的接头连接在DNA酶切片段的两端，从而形成一个带接头的特异片段，通过接头序列和PCR引物3'端的识别，进行PCR扩增，最终经过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，通过银染或放射自显影检测。AFLP技术实际上是将RFLP和PCR相结合的一种技术[9～10]。该技术既继承了RFLP的稳定性，又具有PCR反应快速、灵敏的特点，同时克服了RFLP和RAPD的缺点，且扩增的带纹多（50～100条）。AFLP的大多数扩增片段与基因组的单一位置相对应，实验重复性高，该标记为孟德尔式遗传。目前，AFLP 技术主要用于构建晚疫病病菌的基因连锁图谱，此外也被用来检测病菌的基因型。1997年，Van de Lee[11] 等完成了一张比较完整的致病疫霉基因连锁图谱，这张图谱包括183个AFLP标记，7 个RFLP 标记和交配型基因座，包括10个主要的连锁群和7个次要的连锁群，共827cm，并证明主要连锁群中的标记来自于两个亲本，而次要连锁群中的标记来自A1 交配型的亲本或来自A2 交配型的亲本。同时还证明了致病疫霉是同核型的二倍体[12]。Cooke[13]，Flier等[14]以及Knapova等[15]利用AFLP对来自墨西哥和欧洲的病菌研究发现，墨西哥的菌株几乎每个都具有其特异的AFLP基因型，而欧洲的菌株平均每两个就具有一个特异的AFLP基因型。AFLP带型在分裂中能够保持稳定，并遵循孟德尔遗传规律[16]。交配型及其所在的连锁群的其他标记均不遵循孟德尔遗传规律。AFLP技术用于构建基因连锁图谱，使我们可以从基因水平了解晚疫病病菌，为更好地研究晚疫病病菌、防治晚疫病提供理论依据。短序列重复即SSR（Short sequence repeat）、又称微卫星DNA或短串联重复（Short tandem repeat，STR），这是一类由1～5个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列[17]。同一类的微卫星DNA可分布于整个基因组的不同位置上，由于基本单元重复次数的不同以及重复程度的不完全而造成了SSR位点的多态性，这种多态性有比较丰富的信息量。由于在每个微卫星DNA两端的序列是相对保守的单拷贝序列，因而可根据两端的序列设计一对特定的引物，扩增每一位点的微卫星序列，再经凝胶电泳比较扩增产物的长度变化，即可显示不同基因型个体在微卫星DNA位点上的多态性[18～19]。SSR技术的特点是：呈共显性遗传；在数量方面没有生物学上的限制；其标记带型简单，记录的条带一致、客观、明确；采用PCR技术进行检测只需少量DNA样品，且质量要求不高，即使是部分降解的样品也可进行分析；每个位点均有许多等位形式；另外，它还具有多态性高、实验程序简单等优点[19～20]，所以自1989年SSR技术产生以来，被广泛应用于基因定位和QTLs分析、DNA指纹和品种鉴定、种质资源保存和利用、系谱分析和标记辅助育种[18]。2001年Knapova [21]等首次利用SSR技术研究了瑞士和法国的马铃薯和番茄的晚疫病病菌群体的遗传多样性，同时分析了致病疫霉有性杂交F1代的分离情况，结果发现被测菌株群体具有丰富的遗传多样性。试验中6个SSR位点被鉴定出来，其中的3个SSR位点具有多样性，他们又从3个SSR位点中选择了2个SSR位点的引物（Pi4G和Pi4B）对来源于瑞士和法国的176个菌株进行了鉴定，分别得到4种和6种不同长度的等位基因片段（共21个组合）。2002年G.Knappva [22]等再次报道了法国和瑞士的晚疫病病菌的表型和基因型结构，他们研究的马铃薯晚疫病病菌株中存在11个SSR基因型，其中以A-03和A-06为主，另有1/9的菌株是其他SSR基因型；但尚未发现SSR基因型与菌株的交配型、对甲霜灵的敏感性和菌株来源的地域性有相关关系。Knappva[21～22]等的研究揭示了SSR分子标记适用于分析晚疫病病菌的群体结构，同时也指出了SSR标记技术在病菌应用的潜力和存在的问题，如stutter bands、非特异扩增等。但同其他分子标记相比，SSR技术具有位点特异的优点，有利于分析全球马铃薯晚疫病病菌的种群结构。若能对SSR标记技术进行大量人力、物力的投入，获得更多理想的SSR标记，这种技术将具有巨大的应用潜力。2004年朱杰华用AFLP分子标记研究了河北、云南、四川及黑龙江省的50个晚疫病病菌株的DNA指纹，当欧式距离为10时，50个菌株被聚类为4组，分组情况与菌株来源的地理位置相关，表明马铃薯晚疫病病菌的DNA的AFLP分子标记多样性与病菌的地理来源及病菌对甲霜灵的抗性有一定相关性，但未发现和生理小种及交配型有相关性[23]。2004年魏长拴用RAPD分子标记分析了我国马铃薯主产区的晚疫病病菌的亲缘关系和遗传相关性[24]。2005年郭军等利用SSR、AFLP和线粒体DNA单倍型技术分析了内蒙古地区马铃薯晚疫病病菌的遗传多样性。2006年姚国胜等利用SSR技术测定出中国菌株中存在7种SSR基因型[25]。总的来说，分子标记技术在我国马铃薯晚疫病病菌的研究中应用还很少，今后应进一步将各种分子标记技术应用到马铃薯晚疫病病菌的研究中。综上所述，DNA分子标记技术在马铃薯晚疫病病菌遗传研究上具有重要应用价值，并已取得了可喜的进展，展现了广阔的应用前景。现已研究了晚疫病病菌发源和墨西哥以外地区A2交配型的来源，为晚疫病的防治提供理论基础；明确了一个地区不同菌株之间的基因结构变化，遗传结构差异。利用DNA分子标记技术绘制晚疫病病菌的连锁图谱，使两个标记间距离足够小；借助高密度标记对一些性状基因进行准确定位，从而为抗病育种研究提供科学依据；并运用分子标记找到与目的基因紧密连锁的标记，如在致病疫霉中找到与抗瑞毒霉基因连锁的标记，与毒力基因连锁的标记，从而指导晚疫病的防治。由于上述几种分子标记都各有优缺点，任何一种均不能满足晚疫病病菌遗传研究的所有要求。所以如何更好地利用各种分子标记研究马铃薯晚疫病病菌，预防和控制马铃薯晚疫病，仍需不断研究。

SNP （单核苷酸多态性） 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的 DNA 序列多态性，包含单个碱基的转换、颠换等。InDel是指插入/缺失 （Insertion/Deletion） 基因组中小片段的插入和缺失序列，个体重测序中特指1～50 bp 的小片段插入和缺失。在生物的进化进程中，生物全基因组水平上积累了大量的微小变异，主要包括SNP 和InDel。这些微小变异的变异程度决定了物种之间在表型和生理结构等方面的差异，为新物种的形成提供了最原始的动力，是物种多样性的本质体现。SNP 标记是基因组DNA序列中分布最广泛的一类标记，植物基因组中平均每数百bp就存在着一个SNP （Huang et al.，2010；Qi et al.，2013）。InDel标记也是一种重要的遗传标记，已被广泛应用于图位克隆、基因定位、动植物遗传多样性的鉴定、分子标记辅助育种等领域（Jander et al.，2002；Schnabel et al.，2005；王岩等，2009；王明军等，2010）。随着高通量测序技术的快速发展，利用全基因组重测序（whole genome re-sequencing，WGR） 技术结合混合分组分析法（bulked segregate analysis，BSA） 可高效检测出通过双亲杂交建立的后代群体中导致表型变异的 QTL和突变位点 （Abe et al.，2012；Takagi et al.，2013），并且可以识别大量的 SNP 和 InDel 位点，从而进行SNP 及InDel标记的开发，获得基因区间的SNP 及InDel标记。本研究利用WGR技术及 BSA法相结合，获取与抗炭疽菌叶枯病基因相关的SNP 和InDel位点，并通过对△ （SNP-index） 图谱分析，快速锁定抗病区域，再通过ANNOVAR软件分析，提取注释信息，筛选出候选的抗病基因。并利用实时荧光定量 PCR （qRT-PCR） 技术对候选基因经过炭疽叶枯病病原菌侵染后的不同时间段基因表达量的变化进行分析，寻找响应炭疽叶枯病病原菌侵染的抗病相关基因并对其进行详细的功能分析，以期揭示苹果抗炭疽菌叶枯病的分子机制。用于全基因组重测序的材料为 ‘金冠’ ‘富士’ 及第三章中经过抗病鉴定的 ‘金冠’ב富士’ 的 F1 代群体中极端抗炭疽菌叶枯病的20个单株和极端感炭疽菌叶枯病的20 个单株。取其嫩叶3～5 片，液氮速冻，置于-70℃冰箱保存，用于提取DNA。用于qRT-PCR 分析的材料为 ‘富士’ 和 ‘金冠’ 带嫩叶的一年生健壮新梢各30 枝，用于室内人工离体接种。接种方法同第二章，分别于接种后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h七个时间点采集叶片，液氮速冻后，用于提取RNA，检测基因表达。参考Doyle和Doyle （1987） 及 Cullings （1992） 提取基因组DNA的CTAB法，并加以改进，详见第三章。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的纯度和完整性。条带单一、清晰明亮、无降解、无污染的DNA样品作为合格样品用于后续研究。运用NanoPhotometer ? 分光光度计 （IMPLEN，CA，USA） 对DNA的纯度进行检测。DNA经过 Qubit ? DNA Assay Kit in Qubit ? 2.0 Flu-rometer （Life Technologies，CA，USA） 进行浓度的精确定量。将DNA浓度调整为100 ng/μl。苹果嫩叶总RNA的提取方法如下。（1） 将500 μl裂解液RLT Buffer、50 μl PLANTaid、5 μl β-巯基乙醇，依次加入灭菌的1.5 ml离心管中，混匀，待用。（2） 将冻存于-70℃下的苹果嫩叶0.2 g置于预冷的研钵中，加少量液氮快速研磨成细粉状后转入上述待用的的离心管内 （样品容易褐化，动作要迅速，并保证液氮挥发完全）。（3） 56℃温育5～10 min，期间不断剧烈震荡混匀，以保证充分裂解。（4） 12000 r/min 离心10 min，将离心管缓慢从离心机中取出，将上清液转到新离心管中 （吸取上清液时一定要缓慢，尽量不要吸到底部沉淀）。（5） 较精确估计上清液体积，加入 0.5 倍体积的无水乙醇，盖盖，上下颠倒混匀，此时可能会出现沉淀，但是不影响提取的过程。（6） 将混合物 （每次上样应小于800 μl，可分两次加入） 加入吸附柱中，12000 r/min离心60 s，弃废液。（7） 在吸附柱中加700 μl去蛋白液 RW1，室温下放置5 min （可稍延长时间，去除吸附柱上的蛋白污染），12000 r/min 离心30 s，弃废液。（8） 在吸附柱中加入 500 μl 漂洗液 RW （加过无水乙醇），12000 r/min离心 30 s，弃废液。再加入 500 μl 漂洗液 RW，重复1遍。（9） 将吸附柱放回空收集管中，12000 r/min空离心2 min，尽量除去吸附柱中残留的漂洗液。（10） 将吸附柱放入一个 RNase free 离心管中，在吸附膜上加40 μl RNase-free water （最好事先在 70～90℃中水浴加热），室温放置2 min，12000 r/min 离心1 min，如需RNA浓度较高，可重复离心1次。（11） 取4 μl RNA加入6×RNA Loading Buffer，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取的质量与纯度，并估测提取浓度。（12） 将检测质量好的RNA放入-70℃下保存备用。参照 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time） 试剂盒 （TaKaRa）。具体操作步骤如下 （全程冰上操作）。（1） 基因组 DNA 的去除。在 0.2 ml 灭菌的离心管中依次加入1 μg 总 RNA，2 μl 5×gDNA Eraser Buffer，1 μl gDNA Eraser，用RNase-Free水补足10 μl，42℃，2 min （或者室温5 min）；4℃。（2） 反转录反应。在0.2 ml灭菌的离心管中依次加入10 μl步骤1的反应液，1 μl PrimerScript RT Enzyme Mix I，1 μl RT Primer Mix，4 μl 5×PrimerScript Buffer 2 （for Real Time），用 RNase Free 水补足20 μl。37℃，15 min；85℃，5 s；4℃。（3） 质量检测。用 β-actin 基因的引物对反转录的 cDNA 进行PCR扩增，并用1%的琼脂糖电泳检测，选取质量好的样品在-20℃下保存备用。将 ‘金冠’ב富士’ 的F1 代群体中选取出的 20 个极端抗病的单株和20个极端感病的单株DNA等量混合构建成两个表型池。检验合格的4 份 DNA 样品每份取1.5 μg进行基因文库的构建。通过Covaris破碎机将DNA样品随机打断成长度为350 bp的片段。采用TruSeq Library Construction Kit 进行建库，严格使用说明书推荐的试剂和耗材。DNA 片段经末端修复、加 ployA 尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。构建好的文库通过 illumina HiSeqTM PE150进行测序 （附图4-1）。文库构建完成后，先使用 Qubit 2.0 进行初步定量，稀释文库至1 ng/μl，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段 （insert size） 进行检测，符合预期后，使用Q-PCR 方法对文库的有效浓度进行准确定量 （文库有效浓度＞2 nM），以保证文库质量。4个文库检验合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行 Illumina HiSeq TM PE 150 测序。围绕350 bp的片段进行双末端 125 bp 测序。表型差异的两个亲本测序深度为10 X，抗感池测序深度为20 X。信息分析的主要步骤如下 （附图4-2）。步骤一：对下机得到的原始测序数据 （Raw data） 进行质控得到有效测序数据 （Clean data）。步骤二：将Clean data比对到参考基因组上。步骤三：根据比对结果，进行 SNP、InDel 的检测，分析 SNP、InDel的分布情况并进行注释。步骤四：对子代SNP 频率差异进行分析。步骤五：根据分析结果对目标性状区域进行定位。步骤六：确定候选基因。测序得到的原始测序序列 （Sequenced Reads或者 raw reads），里面含有带接头的、低质量的 reads。为了保证信息分析质量，必须对raw reads过滤，得到有效测序序列 （clean reads），后续分析都基于clean reads。数据处理的步骤如下。一是去除带接头 （adapter） 的reads pair。二是当单端测序read中含有的N的含量超过该条read长度比例的10%时，需要去除此对paired reads。三是当单端测序read中含有的低质量 （Q≤5） 碱基数超过该条read长度比例的 50%时，需要去除此对paired reads。有效测序数据通过 BWA （http：//bio-bwa.sourceforge.net/） 软件 （Li and Durbin，2009） 与 ‘金冠’ 苹果的基因组 （ https：//www.rosaceae.org/data/download） 进行比对，确定reads在基因组上的位置。比对结果使用 SAMTOOLS （ http：//samtools.sourceforge.net/）软件进行SNP-calling （Li and Durbin，2009），发掘 reads 与参考序列以及 reads 之间的 SNP 位点，利用 SAMtools 软件中的 “rmdup” 指令去除序列文件中的重复。人们采用GATK3.3软件 （McKenna et al.，2010） 的UnifiedGeno-typer模块进行多个样本 SNP 和 InDel的检测，使用 VariantFiltration进行过滤，SNP 的过滤参数为：cluster Window Size 4，filter Expression“QD＜4.0 ‖ FS＞60.0 ‖ MQ＜40.0”，G filter “GQ＜20”。InDel的过滤参数为：cluster Window Size 4，filter Expression “QD＜4.0 ‖ FS＞200.0 ‖ ReadPosRankSum＜-20.0 ‖ InbreedingCoeff＜-0.8”。利用ANNOVAR软件 （Wang et al.，2010） 对 SNP 和 InDel 检测结果进行注释。SNP 频率的统计：SNP 频率是指所检测到的总的SNP 数与参考基因组序列的总长度的比值，是衡量一个物种变异程度和多态性的指标。转换颠换率的统计：分别统计发生转换和颠换的SNP 数目。子代 SNP 的频率 （Takagi et al.，2013），即 SNP-index，是与SNP 位点的测序深度相关的参数，是指某个位点含有 SNP 的 reads数与测到该位点的总 reads数的比值。以参考基因组作为参照，分析计算两个子代在每个 SNP 位点的 SNP-index。SNP-index计算方法如附图4-3所示。若该参数为0，则代表所有测到的reads都来自作为参考基因组的亲本，即 ‘金冠’。参数为1则代表所有的reads都来自另一个亲本，即 ‘富士’。参数为0.5，代表此混池中的 SNP 来自两个亲本的频率一致。为减少测序错误和比对错误造成的影响，对计算出 SNP-index后的亲本多态性位点进行过滤，过滤标准如下。（1） 两个子代中 SNP-index 都小于0.3，并且 SNP 深度都小于7的位点，过滤掉。（2） 一个子代SNP-index缺失的位点，过滤掉。计算△ （SNP-index），即两个子代 SNP-index 作差：△ （SNP-index）=SNP-index2 （极端抗病性状）-SNP-index1 （极端感病性状）。为直观反映△ （SNP-index） 在染色体上的分布情况，对其在染色体上的分布进行作图。默认选择1 Mb 为窗口，1 kb 为步长。进行1000次置换检验，选取95%置信水平作为筛选的阈值。为了不忽略掉微效QTL的影响，在全基因组范围内挑选两个子代在SNP-index差异显著的SNP 位点，即挑选子代2 （极端抗病性状） SNP-index大于0.7，且子代1 （极端感病性状） SNP-index小于0.3的位点，并与亲本 ‘富士’ 为纯合及亲本 ‘金冠’ 为杂合的位点取交集，做为候选的基因位点。提取ANNOVAR的注释结果，优先挑选使基因获得终止密码子的变异 （stop loss） 或者使基因失去终止密码子的变异 （stop gain） 或者非同义突变 （missense） 或可变剪接的位点（Splicing） 所在的基因作为候选基因。从网站 https：//www.rosaceae.org/gb/gbrowse/malus_x_domestica/下载候选基因的 mRNA，从基因编码区核苷酸序列的近3’端位置设计引物，PCR产物长度在150～250 bp，引物序列见表4-1，内参基因为β-actin基因。荧光定量 PCR 在罗氏 LightCycler 480 系统上进行，反应体系配制按 SYBR Green PCR Master Mix 说明书进行操作，具体如下：10.0 μl SYBR Premix Ex Taq Ⅱ （2×），0.8 μl正反向引物，2.0 μl cDNA，去离子水补足20 μl。反应程序为95℃ 预变性5 min，95℃ 10 s变性，55℃ 10 s退火，72℃ 10 s延伸，扩增45 个循环。循环结束后进行熔解曲线分析：95℃ 15 s，60℃ 20 s，然后缓慢升温至95℃。基因的相对表达量用公式：F=2-ΔΔCt，ΔΔCt=（待测组目的基因 Ct值-待测组内参基因 Ct值）-（对照组目的基因 Ct值-对照组内参基因Ct值）。Illumina HiSeqTM PE150 测序平台，四个样本共产生 47.115 G的测序原始数据 （Raw data），通过对原始数据中的接头序列，低质量碱基以及未测出的碱基 （用 N 表示） 进行过滤后，得到有效数据 （Clean data） 46.974 G，各样本的 Raw data 在 7774.247～17017.174 Mb，Clean date 在7751.990～16969.215 Mb，过滤后获得的有效数据比率在99.64%～99.72%，碱基错配率低于0.05%。测序质量 Q20 ≥ 95.08%、Q30 ≥ 88.97%，GC 含量在 39.04%～39.16%。这表明所有样本的数据量充足，测序质量很高，GC 分布正常，建库测序成功，保证了后续数据分析的准确性 （表4-1）。样本原始数据/bp有效数据/bp有效率/%错误率/%Q20/%Q30/%GC含量/%富士7774246500775199010099.710.0395.4389.6339.16金冠7900566600787192650099.640.0395.5589.8839.05BR（基因抗池）170171739001696921590099.720.0395.4489.6239.04BS（基因感池）144234894001438116750099.710.0495.0888.9739.15表4-1 测序数据质量概况将四个样品的有效数据与已经发布的金冠苹果参考基因组序列（https：//www.rosaceae.org/data） 进行比对，计算出比对到参考基因组 （参考基因组大小为609314018 bp） 上的 reads条数、测序深度及碱基覆盖率。结果表明，四个样品的比对率均在87%以上，两个亲本的测序深度达到15×以上，抗感池样品的测序深度达到 30×以上。在参考基因组中至少有1个碱基覆盖的位点占基因组的比例达到95%以上，至少有 4 个碱基覆盖的位点占基因组的比例 “富士” 为88.3%，“金冠” 为91.26%，其他两样品达到96%以上。这进一步的说明，本试验测序的数据质量很高，可用于后续的变异检测及相关分析 （表4-2）。样本比对到reference上的reads条数①有效测序数据的reads总条数比对率/%②平均测序深度/x③参考基因组中至少有1个碱基覆盖的位点占基因组的百分比/%参考基因组至少有4个碱基覆盖的位点占基因组的百分比/%富士455966535167993488.2315.9595.9588.3金冠459536665247951087.5615.6798.0991.26BR（基因抗池）10045340711312810688.834.4298.896.67BS（基因感池）8962925610163794888.1830.8898.7896.44表4-2 测序深度及覆盖度统计通过全基因组重测序技术共获得3399950个 SNP 位点，苹果参考基因组总长度为 609314018 bp，据此计算出 SNP 出现的频率为3399950/609314018=0.56%。转换 （T/C、C/T） 和颠换 （T/G、T/A、C/A、C/G） 发生频率 （附图 4-4） 的统计结果显示，T/C 和C/T转换发生的频率分别为 32.5%和 34.1%，T/G、T/A、C/A和C/G颠换发生的频率分别为 9.2%、9.4%、9.4%、5.4%。转换/颠换率为2.0。利用测序获得的有效数据，比对苹果参考基因组序列，经 ANN-OVAR软件分析共得到 SNP 位点 3399950个，InDel 位点 573040个，SNP 位点位于内含子上的465317个，位于外显子上的436309个，其中同义变异 210404个，非同义变异 220539个，InDel 位点位于内含子上的 108996个，位于外显子上的 19957个，其中插入或缺失3 或 3 的整数倍的碱基，不改变蛋白质的编码框的有 6928个。这表明绝大部分变异位于非编码区，或不会导致基因编码的改变，这有利于维持植物体正常的生长发育，保证品种特性的稳定遗传 （表4-3）。类别SNP数量基因上游184156获得终止密码子4837失去终止密码子529外显子同义变异210404非同义变220539内含子465317剪接位点2196基因下游177312基因上游/基因下游12750基因间区2105122转换2265734颠换1134216转换/颠换/%1.997合计3399950表4-3 SNP及InDel检测及注释类别InDel数量基因上游51816获得终止密码子376失去终止密码子68Frameshiftdeletion①7330外显子Frameshiftinsertion5255Non-frameshiftdeletion②3843Non-frameshiftinsertion3085内含子108996剪接位点598基因下游44305基因上游/基因下游3896基因间区342800插入262868缺失310172合计573040表4-3 SNP及InDel检测及注释（续）-1△ （SNP-index）=SNP-index B （极端抗病性状）-SNP-index A （极端感病性状）。进行1000次置换检验，选取95%置信水平作为筛选的阈值。一般情况下，在苹果 F1 群体中，由于每个位点的碱基均来源于双亲中的一个，所以在基因组中大部分区域的 SNP-index都在0.5附近。如果某个SNP 位点与抗性相关，那么在该处的 SNP-index就会显著偏离0.5，△ （SNP-index） 就会显著大于此处的阈值。从抗感池中△SNP-index值在染色体上的分布可以看出，在第15 条染色体2～5 Mb区间内△SNP-index值显著的大于阈值，预示着该区域内可能存在着与抗炭疽菌叶枯病基因相关的位点 （附图4-5）。这与第三章SSR标记所确定的抗性基因所在的区域吻合。在全基因组范围内挑选在两个子代池中 SNP-index 差异显著的SNP 位点，即挑选在抗池中 SNP-index 大于 0.7，在感池中 SNP-index小于0.3，△ （SNP-index） 大于 0.5 的 SNP 位点，并与亲本‘富士’ 为纯合，亲本 ‘金冠’ 为杂合的位点取交集，共得到258 个候选的多态性标记位点 （表4-4）。这258 个 SNP 位点中位于基因上游1 kb的19个，基因下游1 kb 的12 个，位于基因上游1 kb 区域，同时也在另一基因的下游1 kb区域的2 个，位于基因间区的173 个。位于外显子上非同义变异的13 个，同义变异7 个，位于内含子上的31个。其中位于第15条染色体上的有123 个，占整个候选 SNP 位点的47.7%。类别SNP数量基因上游19获得终止密码子0失去终止密码子0外显子同义变异7非同义变13内含子31剪接位点1基因下游12基因上游/基因下游2基因间区173转换161颠换97转换/颠换/%1.659合计258表4-4 候选多态性标记位点的注释提取ANNOVAR的注释结果，优先挑选能引起基因获得终止密码子、失去终止密码子的变异，或者非同义突变，或者可变剪接的位点所在的基因作为候选基因。经筛选后得到33 个 SNP 位点及所对应的29个候选基因 （表4-5）。这些SNP 位点中发生转换的 （G/A、C/T、T/C、A/G） 共 16 个，占 48.5%，发生颠换的 （G/C、C/G、G/T、A/C、A/T、T/G、T/A、C/A） 共17 个占51.5%，其中有21 个位于第15条染色体上。基因ID类型染色体SNP位点参考基因组碱基型Ref突变碱基型AltMDP0000294705nonsynonymous24029182TCMDP0000311597upstream26560007TCMDP0000335197upstream238255166CTMDP0000481284nonsynonymous511687941TCMDP0000266783nonsynonymous516570950ACMDP0000223383upstream814935907CTMDP0000203531upstream918259400TGMDP0000265695upstream919790733GAMDP0000224187nonsynonymous1034991229ATMDP0000226279upstream1123158805AGMDP0000480608upstream123704417TGMDP0000504610upstream1229472316TCMDP0000292279upstream151396770CTMDP0000686092nonsynonymous153955717AGMDP0000686092nonsynonymous153955724AGMDP0000686092nonsynonymous153955738TAMDP0000205432nonsynonymous154094431TAMDP0000120033upstream154236293AGMDP0000864010nonsynonymous154257246GAMDP0000945764nonsynonymous154336468CAMDP0000149107splicing154970310CTMDP0000609131upstream156771435CAMDP0000169753upstream157074724ACMDP0000296372upstream157704309CT表4-5 候选基因ID基因ID类型染色体SNP位点参考基因组碱基型Ref突变碱基型AltMDP0000199827upstream157710714TAMDP0000194508nonsynonymous157757532GAMDP0000320004upstream158084422ATMDP0000320004upstream158084636TCMDP0000320004upstream158084637ACMDP0000148808upstream158365795GTMDP0000133266upstream1533862275AGMDP0000157213nonsynonymous1549031042CGMDP0000169687nonsynonymous1552444208TC表4-5 候选基因ID（续）-1结合 SSR标记定位及全基因组重测序中对△ （SNP-index） 值分析的结果，从这29 个候选基因中筛选出位于第15 条染色体3.9～4.9 Mb距离内的5个基因 MDP0000686092、 MDP0000205432、MDP0000120033、 MDP0000864010、 MDP0000945764 做为抗炭疽菌叶枯病的最终候选基因。通过对5个候选基因进行 GO 功能富集分析发现，5 个候选基因中有3个功能未知。基因 MDP0000120033 具有核酸绑定功能，锌离子结合分子功能，参与 RNA 剪切生物过程，调节基因产物的表达。蛋白结构上具有CCHC型结构域的锌指结构，是丝氨酸精氨酸富集剪接因子。进一步同源比对该基因为 SR基因家族 RSZ亚家族基因，与拟南芥AtRSZ21蛋白的序列一致性达到60%，与花生AdRSZ21蛋白的序列一致性达到79%。基因 MDP0000864010 具有辅酶绑定功能，蛋白结构上具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 （磷酸盐） NAD （P） 绑定区域，属于NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族，进一步的同源性比对，该蛋白与鼠李糖生物合成酶 1 （rhamnose biosynthetic enzyme 1，RHM1） 有较高同源性 （表 4-6）。候选基因编码的氨基酸序列见附录五。基因ID基因功能注释MDP0000686092功能未知蛋白MDP0000205432功能未知蛋白质。MDP0000120033核酸绑定功能，锌离子结合分子功能，参与RNA剪切生物过程，调节基因产物的表达。具有锌指结构，CCHC型结构域，丝氨酸精氨酸富集剪接因子。MDP0000864010辅酶绑定功能，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸盐）NAD（P）绑定区域，NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族，可能与鼠李糖生物合成酶1有关。MDP0000945764功能未知蛋白表4-6 抗炭疽菌叶枯病候选基因的功能注释利用TMHMM2.0软件对候选基因进行跨膜结构分析，基因MDP0000686092和MDP0000120033具有跨膜结构。基因MDP0000686092具有1个跨膜区，基因MDP0000120033具有3个跨膜区，位置分别在153～172、187～209、214～236的区域内（附图4-6）。引物名称引物序列MDP0000686092基因荧光定量PCR引物P1-FP1-RF：5′-CAGGCTGGAGCGAAGTTTA-3′R：5′-CCTTTCTGTGATGGCATTGTT-3′MDP0000205432基因荧光定量PCR引物P2-FP2-RF：5′-GAAAAGCCAGCACCAGAAAC-3′R：5′-CGTATTCGTGGGGTTATAGAGC-3′MDP0000120033基因荧光定量PCR引物P3-FP3-RF：5′-TCTGGGAATGCTGCTAAAACTC-3′R：5′-GCAGGGCAGTAGTGAAGCAC-3′MDP0000864010基因荧光定量PCR引物P4-FP4-RF：5′-CGTGACCAATCGCCTAATA-3′R：5′-GGACGTGAGTGCCGTAGAC-3表4-7 荧光定量PCR引物引物名称引物序列MDP0000945764基因荧光定量PCR引物P5-FP5-RF：5′-TTTGCCAGCCTGTCAGAAGT-3′R：5′-AGTTGTAGAGGGAGGAGGAAGA-3′β-actin基因荧光定量PCR引物P6-FP6-RF：5′-CACTGCTTCTATGACTGGTTTTGA-3′R：5′-CTGGCATATACTCTGGAGGCTT-3′表4-7 荧光定量PCR引物（续）-1对接种炭疽菌叶枯病病菌后 0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h的 ‘富士’ 和 ‘金冠’ 枝条进行采样，提取 RNA，反转录成cDNA后，对5个候选基因的表达进行实时荧光定量分析。结果显示，5个基因均不同程度响应病原菌侵染 （附图4-7、 表4-7）。除了基因MDP0000864010在 ‘富士’ 叶片中的表达量表现为下调外，其余 4个基因均为上调表达。在 ‘富士’ 叶片中，基因 MDP0000205432、MDP0000120033和MDP0000945764 的表达量在接种后 24 h 均达到最高值，48 h降到最低值，然后又缓慢提高。在 ‘金冠’ 叶片中的表现不同于 ‘富士’，三个基因表达量的最高值出现在36 h，但最低值同样出现在48 h，这说明在这3个基因在抗病植株中对病原菌的应答要早于感病植株。尽管基因 MDP0000686092 和 MDP0000945764 在‘富士’ 和 ‘金冠’ 叶片中也均表现为上调表达，但是在 ‘金冠’ 叶片中的表达变化更为显著，基因 MDP0000945764 在 ‘金冠’ 叶片中的表达量达到最高值时为接种前的60 倍，而在 ‘富士’ 中的提高量为接种前的10倍。以上结果说明，5个候选基因均受炭疽菌叶枯病病菌的诱导，是苹果炭疽菌叶枯病抗病相关基因。SNP 标记的开发主要依赖于含有大量测序序列的数据库。通过全基因组测序，不仅可以获得大量的 SNP 标记，还可以了解到 SNP 标记在整个基因组中的分布情况，有利于我们进一步了解不同物种的生物学特性，以及利用标记进行不同需求的生物学研究。在葡萄的基因组测序中发现，SNP 位点的密度高达7%（Jaillon et al.，2007）；2010发表的金冠苹果全基因组序列中，SNP 标记的频率约为 4.4 kD/SM，即227 bp/SNP （Velasco et al.，2010）；梨的全基因组序列中共检测到3402159个 SNP 位点，约占基因组序列的 1.02%（Wu et al.，2013）；柑橘中得到的 SNP 位点数量为106 万个 （Xu et al.，2013）。对于有参基因组，通过全基因组重测序手段进行大量 SNP 标记开发，也是研究不同品种间差异的有效途径之一。通过对6 个玉米自交系的进行全基因组重测序，在非重复序列区域内共获得了 1272134个SNP 标记 （Lai et al.，2010）；对葡萄的230个基因片段重测序，数据统计结果显示，每64 个碱基中就存在着一个 SNP 位点 （Lijavetzky et al.，2007）；在水稻中，水稻籼稻恢复系 7302R 通过全基因组重测序，检测到307627个SNP 位点，其中有30239个位于mRNA序列中（Li et al.，2012b）；通过对苹果品种 ‘金冠’ 和 ‘红玉’ 进行全基因组重测序，在 ‘金冠’ 中得到了 2222816个 SNP 位点，在 ‘红玉’中得到了 4950346 个 SNP 位点，密度分别为 293 bp/SNP 和210 bp/SNP （孙瑞，2015）。SNP 变异从理论上来看主要包括转换、缺失、颠换和插入四种形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2∶1。并且SNP 在CG序列上出现的最为频繁，而且多是 C 转换为 T，主要原因为CG中的胞嘧啶常被甲基化，而后自发脱氨基形成胸腺嘧啶 T （Johnson and Told，2000；Mullikin et al.，2000）。从本实验中对 SNP转换/颠换频率统计结果来看，转换/颠换比为2.0，发生转换的频率为66.6%，发生颠换的频率为 33.4%，C/T 转换发生的频率最高为34.1%。这与前人研究的结论相符。通过重测序技术可以获得海量SNP 标记，利用这些标记构建高密度遗传连锁图谱为不同群体的进化分析，不同性状基因的遗传定位，分子标记辅助育种等提供有效信息。‘M.27’בM.116’ 的高密度遗传图谱是由306个SSR标记和2272个 SNP 标记组成，图谱密度达到了每 0.5 cM 一个标记 （Antanaviciute et al.，2012）。Khan 等（2012） 利用2875个分子标记构建了苹果的整合遗传图谱，其中包含了2033个 SNP 标记和 843 个 SSR 标记，总长为 1991.38 cM。Clark等 （2014） 利用3个不同的F1 杂交群体和SNP 芯片分型技术构建了包含1091个 SNP 标记的苹果品种 ‘Honeycrisp’ 的整合遗传图谱，标记间的平均距离为1.36 cM。基于高通量基因组重测序技术能够更加准确、全面的对测序物种进行全基因组水平上的位点进行评估，可以精确的完成单核苷酸多态性位点的检测，分子标记的开发，遗传图谱的构建，不同群体间的进化分析，与表型变异相关基因的挖掘以及快速定位等等。本研究通过运用全基因组重测序的方法对有着明显抗感性状分离的 ‘金冠’ 和 ‘富士’ 及其由 F1 代极端表型个体组成的抗感池进行全基因组范围内的遗传变异检测，共筛选得到 SNP位点3399950个，InDel位点573040个。通过对△SNP-index图谱的分析发现，在第15条染色体的2～5 Mb的区间内，△SNP-index显著的大于阈值，存在着明显的连锁不平衡，意味着该区域可能存在着抗炭疽菌叶枯病基因位点。这一结果与SSR标记所定位的抗炭疽菌叶枯病基因位点位置相吻合。SNP 广泛分布于基因组DNA中，且数量巨大。因为任何碱基均有可能发生变异，因此SNP 既有可能出现在基因的编码区，也有可能在基因的非编码区，或者两个基因之间的序列上。总的来说，位于基因内编码区的SNP 比较少，且该部分的 SNP 有可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此位于编码区 SNP 的研究更受关注。本试验对可能引起基因获得终止密码子、失去终止密码子、非同义突变、可变剪接的变异位点进行重点筛选，将其所在的基因作为候选基因。通过筛选共得到33个候选SNP 位点和29个候选基因。结合第三章SSR标记对炭疽叶枯病抗性基因的定位，最终锁定了 5 个候选基因： MDP0000686092、 MDP0000205432、 MDP0000120033、 MDP0000864010、MDP0000945764。锌指结构是一类在很多蛋白中存在的具有指状结构的模体，是具有识别特定碱基序列的一种转录因子结构。锌指的典型功能是作为互作的组件与核酸、蛋白质和小分子等多种物质相结合，参与多种细胞过程，如DNA的复制与修复、RNA 转录与翻译、物质代谢与信号转导、细胞的增殖与凋亡等 （Krishna et al，2003）。可变剪切 （Alternative splicing，AS） 是重要的转录后调控机制，在动物中对其在不同的生理以及病程条件下的可变剪切的调控作用研究的较多 （Garcia-Blanco et al.，2004；Nilsen and Graveley，2010）。据报道在拟南芥中超过 42%的外显子基因存在可变剪切现象（Filichkin et al.，2010）。在植物可变剪切数据库中有很大比例的 AS参与逆境响应基因的表达，这进一步强调了可变剪切在逆境响应中的重要作用 （Wang and Brendel，2006；Duque，2011）。在生物胁迫中，有许多试验证明AS参与植物的抵抗和防御机制。例如，在一些 R 基因中如番茄的N 基因，拟南芥的SNC1、 RPS4基因，发现可变剪切的存在 （Dinesh-Kumar and Baker，2000；Zhang and Gassmann，2003）。SR蛋白，丝氨酸/精氨酸富集剪切蛋白 （serine/arginine-rich proteins，SR protein） 是RNA绑定蛋白家族中功能和结构高度保守的一类因子，参与可变剪切过程。例如， AtSR30在高盐碱以及过氧逆境中被上调表达 （Tanabe et al.，2007）。SR在不同的环境条件下的表达量的差异说明了SR蛋白在逆境响应中的调控作用。基因MDP0000120033具有核酸绑定，锌离子结合分子功能，参与 RNA 剪切生物过程，调节基因产物的表达。具有CCHC型锌指结构和丝氨酸/精氨酸富集剪接因子，属于SR 基因家族 RSZ 亚家族基因。丝裂原活化蛋白激酶 MPK6 和MPK3在植物的防御反应中起着重要作用，而拟南芥基因 AtRSZ21 在体外试验中被发现能够被MPK6/MPK3磷酸化 （Feilner et al.，2005），这就意味着 AtRSZ21 也可能参与了植物的防御应答。Kumar 和 Kirti （2012） 报道了花生的一个属于 SR 亚家族基因 RSZ 蛋白基因AdRSZ21，在植物的超敏反应和抗逆反应中起着重要的作用。NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族是真菌病原体镰刀菌致病机制中的一个关键酶 （Srivastava et al.，2014）。细胞壁是植物细胞进行正常的生命活动不可缺少的重要组成部分。其不但在维持细胞形态、细胞间黏结、细胞壁的强度和调控细胞伸长等方面起着重要的作用，还参与了细胞的分化、抗病、细胞识别及信号传导等一系列生理、生化过程。细胞壁主要成分包含纤维素、半纤维素、果胶和少量的结构蛋白等。基因MDP0000864010属于依赖差向异构酶/脱氢酶家族，并且与鼠李糖合成酶Ⅰ （ RHMⅠ） 有较高的同源性。可能参与合成鼠李糖，而鼠李糖是细胞壁果胶多聚糖的重要组分之一。所以该候选基因有可能在细胞的组成层面增加个体的抗性。基因的相对表达量分析也表明，五个基因都不同程度的响应了病菌的诱导，是与抗炭疽菌叶枯病相关的候选基因。但是其参与抗病的机理和途径仍不清楚，深入的研究将继续展开。

主栽品种有八月鲜、扁匣榛、红壳、粉壳、大广眼、油潭本等。主栽品种有广眼、大乌圆、双孖木、粉壳、石硖、红核仔、乌龙岭、水南1号等。主栽品种有草铺种、福眼、白露、储良、立冬本。龙眼生长结果需充足日光：要求年平均气温18～26℃,最低温2～3℃,冬季12月至翌年1月要求有适当低温8～14℃,温度在0～2℃会遭受冻害使顶梢枯萎；3月平均气温较低，也难以成花。龙眼耐旱忌水浸，生长发育期间，要求有充足水分，年雨量1000～1200mm地区生长良好。龙眼对土壤适应能力强，除碱性土外的平地、冲积土以及山丘地，除碱性土外，沙壤土、红壤土、黏质土等各种土壤都能适应，瘠薄土壤宜增施有机肥或进行土壤改良。育苗一般有高压育苗和嫁接育苗两种。一般在2—8月均可进行，但以3—4月进行时发根良好，成功率高。操作方法是：选择生长良好的优良母株，在其上选2～4年生的健壮枝条进行环状剥皮，宽约4cm，刮净红色皮层至见白为度，7d以后，待剥口长出瘤状物用催根材料包扎，经过约100d以后待根长多后，再锯下假植。(1)砧木选用。共砧以及大乌圆、广眼等大核种子品种的实生苗。(2)嫁接方法。切接(含改良切接)、枝腹接、芽腹接、舌接。(3)嫁接时间。最好在每年的3—5月进行，嫁接后1个月可检查其成活与否，未成活者可进行补接，若已成活，则解绑，在10～15d后剪砧。一般选择土层深厚、疏松肥沃、排水方便的丘陵坡地建园。采用等高定点开坑或按等高线开垦成简易梯田后定点挖坑。龙眼种植前1～2个月要挖好种植坑，种植坑的规格为长1m、宽1m、深1m为好，挖坑时要将表土和底土分开堆放，定植前将土放回种植坑中，先放进杂草、绿肥，并撒上石灰与表土拌匀，再放入农家肥与松细土拌匀回至高出地面30cm。平地筑土堆，开浅穴定植。龙眼定植可分为春植和秋植。春植在3—4月进行，秋季在9—10月进行。一般采用的种植株行距为：行距5～6m、株距3～5m。种植株数平地为每667m2 20～35株，山地为每667m2 35～40株；也可进行矮化密植。栽植苗木应选择品种纯正、粗壮、直立的嫁接苗，以营养钵苗或者带土团的苗木为好。栽苗时在种植坑中心挖一个小坑，把苗放入坑中，种下回土以不盖嫁接节位为宜，轻压松紧适度。淋透定根水，并用稻草覆盖整个树盘。种后如果遇到干旱天气每隔2～3d要淋水1次，保持树盘湿润。下雨后要检查及时排去积水。结果树的施肥数量宜根据品种特性、树龄大小、树势强弱、果园土壤肥力状况、上年产量和当年的花果量多少等情况而定。周年施肥技术如下所述。(1)基肥。要求在1月上中旬施，株施麸肥0.25～0.5kg，磷肥1kg。同时，叶面喷施0.3%磷酸二氢钾和0.3%尿素溶液或根际淋施复合肥，促使花芽及时萌动。(2)壮花肥。一般在2月下旬至3月上旬花穗抽出后施；株施氯化钾0.3～0.4kg加复合肥0.3～0.4kg，麸肥0.25～0.5kg，对水或浅沟淋施，以促进花芽分化的数量和质量，提高抽穗率和增大花穗。(3)保花果肥。每年4月下旬至5月在谢花后至果实黄豆般大小时施下。株施腐熟人粪尿40kg加麸肥0.2～0.3kg，复合肥0.2～0.3kg，促进果实生长，减少生理落果每株施氮磷钾三元复合肥0.5kg。(4)促梢壮梢肥。一般于每年7—8月采果前后5d和9月下旬分两次施肥，结合灌水施速效肥，梢前以氮肥为主配合磷钾肥，恢复树势，促进采后第一次秋梢及时抽发并在9月下旬老熟、第二次秋梢在10月中旬抽发能在12月中旬老熟。根据种植地气候、树势和树龄的不同，通过采果前后的肥水管理和采果后的修剪，培养次年的结果母枝。防止植株在冬季抽生冬梢不能进行花芽分化导致次年无花或花量少。如只培养一次秋梢作结果母枝，结果母枝抽发期安排在9月下旬到10上旬。这种秋梢的结果母枝老熟后抽发冬梢可能性极小，次年抽穗率高；如要培养两次秋梢，并以第二次秋梢作次年主要的结果母枝。第一次秋梢抽发期安排在8月下旬到9月上旬，促使本次秋梢在9月下旬老熟，第二次秋梢抽发期安排在10月中下旬，促使二次秋梢在12月中旬老熟。(1)采果后适期培养次年结果母枝。(2)培养秋梢的追肥以速效性肥为主，并控制氮肥用量，加大钾肥用量，不宜施用大量的迟效有机肥，末次秋梢老熟后不再施入氮肥。(3)采后及时修剪，刺激新梢抽生。(4)壮旺树在11—12月对其一级枝和二级枝的树皮光滑处进行螺旋环割。环割宽度0.2～0.4cm，螺旋线间距为3～5cm。螺圈2～3个。(5)在末级秋梢老熟后沿树冠滴水线处深翻约4cm，锄断部分根系并晾根5～7d。(6)冬梢萌发时人工及时摘除。(7)喷药促控。在11—12月使用浓度200～400mg/L的乙烯利；浓度200～400mg/L的多效唑(注意只能间隔几年使用一次)，浓度800～1000mg/L的B9溶液等化学药剂控制。这些药剂喷雾一次能抑制枝梢生长期限约25d。也可试用花果灵、龙眼和荔枝杀梢促花素和龙眼丰产素等市场推广的控梢药剂。

柑橘砧木的选择是决定其品质好坏和产量高低的重要因素之一。我国柑橘产区一般以枳壳(又称枸橘，俗称臭橘子)砧木为主，是因为其具有亲和性好、矮化树体、早结丰产和抗寒性强等优点。根据柑橘砧木的不同生态习性，特别是砧木的抗逆性和对养分吸收能力的差异，生产中不同的柑橘栽培区域宜选用不同的砧木类型。枳壳虽是我国柑橘的主用砧木，但其不耐盐碱，土壤含盐量过高时，容易发生缺铁性的黄叶现象。故在沿海地区不宜选用枳壳，应选用抗盐力强的枸头橙作为砧木。山地种植时，面临着土壤条件差、养分淋失严重等问题，可选用根系分布深、养分吸收能力强的枳橙、红橘作为砧木。橘苗应选择纯正的品种。根据不同的区域选择砧木，以嫁接愈合良好，根系发达，具有一定的高度和粗度，一年生苗木干茎粗度达0.7cm以上，具2～3个分枝，适合本地气候和外界环境的砧木为宜。橘苗应无严重病虫害和检疫病虫害。橘园定植苗木也可用计划密植园中疏伐出的橘树，大苗定植，嫁接优良品种，使其迅速恢复树势，便于提早投产。(1)单芽腹接。嫁接部位在砧木苗的腹部，离地面10～15cm，接穗为单芽，不剪砧，这种方法称单芽腹接法。因其接穗的削法和形状不同分为两种，其接穗用通头单芽者称为单芽腹接；用芽苞片者称为芽苞腹接或芽片腹接。①接穗削取方法：通头单芽削取方法接穗采自春梢或秋梢，削取时将接穗倒持于左手，最宽且较平的一面紧贴左手食指，使要用的芽眼向上。在芽眼下方1～1.2cm处以45°角削断接穗，此削面称短削面。再翻转接穗180°，把宽平的一面朝上，芽眼向下，在芽眼背面上方下刀不伤芽眼，由浅至深削下皮层，深度恰好到形成层(黄白色)，此削面为长削面，要求削面平、直、光滑。然后再把接穗翻转180°，在芽眼上方0.2cm处以45°角斜削断接穗，把单芽削到盛有清水的碗内待接，4h内接完。因长削面超过芽上方，削成的芽称为通头芽。芽苞片削取方法从粗壮春梢或秋梢上取芽片，左手顺持接穗，刀口向内，将嫁接刀的后刃放于芽眼外侧的叶柄背面，以20°角沿叶痕向叶柄基部斜拉切一刀，深达木质部，取出刀后用刀在芽眼上方0.2cm处沿与枝条平行方向向下平削，当削过与第一刀的切口交叉处时，用右手大拇指将芽苞片压在刀片上，取下芽片放入水碗，接芽削面带少量木质部，基部呈楔形，芽片可用作切接和腹接。②砧木切口与嫁接：在砧木主干上方离地10～15cm处，选用东南方向，较平宽光滑处，刀紧贴主干向下推压纵切一刀，由浅至深，正好切到形成层，切口长度比接穗长削面稍长，将削下的切口皮层上方切掉1/3～1/2。芽苞腹接时，切口皮层还可形成“T”形。接合时，用刀尖挑开皮层，把接穗长削面朝里插入切口，接穗下方短削面与砧木底部接触，砧木、接穗的形成层相互对准、紧贴后，削起的砧木皮贴住接穗背面，用长15cm、宽0.8～1.0cm的薄膜条带紧扎接穗和砧木接口。春季和5—6月嫁接时可进行露芽捆扎，仅露出芽眼。嫁接过程中，注意保持接穗削面、砧木切口及放接穗的水要清洁，以免影响成活。单芽腹接一般在秋季进行，嫁接成活后，由于没有剪砧，当年不萌发，待翌年春季剪砧后接穗才萌发。(2)单芽切接。切接的接穗可用单芽或芽苞片，用芽苞片的称芽苞切接，用单芽的称单芽切接。切接成活后发芽快而整齐，苗木生长健壮，不剪砧，只能在春季应用。春季雨水充足地区，砧木应于嫁接前1～2天，离地面10～15cm处剪断，使多余的水分蒸发，以防接后接口处水分过多而影响成活。砧木切口方法如腹接法切口，以只切到形成层为宜，在砧木切口的上部将刀口朝一侧斜拉断砧木，断面为光滑斜面，切口在砧桩低的一侧。将接芽嵌入砧木及砧木切口，用塑料薄膜带缚扎，砧木顶部用方块聚乙烯薄膜将接芽及砧木包在内，形成“小室”，萌发后再剪破“小室”上端。(3)“T”形芽接法。将砧木洗净，用芽接刀横切，再垂直纵切一刀，成“T”字形。然后用尾端骨片沿垂直口轻轻将树皮撬开，在芽上方0.5cm处横切一刀，深至木质部，再在芽下1cm处斜切与前刀口交叉处。将芽取下，用骨片挑除木质部，然后插入“T”字形切口撬开的皮层内，使芽穗与砧木两者形成层紧贴后绑扎。(1)清砧。一般情况下一株苗木选择3～5个健壮的大枝进行嫁接，若树冠较大且枝条较粗，每个大枝可选2个副主枝嫁接，即在二级分枝上嫁接。将不接芽的枝梢剪除，疏删扰乱树形的交叉枝、平行枝、重叠枝、丛生枝、过密枝、内膛弱枝及分枝部位过低的主枝。植株有2个以上主干的只保留1个，将多余的剪除。通过短截达到初步整形的目的。(2)合理分布嫁接点。采用低位分层少芽换接，由下而上分布嫁接点，从选定的骨干枝下部开始嫁接，每个嫁接点相距30～40cm，方位错开，不接顺风(即接芽分布在一个方位)和对口芽，也不要接一口双芽。一般一株小树或一个大枝嫁接2～4层，主干过高应在离地面50cm左右补接一芽(萌发后培养为主枝)。嫁接高度依树龄而定，一般5年以内的苗木为1m以内，10年以内的苗木为1.2m以内，15年以内的苗木为1.5m以内，通常主干最下部位的接穗高度不得超过1.5m。(3)嫁接。嫁接的方法根据树势的不同而有所不同，一般采用单芽腹接(即每枝段一芽)，若接穗较粗或为圆形可用小芽(即芽片)腹接。中间砧树势一般，选择腹接法(即成活后剪砧)，树势强旺，可选择切接，更有利于恢复树势。(1)检查成活率和补接。春季嫁接的50天左右检査成活率；秋季嫁接的20天以后检查成活率。检査方法：先将捆绑的薄膜解开，经过风吹日晒一个星期，判断接芽成活与否。成活者，接芽新鲜，芽眼饱满，接芽与砧木相互愈合，唯独叶柄发黄，轻轻一拢，叶柄即刻脱落。未接活者接穗发黄、干枯或霉烂。成活率在80%以上的可以不补接，低于80%的应进行补接。(2)解绑与锯砧。当年秋季嫁接芽或接穗，应于翌年春季萌芽，在萌芽时，应及时解绑(或在芽背面划开薄膜)，同时，进行锯砧。春季嫁接的不能1次全部解绑，应采取挑破芽眼上薄膜的方法，即在离接芽0.5cm处的薄膜上划开0.5～1cm的口子，并用小刀挑开薄膜露出芽眼，提高芽眼对外界环境的适应性，接芽下半部捆扎的薄膜仍继续全部保留，待接芽第一次抽梢停止生长后，再将薄膜全部解除。春季嫁接的剪砧，也在挑芽眼的同时进行。无论是春季嫁接的，还是秋季嫁接的，剪砧都应分两次进行，第一次在接芽上方30cm处剪砧(即保留砧桩)，剪面要平整、光滑(伤口愈合速度快)，以防剪砧伤口过大而致接芽枯死。第二次剪砧，在接芽第一次抽梢自剪后或有小指粗时进行(此时锯掉砧桩)。用桐油涂刷于剪砧后的伤口，以防水分过分蒸发和发生流胶病，秋季嫁接的苗木，树势比较弱，应采用相应的防寒防冻措施，即对主干进行刷白处理。(3)抹除砧木萌蘗。在嫁接或锯砧时，砧木嫁接部位以下有些潜伏芽会萌发生出，应及时抹除，随见随除，一般3～5天进行1次。(4)摘心与疏梢。春梢长度达15～20cm或8片叶时摘心，夏梢长度达20～25cm时摘心，有利于秋季结果母枝的抽梢。秋梢只对骨干枝的延长枝进行短截或摘心，其余的一律缓放(即不摘心，不短截)，以利早结果。过密分枝、交叉枝或丛生枝应适当疏除少许，避免消耗过多的养分，不利于结果，一般丛生枝按三疏一、五疏二的原则把握疏梢程度。(5)设立支柱。嫁接时，特别是枝接时，由于伤口还未愈合，嫁接部位比较脆弱，应将接穗及所抽新梢捆缚在支柱上，防止被强风吹折。(6)病虫防治和肥水管理。预防为主，综合防治。刚高接的苗木树势相对比较弱，应及时预防螨类、蚧类、橘蚜、潜叶蛾、粉虱和凤蝶等对柑橘的为害，以促进植株恢复和生长。(1)苗木。假植苗使用一年生嫁接苗，要求苗高35～45cm，茎粗0.8～1cm。苗相好，叶色健康，不带病虫。(2)营养袋。营养袋材料为黑色耐氧化聚乙烯膜，厚度为3丝。规格为高45cm，口径18cm。袋底和侧面设8～10个口径为0.5cm的滤水孔。(3)营养土。营养土基质为富含有机质(不低于3%)的肥沃园田土和塘泥，每立方米基质掺入0.1m3细河沙、100kg腐熟的人畜粪便、30kg经过充分腐熟的饼肥、4kg柑橘专用肥、150g硫酸亚铁和150g硫酸锌。以上材料混合均匀后，再用粉碎机粉碎细化，最后用500倍多菌灵消毒，堆沤15天后即可使用。(4)假植圃。假植圃一般设在基地的中心区域。假植圃对土壤的要求不高，只要是平地，排灌条件良好即可。假植圃内设若干小区，小区之间用道路和排灌渠道隔开，小区一般为长方形，长度以40m为宜，宽度一般不超过20m。(1)假植的时间。假植一般以11月和2月为宜。(2)起苗及运输。起苗一般在阴天进行，起苗前苗圃灌足水，起苗时尽量多保留须根。苗圃与假植圃邻近，一般在起苗的同时进行假植，不让苗木离土过夜。长距离运输的苗木，起苗的同时用浓泥浆浆根，并用农膜包根，存放在阴凉处。每次起运地苗木在运输过程中一定要做到全封闭，严禁风吹雨淋。(3)装袋及摆放。苗木进袋时要做到苗正根直、摆放整齐。小苗进袋的技术要求与大田植苗要求相同。假植圃中一般每行摆放4袋，行宽80cm，行间距(走道)60cm。(4)定根水。苗袋摆放好后立即浇足浇透定根水，定根水的标准是营养袋底孔出水。苗木进袋后遇高温，应连续浇水3～4次，防止苗木脱水枯死。定根水也不宜过量，否则，会造成营养的流失。有条件的可用一层湿木屑覆盖营养袋表层土，可以起到保水防草的作用。(5)定干。苗木进袋后要进行适当的修剪。一是剪除苗木40cm以上的中心干，促发苗木在假植期间抽发侧枝，增加分枝级数和末级梢量；二是剪除苗木的病虫枝、萎蔫枝叶，提高苗木成活率。(6)有检疫性病虫害的小区，宜在假植区罩上塑料网。(1)肥料。营养袋假植的苗木，由于营养土养分充足，基本可以满足苗木抽发春梢和夏梢的营养需求，因此，在7月前一般不用施肥。8月苗木抽发早秋梢前应补充1次肥料，肥料可施用速效氮肥。早秋梢生长结束后停止施肥。(2)水分。营养袋假植的苗木对水分的要求比较高，因为营养袋隔断了营养土与地面的联系，遇高温、干旱营养土更容易枯水，而袋内积水则会导致苗木烂根。因此，要根据天气情况及时补充水分和排出假植圃内的积水。(3)除草。在苗木抽生春、夏梢期间，由于营养袋营养充足，大量杂草也会同时发生，及时除草是这一阶段苗木管理的主要工作，否则，会影响到苗木的正常生长。营养袋除草要做到除早除小，人工拔除营养袋内失控大株杂草，容易伤及苗木根系，影响苗木生长。假植圃走道杂草可使用除草剂，营养袋除草严禁使用除草剂。(4)病虫防治。进圃假植的苗木要经过严格的检疫，防止携带检疫性病虫。假植圃苗木病虫防治的重点是恶性叶甲、红黄蜘蛛、黑刺粉虱和潜叶蛾，其中，春季的叶甲和秋季的潜叶蛾是重中之重。假植圃施药以无公害的农药为主，不能使用高毒高残留农药。(1)出圃苗木规格。营养袋假植苗木出圃规格为苗高60cm以上，茎粗1.2cm以上，有3～4个明显主枝，末级梢不少于40条，根系完整，细根发达。同时，做好出圃苗木的砧木、接穗的信息核对及出圃时间和去向的登记。(2)定植时间。经过营养袋假植苗木，在营养袋中生长的时间不宜超过6个月，最好在春梢老熟后即行移栽，否则，会造成主根弯曲，影响苗木的继续生长。营养袋假植的苗木出圃定植的时间不受季节、天气的影响，只要苗木达到定植规格，随时可以进园定植，且苗木的成活率、生长势均不会受到任何影响。(3)运输及定植。苗木运输过程中要尽量保证营养袋完整，根系不受伤害。定植时先将容器苗运放到定植点，栽时轻拍育苗袋四周，使苗木带土与袋分离。再一手抓住苗木主干的基部，另一手按住育苗袋，将柑橘苗带土轻轻拉出。栽苗时要疏理根群，使根系展开，扶正苗木，再填上细土夯实，不深不浅，土齐根茎。栽后整理树盘，浇足定根水，当风面最好立上支柱，防止主干摇动，确保充分成活。

苗木是果树生产的基础。苗木的质量直接影响果树的结果时期、果实的品质及产量、果树的适应性及抵抗病虫害的能力，影响经济收益。凡用种子繁殖的苗木都称为实生苗。实生苗繁殖简单、繁殖系数高，多数是用于培育嫁接苗的砧木，是果树嫁接育苗的基础。1.苹果(1)海棠果。抗旱、抗寒、抗涝，耐盐碱，嫁接亲和力强。（2）山丁子。抗寒、抗旱，耐瘠薄，但不耐盐碱，抗旱力不如海棠果。（3）楸子。抗旱、抗寒、抗涝，耐盐碱，对苹果绵蚜和根头癌病有抵抗能力。（4）新疆野苹果。抗旱、抗寒，耐盐碱，生长迅速，树体高大。2.常用矮化砧木（1）红花（沙果）。类型较多，结果早。（2）GM256。矮化中间砧木，抗寒，结果早。（3）M26。从英国引进的矮化砧木，固堤性好，抗白粉病、抗寒、抗旱性差，结果早，果个大。（4）MM106。从英国引进的半矮化砧木，抗根绵蚜、固堤性好，耐瘠薄，抗寒，可以进行硬枝扦插，结果早。3.梨（1）杜梨。平原地区梨的主要砧木，根系发达，耐旱，耐盐碱，嫁接亲和力强，结果早，丰产，寿命长。适应辽宁、内蒙古、河北、山东等地。（2）秋子梨。东北、华北地区的主要砧木，抗寒性极强，抗腐烂病，不抗盐碱，丰产，寿命长。（3）麻梨。西北地区常用砧木，抗寒、抗旱，抗盐碱，生长势强。4.葡萄（1）山葡萄。极具抗寒力，嫁接亲和力好，扦插较难生根。（2）贝达。抗寒，结果早，嫁接亲和力好，扦插易生根。5.桃（1）山桃。适于较干旱的山地，如东北、华北、西北。抗寒、抗旱，抗盐碱，较耐贫瘠，嫁接亲和力强。（2）毛桃。应用广泛的砧木。比较抗旱、耐寒，耐盐碱，嫁接亲和力强，生长快，结果早。（3）毛樱桃。抗寒力强、抗旱，嫁接亲和力较强，有矮化作用，结果早。6.李（1）山桃。耐盐碱、耐瘠薄，抗旱、抗寒，与中国李嫁接亲和力强。（2）毛樱桃。抗寒、抗旱，结果早，有矮化作用。7.杏杏与中国李嫁接容易成活，有的品种不完全亲和，结果早，但抗涝性差。（1）山杏。适应东北、华北、西北地区，主要是抗寒、抗旱，耐瘠薄，嫁接亲和力好。（2）山桃。较抗寒、抗旱，与杏嫁接亲和力好。8.樱桃（1）山樱桃。较抗寒，生长旺盛，嫁接亲和力好。（2）中国樱桃。包括毛樱桃、莱阳矮樱桃和毛把酸3个类型。适应性较广，抗寒，耐旱能力弱，结果早，嫁接亲和力强。9.柿柿的主要砧木为君迁子。适应性强，较抗寒，抗旱，耐盐碱，与柿嫁接亲和力好。1.种子的采集一般在母本园内，也可在野生母林中选择品种纯正、无病虫害、充分成熟、籽粒饱满、无混杂的种子进行采集。采收后要根据果实特点取种，果肉无利用价值的，多采用堆沤取种；果肉有利用价值的，结合加工过程取种。但需要注意的是，堆沤取种的堆温应保持25～30℃，加工过程取种防止高温(45℃以上)、强酸、强碱或机械损伤，破坏种子生命力。2.种子的储藏方法（1）干藏法。分为普通干藏法和密封干藏法两种。生产用种子采用干藏法。普通干藏法是指将经过干燥处理的种子，如苹果、梨、桃、山楂、枣、柿等装入麻袋、布袋等，然后放入通风、干燥、经过消毒的室内储藏。密封干藏法用于保护一些珍贵种子，是指将种子干燥到安全含水量以后，装入容器并放入适量吸湿剂，密封，在低温条件下储藏。容器一般是已消毒的玻璃瓶、铅桶或铁桶等。（2）湿藏法。是指将种子，如板栗、柑橘、樱桃等储藏在室温环境条件下，在储藏期间使种子保持湿润状态。此方法常与层积处理同时进行。1.种子质量检验种子净度是指被检测样品中完整无缺、形状发育正常的种子重量占被测样品总重量的百分比。净度是测定种子播种质量的重要指标之一，是科学确定播种量的主要依据。种子净度越高，说明种子质量越高，其公式为种子总重量包括纯净种子、废种子和其他杂物。2.种子生活力测定（1）染色法。常用染色剂有靛蓝胭脂红、氯化三苯基四氮唑、5%红墨水等。将一定数量的种子浸入清水中12～24h,种皮变柔软后，剥去种皮，置于靛蓝染色剂或红墨水中1～2h，最后用清水漂洗。子叶和种胚不着色者或稍有浅斑者为好种子，着色者则为失去生活力的种子。若用氯化三苯基四氮唑染色，结果则正好相反。（2）发芽法。将一定数量的种子置于衬有滤纸、湿纱布或清洁河沙的容器中，于20～25℃下催芽3～5d。依据发芽的数量鉴别种子的质量。层积处理是解除种子休眠的一种方法，即将种子埋在湿沙中，温度为1～10℃，经过1～3个月的低温处理就能有效地解除种子休眠。种子层积、主要果树砧木种子层积日数及播种量分别见图2-1和表2-1。图2-1 种子层积处理过程名称采收时间层积天数（天）每千克粒数（万粒）播种量（kg/hm2）山丁子9—10月30～9015.00～22.0015.0～22.5海棠果9—10月40～554.00～6.0015.0～22.5楸子9—10月40～604.00～6.0015.0～22.5沙果7—8月60～804.4815.0～34.0杜梨9—10月60～802.80～7.0015～37.5山桃、毛桃7—8月80～100（0.04～0.06）/（0.02～0.04）450～750杏6—7月90～1000.03～0.04400～600枣9月60～1000.2～0.26112.5～150山楂8—11月200～3001.3～1.8112.5～225山葡萄8月90～1102.6～3.022.5～37.5板栗9—10月100～1600.01～0.031500～2625表2-1 主要果树砧木种子层积日数及播种量一般要进行土地平整，捡除植物残体，作畦，施肥。土壤要求富含熟化的有机质，禁用盐碱土和生土。每亩(1亩≈667m2，15亩=1公顷，全书同)施用腐熟有机肥4500kg左右，然后进行翻耕、浇水。还要进行土壤消毒，主要目的是消灭土壤中残存的病菌，常用的药剂有硫酸亚铁(黑矾)、五氯硝基苯混合剂。土壤灭虫的常用药剂有西维因和辛硫磷。根据种子特性和当地的土壤、气候条件决定采用春播还是秋播。我国北部地区多为春播，春播时期一般为3月中旬至4月中旬。秋播时期一般为10月下旬至11月中旬，在土壤结冻前完成。播种方法有撒播、条播和点播三种。山桃、桃等大颗粒种子一般采用点播。如播种后覆盖地膜苗木生长健壮、整齐，田间管理方便。山丁子、海棠、杜梨等小颗粒种子一般用条播。为了确保出苗，播种后应覆盖地膜，出苗后进行间苗移栽，保障行内苗木的株距一致。这种播种方式的用种量较大。将植株的一段枝或芽接到另一植株的枝干或根上，使之愈合形成一个新植株的过程称为嫁接，这样得到的苗木称为嫁接苗。嫁接原理是嫁接后砧穗紧密结合，形成层部分形成愈伤组织，使二者生长在一起成为一个有机统一体。嫁接亲和力，嫁接技术，温湿度、光照、空气等环境条件，嫁接时间，嫁接方法及砧木和接穗的质量都直接影响嫁接苗的成活。春、夏、秋季均可进行室外嫁接，冬季一般在室内嫁接。落叶果树的枝接一般以春季(3—4月)嫁接为主，芽接主要在夏季(5—6月)、秋季(8—9月)进行。生产上用的嫁接方法主要为芽接和枝接。芽接是用一个芽片做接穗的嫁接方法，枝接是将带有一个或数个芽的枝条做接穗的嫁接方法。芽接适于在生长季节进行，具有操作简单、速度快、容易愈合、成活率高的特点。这里介绍两种常用芽接方法，即“T”字芽接和嵌芽接。1.“T”字芽接“T”字芽接(图2-2)是果树孕育苗中应用最多的一种方法，要求砧木和接穗皮层均易剥离，只能在离皮期进行。图2-2　“T”字芽接先削接芽，在芽的上方0.5cm处横向环切，深达木质部，然后从芽的下方1.5cm处向上斜削一刀，与芽上横刀口相交，掰下芽片(不带木质)。然后，在砧木距地5cm处选取光滑部位，切一个“T”字形口，插入接芽，用塑料条绑紧。此方法适用于苹果、梨、桃、山楂等树种。2.嵌芽接嵌芽接(图2-3)是果树育苗中普遍采用的方法，特别是对皮层较薄的树种较为适用。先在接穗芽的下方，距芽0.5cm左右向下斜削一刀，深达接穗直径的1/3左右，再从芽上1.5cm左右向下斜削一刀，与芽下切口相接，取下一盾形带木质芽片。在砧木上选择一个光滑位置，削一个与接芽同样形状、稍长于或等于芽片的切口。此方法适用于柿、樱桃、板栗、李、杏等树种。图2-3 嵌芽接除上述两种常用芽接方法以外，还有套管芽接和方块形芽接等方法。枝接可分为硬枝嫁接和绿枝嫁接。硬枝嫁接多在春季旺盛生长前进行，绿枝嫁接在生长季进行。下面介绍枝接常用的三种方法，即劈接、切接和腹接。1.劈接劈接(图2-4)适用于砧木较粗或与接穗等粗的枝接。先将接穗削成楔形，两个削面长度为3cm左右，保留一两个好芽，砧木在距地面5～8cm处剪断。削面一定要平直、光滑，横断面要平滑。图2-4 劈接2.切接切接(图2-5)适用于砧木较粗的嫁接，与劈接相似。图2-5 切接3.腹接腹接(图2-6)一般用于春季苗圃补接。图2-6 腹芽接嫁接方法是先把穗削成楔形，切口一面较长，长约3.5cm,嫁接时靠里侧。另一面切口较短，长约3cm,嫁接时靠外侧。插入接穗，将砧木和接穗的形成层对齐，且将接穗大削面上部稍微露出砧木横切口。将果树部分营养器官插入土壤(基质)中，使其生根、萌芽、抽枝，成为新的植株的方法称为扦插。用这种方法繁殖的苗木叫扦插苗。扦插可在露地进行，也可在保护地进行。扦插根据材料不同可分为枝插和根插。枝插根据生长季节分为硬枝扦插和嫩枝扦插，见图2-7。图2-7 枝插硬枝扦插是指用充分木质化的一年生枝条作插条的扦插方法。生产中常用此方法的季节以春季为主，以葡萄应用最为广泛。（1）在晚秋或初冬结合冬剪进行插条的采集。（2）插条要求芽饱满、无病虫害。（3）插条采回后剪成50cm左右的枝段，每50～100枝为一捆，标明品种，进行沟藏或窖藏，见图2-8。（4）第二年春插时将插条剪成15cm左右的枝段（含2～3个饱满芽）。（5）当土温稳定在10℃以上时即可扦插。图2-8 插条储藏嫩枝扦插又名绿枝扦插，是指利用带叶的当年生半木质化的新梢在生长期进行扦插的方法。（1）嫩枝扦插主要在生长季进行，过晚影响新梢成熟。（2）扦插成活与空气和土壤湿度有关，把采后的插条剪成15cm左右的枝段，保留新梢上部1～2片叶。根插是指用根段进行扦插的方法。根段以0.3～1.5cm为宜，剪成5～10cm,上口平剪，下口斜剪。可冬藏春插，也可春季随剪随插。压条繁殖是指在枝蔓不与母株分离的情况下，将枝蔓压入土中，使其压入部分生根，再与母株分离形成独立植株。常用的压条方法有水平压条、直立压条、空中压条、曲枝压条。1.水平压条水平压条(图2-9)又称连续压条，是指将要繁殖的枝条截去过长部分，春季时在树旁挖掘约5cm浅沟，将枝条水平压入浅沟内，用枝杈固定，使其生根和发梢，随着新梢的伸长加深覆土，及时抹去枝条基部强旺萌蘖，秋后剪离分植。葡萄、苹果矮化砧、紫藤、蔓越橘、蔓性蔷薇等常用此法繁殖。图2-9 水平压条2.直立压条直立压条(图2-10)是指早春萌芽前，对母株进行平茬或截干，促其萌发多个新梢，待新梢长到30cm以上时，进行一次培土，随着新梢的增高再进行第二次培土。两次总高度为30cm。一段时间后新梢基部产生不定根。由此可以采用新梢基部环剥或者环割方法，促其生根，于休眠期切离母体。图2-10 直立压条3.空中压条空中压条(图2-11)是指选择健壮的1～3年生枝条，在其基部5～6cm处纵刻伤或环剥，伤口处涂抹生根调节剂或生根粉，再用塑料薄膜卷成筒状或者用竹筒套在刻伤部位，将塑料袋的下端绑紧，把疏松、肥沃的土壤或者苔藓蛭石等保鲜材料装入袋中，适量浇水，将上端绑紧。以后进行检查、浇水，一般2～3个月即可长出大量新根。图2-11 空中压条4.曲枝压条曲枝压条(图2-12)又称低压法。凡枝条柔软的花木，如葡萄、无花果、山莓、夹竹桃、桂花、迎春、茉莉等可采用曲枝压条。它是指将植株基部的枝条弯成弧形，将圆弧部分埋入土中，再将土压实或埋土上压一块砖头或石块，以免枝条生根前弹出土外。埋入土中的部分也要刻伤或作环状剥皮，充分生根后剪离母株。图2-12 曲枝压条分株繁殖是指利用植株的营养器官进行分离或分割成若干个独立生存植株的方法。常用分株方法有根蘖分株、匍匐茎分株、根状茎分株。1.根蘖分株根蘖分株是指利用树种易发生根蘖的特性，于成龄果园，春季或秋季在树冠外围挖沟断根，将树体部分1～2cm的根水平切断后填回土壤，切离母体的水平根即可萌生新梢。秋后将新的根蘖苗刨出，进行集中培养，即可培育出合格的果苗或砧木苗。北方果树中的枣、山楂、山丁子、海棠、杜梨等易发生根蘖。2.匍匐茎分株匍匍茎分株是指当前草莓生产中的主要方法之一，可建立专一的良种繁育苗圃。苗种栽植按株距15～20cm、行距30～60cm定植。疏掉母株所有花序，促进匍匐茎生成。苗圃地要及时松土、浇水，匍匐茎生根之后及时压土。一般母株年龄不宜超过3年，3年后进行更新，另换地重建母本园。3.根状茎分株草莓浆果采收后，当地上部有新叶抽出、地下部分有新根生长时，整株挖出，将1～2年生的根状茎分枝逐个分离成为单株，即可定植。组织培养是指通过无菌操作，将植物体的器官、组织或细胞接种于人工配制的培养基上，在一定的温度和光照条件下，使之生长发育为完整植株的方法。组织培养的材料包括器官、愈伤组织、细胞、原生质体或胚胎。果树上主要利用组织培养繁殖无病毒苗。确切地说，“无病毒”只防治了一些对果树生长结果为害较大的主要病毒病，并非绝对的无病毒，习惯上称这样的苗木为无病毒苗。对苗木生产基地进行功能分区，其目的在于合理利用圃地面积，便于生产管理和作业实施，提高生产效益。首先要进行实地测量，将生产用地和辅助用地按一定比例描绘在图纸上，要标明各育苗区的所用设施的平面轮廓。同时要注明生产用地中各种植区的面积、培育的果树苗木种类及数量等，同时要考虑苗木的移栽、检验、假植、包装、贮藏和运输等相关环节的安排。首先要做好调研工作，准确把握苗木生产基地自身的栽培技术水平、种源、设备、人力、物力、财力、自身的产品质量、在市场中的地位等背景资料；要依据当地的土壤状况、气候变化规律和农业经济发展水平等条件，因地制宜地发展适销对路的果树苗木，并确定适宜的生产方式。其次要根据资金周转、土地状况及当地果树发展需求、种类、数量等进行统筹规划，合理安排。1.制订合理的生产计划包括生产进度安排、时间安排以及一系列技术规范与要求等，并要考虑主要的生产程序和生产过程中可能存在的不利因素等。2.生产计划的执行和实施生产计划制订后，关键是执行和组织实施。要把计划和任务层层落实，同时要求苗木生产基地各基层单位要做好各个环节的作业计划，并要掌握计划执行的进度，确保苗木生产各个环节的顺利进行，按时、按质、按量完成苗木生产任务，提高苗圃的生产经营水平和经济效益。3.做好生产记录苗木生产过程中应有专人负责作生产记录，要及时准确记录各个环节和主要生产过程，有助于积累经验，为下周期生产奠定良好基础。记录主要包括如下内容。(1)栽培过程记录。包括各项操作过程记录和环境因素记录。①操作过程记录。主要记录如种子处理、播种、间苗、移栽、嫁接、接后管理等各个环节的具体时间、操作要点、生产效果、劳动力预算等。②环境因素记录。包括生产地点的温度、光照、水分、土壤、基质、病虫害发生等情况，特别是保护地设施育苗中环境因素如何调节等。(2)产品成长记录。主要记录果树苗木的生长表现和物候特征，如苗高、胸径、萌芽、抽枝等生长状况记录。至少每周或半月评估一次苗木生长发育情况，并做好详细记录。(3)产出和投入记录。指投入和产出(收入)的记录。通过产投记录分析，可发现、评估并纠正生产中的失误，并可严格实施苗圃经营的程序。营销策划是指巧妙的设计和策略。其基本思路是将企业现有的经营要素按新的思路重新组合，实现新的经营目标的营销活动。营销策划的构成要素主要有如下内容。1.明确目标企业或苗木生产单位要设定战略性、明确性或方向性目标。2.丰富信息要有丰富的信息资源，可通过网络、广告、展会等形式，收集和积累相关的信息资料。尽量做到别人不知我们知、别人无法利用我们可利用、别人没有意识到我们却有超前意识。3.创意和理念创意和理念是营销策划的灵魂，创意的水平决定着企业策划的质量和营销的前景。要始终体现发展企业的思想和核心理念。4.控制意识在落实企业的创意和理念过程中，要客观分析企业当前所面临的困难和条件，控制好苗木从生产到销售的各个环节，保证企业的创意和效益能如期实现。销售渠道是指果树苗木产品从生产到消费者手中所经过的渠道。1.直接销售直接销售是从苗圃将自己生产的果树苗木直接出售给生产用户，其间不经过任何中间商，实行产销合一的经营方式。2.间接销售是在销售渠道中有中间商参与，商品所有权至少要转移两次或两次以上。其优点是有利于开拓市场，且苗木生产基地不从事产品经销，能集中人力、物力和财力组织好产品生产。其缺点是销售渠道较长，商品流转时间长，对果树苗木来说，势必要增加流通费用，提高苗木价格，易造成产销脱节。促销是指苗木生产基地通过各种手段或方法，向消费者宣传本单位果树苗木产品的种类、品种、价格、服务等，有助于树立良好的企业形象和文化，促使消费者产生购买的动机和行为。苗木促销的方法主要有：参加各地举办的苗木展览会、苗木信息研讨会等；利用网络或电话等做好广告宣传；优化售前、售中和售后服务。苗木产品的定价，有其科学性和艺术性。合理的定价方法和合适的价格是苗木生产单位在激烈的市场竞争中立于不败之地的关键之一。通常苗木的价格是根据其生产成本和预先设定的目标利润及税率等因素决定的，计算公式为：果树苗木的销售价格一般采用市场价，买卖双方可以自由协商制定，同时还受到市场供需情况、买卖双方的心理、苗木质量、购买能力等因素的影响，所以苗木生产或经营单位在市场营销活动中，可灵活运用价格策略，合理制定自身产品的价格，以取得较大的经济利益。技术管理是指对苗木生产、包装、贮存等各项技术的科学组织与管理。加强技术管理有利于建立良好的生产秩序，提高本单位或行业的技术水平，扩大苗木种类和品种，提高苗木产量和品质，节约能耗，降低产品成本等。1.建立健全技术管理体系技术管理体系包括技术规范和技术规程，这是进行技术管理、安全管理和质量管理的依据和基础，是标准化生产的重要内容。(1)技术规范。是对各类苗木的质量、规格及其检验方法等作出的技术规定，是企业单位和个人在生产经营活动中行动统一的技术准则，可分为国家标准、地区标准、部门标准及企业标准。(2)制定技术规程的目的。技术规程是为了保证达到技术规范，对生产过程、操作方法以及工具设备的使用、维修、技术安全等方面所做的技术规定，苗圃可以根据自身的具体条件，自行制定和执行。2.注意事项制定技术规范和技术规程应注意以下三方面。(1)要以国家对果树苗木生产的规定和政策、技术标准为依据，同时要因地制宜地结合当地特点和地区操作方法、操作习惯等。(2)要对国内外先进技术的成就和经验结合自身和现有条件加以合理利用，防止盲目拔高或降低标准。(3)要广泛征求多方意见，并结合生产实践多次试行、总结修改后方可批准执行。在执行过程中应随着技术经济的发展及时进行修订，使之不断完善，确保技术规范、规程既严格又可操作性强。生产实践中果树苗木行业的质量管理主要有以下方面。(1)要依据国家标准和行业标准执行果树苗木产品质量检验，进行质量调查分析评价，建立质量保证体系。其次要建立并执行各项质量管理制度。企业或生产单位要实行质量责任制，要设专人负责质量管理工作。(2)要进行全面质量教育，帮助企业领导、技术人员和员工树立质量意识，要开展技术培训、技术考核、技术竞赛等各种有利于提高企业效益和长久发展的活动，鼓励职工钻研技术，提高技术水平。(3)要实行综合质量管理，把好各个生产阶段和每一个环节的技术质量关。做好质量信息反馈工作，积极听取消费者意见，及时反馈市场信息，改进和完善企业质量管理制度。1.科技情报工作的主要内容及时搜集、整理、检索、储存国内外本行业或相关行业的科技资料、信息，为生产、科研、技术改革提供有价值的资料及信息。2.果树苗圃技术档案工作是对苗圃生产和经营活动真实记录的整理与保管。目的是通过不断地记录、整理分析苗圃的使用、苗木生长发育、育苗技术措施的实施情况和人力、物力、财力的投入及综合效果等，掌握苗木生产规律，总结苗木生产技术经验，不断探索苗圃经营管理的合理可行的科学方法，不断提高苗圃的生产经营和管理水平。