柑橘砧木的选择是决定其品质好坏和产量高低的重要因素之一。我国柑橘产区一般以枳壳(又称枸橘，俗称臭橘子)砧木为主，是因为其具有亲和性好、矮化树体、早结丰产和抗寒性强等优点。根据柑橘砧木的不同生态习性，特别是砧木的抗逆性和对养分吸收能力的差异，生产中不同的柑橘栽培区域宜选用不同的砧木类型。枳壳虽是我国柑橘的主用砧木，但其不耐盐碱，土壤含盐量过高时，容易发生缺铁性的黄叶现象。故在沿海地区不宜选用枳壳，应选用抗盐力强的枸头橙作为砧木。山地种植时，面临着土壤条件差、养分淋失严重等问题，可选用根系分布深、养分吸收能力强的枳橙、红橘作为砧木。橘苗应选择纯正的品种。根据不同的区域选择砧木，以嫁接愈合良好，根系发达，具有一定的高度和粗度，一年生苗木干茎粗度达0.7cm以上，具2～3个分枝，适合本地气候和外界环境的砧木为宜。橘苗应无严重病虫害和检疫病虫害。橘园定植苗木也可用计划密植园中疏伐出的橘树，大苗定植，嫁接优良品种，使其迅速恢复树势，便于提早投产。(1)单芽腹接。嫁接部位在砧木苗的腹部，离地面10～15cm，接穗为单芽，不剪砧，这种方法称单芽腹接法。因其接穗的削法和形状不同分为两种，其接穗用通头单芽者称为单芽腹接；用芽苞片者称为芽苞腹接或芽片腹接。①接穗削取方法：通头单芽削取方法接穗采自春梢或秋梢，削取时将接穗倒持于左手，最宽且较平的一面紧贴左手食指，使要用的芽眼向上。在芽眼下方1～1.2cm处以45°角削断接穗，此削面称短削面。再翻转接穗180°，把宽平的一面朝上，芽眼向下，在芽眼背面上方下刀不伤芽眼，由浅至深削下皮层，深度恰好到形成层(黄白色)，此削面为长削面，要求削面平、直、光滑。然后再把接穗翻转180°，在芽眼上方0.2cm处以45°角斜削断接穗，把单芽削到盛有清水的碗内待接，4h内接完。因长削面超过芽上方，削成的芽称为通头芽。芽苞片削取方法从粗壮春梢或秋梢上取芽片，左手顺持接穗，刀口向内，将嫁接刀的后刃放于芽眼外侧的叶柄背面，以20°角沿叶痕向叶柄基部斜拉切一刀，深达木质部，取出刀后用刀在芽眼上方0.2cm处沿与枝条平行方向向下平削，当削过与第一刀的切口交叉处时，用右手大拇指将芽苞片压在刀片上，取下芽片放入水碗，接芽削面带少量木质部，基部呈楔形，芽片可用作切接和腹接。②砧木切口与嫁接：在砧木主干上方离地10～15cm处，选用东南方向，较平宽光滑处，刀紧贴主干向下推压纵切一刀，由浅至深，正好切到形成层，切口长度比接穗长削面稍长，将削下的切口皮层上方切掉1/3～1/2。芽苞腹接时，切口皮层还可形成“T”形。接合时，用刀尖挑开皮层，把接穗长削面朝里插入切口，接穗下方短削面与砧木底部接触，砧木、接穗的形成层相互对准、紧贴后，削起的砧木皮贴住接穗背面，用长15cm、宽0.8～1.0cm的薄膜条带紧扎接穗和砧木接口。春季和5—6月嫁接时可进行露芽捆扎，仅露出芽眼。嫁接过程中，注意保持接穗削面、砧木切口及放接穗的水要清洁，以免影响成活。单芽腹接一般在秋季进行，嫁接成活后，由于没有剪砧，当年不萌发，待翌年春季剪砧后接穗才萌发。(2)单芽切接。切接的接穗可用单芽或芽苞片，用芽苞片的称芽苞切接，用单芽的称单芽切接。切接成活后发芽快而整齐，苗木生长健壮，不剪砧，只能在春季应用。春季雨水充足地区，砧木应于嫁接前1～2天，离地面10～15cm处剪断，使多余的水分蒸发，以防接后接口处水分过多而影响成活。砧木切口方法如腹接法切口，以只切到形成层为宜，在砧木切口的上部将刀口朝一侧斜拉断砧木，断面为光滑斜面，切口在砧桩低的一侧。将接芽嵌入砧木及砧木切口，用塑料薄膜带缚扎，砧木顶部用方块聚乙烯薄膜将接芽及砧木包在内，形成“小室”，萌发后再剪破“小室”上端。(3)“T”形芽接法。将砧木洗净，用芽接刀横切，再垂直纵切一刀，成“T”字形。然后用尾端骨片沿垂直口轻轻将树皮撬开，在芽上方0.5cm处横切一刀，深至木质部，再在芽下1cm处斜切与前刀口交叉处。将芽取下，用骨片挑除木质部，然后插入“T”字形切口撬开的皮层内，使芽穗与砧木两者形成层紧贴后绑扎。(1)清砧。一般情况下一株苗木选择3～5个健壮的大枝进行嫁接，若树冠较大且枝条较粗，每个大枝可选2个副主枝嫁接，即在二级分枝上嫁接。将不接芽的枝梢剪除，疏删扰乱树形的交叉枝、平行枝、重叠枝、丛生枝、过密枝、内膛弱枝及分枝部位过低的主枝。植株有2个以上主干的只保留1个，将多余的剪除。通过短截达到初步整形的目的。(2)合理分布嫁接点。采用低位分层少芽换接，由下而上分布嫁接点，从选定的骨干枝下部开始嫁接，每个嫁接点相距30～40cm，方位错开，不接顺风(即接芽分布在一个方位)和对口芽，也不要接一口双芽。一般一株小树或一个大枝嫁接2～4层，主干过高应在离地面50cm左右补接一芽(萌发后培养为主枝)。嫁接高度依树龄而定，一般5年以内的苗木为1m以内，10年以内的苗木为1.2m以内，15年以内的苗木为1.5m以内，通常主干最下部位的接穗高度不得超过1.5m。(3)嫁接。嫁接的方法根据树势的不同而有所不同，一般采用单芽腹接(即每枝段一芽)，若接穗较粗或为圆形可用小芽(即芽片)腹接。中间砧树势一般，选择腹接法(即成活后剪砧)，树势强旺，可选择切接，更有利于恢复树势。(1)检查成活率和补接。春季嫁接的50天左右检査成活率；秋季嫁接的20天以后检查成活率。检査方法：先将捆绑的薄膜解开，经过风吹日晒一个星期，判断接芽成活与否。成活者，接芽新鲜，芽眼饱满，接芽与砧木相互愈合，唯独叶柄发黄，轻轻一拢，叶柄即刻脱落。未接活者接穗发黄、干枯或霉烂。成活率在80%以上的可以不补接，低于80%的应进行补接。(2)解绑与锯砧。当年秋季嫁接芽或接穗，应于翌年春季萌芽，在萌芽时，应及时解绑(或在芽背面划开薄膜)，同时，进行锯砧。春季嫁接的不能1次全部解绑，应采取挑破芽眼上薄膜的方法，即在离接芽0.5cm处的薄膜上划开0.5～1cm的口子，并用小刀挑开薄膜露出芽眼，提高芽眼对外界环境的适应性，接芽下半部捆扎的薄膜仍继续全部保留，待接芽第一次抽梢停止生长后，再将薄膜全部解除。春季嫁接的剪砧，也在挑芽眼的同时进行。无论是春季嫁接的，还是秋季嫁接的，剪砧都应分两次进行，第一次在接芽上方30cm处剪砧(即保留砧桩)，剪面要平整、光滑(伤口愈合速度快)，以防剪砧伤口过大而致接芽枯死。第二次剪砧，在接芽第一次抽梢自剪后或有小指粗时进行(此时锯掉砧桩)。用桐油涂刷于剪砧后的伤口，以防水分过分蒸发和发生流胶病，秋季嫁接的苗木，树势比较弱，应采用相应的防寒防冻措施，即对主干进行刷白处理。(3)抹除砧木萌蘗。在嫁接或锯砧时，砧木嫁接部位以下有些潜伏芽会萌发生出，应及时抹除，随见随除，一般3～5天进行1次。(4)摘心与疏梢。春梢长度达15～20cm或8片叶时摘心，夏梢长度达20～25cm时摘心，有利于秋季结果母枝的抽梢。秋梢只对骨干枝的延长枝进行短截或摘心，其余的一律缓放(即不摘心，不短截)，以利早结果。过密分枝、交叉枝或丛生枝应适当疏除少许，避免消耗过多的养分，不利于结果，一般丛生枝按三疏一、五疏二的原则把握疏梢程度。(5)设立支柱。嫁接时，特别是枝接时，由于伤口还未愈合，嫁接部位比较脆弱，应将接穗及所抽新梢捆缚在支柱上，防止被强风吹折。(6)病虫防治和肥水管理。预防为主，综合防治。刚高接的苗木树势相对比较弱，应及时预防螨类、蚧类、橘蚜、潜叶蛾、粉虱和凤蝶等对柑橘的为害，以促进植株恢复和生长。(1)苗木。假植苗使用一年生嫁接苗，要求苗高35～45cm，茎粗0.8～1cm。苗相好，叶色健康，不带病虫。(2)营养袋。营养袋材料为黑色耐氧化聚乙烯膜，厚度为3丝。规格为高45cm，口径18cm。袋底和侧面设8～10个口径为0.5cm的滤水孔。(3)营养土。营养土基质为富含有机质(不低于3%)的肥沃园田土和塘泥，每立方米基质掺入0.1m3细河沙、100kg腐熟的人畜粪便、30kg经过充分腐熟的饼肥、4kg柑橘专用肥、150g硫酸亚铁和150g硫酸锌。以上材料混合均匀后，再用粉碎机粉碎细化，最后用500倍多菌灵消毒，堆沤15天后即可使用。(4)假植圃。假植圃一般设在基地的中心区域。假植圃对土壤的要求不高，只要是平地，排灌条件良好即可。假植圃内设若干小区，小区之间用道路和排灌渠道隔开，小区一般为长方形，长度以40m为宜，宽度一般不超过20m。(1)假植的时间。假植一般以11月和2月为宜。(2)起苗及运输。起苗一般在阴天进行，起苗前苗圃灌足水，起苗时尽量多保留须根。苗圃与假植圃邻近，一般在起苗的同时进行假植，不让苗木离土过夜。长距离运输的苗木，起苗的同时用浓泥浆浆根，并用农膜包根，存放在阴凉处。每次起运地苗木在运输过程中一定要做到全封闭，严禁风吹雨淋。(3)装袋及摆放。苗木进袋时要做到苗正根直、摆放整齐。小苗进袋的技术要求与大田植苗要求相同。假植圃中一般每行摆放4袋，行宽80cm，行间距(走道)60cm。(4)定根水。苗袋摆放好后立即浇足浇透定根水，定根水的标准是营养袋底孔出水。苗木进袋后遇高温，应连续浇水3～4次，防止苗木脱水枯死。定根水也不宜过量，否则，会造成营养的流失。有条件的可用一层湿木屑覆盖营养袋表层土，可以起到保水防草的作用。(5)定干。苗木进袋后要进行适当的修剪。一是剪除苗木40cm以上的中心干，促发苗木在假植期间抽发侧枝，增加分枝级数和末级梢量；二是剪除苗木的病虫枝、萎蔫枝叶，提高苗木成活率。(6)有检疫性病虫害的小区，宜在假植区罩上塑料网。(1)肥料。营养袋假植的苗木，由于营养土养分充足，基本可以满足苗木抽发春梢和夏梢的营养需求，因此，在7月前一般不用施肥。8月苗木抽发早秋梢前应补充1次肥料，肥料可施用速效氮肥。早秋梢生长结束后停止施肥。(2)水分。营养袋假植的苗木对水分的要求比较高，因为营养袋隔断了营养土与地面的联系，遇高温、干旱营养土更容易枯水，而袋内积水则会导致苗木烂根。因此，要根据天气情况及时补充水分和排出假植圃内的积水。(3)除草。在苗木抽生春、夏梢期间，由于营养袋营养充足，大量杂草也会同时发生，及时除草是这一阶段苗木管理的主要工作，否则，会影响到苗木的正常生长。营养袋除草要做到除早除小，人工拔除营养袋内失控大株杂草，容易伤及苗木根系，影响苗木生长。假植圃走道杂草可使用除草剂，营养袋除草严禁使用除草剂。(4)病虫防治。进圃假植的苗木要经过严格的检疫，防止携带检疫性病虫。假植圃苗木病虫防治的重点是恶性叶甲、红黄蜘蛛、黑刺粉虱和潜叶蛾，其中，春季的叶甲和秋季的潜叶蛾是重中之重。假植圃施药以无公害的农药为主，不能使用高毒高残留农药。(1)出圃苗木规格。营养袋假植苗木出圃规格为苗高60cm以上，茎粗1.2cm以上，有3～4个明显主枝，末级梢不少于40条，根系完整，细根发达。同时，做好出圃苗木的砧木、接穗的信息核对及出圃时间和去向的登记。(2)定植时间。经过营养袋假植苗木，在营养袋中生长的时间不宜超过6个月，最好在春梢老熟后即行移栽，否则，会造成主根弯曲，影响苗木的继续生长。营养袋假植的苗木出圃定植的时间不受季节、天气的影响，只要苗木达到定植规格，随时可以进园定植，且苗木的成活率、生长势均不会受到任何影响。(3)运输及定植。苗木运输过程中要尽量保证营养袋完整，根系不受伤害。定植时先将容器苗运放到定植点，栽时轻拍育苗袋四周，使苗木带土与袋分离。再一手抓住苗木主干的基部，另一手按住育苗袋，将柑橘苗带土轻轻拉出。栽苗时要疏理根群，使根系展开，扶正苗木，再填上细土夯实，不深不浅，土齐根茎。栽后整理树盘，浇足定根水，当风面最好立上支柱，防止主干摇动，确保充分成活。

绿盲蝽Lygocoris lucorum(Meyer-Dur.)，又名花叶虫，属半翅目，盲蝽科。寄主植物多，可为害果树、蔬菜、棉花、苜蓿等多类作物，是棉花上的重要害虫。近年来，随着农业产业结构的调整，葡萄种植面积的扩大，绿盲蝽在葡萄上的为害日益严重，已成为葡萄上的重要害虫之一。绿盲蝽分布广泛，全国各地均普遍发生。国外分布于日本、欧洲、美国等地。绿盲蝽以成、若虫刺吸为害葡萄的幼芽、嫩叶、花蕾和幼果，刺的过程分泌毒汁，吸的过程吸食植物汁液，造成受害部位细胞坏死或畸形生长。葡萄嫩叶被害后，先出现枯死小点，随叶芽伸展，小点变成不规则的多角形孔洞，俗称“破叶疯”(彩图9-1-1)；花蕾受害后即停止发育，枯萎脱落；受害幼果粒初期表面呈现不很明显的黄褐色小斑点，随果粒生长，小斑点逐渐扩大，呈黑色，受害皮下组织发育受阻，渐趋凹陷，严重的受害部位发生龟裂，严重影响葡萄的产量和品质。卵：长约1毫米，黄绿色，长口袋形，卵盖奶黄色，中央凹陷，两端突起，无附属物。若虫：若虫共5龄，初孵时绿色，复眼桃红色。5龄若虫全体鲜绿色，触角淡黄色，端部色渐深，复眼灰色。翅芽尖端蓝色，达腹部第4节(彩图9-1-2、彩图9-1-3)。成虫：体长约5毫米，雌虫稍大，体绿色。复眼黑色突出。触角4节丝状，较短，约为体长2/3，第2节长等于第3、第4节之和，向端部颜色渐深，1节黄绿色，4节黑褐色。前胸背板深绿色，有许多黑色小刻点。小盾片三角形微突，黄绿色，中央具1浅纵纹。前翅膜片半透明暗灰色，余绿色。1年发生3～5代，主要以卵在各种果树树皮内、芽眼间、枯枝断面，棉花枯断枝茎髓内及杂草或浅层土壤中越冬。翌年3—4月越冬卵开始孵化，越冬代卵孵化期较为整齐，4月下旬，葡萄萌芽后即开始为害，5月上中旬展叶盛期为为害盛期，5月中下旬幼果期开始为害果粒，5月下旬后气温渐高，虫口渐少。第1、第2、第3、第4代分别出现在6月上旬、7月中旬、8月中旬、9月中旬，世代重叠现象严重，主要转移到豆类、玉米、蔬菜等作物上为害。9月下旬至10月上旬产卵越冬。成虫飞翔能力强，若虫活泼，白天潜伏，稍受惊动，迅速爬迁，白天不易发现。主要于清晨和傍晚在芽、嫩叶及幼果上刺吸为害。这就是只看到破叶、看不到虫子的原因。成虫寿命较长，30～40天，羽化后6～7天开始产卵，产卵期可持续20～30天，且产卵一般具有趋嫩性，多产于幼芽、嫩叶、花蕾和幼果等组织内，但越冬卵大多产于枯枝、干草等处。绿盲蝽发生与气候条件密切相关，其喜温暖、潮湿环境，高湿条件下，若虫活跃，生长发育快，雨多的年份，发生较重。气温20～30℃、相对湿度80%～90%最易发生为害。近年来5月上中旬气温、湿度条件适合，是造成绿盲蝽发生严重的主要原因之一。绿盲蝽食性杂，但以前只在牧草、棉花上危害严重，近些年随着农业结构的调整，特别是大面积推广种植转基因抗虫棉以来，由于抗虫棉生长前期抗虫性较好，棉田化学农药使用次数减少，有利于绿盲蝽的发生和繁衍，虫源基数逐年增加，使其逐渐成为葡萄、枣树、苹果及蔬菜等多种作物上的重要害虫。葡萄园内或周围种植棉花、牧草、枣树、豆科作物等喜食植物，对其早春食物衔接、养分补充提供了有利条件，有利于其种群发生。绿盲蝽天敌种类较多，卵寄生蜂有点脉缨小蜂、盲蝽黑卵蜂、柄缨小蜂。捕食性天敌有花蝽、草蛉、姬猎蝽、蜘蛛等。自然条件下对其有较强的控制作用。（1）清理越冬场所。在葡萄越冬前（北方埋土防寒前），清除枝蔓上的老粗皮、剪除有卵剪口、枯枝等。（2）及时清除葡萄园周围棉田中的棉柴、棉叶，清除树下及田埂、沟边、路旁的杂草及刮除四周果树的老翘皮，剪除枯枝集中销毁。减少、切断绿盲蝽越冬虫源和早春寄主上的虫源。（3）葡萄生长期间及时清除果园内外杂草，及时进行夏剪和摘心，消灭其中潜伏的若虫和卵。每4公顷果园悬挂1台频振式杀虫灯，利用绿盲蝽成虫的趋光性进行诱杀。（1）统一防治。绿盲蝽具有很强的迁移性，一家一户防治效果不理想，要根据预测预报发动村民统一防治，有条件的乡（镇）、村要成立机防专业队，做到统一时间、统一用药、统一行动。（2）适宜的防治时机。绿盲蝽具有昼伏夜出习性，成虫白天多潜伏于树下，沟旁杂草内，多在夜晚和清晨为害。所以，喷药防治要在傍晚或清晨进行以达到较好的防治效果。（3）注意保护利用天敌。绿盲蝽的自然天敌种类多，在进行化学防治时，要以保护天敌为前提，尽量选用对天敌毒性小的新烟碱类杀虫剂。（4）早春葡萄芽前，全树喷施一遍3波美度的石硫合剂，消灭越冬卵及初孵若虫。越冬卵孵化后，抓住越冬代低龄若虫期，适时进行药剂防治。常用药剂有：吡虫啉、啶虫脒、马拉硫磷、溴氰菊酯、高效氯氢菊酯等。连喷2～3次，间隔7～10天。喷药一定要细致、周到，对树干、地上杂草及行间作物全面喷药，做到树上、树下，喷严、喷全，以达到较好的防治效果。葡萄透翅蛾(Paranthrene regalis Butler)，属鳞翅目，透翅蛾科。主要为害葡萄，也可为害苹果、梨、桃、杏、樱桃等，是葡萄生产上的主要害虫之一。葡萄透翅蛾分布较广，国内广泛分布于辽宁、吉林、内蒙古自治区、河北、天津、山西、河南、山东、江苏、浙江、安徽、陕西及四川等葡萄产区；国外分布于日本、朝鲜。幼虫为害葡萄嫩枝及1～2年生枝蔓，初龄幼虫蛀入嫩梢，蛀食髓部，使嫩梢枯死。幼虫长大后，转到较为粗大的枝蔓中为害，被害部肿大呈瘤状，蛀孔外有褐色粒状虫粪，枝蔓易折断，其上部叶变黄枯萎，果穗枯萎，果实脱落(彩图9-2-1)。轻者树势衰弱，产量和品质下降；重者致使大部枝蔓干枯，甚至全株死亡。成虫：体长18～20毫米，翅展30～36毫米，体蓝黑色至黑褐色，触角黑紫色，头顶、颈部、后胸两侧、下唇须第3节橙黄色。前翅红褐色，前缘、外缘及翅脉黑色，后翅半透明，前后翅缘毛均为紫色。腹部有3条黄色横带，分别在第4、第5节及第6节，以第4节横带最宽，第6节后缘次之，第5节上的最细。雄蛾腹末两侧各有1长毛束。卵：长1.1毫米，椭圆形，略扁平，紫褐色。幼虫：体长25～38毫米，全体略呈圆筒形。头部红褐色，胸腹部淡黄白色，老熟时淡紫红色，全体疏生细毛。前胸盾具倒“八”字纹，胸足淡褐色，围气门片褐色(彩图9-2-2)。蛹：体长约18毫米，红褐色。腹部2～6节背面各有2横列刺，7～8节各有1横列刺。末节腹面亦有1横列刺。1年发生1代，以老熟幼虫在被害枝蔓里越冬。翌年4月下旬至5月上旬幼虫开始活动，在越冬处的枝条里咬一个圆形羽化孔，后吐丝作茧化蛹。蛹期10天左右，5月中旬至6月羽化，一般成虫羽化盛期和葡萄开花盛期相一致。成虫羽化后即可开始交配、产卵，雌雄虫一生只交尾一次。成虫飞翔力强，白天活动。卵多产在直径0.5厘米以上的新梢上，产于叶腋、叶片、果穗、卷须、嫩芽等处，但以叶腋和叶片最多。卵多散产，个别有2～4粒在一处的，1头雌虫一生平均产卵79～91粒，卵期10天。初孵幼虫多从叶柄基部侵入嫩梢，蛀孔处呈紫红色。幼虫蛀入枝蔓后，先向枝蔓先端蛀食，致使蔓梢很快枯死。此后转向枝蔓基部方向蛀食，受害部位呈现膨肿状或形成瘤状突起，受害处上部叶片变黄，果实脱落。幼虫可进行2～3次转移为害，越冬前转移到2年及以上生枝蔓蛀食为害，遇震动或风吹时常造成折断或枝蔓枯死，9—10月以老熟幼虫越冬。随树龄增加株蛀害率加重。因为成虫喜欢在长势旺盛、枝叶茂密的植株上产卵，随树龄增加，主干增粗，枝梢生长旺盛，营养丰富，为害加重。同一品种，不同生育期，受害不同。从萌芽生长期开始为害，以开花期和浆果期受害最重，浆果成熟采收期，为害逐渐减轻。调查发现该虫蛹的寄生蜂有松毛虫黑点瘤姬蜂，幼虫期和蛹期有白僵菌寄生。（1）冬、春季剪除虫枝。修剪时结合冬季修剪，认真剪除虫枝，予以烧毁。春季萌芽期再细心检查，凡枝蔓不萌芽或萌芽后萎缩的，虫枝应及时剪除，以消灭越冬幼虫，降低虫源。（2）生长季节，幼虫孵化蛀入期间，发现节间紫红色的先端嫩梢枯死，或叶片凋萎，或先端叶边缘干枯的枝蔓均为被害枝蔓，及时剪除。7、8月以后，发现有虫粪的较大蛀孔，可用铁丝从蛀孔刺死或钩杀幼虫。（1）药液注射。用注射针筒向幼虫排粪孔内注入80%敌敌畏乳油100倍液或2.5%敌杀死乳油200倍液，然后用湿泥封口。（2）卵孵化高峰喷施化学药剂。种类有：三唑磷、辛硫磷、三氟氯氰菊酯、高效氯氢菊酯等，1年只需施药1次就能消除葡萄透翅蛾的危害。又名远东盔蚧、扁平球坚蚧等。属同翅目，蚧总科，坚蚧科。是果树和林木的重要害虫。主要寄主有桃、杏、苹果、梨、山楂、核桃、葡萄、刺槐、国槐、白蜡、合欢等，其中以葡萄、桃、刺槐受害最重。东方盔蚧在我国分布广泛，主要分布在河北、河南、山东、山西、江苏、青海等葡萄产区。以雌成虫、若虫为害葡萄枝干、叶片和果实(彩图9-3-1、彩图9-3-2)。雌成虫和若虫附着在枝干、叶和果穗上刺吸汁液，并排出大量黏液，招致霉菌寄生，表面呈现烟煤状，严重影响叶片的光合作用，枝条严重受害后枯死，果面被污染，造成树势衰弱，使产量和品质受到严重影响。雌成虫：黄褐色或红褐色，扁椭圆形，体长3.5～6.0毫米，体宽3.5～4.5毫米，体背中央有4纵排断续的凹陷，凹陷内外形成5条隆脊。体背边缘有横列的皱褶排列较规则，腹部末端具臀裂缝。卵：长椭圆形，淡黄白色，长径0.5～0.6毫米，短径0.25毫米，近孵化时呈粉红色，卵上微覆蜡质白粉。若虫：初龄若虫扁椭圆形，长径0.3毫米，淡黄色。触角和足发达，具有一对尾毛。3龄若虫黄褐色，形似雌成虫。越冬2龄若虫体赭褐色，椭圆形，上下较扁平，体外有1层极薄的蜡层，虫体周边锥形刺毛达108条。东方盔蚧在葡萄上每年发生2代，以2龄若虫在枝蔓的裂缝、叶痕处或枝条的阴面越冬。翌年4月葡萄出土后，随着气温升高越冬若虫开始活动，爬至1～2年生枝条或叶上为害。4月上旬虫体开始膨大并蜕皮变为成虫，4月下旬雌虫体背膨大并硬化，5月上旬开始产卵在体下介壳内，5月中旬为产卵盛期，通常孤雌生殖，每雌产卵1400～2700粒，卵期20～30天。5月下旬至6月上旬为若虫孵化盛期，若虫爬到叶片背面固定为害，少数寄生于叶柄。6月中旬蜕皮为2龄若虫并转移到当年生枝蔓、穗轴、果粒上为害，7月上旬羽化为成虫。7月下旬至8月上旬产卵，第2代若虫8月孵化，中旬为盛期，仍先在叶上为害，9月蜕皮为2龄后转移到枝蔓越冬。此虫在红玫瑰、金后、红鸡心、龙眼上发生严重。该虫的捕食性天敌有黑缘红瓢虫、小红点瓢虫等，黑缘红瓢虫是其主要天敌，1头黑缘红瓢虫一生可食2000余头东方盔蚧个体。田间寄生蜂的寄生率一般可达10%。（1）杜绝虫源。注意不要采用带虫接穗，苗木和接穗出苗圃要及时采取处理措施。果园附近防风林，不要栽植刺槐等寄主林木。（2）冬季清园。在葡萄埋土防寒前，清除枝蔓上的老粗皮，减少越冬虫口基数。春季发芽前喷3～5波美度石硫合剂或3%～5%柴油乳剂，消灭越冬若虫。（3）保护和利用天敌。少用或避免使用广谱性农药，以减少对黑缘红瓢虫等天敌的杀伤。（4）生长季药剂防治。要抓住两个防治关键：一是4月上中旬，虫体开始膨大时；二是5月下旬至6月上旬第1代若虫孵化盛期。发生严重果园于6月下旬加施一次。常用药剂：吡虫啉、啶虫脒、杀扑磷、苯氧威、吡蚜酮、毒死蜱等喷雾防治。喷药时加入渗透剂，可提高防治效果。据资料记载，为害葡萄的粉蚧类有四种：葡萄粉蚧(Grape mealbug)(Pseudococcus maritimus)、康氏粉蚧(Comestock mealybug)(Pseudococcus comstocki)、暗色粉蚧(Obscure mealbug)(Pseudococcus viburni)、长尾粉蚧(Longtailed mealybug)(Pseudococcus longispinus)。国家葡萄产业技术体系病虫害防控研究室正在对来自全国采集到的标本进行鉴定。以康氏粉蚧、葡萄粉蚧为例，介绍粉蚧类害虫。康氏粉蚧Pseudococcus Comstocki(Kuwana)康氏粉蚧属同翅目，粉蚧科，又名梨粉蚧。食性很杂，除为害葡萄外，还为害苹果、梨、山楂、桃、李、杏、樱桃、梅、板栗、核桃、柿、枣等多种果树及桑、杨、柳及蔬菜等多种植物。国内分布于吉林、辽宁、河北、北京、河南、山东、山西、四川等省、直辖市。以雌成虫和若虫刺吸嫩芽、嫩叶、果实、枝干的汁液。嫩枝受害后，被害处肿胀，严重时造成树皮纵裂而枯死。果实被害时，造成组织坏死，出现大小不同的褪色斑点、黑点或黑斑，为害处该虫所产白色棉絮状蜡粉等污染果实；排泄蜜露到果实、叶片、枝条上，造成污染，湿度大时蜜露上产生杂菌污染，形成煤污病；有煤污病的果实彻底失去食用和利用价值。粉蚧对葡萄造成的伤害不是特别严重，但危害和损失巨大(彩图9-3-3、彩图9-3-4)。成虫：雌成虫体长约5毫米，宽约3毫米，椭圆形，淡粉红色，被较厚的白色蜡粉。体缘具17对白色蜡刺，蜡丝基部粗向端渐细，体前端的蜡丝较短，向后渐长，最后1对最长，与体长接近。眼半球形，触角8节，足较发达疏生刚毛。雄成虫体长约1.1毫米，翅展2毫米左右，紫褐色，触角和胸背中央色淡，单眼紫褐色，前翅发达透明，后翅退化为平衡棒。尾毛较长。(彩图9-3-5)卵：椭圆形，长0.3～0.4毫米，浅橙黄色，附有白色蜡粉，产于白色絮状卵囊内。若虫：雌3龄，雄2龄，1龄椭圆形，长约0.5毫米，淡黄色，眼近半球形，紫褐色，体表两侧布满纤毛；2龄体长约1毫米，被白色蜡粉，体缘出现蜡刺；3龄体长约1.7毫米，与雌成虫相似。雄蛹：长约1.2毫米，淡紫褐色，裸蛹。茧体长2.0～2.5毫米，长椭圆形，白色絮状。康氏粉蚧1年发生3代，主要以卵在树体各种缝隙及树干基部附近土石缝处越冬，翌春葡萄发芽时，越冬卵孵化，爬到枝叶等幼嫩部位为害。第1代若虫盛发期为5月中、下旬，第2代为7月中、下旬，第3代为8月下旬。该虫第1代为害枝干，第2、第3代以为害果实为主。若虫发育期雌虫为35～50天，蜕皮3次即为雌成虫，雄虫为25～37天，蜕皮2次后化蛹，雄成虫羽化的时期，正值雌虫蜕第3次皮而为雌成虫，雌雄交尾。交尾后雄虫死亡，雌虫取食一段时间爬到枝干粗皮裂缝间、树叶下、枝杈处、果实上分泌卵囊，而后将卵产于卵囊内。每雌虫产卵200～400粒，以末代卵越冬。康氏粉蚧喜在阴暗处活动，套袋内是其繁殖为害的最佳场所，因此，套袋果园，树冠郁闭、光照差的果园发生较重。（1）冬春防治。果实采收后及时处理果园，将虫果、旧纸袋、落叶等集中烧毁或深埋。葡萄埋土防寒前（或出土上架时），清除枝蔓上的老粗皮，减少越冬虫口基数。春季发芽前喷3～5波美度石硫合剂或3%～5%柴油乳剂，消灭越冬卵和若虫。（2）生长季防治。生长期应抓住各代若虫孵化盛期，花序分离到开花前是防治第1代康氏粉蚧的关键时期，这是最重要的一次防治，因此要根据虫口密度适时用药1～2次。套袋前的防治非常重要；套袋后，康氏粉蚧有向袋内转移为害特点，所以套袋后3～5天是防治该虫的第3个最佳时期。药剂种类和用法同东方盔蚧。（3）土壤处理防治。在卵孵化期，根际施药，包括颗粒剂、片剂或药液土壤泼浇等。药剂一般使用具有内吸性的，如吡虫啉等。叶蝉是葡萄上的重要害虫，国内各葡萄产区普遍发生。为害葡萄的叶蝉主要有两种，即葡萄斑叶蝉Erythroneura apicalis(Nawa)(又名葡萄二星叶蝉或葡萄二点叶蝉)和葡萄二黄斑叶蝉Erythroneura sp.。属同翅目，叶蝉科。两种叶蝉在葡萄上常混合发生，除为害葡萄外，还为害桃、梨、苹果、樱桃、山楂等果树。葡萄斑叶蝉和葡萄二黄斑叶蝉主要分布在我国辽宁、北京、河北、山东、河南、湖北、安徽、江苏、浙江、陕西、甘肃、新疆等葡萄产区，尤其是管理粗放的果园发生严重。两种叶蝉在葡萄的整个生长期都能为害，以成、若虫群集于叶片背面刺吸汁液为害。一般喜在郁闭处活动取食，故为害时先从枝蔓中下部老叶和内膛开始逐渐向上部和外围蔓延。叶片受害后，正面呈现密集的白色失绿斑点，严重时叶片苍白、焦枯，严重影响叶片的光合作用、枝条的生长和花芽分化，造成葡萄早期落叶，树势衰退。所排出的虫粪污染叶片和果实，造成黑褐色粪斑，影响当年以至第2年果实的质量和产量。卵：初为乳白色，后变为黄白色，长椭圆形，稍弯曲，长约0.6毫米。若虫：体形似成虫，初为乳白色；老熟时黄白色，体长约2.0毫米(彩图9-4-1)。成虫：体长至翅端3.0～4.0毫米，体淡黄白色。头顶有2个明显的圆形黑色斑点，复眼黑色。前胸背板前缘有3个小黑点。小盾片前缘左右各有近三角形的黑色斑纹1个。前翅半透明，黄白色，有不规则的淡褐色斑纹。卵：和葡萄斑叶蝉卵相似。若虫：末龄若虫体长约1.6毫米，紫红色，触角、足体节间、背中浅淡黄白色。体略短宽，腹末几节向上方翘起。成虫：体长至翅端约3.0毫米。头顶前缘有2个黑褐色斑点，复眼黑或暗褐色。前胸背板中央具暗色纵纹，前缘有3个黑褐色小斑点。小盾片淡黄白色，前缘左右各有较大的黑色斑点1个。前翅表面暗褐色，后缘各有近半圆形的黄色斑纹2个，两翅合拢后在体背形成2个近圆形黄斑。成虫颜色有变化，越冬前为红褐色(彩图9-4-2)。(1)葡萄斑叶蝉。每年发生3～4代，以成虫在葡萄园的落叶、杂草下及附近的树皮缝、石缝、土缝等隐蔽处越冬。在华北地区，翌年成虫于3月中旬至4月上旬开始活动，先在园边发芽早的植物上为害，如苹果、梨、桃等，待葡萄展叶后即开始为害葡萄叶片。越冬成虫于4月中下旬产卵，5月中下旬若虫盛发。第1代成虫期在5月底至6月，第2、第3代成虫分别发生于6月下旬至7月、8月下旬至9月，后期世代重叠，10月下旬以后成虫陆续开始越冬。成、若虫多在叶背为害。雌成虫喜欢在成熟未老化的叶片上产卵，卵多产于叶背的叶脉上。在早晨、傍晚温度较低时，多潜藏于叶背面不活动，但中午阳光强烈时隐伏于叶背面避光处，活动取食高峰为7:00—9:00和18:00—20:00。成虫趋光性强，善飞蹦，受惊扰后即飞往他处。若虫受惊，则迅速爬行。(2)葡萄二黄斑叶蝉。生活史及习性和葡萄斑叶蝉相似。冬季气温偏暖对其越冬存活较为有利，春季开春早，气温回升快，夏季高温、干旱，极利于该虫繁殖。但葡萄园环境过于干旱，或植株叶片老化，可促使其迁飞扩散，种群数量下降。葡萄园内或周围种植杏树、桑树、杨树、榆树等，对其越冬及早春及时补充养分提供了有利条件，有利其种群发生。不同葡萄品种其发生为害程度也不同，一般叶片绒毛多的葡萄品种受害较轻，绒毛少的品种则受害重。该虫喜欢隐蔽的环境，一般通风透光差，修剪不好的葡萄园叶蝉为害较重。据调查，通风透光好的葡萄园百叶虫量最高为616头，通风透光差的葡萄园百叶虫量最高可达2390头。园内管理粗放，园内杂草丛生，有利其越冬及早春养分补充，为害严重。生长期有多种捕食性天敌，捕食能力强的主要为蜘蛛类，如丁纹豹蛛对葡萄斑叶蝉的日平均捕食量达5～7头。寄生性螨对葡萄斑叶蝉1、2龄的低龄若虫致死性较强。生长后期斑叶蝉卵常被寄生蜂寄生，寄生率可高达60%以上。（1）避免果园郁闭。合理修剪，改善架面通风透光条件及合理负载。生长期及时除萌、抹芽和打副梢，减少下部叶片，使葡萄枝叶分布均匀，通风透光，可减少叶蝉发生为害。（2）树种合理布局。果园内部和周围不种桃、梨、苹果、樱桃、山楂等果树及桑树、杨树、榆树等林木，以减少生长季节和越冬期的中间寄主。（3）清洁田园。生长期及时清除杂草，创造不利于其发生的生态条件。秋后彻底清除田间地头落叶和杂草，集中烧毁或深埋，消灭其越冬场所，能显著减少虫害基数。该虫对黄色有趋性，可设置黄板诱杀。方法：20～24厘米佳多黄板，用专用粘虫胶涂均匀，按20～30块/亩置于葡萄架上。当葡萄斑叶蝉粘满板面时，需要及时重涂。目前有两种粘虫胶，一种10天左右需要重涂一次，另一种为30天左右重涂一次(适合刮风较少的地方和温室等地使用)。（1）防治时期。防治葡萄斑叶蝉全年要抓住两个关键时期，即发芽后，是越冬代成虫防治关键期；开花前后是第1代若虫防治关键期。另外，幼果期根据虫口密度使用药剂，落叶前1个半月左右注意防控越冬成虫。（2）防治用药。可选用噻虫嗪、吡虫啉、多杀菌素、甲氰菊酯、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、辛硫磷等药剂喷雾。要注意喷雾均匀、周到、全面；同时注意喷防葡萄园的杂草及周围的林带、杂草。葡萄虎天牛(Xylotrechus pyrrhoderus Bates)，属鞘翅目，天牛科。又名葡萄天牛、葡萄枝天牛。它是蛀食葡萄枝蔓的主要害虫之一。葡萄虎天牛在我国东北、华北、华中及陕西、湖北、四川等葡萄产区均有发生。主要以幼虫为害枝蔓，初龄幼虫先在表皮下纵行蛀食，被害枝蔓的表皮稍隆起变黑，虫粪排于隧道内，不排出，所以不易被发现。幼虫蛀入木质部后，常将枝横向切断，造成枝条枯死，遇风容易折断，严重时造成一定的经济损失(彩图9-5-1)。成虫：体长约15毫米，体近圆筒形，大部黑色，头部有深而粗的刻点，触角短小，11节，仅伸到鞘翅基部。前胸背板、前、中胸腹板和小盾片深红色。前胸背板球形，长略大于宽，布有颗粒或刻点。小盾片半圆形，后端有少量黄毛。鞘翅黑色，两翅合并时，基部有“X”形黄白色斑纹，近端部有一黄白色横纹，端缘平直，外缘角极尖锐呈刺状。后胸腹板和第1、第2腹节后缘有黄色白绒毛，形成3条黄白色横纹。雄虫后足腿节长超过腹部末端，雌虫的短，仅至腹部末端(很少超过)(彩图9-5-2)。卵：椭圆形，长约1毫米，乳白色。幼虫：体长13～17毫米，淡黄白色，头小，无足。前胸宽大、淡褐色，后缘有“山”字形细凹纹；中胸至第8腹节背、腹面具肉状突起。蛹：长约15毫米，初淡黄白色，后逐渐加深为黄褐色。每年发生1代，以低龄幼虫在葡萄蔓内越冬，翌年春季葡萄发芽后开始活动，随龄期增大，可把枝条蛀空，使其充满虫粪、木屑，有时将枝条横向蛀断，使枝枯死，枝头脱落。7月间幼虫老熟在接近断口处化蛹，蛹期10～15天。8月羽化出现成虫，并产卵于芽鳞缝隙内或芽腋、叶腋缝隙处，卵散产，经5～6天孵化为幼虫，即由芽部蛀入茎内，粪便排于枝内，故从外部难以发现虫道。落叶后在节的附近，被害处表皮变黑，易于识别。结合冬季修剪，剪除节附近表皮变黑的虫枝，予以烧毁。春季萌芽期再细心检查，凡枝蔓不萌芽或萌芽后萎缩的，多为虫枝，应及时剪除。生长期随时检查，发现受害枝蔓及时剪除并深埋销毁或用铁丝插入蛀孔内刺杀幼虫。利用成虫迁飞能力弱的特点，人工捕捉成虫，一般可在8、9月早晨露水未干前进行捕捉，效果好。在8月成虫羽化期，利用其补充营养习性，可用敌敌畏、辛硫磷等喷雾。幼虫蛀入枝蔓后，在葡萄采收后喷施内吸性杀虫剂，或80%的敌敌畏乳油100倍液注射蛀孔并严密封堵。葡萄蓟马(Thrips tabaci Lindeman)，属缨翅目，蓟马科。又称烟蓟马、葱蓟马、棉蓟马。在我国各葡萄产区均有分布。寄主广泛，除为害葡萄外还为害苹果、李、梅、柑橘、草莓、菠萝、烟草等多种植物。若虫和成虫锉吸葡萄幼果、嫩叶、枝蔓和新梢的汁液。幼果受害初期，果面上形成纵向的黑斑，使整穗果粒呈黑色。后期果面形成纵向木栓化褐色锈斑，严重时会引起裂果，降低果实的商品价值。叶片受害后先出现褪绿黄斑，后变小，发生卷曲，甚至干枯，有时还出现穿孔(彩图9-6-1)。成虫：体长0.8～1.5毫米，淡黄色至深褐色，体光滑，复眼紫红色，单眼3个，其后两侧有一对短鬃。两对翅狭长，透明，前翅前缘有一排细鬃毛，前脉上有10～13根细鬃毛，后脉有14～17根细鬃毛。腹部第2～第8节背片前缘有一黑色横纹。触角6～9节，略呈珍珠状。卵：长约0.3毫米，淡黄色，似肾形。若虫：体长0.6～1.0毫米，初为白色透明，后为浅黄色至深黄色，与成虫相似(彩图9-6-2)。一年发生6～10代，多以成虫和若虫在葡萄、杂草和死株上越冬，少数以蛹在土中越冬。来年，葱、蒜返青开始恢复活动，为害一段时间后，便飞到果树、棉等作物上为害繁殖。在葡萄初花期开始发现有蓟马为害幼果的症状，6月下旬至7月上旬，在副梢二次花序上发现有若虫和成虫为害。7—8月间，几种虫态同时为害花蕾和幼果。至9月份虫口逐渐减少。10月早霜来临之前，大量蓟马迁往果园附近的葱、蒜、白菜、萝卜等蔬菜上进行为害。农业防治：清理葡萄园杂草，烧毁枯枝落叶，保持园内整洁。初秋和早春集中消灭在葱、蒜上为害的蓟马，以减少虫源。化学防治：蓟马为害严重的葡萄园需要药剂防治，喷药的关键时期应在开花前1～2天或初花期。可使用的药剂有吡虫啉、功夫等药剂。生物防治：保护、利用小花蝽、姬猎蝽等天敌，对蓟马发生有一定的控制作用。

马铃薯晚疫病是一种毁灭性病害，从20世纪在欧洲暴发引起大饥荒以来，在全球范围内绝大多数马铃薯栽培地区广泛传播。1996年，据CIP（国际马铃薯中心）估计，全球因晚疫病造成的直接经济损失达到170亿美元，发展中国家的损失53亿美元。晚疫病的危害性、防治难度及对社会的影响早已超过水稻稻瘟病和小麦锈病，被视为国际第一大作物病害。近几十年随着分子生物学技术的发展，各国科学家都对马铃薯晚疫病病菌的分子遗传学进行了深入的研究。本文仅对分子标记技术在晚疫病病菌研究中的应用进行简要的综述。限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，简称RFLP）。RFLP是出现最早，现在依然使用最普遍的DNA标记。RFLP技术的基本原理是：不同材料的DNA用已知的限制性内切酶消化后，产生许多大小不等的DNA片段，电泳分离、Southern印迹转移到硝酸纤维膜上，用放射性标记的探针与膜上变性的酶切DNA进行杂交，放射自显影，即可显示出不同材料的多态性图谱，即显示出所分析的DNA序列间的RFLP。目前，有两种方法可进行DNA的RFLP分析：①如原理中所述，其中用作RFLP的探针可以是特殊基因的DNA克隆、cDNA克隆、随机的基因组DNA克隆和合成的低聚核苷酸克隆。②对那些分子量较小的DNA样本（如线粒体DNA、核糖体DNA等），可在酶切后对其产物直接电泳，将不同大小的限制性酶切DNA片段分离，从而得到该DNA的RFLP图谱。RFLP反映了DNA水平上的差异，而差异往往是由变异造成的，变异分为单碱基突变型和结构重排型两大类。单碱基因突变发生在限制性内切酶的位点上，致使酶切位点增加或丢失而产生多态性，这称为点多态性。结构重排型是指DNA序列内部发生了较大的变化，如插入或缺失，从而使酶切位点间的长度发生改变，造成了片段长度的多态性。这些变异经酶切、分离、杂交、放射自显影就会使RFLP带的特征发生改变，由此对生物的变异进行分析。目前，在晚疫病病菌的研究中，RFLP技术主要用于病菌群体的遗传分化，如：分析一个国家或地区致病疫霉种群的基因结构及变化；有性生殖的发生情况等。1992年Stephen等利用RG57探针分析了墨西哥中北部的晚疫病病菌遗传结构，发现墨西哥中部病菌的遗传多样性非常明显，这也充分说明这个地区由于A2交配型的存在有性重组率高于其他地区[1]；1993年Drenth等将采自荷兰6个地区的153个菌株分为35个RG-57基因型，明确了荷兰不同地区基因型的分布情况[2]；1998年Lionel等利用RG57探针和同工酶基因型研究发现采自番茄和马铃薯上的晚疫病病菌基因型明显不同，说明晚疫病病菌有寄主专化作用[3]。目前利用该标记对来自全世界的成千上万的马铃薯晚疫病病菌建立了指纹图谱数据库。1990年Williams等人首次应用随机引物扩增寻找多态性DNA片段作为分子标记，并将此法命名为随机扩增多态性DNA（Random amplified polymorphism DNA，RAPD）[4]。RAPD技术是建立在PCR技术基础上的，利用随机的短的脱氧核苷酸序列作为PCR引物（通常为十聚体）以基因组DNA为模板进行PCR扩增。通过凝胶电泳分离得到扩增产物DNA片段的多态性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同，但对任一特定的引物，它同基因组DNA序列有特定的结合位点。如果基因组在这些有特定位点的区域发生DNA插入，缺失或碱基突变就可导致这些特定结合位点发生相应的变化。通过对PCR产物的检测可测出基因组DNA在这些区域的多态性。在RAPD分析中可用一系列的引物使检测区域扩大至整个基因组。因此，RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性分析，适于研究生物的遗传多样性及生物的遗传关系，进行遗传作图和基因定位等。在晚疫病病菌的研究中，RAPD技术一般多用于研究种内群体遗传分析。如：Mahuku[5]对1994～1996年采自加拿大的141个菌株进行RAPD分析，将其分为21个组，分析表明97%的变异来自于种群内，3%的变异来源于种群间。2001年朱杰华等利用RAPD方法研究了马铃薯晚疫病病菌DNA多态性与A2交配型的关系[6]。2005年侯淑英等使用178个10bp随机引物对晚疫病病菌的甲霜灵抗性性状进行RAPD分析，得到一个相对稳定的与甲霜灵抗性连锁或相关的标记S500，为晚疫病的有效防治和病原菌的抗药性治理提供了理论依据和实践方法[7]。AFLP是1993年由荷兰keygene公司科学家Zabeau等人发明的一种DNA分子标记技术[8]，该技术的基本原理是：对基因组DNA进行限制性酶切片段的选择性扩增。主要步骤是：将基因组DNA进行限制性酶切后，将特定的接头连接在DNA酶切片段的两端，从而形成一个带接头的特异片段，通过接头序列和PCR引物3'端的识别，进行PCR扩增，最终经过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，通过银染或放射自显影检测。AFLP技术实际上是将RFLP和PCR相结合的一种技术[9～10]。该技术既继承了RFLP的稳定性，又具有PCR反应快速、灵敏的特点，同时克服了RFLP和RAPD的缺点，且扩增的带纹多（50～100条）。AFLP的大多数扩增片段与基因组的单一位置相对应，实验重复性高，该标记为孟德尔式遗传。目前，AFLP 技术主要用于构建晚疫病病菌的基因连锁图谱，此外也被用来检测病菌的基因型。1997年，Van de Lee[11] 等完成了一张比较完整的致病疫霉基因连锁图谱，这张图谱包括183个AFLP标记，7 个RFLP 标记和交配型基因座，包括10个主要的连锁群和7个次要的连锁群，共827cm，并证明主要连锁群中的标记来自于两个亲本，而次要连锁群中的标记来自A1 交配型的亲本或来自A2 交配型的亲本。同时还证明了致病疫霉是同核型的二倍体[12]。Cooke[13]，Flier等[14]以及Knapova等[15]利用AFLP对来自墨西哥和欧洲的病菌研究发现，墨西哥的菌株几乎每个都具有其特异的AFLP基因型，而欧洲的菌株平均每两个就具有一个特异的AFLP基因型。AFLP带型在分裂中能够保持稳定，并遵循孟德尔遗传规律[16]。交配型及其所在的连锁群的其他标记均不遵循孟德尔遗传规律。AFLP技术用于构建基因连锁图谱，使我们可以从基因水平了解晚疫病病菌，为更好地研究晚疫病病菌、防治晚疫病提供理论依据。短序列重复即SSR（Short sequence repeat）、又称微卫星DNA或短串联重复（Short tandem repeat，STR），这是一类由1～5个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列[17]。同一类的微卫星DNA可分布于整个基因组的不同位置上，由于基本单元重复次数的不同以及重复程度的不完全而造成了SSR位点的多态性，这种多态性有比较丰富的信息量。由于在每个微卫星DNA两端的序列是相对保守的单拷贝序列，因而可根据两端的序列设计一对特定的引物，扩增每一位点的微卫星序列，再经凝胶电泳比较扩增产物的长度变化，即可显示不同基因型个体在微卫星DNA位点上的多态性[18～19]。SSR技术的特点是：呈共显性遗传；在数量方面没有生物学上的限制；其标记带型简单，记录的条带一致、客观、明确；采用PCR技术进行检测只需少量DNA样品，且质量要求不高，即使是部分降解的样品也可进行分析；每个位点均有许多等位形式；另外，它还具有多态性高、实验程序简单等优点[19～20]，所以自1989年SSR技术产生以来，被广泛应用于基因定位和QTLs分析、DNA指纹和品种鉴定、种质资源保存和利用、系谱分析和标记辅助育种[18]。2001年Knapova [21]等首次利用SSR技术研究了瑞士和法国的马铃薯和番茄的晚疫病病菌群体的遗传多样性，同时分析了致病疫霉有性杂交F1代的分离情况，结果发现被测菌株群体具有丰富的遗传多样性。试验中6个SSR位点被鉴定出来，其中的3个SSR位点具有多样性，他们又从3个SSR位点中选择了2个SSR位点的引物（Pi4G和Pi4B）对来源于瑞士和法国的176个菌株进行了鉴定，分别得到4种和6种不同长度的等位基因片段（共21个组合）。2002年G.Knappva [22]等再次报道了法国和瑞士的晚疫病病菌的表型和基因型结构，他们研究的马铃薯晚疫病病菌株中存在11个SSR基因型，其中以A-03和A-06为主，另有1/9的菌株是其他SSR基因型；但尚未发现SSR基因型与菌株的交配型、对甲霜灵的敏感性和菌株来源的地域性有相关关系。Knappva[21～22]等的研究揭示了SSR分子标记适用于分析晚疫病病菌的群体结构，同时也指出了SSR标记技术在病菌应用的潜力和存在的问题，如stutter bands、非特异扩增等。但同其他分子标记相比，SSR技术具有位点特异的优点，有利于分析全球马铃薯晚疫病病菌的种群结构。若能对SSR标记技术进行大量人力、物力的投入，获得更多理想的SSR标记，这种技术将具有巨大的应用潜力。2004年朱杰华用AFLP分子标记研究了河北、云南、四川及黑龙江省的50个晚疫病病菌株的DNA指纹，当欧式距离为10时，50个菌株被聚类为4组，分组情况与菌株来源的地理位置相关，表明马铃薯晚疫病病菌的DNA的AFLP分子标记多样性与病菌的地理来源及病菌对甲霜灵的抗性有一定相关性，但未发现和生理小种及交配型有相关性[23]。2004年魏长拴用RAPD分子标记分析了我国马铃薯主产区的晚疫病病菌的亲缘关系和遗传相关性[24]。2005年郭军等利用SSR、AFLP和线粒体DNA单倍型技术分析了内蒙古地区马铃薯晚疫病病菌的遗传多样性。2006年姚国胜等利用SSR技术测定出中国菌株中存在7种SSR基因型[25]。总的来说，分子标记技术在我国马铃薯晚疫病病菌的研究中应用还很少，今后应进一步将各种分子标记技术应用到马铃薯晚疫病病菌的研究中。综上所述，DNA分子标记技术在马铃薯晚疫病病菌遗传研究上具有重要应用价值，并已取得了可喜的进展，展现了广阔的应用前景。现已研究了晚疫病病菌发源和墨西哥以外地区A2交配型的来源，为晚疫病的防治提供理论基础；明确了一个地区不同菌株之间的基因结构变化，遗传结构差异。利用DNA分子标记技术绘制晚疫病病菌的连锁图谱，使两个标记间距离足够小；借助高密度标记对一些性状基因进行准确定位，从而为抗病育种研究提供科学依据；并运用分子标记找到与目的基因紧密连锁的标记，如在致病疫霉中找到与抗瑞毒霉基因连锁的标记，与毒力基因连锁的标记，从而指导晚疫病的防治。由于上述几种分子标记都各有优缺点，任何一种均不能满足晚疫病病菌遗传研究的所有要求。所以如何更好地利用各种分子标记研究马铃薯晚疫病病菌，预防和控制马铃薯晚疫病，仍需不断研究。

（1）症状：此病从幼苗到成株期均可发病，以成株期受害较重，主要为害叶片，由下部叶片向上发展。发病初期叶片正面产生浅黄色近圆形至多角形斑，空气潮湿时叶背面产生霜状霉层，有时可蔓延到叶面，后期病斑呈黄褐色连片枯死。田间种植过密、空气湿度大、夜间结露时间长、春末夏初或者秋季连续阴雨天易发病。生菜霜霉病病叶正面生菜霜霉病病叶背面莴笋霜霉病病叶（2）药剂防治：同葫芦科蔬菜霜霉病防治方法。（1）症状：此病从根茎或下部叶片开始发生。引起叶面萎蔫或枯黄，最后腐烂。根茎受害初期呈水渍状，迅速扩展，使根茎腐烂，病部产生灰色霉层。病菌从叶缘侵染时，病斑呈弧形，初为水渍状，逐渐扩大呈黄褐色，有明显轮纹，上生灰霉。植株叶面有水滴、管理造成的伤口、生长衰弱容易感病。在冬季温室和春秋各种保护地生产发病较多。（2）药剂防治：同茄科蔬菜灰霉病防治方法。生菜灰霉病病斑生菜灰霉病霉层（1）症状：该病主要为害茎基部。最初病部为黄褐色水渍状，逐渐扩展至整个茎部发病，引起烂帮和烂叶。保护地湿度偏高时，在病部会产生浓密白色絮状菌丝，后期转变成黑色鼠粪状菌核。菌核病属于土传病害，病菌以菌丝体残留在土壤中越冬，病菌先侵染植株根茎部或基部叶片，受害病叶与相邻植株接触即可传染。保护地1—3月、11—12月发生重。生菜菌核病病株生菜茎部白色菌丝及菌核（2）药剂防治：同茄科作物菌核病防治方法。（1）症状：此病常在生菜生长中后期或者结球期发生，多从植株基部伤口处感染。初期呈半透明状，以后病部扩展呈不规则斑，水渍状并有浅灰色黏稠物，有恶臭气味，随病情发展病害沿基部向上扩展，使菜球腐烂。地势低洼、排水不良的地块、田间水肥管理不当、害虫数量多或因农事操作等造成的伤口多时发病严重。（2）药剂防治：同葫芦科细菌性角斑病防治方法。（1）为害特点：主要以幼虫钻食叶肉组织，在叶片上形成蛇形弯曲隧道，多为白色，发生严重时叶片在很短时间内就被钻花，导致叶片呈枯白色，严重影响植株的光合作用。潜叶蝇为害状潜叶蝇潜道内化蛹（2）药剂防治：同茄科作物潜叶蝇防治方法。（1）为害特点：以幼虫为害，初孵幼虫群集叶背，吐丝结网，在网内取食叶肉，留下表皮。3龄后将叶片吃成孔洞或缺刻，严重时将叶片食成网状，可钻蛀蔬菜的球茎。在露地秋茬作物上为害严重。甜菜夜蛾为害生菜（2）形态特征：是一种世界性分布、间歇性大发生的以为害蔬菜为主的杂食性害虫。①成虫。体长10～14毫米，翅展25～34毫米，体灰褐色。前翅中央近前缘外方有肾形斑1个，内方有圆形斑1个，后翅银白色。②卵：圆馒头形，白色，表面有放射状的隆起线。③幼虫。体长约22毫米。体色变化很大，有绿色、暗绿色至黑褐色。腹部体侧气门下线为明显的黄白色纵带，有的带粉红色，带的末端直达腹部末端，不弯到臀足上去。④蛹。体长10毫米左右，黄褐色。诱捕器（3）生物防治：性诱捕技术，在甜菜夜蛾发生时期，田间悬挂甜菜夜蛾诱芯，配套夜蛾类诱捕器。放置高度距地面1～1.5米为最佳。监测每公顷放置1套，防治每亩放1～2套，1个月左右更换一次诱芯。（4）药剂防治：可选用2.2%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐微乳剂2500～3000倍液、25克/升多杀霉素悬浮剂1000倍液或25%灭幼脲悬浮剂500～1000倍液对水喷雾。

以良种区域化，再配以优良的栽培管理技术，才能实现猕猴桃栽培的高产、稳产、优质、高效的目标。在栽培时间短、尚未实现规模化、产业化发展的地区，尤其应做好品种的引种、观察、筛选工作，建立良种区试基地，明确当地的最适栽培品种后，再大面积推广。对一个优良品种来说，最基本的要求是大果、优质、结果早、易丰产、耐贮运，品种的风味、口感应该适合当地群众的习惯。必须要考虑品种布局，应早、中、晚熟搭配，鲜食与加工品种搭配。适当减少中熟品种的发展，加大早熟、晚熟、极晚熟品种的栽培面积。将要发展的品种替代原有老品种，或者新发展品种的成熟期是原有品种群的上市空档。将发展的品种在本地必须生长良好，栽培管理容易，抗逆性强，抗病虫能力强。近几年，红心、黄心猕猴桃新品种相继出现并开始推广，具有很好的发展前景。一些特异品种，如白果品种、观赏品种也可以适量发展，以满足市场消费多样化的需求。苗木繁殖是猕猴桃优质丰产栽培的重要基础与技术环节，苗木质量的好坏直接影响猕猴桃结果及其产量、品质和经济寿命。自1978年以来，我国在借鉴新西兰猕猴桃产业苗木繁殖相关技术的基础上，针对我国特定的气候及栽培区域环境条件开展了猕猴桃繁殖方法的试验研究，并随着产业的迅速发展，建立了猕猴桃商品苗圃，不断研究和改进育苗方法和技术，保证了产业化发展中优质苗木的需求。种子采集是育苗成功的基础，选择充分成熟的果实取种，清洗出的种子放在室内摊薄晾干，然后用塑料袋封装后放入10℃以下低温冰箱贮藏备用。猕猴桃成熟的种子有休眠期，处在该时期的种子，即使温度、水分、空气等条件都已具备也不会发芽。必须创造适宜的外界条件，让种子度过休眠期，才能提高种子的发芽率和发芽整齐度。打破种子休眠主要用沙藏层积和变温处理2 种方法，其次是用激素处理。（1） 沙藏层积。将阴干的种子与5～10倍的湿润清洁消毒过的细河沙拌匀，细河沙湿度以用手捏能成团、松开团能散为宜，沙的含水量约为20%，然后将混匀好的种子用纤维袋 （或木箱） 装好，埋在室外地势高、干燥的庇荫处，并用稻草和塑料膜等覆盖，既防止雨雪侵袭又保证通透性，防止种子发霉腐烂。拌沙前种子用温水 （开水和凉水的比例为2 ∶ 1） 浸泡1～2天，效果更好。沙藏时间以40～60天最好，应不少于30天。（2） 变温处理。将种子放在4.4℃条件下6～8周，可以显著提高种子发芽率；或将种子放在4.4℃条件下2周以上，再进行变温处理，夜间10℃、白天20℃；或将种子贮藏于塑料袋内，放在4℃条件下5周，然后再经16小时的21℃和8小时的10℃变温处理，能得到更高的发芽率。（3） 激素处理。播种前用2.5～5.0克/升的赤霉素浸种24小时，亦可取得变温处理同样的效果。选择背风向阳、灌排方便的地方建苗圃，以富含有机质、疏松肥沃、呈中性或微酸性的沙质壤土播种为宜。为达到提早出苗，可采用塑料大棚或温室于12月至翌年1月播种，6月中下旬即可达到嫁接粗度。播种方法可采取条播或撒播。条播采用宽窄行；撒播是指将种子集中均匀撒在苗床上，出苗后达3片真叶即可移栽。播种后苗期管理是出苗率和苗木生长好坏的关键，特别是水分和遮阴的管理尤为重要；同时，需要及时清除杂草，保持苗木直立生长并及时摘心。对于1月播种或采用大棚播种的幼苗，于当年6月中旬苗木可达到嫁接粗度，实现当年播种、当年嫁接、当年成苗的效果，即猕猴桃 “三当” 育苗技术。嫁接是猕猴桃商品生产、保持品种特性的常用繁殖方法。我国对猕猴桃的嫁接方法研究颇多，针对猕猴桃枝梢生长特性，进行了嫁接方法的多种改进，嫁接技术也日益完善。我国在中华猕猴桃驯化的早期就开展了不同嫁接方法和时期的研究，逐步形成了劈接、舌接、切接、单芽枝腹接、皮下接、芽接等多种方法。除芽接仅在生长期使用外，其他方法除伤流期外，全年都可进行，春季伤流期之前是嫁接的最佳时期。除春季可采取扬接外，其他均在圃内嫁接。扬接 （相对常规圃内坐地嫁接，指掘起砧木于室内嫁接后再植于圃地），即在休眠期，提前将砧木挖出集中假植，在室内进行嫁接，比传统的室外坐地嫁接提高了嫁接速度和嫁接成活率。另外，提前将砧木挖出假植，推迟伤流期，可延长嫁接时间，且不受外界天气的影响，嫁接成活率可达95%。无论采用何种方法嫁接，嫁接成活的关键在于4个字——快、准、紧、湿，即削刀要快，砧穗的接合部位形成层要对准，包扎要紧，伤口要密封，枝接时要留保护桩，保持结合部位的湿润和土壤的湿润。目前国内多采用中华猕猴桃和美味猕猴桃实生苗作砧木，且美味猕猴桃砧木嫁接植株长势旺，适应性较强。北方种植软枣时主要采用扦插苗或抗寒性强的软枣猕猴桃作砧木；用长叶猕猴桃作砧木嫁接中华猕猴桃和美味猕猴桃品种，能进一步增强耐旱、抗病能力。研究表明，砧木 “凯迈” 可以提高 “海沃德” 品种的花芽量及产量；用大籽猕猴桃嫁接中华猕猴桃，有树体矮化的表现特性。猕猴桃砧木品种的研究和选育相对滞后于猕猴桃产业的发展，选育抗性更强的专用砧木如抗旱、耐湿的砧木或耐碱的砧木，是提高猕猴桃优质高产及扩大适栽区域的重要研发方向之一。嫁接后管理的好坏对接芽成活和生长发育有着直接的影响，除了加强肥水管理外，应及时做好断砧、除萌、摘心、立支柱等各项工作。嫩枝扦插也叫绿枝扦插，是指当年生半木质化枝条作插条培育苗木的方法。嫩枝扦插主要在猕猴桃的生长期使用，一般在新梢半木质化后的5—8月进行。在避风、阴凉的地方建立插床，铺上干净细河沙或蛭石作基质。选择露水未干前采集插穗，粗度以直径0.4～1.0厘米为好，长度10～15 厘米，有2～3 个芽，剪好的枝条应置于阴凉避风场地或室内，扦插前用促进生根的生长调节剂处理基部切口。扦插时，插条入土深度为插条长的2/3，密度以插下后插条叶片不相互遮盖为准。插好后，浇足水，使基质与插条紧贴。盖上遮阳网调整光照强度，保持整个环境通风，同时需要调整好插床的湿度，有条件的地方可采用自动喷雾装置，则生根效果更好。硬枝扦插是指利用1年生休眠期的枝条作插条培育苗木的方法。因木质化枝条组织老化，较难生根，特别是中华猕猴桃和美味猕猴桃，在刚开始驯化利用时，国内认为几乎不能生根，而国外仅日本扦插成活，成活率为66.7%。为了解决异地引种的问题，中国科学院武汉植物园针对难生根的原因开展了大量的试验，如在插穗类型、处理插穗的药剂筛选、药剂的处理浓度及时间、插床的温度调节如加埋地热线升温等，选择最佳的处理组合，使生根成活率达90%。猕猴桃组织培养繁殖研究始于20世纪70年代，首次以猕猴桃茎段为材料，进行离体培养的研究。我国相继对猕猴桃不同器官，例如茎段、叶片、根段、顶芽、腋芽、花药、花粉、胚、胚乳进行了离体培养研究，并开展了组织培养技术有关基础理论及应用的研究。近年来，我国在猕猴桃转基因体系研究方面取得了一些进展，获得了不同器官的试管苗，利用种胚、下胚轴、子叶等培养愈伤组织分化苗，利用胚乳培养三倍体植株也获得了成功。对离体培养的猕猴桃茎段愈伤组织发生的组织学和形态发生学研究表明，愈伤组织起源于形成层和韧皮部，初生木质部也参与了愈伤组织形成。意大利将扦插和组织培养相关技术集成，应用在商业化苗木繁殖，快速地为生产提供了大量优质苗木，即用组织培养产生大量幼小茎段为材料，用扦插繁殖的方法在棚内养苗，带钵移植，1年上架分枝，主干粗2厘米，长势旺；翌年即可结果。由于猕猴桃在长期系统发育过程中形成了 “三喜” “五怕”的特性，因此，在建园时必须充分考虑猕猴桃对环境条件的要求，尤其是气候条件、土壤条件和社会经济条件要满足猕猴桃生产的需求。因此我们建议各地果农在建园时，必须做到 “五要”，即态度上要有发展的积极性，环境上要有适宜的生态条件，产品上要有一定的发展规模，资金上要有相应的投资能力，科技上要有切实可行的技术保障。猕猴桃直插建园是将插条一次性扦插于植株栽植穴中，直接培育成苗的一种快速建园方法。由于繁苗与建园一次到位，方便简便，施工容易，建园成本低，在管理良好的条件下，苗木生长迅速健壮，一般翌年即可开始结果。由于直插建园枝条扦插的地方不仅是苗木培育的场所，也是今后植株生长的地方，所以一定要准备好栽植沟。先挖好宽0.6～0.8 米、深0.8 米的定植沟，沟底填入切碎的玉米秸秆，然后再用混合好的表土与有机肥将沟填平，并灌1次透水使沟内土壤沉实。按植株行距要求将定植沟内土壤翻锄、整平，做成宽度为60厘米的平畦。直插建园多用长条扦插，即1个插条上至少要保留2～3个芽眼，有利于插条发根和幼苗生长。在扦插时可按规定的株距，在定植沟的覆膜上先用前端较尖的小木棍在扦插穴上打2～3个插植孔。为了保证每个定植穴上都有成活的植株，一般每个插穴上应沿行向斜插2～3个插条，插条间距离10厘米，形成 “八” 字形，插条上部芽眼与地膜相平，扦插后及时向插植穴内浇水，为了保证良好的育苗效果和促进苗木健壮生长，直插建园时定植带应铺盖地膜，膜的周边用细土压实。覆膜能有效提高地温，并有保墒和减少杂草为害的作用。栽苗建园是整地后按一定的密度定植实生苗的建园方式。栽苗建园的优点是建园成本低，定植实生苗成活率高，品种搭配比较容易掌握，株行距规范，树体大小一致，生长旺盛，便于整形，便于集约化经营管理，早期丰产、稳产。在栽苗建园时，行距控制在4米左右，株距应保持在2米左右。先在种植园里挖深60厘米、长宽均为1米的定植坑，在坑内施足基肥，不但可以节省肥料，还有利于树体吸收养分。定植时，在坑内覆一层土再栽实生苗，否则会造成烧苗现象。栽好的实生苗经过1年生长后再高接，有利于成活。接口应距地面40厘米以上，避免接口冻害，一旦高接成活，则去除实生苗全部分枝，以免争夺养分。

SNP （单核苷酸多态性） 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的 DNA 序列多态性，包含单个碱基的转换、颠换等。InDel是指插入/缺失 （Insertion/Deletion） 基因组中小片段的插入和缺失序列，个体重测序中特指1～50 bp 的小片段插入和缺失。在生物的进化进程中，生物全基因组水平上积累了大量的微小变异，主要包括SNP 和InDel。这些微小变异的变异程度决定了物种之间在表型和生理结构等方面的差异，为新物种的形成提供了最原始的动力，是物种多样性的本质体现。SNP 标记是基因组DNA序列中分布最广泛的一类标记，植物基因组中平均每数百bp就存在着一个SNP （Huang et al.，2010；Qi et al.，2013）。InDel标记也是一种重要的遗传标记，已被广泛应用于图位克隆、基因定位、动植物遗传多样性的鉴定、分子标记辅助育种等领域（Jander et al.，2002；Schnabel et al.，2005；王岩等，2009；王明军等，2010）。随着高通量测序技术的快速发展，利用全基因组重测序（whole genome re-sequencing，WGR） 技术结合混合分组分析法（bulked segregate analysis，BSA） 可高效检测出通过双亲杂交建立的后代群体中导致表型变异的 QTL和突变位点 （Abe et al.，2012；Takagi et al.，2013），并且可以识别大量的 SNP 和 InDel 位点，从而进行SNP 及InDel标记的开发，获得基因区间的SNP 及InDel标记。本研究利用WGR技术及 BSA法相结合，获取与抗炭疽菌叶枯病基因相关的SNP 和InDel位点，并通过对△ （SNP-index） 图谱分析，快速锁定抗病区域，再通过ANNOVAR软件分析，提取注释信息，筛选出候选的抗病基因。并利用实时荧光定量 PCR （qRT-PCR） 技术对候选基因经过炭疽叶枯病病原菌侵染后的不同时间段基因表达量的变化进行分析，寻找响应炭疽叶枯病病原菌侵染的抗病相关基因并对其进行详细的功能分析，以期揭示苹果抗炭疽菌叶枯病的分子机制。用于全基因组重测序的材料为 ‘金冠’ ‘富士’ 及第三章中经过抗病鉴定的 ‘金冠’ב富士’ 的 F1 代群体中极端抗炭疽菌叶枯病的20个单株和极端感炭疽菌叶枯病的20 个单株。取其嫩叶3～5 片，液氮速冻，置于-70℃冰箱保存，用于提取DNA。用于qRT-PCR 分析的材料为 ‘富士’ 和 ‘金冠’ 带嫩叶的一年生健壮新梢各30 枝，用于室内人工离体接种。接种方法同第二章，分别于接种后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h七个时间点采集叶片，液氮速冻后，用于提取RNA，检测基因表达。参考Doyle和Doyle （1987） 及 Cullings （1992） 提取基因组DNA的CTAB法，并加以改进，详见第三章。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的纯度和完整性。条带单一、清晰明亮、无降解、无污染的DNA样品作为合格样品用于后续研究。运用NanoPhotometer ? 分光光度计 （IMPLEN，CA，USA） 对DNA的纯度进行检测。DNA经过 Qubit ? DNA Assay Kit in Qubit ? 2.0 Flu-rometer （Life Technologies，CA，USA） 进行浓度的精确定量。将DNA浓度调整为100 ng/μl。苹果嫩叶总RNA的提取方法如下。（1） 将500 μl裂解液RLT Buffer、50 μl PLANTaid、5 μl β-巯基乙醇，依次加入灭菌的1.5 ml离心管中，混匀，待用。（2） 将冻存于-70℃下的苹果嫩叶0.2 g置于预冷的研钵中，加少量液氮快速研磨成细粉状后转入上述待用的的离心管内 （样品容易褐化，动作要迅速，并保证液氮挥发完全）。（3） 56℃温育5～10 min，期间不断剧烈震荡混匀，以保证充分裂解。（4） 12000 r/min 离心10 min，将离心管缓慢从离心机中取出，将上清液转到新离心管中 （吸取上清液时一定要缓慢，尽量不要吸到底部沉淀）。（5） 较精确估计上清液体积，加入 0.5 倍体积的无水乙醇，盖盖，上下颠倒混匀，此时可能会出现沉淀，但是不影响提取的过程。（6） 将混合物 （每次上样应小于800 μl，可分两次加入） 加入吸附柱中，12000 r/min离心60 s，弃废液。（7） 在吸附柱中加700 μl去蛋白液 RW1，室温下放置5 min （可稍延长时间，去除吸附柱上的蛋白污染），12000 r/min 离心30 s，弃废液。（8） 在吸附柱中加入 500 μl 漂洗液 RW （加过无水乙醇），12000 r/min离心 30 s，弃废液。再加入 500 μl 漂洗液 RW，重复1遍。（9） 将吸附柱放回空收集管中，12000 r/min空离心2 min，尽量除去吸附柱中残留的漂洗液。（10） 将吸附柱放入一个 RNase free 离心管中，在吸附膜上加40 μl RNase-free water （最好事先在 70～90℃中水浴加热），室温放置2 min，12000 r/min 离心1 min，如需RNA浓度较高，可重复离心1次。（11） 取4 μl RNA加入6×RNA Loading Buffer，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取的质量与纯度，并估测提取浓度。（12） 将检测质量好的RNA放入-70℃下保存备用。参照 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time） 试剂盒 （TaKaRa）。具体操作步骤如下 （全程冰上操作）。（1） 基因组 DNA 的去除。在 0.2 ml 灭菌的离心管中依次加入1 μg 总 RNA，2 μl 5×gDNA Eraser Buffer，1 μl gDNA Eraser，用RNase-Free水补足10 μl，42℃，2 min （或者室温5 min）；4℃。（2） 反转录反应。在0.2 ml灭菌的离心管中依次加入10 μl步骤1的反应液，1 μl PrimerScript RT Enzyme Mix I，1 μl RT Primer Mix，4 μl 5×PrimerScript Buffer 2 （for Real Time），用 RNase Free 水补足20 μl。37℃，15 min；85℃，5 s；4℃。（3） 质量检测。用 β-actin 基因的引物对反转录的 cDNA 进行PCR扩增，并用1%的琼脂糖电泳检测，选取质量好的样品在-20℃下保存备用。将 ‘金冠’ב富士’ 的F1 代群体中选取出的 20 个极端抗病的单株和20个极端感病的单株DNA等量混合构建成两个表型池。检验合格的4 份 DNA 样品每份取1.5 μg进行基因文库的构建。通过Covaris破碎机将DNA样品随机打断成长度为350 bp的片段。采用TruSeq Library Construction Kit 进行建库，严格使用说明书推荐的试剂和耗材。DNA 片段经末端修复、加 ployA 尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。构建好的文库通过 illumina HiSeqTM PE150进行测序 （附图4-1）。文库构建完成后，先使用 Qubit 2.0 进行初步定量，稀释文库至1 ng/μl，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段 （insert size） 进行检测，符合预期后，使用Q-PCR 方法对文库的有效浓度进行准确定量 （文库有效浓度＞2 nM），以保证文库质量。4个文库检验合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行 Illumina HiSeq TM PE 150 测序。围绕350 bp的片段进行双末端 125 bp 测序。表型差异的两个亲本测序深度为10 X，抗感池测序深度为20 X。信息分析的主要步骤如下 （附图4-2）。步骤一：对下机得到的原始测序数据 （Raw data） 进行质控得到有效测序数据 （Clean data）。步骤二：将Clean data比对到参考基因组上。步骤三：根据比对结果，进行 SNP、InDel 的检测，分析 SNP、InDel的分布情况并进行注释。步骤四：对子代SNP 频率差异进行分析。步骤五：根据分析结果对目标性状区域进行定位。步骤六：确定候选基因。测序得到的原始测序序列 （Sequenced Reads或者 raw reads），里面含有带接头的、低质量的 reads。为了保证信息分析质量，必须对raw reads过滤，得到有效测序序列 （clean reads），后续分析都基于clean reads。数据处理的步骤如下。一是去除带接头 （adapter） 的reads pair。二是当单端测序read中含有的N的含量超过该条read长度比例的10%时，需要去除此对paired reads。三是当单端测序read中含有的低质量 （Q≤5） 碱基数超过该条read长度比例的 50%时，需要去除此对paired reads。有效测序数据通过 BWA （http：//bio-bwa.sourceforge.net/） 软件 （Li and Durbin，2009） 与 ‘金冠’ 苹果的基因组 （ https：//www.rosaceae.org/data/download） 进行比对，确定reads在基因组上的位置。比对结果使用 SAMTOOLS （ http：//samtools.sourceforge.net/）软件进行SNP-calling （Li and Durbin，2009），发掘 reads 与参考序列以及 reads 之间的 SNP 位点，利用 SAMtools 软件中的 “rmdup” 指令去除序列文件中的重复。人们采用GATK3.3软件 （McKenna et al.，2010） 的UnifiedGeno-typer模块进行多个样本 SNP 和 InDel的检测，使用 VariantFiltration进行过滤，SNP 的过滤参数为：cluster Window Size 4，filter Expression“QD＜4.0 ‖ FS＞60.0 ‖ MQ＜40.0”，G filter “GQ＜20”。InDel的过滤参数为：cluster Window Size 4，filter Expression “QD＜4.0 ‖ FS＞200.0 ‖ ReadPosRankSum＜-20.0 ‖ InbreedingCoeff＜-0.8”。利用ANNOVAR软件 （Wang et al.，2010） 对 SNP 和 InDel 检测结果进行注释。SNP 频率的统计：SNP 频率是指所检测到的总的SNP 数与参考基因组序列的总长度的比值，是衡量一个物种变异程度和多态性的指标。转换颠换率的统计：分别统计发生转换和颠换的SNP 数目。子代 SNP 的频率 （Takagi et al.，2013），即 SNP-index，是与SNP 位点的测序深度相关的参数，是指某个位点含有 SNP 的 reads数与测到该位点的总 reads数的比值。以参考基因组作为参照，分析计算两个子代在每个 SNP 位点的 SNP-index。SNP-index计算方法如附图4-3所示。若该参数为0，则代表所有测到的reads都来自作为参考基因组的亲本，即 ‘金冠’。参数为1则代表所有的reads都来自另一个亲本，即 ‘富士’。参数为0.5，代表此混池中的 SNP 来自两个亲本的频率一致。为减少测序错误和比对错误造成的影响，对计算出 SNP-index后的亲本多态性位点进行过滤，过滤标准如下。（1） 两个子代中 SNP-index 都小于0.3，并且 SNP 深度都小于7的位点，过滤掉。（2） 一个子代SNP-index缺失的位点，过滤掉。计算△ （SNP-index），即两个子代 SNP-index 作差：△ （SNP-index）=SNP-index2 （极端抗病性状）-SNP-index1 （极端感病性状）。为直观反映△ （SNP-index） 在染色体上的分布情况，对其在染色体上的分布进行作图。默认选择1 Mb 为窗口，1 kb 为步长。进行1000次置换检验，选取95%置信水平作为筛选的阈值。为了不忽略掉微效QTL的影响，在全基因组范围内挑选两个子代在SNP-index差异显著的SNP 位点，即挑选子代2 （极端抗病性状） SNP-index大于0.7，且子代1 （极端感病性状） SNP-index小于0.3的位点，并与亲本 ‘富士’ 为纯合及亲本 ‘金冠’ 为杂合的位点取交集，做为候选的基因位点。提取ANNOVAR的注释结果，优先挑选使基因获得终止密码子的变异 （stop loss） 或者使基因失去终止密码子的变异 （stop gain） 或者非同义突变 （missense） 或可变剪接的位点（Splicing） 所在的基因作为候选基因。从网站 https：//www.rosaceae.org/gb/gbrowse/malus_x_domestica/下载候选基因的 mRNA，从基因编码区核苷酸序列的近3’端位置设计引物，PCR产物长度在150～250 bp，引物序列见表4-1，内参基因为β-actin基因。荧光定量 PCR 在罗氏 LightCycler 480 系统上进行，反应体系配制按 SYBR Green PCR Master Mix 说明书进行操作，具体如下：10.0 μl SYBR Premix Ex Taq Ⅱ （2×），0.8 μl正反向引物，2.0 μl cDNA，去离子水补足20 μl。反应程序为95℃ 预变性5 min，95℃ 10 s变性，55℃ 10 s退火，72℃ 10 s延伸，扩增45 个循环。循环结束后进行熔解曲线分析：95℃ 15 s，60℃ 20 s，然后缓慢升温至95℃。基因的相对表达量用公式：F=2-ΔΔCt，ΔΔCt=（待测组目的基因 Ct值-待测组内参基因 Ct值）-（对照组目的基因 Ct值-对照组内参基因Ct值）。Illumina HiSeqTM PE150 测序平台，四个样本共产生 47.115 G的测序原始数据 （Raw data），通过对原始数据中的接头序列，低质量碱基以及未测出的碱基 （用 N 表示） 进行过滤后，得到有效数据 （Clean data） 46.974 G，各样本的 Raw data 在 7774.247～17017.174 Mb，Clean date 在7751.990～16969.215 Mb，过滤后获得的有效数据比率在99.64%～99.72%，碱基错配率低于0.05%。测序质量 Q20 ≥ 95.08%、Q30 ≥ 88.97%，GC 含量在 39.04%～39.16%。这表明所有样本的数据量充足，测序质量很高，GC 分布正常，建库测序成功，保证了后续数据分析的准确性 （表4-1）。样本原始数据/bp有效数据/bp有效率/%错误率/%Q20/%Q30/%GC含量/%富士7774246500775199010099.710.0395.4389.6339.16金冠7900566600787192650099.640.0395.5589.8839.05BR（基因抗池）170171739001696921590099.720.0395.4489.6239.04BS（基因感池）144234894001438116750099.710.0495.0888.9739.15表4-1 测序数据质量概况将四个样品的有效数据与已经发布的金冠苹果参考基因组序列（https：//www.rosaceae.org/data） 进行比对，计算出比对到参考基因组 （参考基因组大小为609314018 bp） 上的 reads条数、测序深度及碱基覆盖率。结果表明，四个样品的比对率均在87%以上，两个亲本的测序深度达到15×以上，抗感池样品的测序深度达到 30×以上。在参考基因组中至少有1个碱基覆盖的位点占基因组的比例达到95%以上，至少有 4 个碱基覆盖的位点占基因组的比例 “富士” 为88.3%，“金冠” 为91.26%，其他两样品达到96%以上。这进一步的说明，本试验测序的数据质量很高，可用于后续的变异检测及相关分析 （表4-2）。样本比对到reference上的reads条数①有效测序数据的reads总条数比对率/%②平均测序深度/x③参考基因组中至少有1个碱基覆盖的位点占基因组的百分比/%参考基因组至少有4个碱基覆盖的位点占基因组的百分比/%富士455966535167993488.2315.9595.9588.3金冠459536665247951087.5615.6798.0991.26BR（基因抗池）10045340711312810688.834.4298.896.67BS（基因感池）8962925610163794888.1830.8898.7896.44表4-2 测序深度及覆盖度统计通过全基因组重测序技术共获得3399950个 SNP 位点，苹果参考基因组总长度为 609314018 bp，据此计算出 SNP 出现的频率为3399950/609314018=0.56%。转换 （T/C、C/T） 和颠换 （T/G、T/A、C/A、C/G） 发生频率 （附图 4-4） 的统计结果显示，T/C 和C/T转换发生的频率分别为 32.5%和 34.1%，T/G、T/A、C/A和C/G颠换发生的频率分别为 9.2%、9.4%、9.4%、5.4%。转换/颠换率为2.0。利用测序获得的有效数据，比对苹果参考基因组序列，经 ANN-OVAR软件分析共得到 SNP 位点 3399950个，InDel 位点 573040个，SNP 位点位于内含子上的465317个，位于外显子上的436309个，其中同义变异 210404个，非同义变异 220539个，InDel 位点位于内含子上的 108996个，位于外显子上的 19957个，其中插入或缺失3 或 3 的整数倍的碱基，不改变蛋白质的编码框的有 6928个。这表明绝大部分变异位于非编码区，或不会导致基因编码的改变，这有利于维持植物体正常的生长发育，保证品种特性的稳定遗传 （表4-3）。类别SNP数量基因上游184156获得终止密码子4837失去终止密码子529外显子同义变异210404非同义变220539内含子465317剪接位点2196基因下游177312基因上游/基因下游12750基因间区2105122转换2265734颠换1134216转换/颠换/%1.997合计3399950表4-3 SNP及InDel检测及注释类别InDel数量基因上游51816获得终止密码子376失去终止密码子68Frameshiftdeletion①7330外显子Frameshiftinsertion5255Non-frameshiftdeletion②3843Non-frameshiftinsertion3085内含子108996剪接位点598基因下游44305基因上游/基因下游3896基因间区342800插入262868缺失310172合计573040表4-3 SNP及InDel检测及注释（续）-1△ （SNP-index）=SNP-index B （极端抗病性状）-SNP-index A （极端感病性状）。进行1000次置换检验，选取95%置信水平作为筛选的阈值。一般情况下，在苹果 F1 群体中，由于每个位点的碱基均来源于双亲中的一个，所以在基因组中大部分区域的 SNP-index都在0.5附近。如果某个SNP 位点与抗性相关，那么在该处的 SNP-index就会显著偏离0.5，△ （SNP-index） 就会显著大于此处的阈值。从抗感池中△SNP-index值在染色体上的分布可以看出，在第15 条染色体2～5 Mb区间内△SNP-index值显著的大于阈值，预示着该区域内可能存在着与抗炭疽菌叶枯病基因相关的位点 （附图4-5）。这与第三章SSR标记所确定的抗性基因所在的区域吻合。在全基因组范围内挑选在两个子代池中 SNP-index 差异显著的SNP 位点，即挑选在抗池中 SNP-index 大于 0.7，在感池中 SNP-index小于0.3，△ （SNP-index） 大于 0.5 的 SNP 位点，并与亲本‘富士’ 为纯合，亲本 ‘金冠’ 为杂合的位点取交集，共得到258 个候选的多态性标记位点 （表4-4）。这258 个 SNP 位点中位于基因上游1 kb的19个，基因下游1 kb 的12 个，位于基因上游1 kb 区域，同时也在另一基因的下游1 kb区域的2 个，位于基因间区的173 个。位于外显子上非同义变异的13 个，同义变异7 个，位于内含子上的31个。其中位于第15条染色体上的有123 个，占整个候选 SNP 位点的47.7%。类别SNP数量基因上游19获得终止密码子0失去终止密码子0外显子同义变异7非同义变13内含子31剪接位点1基因下游12基因上游/基因下游2基因间区173转换161颠换97转换/颠换/%1.659合计258表4-4 候选多态性标记位点的注释提取ANNOVAR的注释结果，优先挑选能引起基因获得终止密码子、失去终止密码子的变异，或者非同义突变，或者可变剪接的位点所在的基因作为候选基因。经筛选后得到33 个 SNP 位点及所对应的29个候选基因 （表4-5）。这些SNP 位点中发生转换的 （G/A、C/T、T/C、A/G） 共 16 个，占 48.5%，发生颠换的 （G/C、C/G、G/T、A/C、A/T、T/G、T/A、C/A） 共17 个占51.5%，其中有21 个位于第15条染色体上。基因ID类型染色体SNP位点参考基因组碱基型Ref突变碱基型AltMDP0000294705nonsynonymous24029182TCMDP0000311597upstream26560007TCMDP0000335197upstream238255166CTMDP0000481284nonsynonymous511687941TCMDP0000266783nonsynonymous516570950ACMDP0000223383upstream814935907CTMDP0000203531upstream918259400TGMDP0000265695upstream919790733GAMDP0000224187nonsynonymous1034991229ATMDP0000226279upstream1123158805AGMDP0000480608upstream123704417TGMDP0000504610upstream1229472316TCMDP0000292279upstream151396770CTMDP0000686092nonsynonymous153955717AGMDP0000686092nonsynonymous153955724AGMDP0000686092nonsynonymous153955738TAMDP0000205432nonsynonymous154094431TAMDP0000120033upstream154236293AGMDP0000864010nonsynonymous154257246GAMDP0000945764nonsynonymous154336468CAMDP0000149107splicing154970310CTMDP0000609131upstream156771435CAMDP0000169753upstream157074724ACMDP0000296372upstream157704309CT表4-5 候选基因ID基因ID类型染色体SNP位点参考基因组碱基型Ref突变碱基型AltMDP0000199827upstream157710714TAMDP0000194508nonsynonymous157757532GAMDP0000320004upstream158084422ATMDP0000320004upstream158084636TCMDP0000320004upstream158084637ACMDP0000148808upstream158365795GTMDP0000133266upstream1533862275AGMDP0000157213nonsynonymous1549031042CGMDP0000169687nonsynonymous1552444208TC表4-5 候选基因ID（续）-1结合 SSR标记定位及全基因组重测序中对△ （SNP-index） 值分析的结果，从这29 个候选基因中筛选出位于第15 条染色体3.9～4.9 Mb距离内的5个基因 MDP0000686092、 MDP0000205432、MDP0000120033、 MDP0000864010、 MDP0000945764 做为抗炭疽菌叶枯病的最终候选基因。通过对5个候选基因进行 GO 功能富集分析发现，5 个候选基因中有3个功能未知。基因 MDP0000120033 具有核酸绑定功能，锌离子结合分子功能，参与 RNA 剪切生物过程，调节基因产物的表达。蛋白结构上具有CCHC型结构域的锌指结构，是丝氨酸精氨酸富集剪接因子。进一步同源比对该基因为 SR基因家族 RSZ亚家族基因，与拟南芥AtRSZ21蛋白的序列一致性达到60%，与花生AdRSZ21蛋白的序列一致性达到79%。基因 MDP0000864010 具有辅酶绑定功能，蛋白结构上具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 （磷酸盐） NAD （P） 绑定区域，属于NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族，进一步的同源性比对，该蛋白与鼠李糖生物合成酶 1 （rhamnose biosynthetic enzyme 1，RHM1） 有较高同源性 （表 4-6）。候选基因编码的氨基酸序列见附录五。基因ID基因功能注释MDP0000686092功能未知蛋白MDP0000205432功能未知蛋白质。MDP0000120033核酸绑定功能，锌离子结合分子功能，参与RNA剪切生物过程，调节基因产物的表达。具有锌指结构，CCHC型结构域，丝氨酸精氨酸富集剪接因子。MDP0000864010辅酶绑定功能，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸盐）NAD（P）绑定区域，NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族，可能与鼠李糖生物合成酶1有关。MDP0000945764功能未知蛋白表4-6 抗炭疽菌叶枯病候选基因的功能注释利用TMHMM2.0软件对候选基因进行跨膜结构分析，基因MDP0000686092和MDP0000120033具有跨膜结构。基因MDP0000686092具有1个跨膜区，基因MDP0000120033具有3个跨膜区，位置分别在153～172、187～209、214～236的区域内（附图4-6）。引物名称引物序列MDP0000686092基因荧光定量PCR引物P1-FP1-RF：5′-CAGGCTGGAGCGAAGTTTA-3′R：5′-CCTTTCTGTGATGGCATTGTT-3′MDP0000205432基因荧光定量PCR引物P2-FP2-RF：5′-GAAAAGCCAGCACCAGAAAC-3′R：5′-CGTATTCGTGGGGTTATAGAGC-3′MDP0000120033基因荧光定量PCR引物P3-FP3-RF：5′-TCTGGGAATGCTGCTAAAACTC-3′R：5′-GCAGGGCAGTAGTGAAGCAC-3′MDP0000864010基因荧光定量PCR引物P4-FP4-RF：5′-CGTGACCAATCGCCTAATA-3′R：5′-GGACGTGAGTGCCGTAGAC-3表4-7 荧光定量PCR引物引物名称引物序列MDP0000945764基因荧光定量PCR引物P5-FP5-RF：5′-TTTGCCAGCCTGTCAGAAGT-3′R：5′-AGTTGTAGAGGGAGGAGGAAGA-3′β-actin基因荧光定量PCR引物P6-FP6-RF：5′-CACTGCTTCTATGACTGGTTTTGA-3′R：5′-CTGGCATATACTCTGGAGGCTT-3′表4-7 荧光定量PCR引物（续）-1对接种炭疽菌叶枯病病菌后 0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h的 ‘富士’ 和 ‘金冠’ 枝条进行采样，提取 RNA，反转录成cDNA后，对5个候选基因的表达进行实时荧光定量分析。结果显示，5个基因均不同程度响应病原菌侵染 （附图4-7、 表4-7）。除了基因MDP0000864010在 ‘富士’ 叶片中的表达量表现为下调外，其余 4个基因均为上调表达。在 ‘富士’ 叶片中，基因 MDP0000205432、MDP0000120033和MDP0000945764 的表达量在接种后 24 h 均达到最高值，48 h降到最低值，然后又缓慢提高。在 ‘金冠’ 叶片中的表现不同于 ‘富士’，三个基因表达量的最高值出现在36 h，但最低值同样出现在48 h，这说明在这3个基因在抗病植株中对病原菌的应答要早于感病植株。尽管基因 MDP0000686092 和 MDP0000945764 在‘富士’ 和 ‘金冠’ 叶片中也均表现为上调表达，但是在 ‘金冠’ 叶片中的表达变化更为显著，基因 MDP0000945764 在 ‘金冠’ 叶片中的表达量达到最高值时为接种前的60 倍，而在 ‘富士’ 中的提高量为接种前的10倍。以上结果说明，5个候选基因均受炭疽菌叶枯病病菌的诱导，是苹果炭疽菌叶枯病抗病相关基因。SNP 标记的开发主要依赖于含有大量测序序列的数据库。通过全基因组测序，不仅可以获得大量的 SNP 标记，还可以了解到 SNP 标记在整个基因组中的分布情况，有利于我们进一步了解不同物种的生物学特性，以及利用标记进行不同需求的生物学研究。在葡萄的基因组测序中发现，SNP 位点的密度高达7%（Jaillon et al.，2007）；2010发表的金冠苹果全基因组序列中，SNP 标记的频率约为 4.4 kD/SM，即227 bp/SNP （Velasco et al.，2010）；梨的全基因组序列中共检测到3402159个 SNP 位点，约占基因组序列的 1.02%（Wu et al.，2013）；柑橘中得到的 SNP 位点数量为106 万个 （Xu et al.，2013）。对于有参基因组，通过全基因组重测序手段进行大量 SNP 标记开发，也是研究不同品种间差异的有效途径之一。通过对6 个玉米自交系的进行全基因组重测序，在非重复序列区域内共获得了 1272134个SNP 标记 （Lai et al.，2010）；对葡萄的230个基因片段重测序，数据统计结果显示，每64 个碱基中就存在着一个 SNP 位点 （Lijavetzky et al.，2007）；在水稻中，水稻籼稻恢复系 7302R 通过全基因组重测序，检测到307627个SNP 位点，其中有30239个位于mRNA序列中（Li et al.，2012b）；通过对苹果品种 ‘金冠’ 和 ‘红玉’ 进行全基因组重测序，在 ‘金冠’ 中得到了 2222816个 SNP 位点，在 ‘红玉’中得到了 4950346 个 SNP 位点，密度分别为 293 bp/SNP 和210 bp/SNP （孙瑞，2015）。SNP 变异从理论上来看主要包括转换、缺失、颠换和插入四种形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2∶1。并且SNP 在CG序列上出现的最为频繁，而且多是 C 转换为 T，主要原因为CG中的胞嘧啶常被甲基化，而后自发脱氨基形成胸腺嘧啶 T （Johnson and Told，2000；Mullikin et al.，2000）。从本实验中对 SNP转换/颠换频率统计结果来看，转换/颠换比为2.0，发生转换的频率为66.6%，发生颠换的频率为 33.4%，C/T 转换发生的频率最高为34.1%。这与前人研究的结论相符。通过重测序技术可以获得海量SNP 标记，利用这些标记构建高密度遗传连锁图谱为不同群体的进化分析，不同性状基因的遗传定位，分子标记辅助育种等提供有效信息。‘M.27’בM.116’ 的高密度遗传图谱是由306个SSR标记和2272个 SNP 标记组成，图谱密度达到了每 0.5 cM 一个标记 （Antanaviciute et al.，2012）。Khan 等（2012） 利用2875个分子标记构建了苹果的整合遗传图谱，其中包含了2033个 SNP 标记和 843 个 SSR 标记，总长为 1991.38 cM。Clark等 （2014） 利用3个不同的F1 杂交群体和SNP 芯片分型技术构建了包含1091个 SNP 标记的苹果品种 ‘Honeycrisp’ 的整合遗传图谱，标记间的平均距离为1.36 cM。基于高通量基因组重测序技术能够更加准确、全面的对测序物种进行全基因组水平上的位点进行评估，可以精确的完成单核苷酸多态性位点的检测，分子标记的开发，遗传图谱的构建，不同群体间的进化分析，与表型变异相关基因的挖掘以及快速定位等等。本研究通过运用全基因组重测序的方法对有着明显抗感性状分离的 ‘金冠’ 和 ‘富士’ 及其由 F1 代极端表型个体组成的抗感池进行全基因组范围内的遗传变异检测，共筛选得到 SNP位点3399950个，InDel位点573040个。通过对△SNP-index图谱的分析发现，在第15条染色体的2～5 Mb的区间内，△SNP-index显著的大于阈值，存在着明显的连锁不平衡，意味着该区域可能存在着抗炭疽菌叶枯病基因位点。这一结果与SSR标记所定位的抗炭疽菌叶枯病基因位点位置相吻合。SNP 广泛分布于基因组DNA中，且数量巨大。因为任何碱基均有可能发生变异，因此SNP 既有可能出现在基因的编码区，也有可能在基因的非编码区，或者两个基因之间的序列上。总的来说，位于基因内编码区的SNP 比较少，且该部分的 SNP 有可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此位于编码区 SNP 的研究更受关注。本试验对可能引起基因获得终止密码子、失去终止密码子、非同义突变、可变剪接的变异位点进行重点筛选，将其所在的基因作为候选基因。通过筛选共得到33个候选SNP 位点和29个候选基因。结合第三章SSR标记对炭疽叶枯病抗性基因的定位，最终锁定了 5 个候选基因： MDP0000686092、 MDP0000205432、 MDP0000120033、 MDP0000864010、MDP0000945764。锌指结构是一类在很多蛋白中存在的具有指状结构的模体，是具有识别特定碱基序列的一种转录因子结构。锌指的典型功能是作为互作的组件与核酸、蛋白质和小分子等多种物质相结合，参与多种细胞过程，如DNA的复制与修复、RNA 转录与翻译、物质代谢与信号转导、细胞的增殖与凋亡等 （Krishna et al，2003）。可变剪切 （Alternative splicing，AS） 是重要的转录后调控机制，在动物中对其在不同的生理以及病程条件下的可变剪切的调控作用研究的较多 （Garcia-Blanco et al.，2004；Nilsen and Graveley，2010）。据报道在拟南芥中超过 42%的外显子基因存在可变剪切现象（Filichkin et al.，2010）。在植物可变剪切数据库中有很大比例的 AS参与逆境响应基因的表达，这进一步强调了可变剪切在逆境响应中的重要作用 （Wang and Brendel，2006；Duque，2011）。在生物胁迫中，有许多试验证明AS参与植物的抵抗和防御机制。例如，在一些 R 基因中如番茄的N 基因，拟南芥的SNC1、 RPS4基因，发现可变剪切的存在 （Dinesh-Kumar and Baker，2000；Zhang and Gassmann，2003）。SR蛋白，丝氨酸/精氨酸富集剪切蛋白 （serine/arginine-rich proteins，SR protein） 是RNA绑定蛋白家族中功能和结构高度保守的一类因子，参与可变剪切过程。例如， AtSR30在高盐碱以及过氧逆境中被上调表达 （Tanabe et al.，2007）。SR在不同的环境条件下的表达量的差异说明了SR蛋白在逆境响应中的调控作用。基因MDP0000120033具有核酸绑定，锌离子结合分子功能，参与 RNA 剪切生物过程，调节基因产物的表达。具有CCHC型锌指结构和丝氨酸/精氨酸富集剪接因子，属于SR 基因家族 RSZ 亚家族基因。丝裂原活化蛋白激酶 MPK6 和MPK3在植物的防御反应中起着重要作用，而拟南芥基因 AtRSZ21 在体外试验中被发现能够被MPK6/MPK3磷酸化 （Feilner et al.，2005），这就意味着 AtRSZ21 也可能参与了植物的防御应答。Kumar 和 Kirti （2012） 报道了花生的一个属于 SR 亚家族基因 RSZ 蛋白基因AdRSZ21，在植物的超敏反应和抗逆反应中起着重要的作用。NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族是真菌病原体镰刀菌致病机制中的一个关键酶 （Srivastava et al.，2014）。细胞壁是植物细胞进行正常的生命活动不可缺少的重要组成部分。其不但在维持细胞形态、细胞间黏结、细胞壁的强度和调控细胞伸长等方面起着重要的作用，还参与了细胞的分化、抗病、细胞识别及信号传导等一系列生理、生化过程。细胞壁主要成分包含纤维素、半纤维素、果胶和少量的结构蛋白等。基因MDP0000864010属于依赖差向异构酶/脱氢酶家族，并且与鼠李糖合成酶Ⅰ （ RHMⅠ） 有较高的同源性。可能参与合成鼠李糖，而鼠李糖是细胞壁果胶多聚糖的重要组分之一。所以该候选基因有可能在细胞的组成层面增加个体的抗性。基因的相对表达量分析也表明，五个基因都不同程度的响应了病菌的诱导，是与抗炭疽菌叶枯病相关的候选基因。但是其参与抗病的机理和途径仍不清楚，深入的研究将继续展开。

（1）症状：该病全生育期均可发生，以生长中后期受害严重。主要为害叶片，叶柄、茎蔓次之。发病初期在叶正面或叶背面及茎蔓上产生白色近圆形小粉斑，以叶面居多，以后向四周扩散形成边缘不明显的连片白粉，即病菌的菌丝和分生孢子。发病后期，白色霉斑逐渐消失，病部呈灰褐色，病叶枯黄坏死。有时在病斑上长出黄褐色至黑褐色小粒点，即病菌的闭囊壳。田间湿度大，白粉病流行的速度加快。（2）药剂防治：可选用40%氟硅唑乳油8000倍液、10%苯醚甲环唑水分散粒剂2000～3000倍液、50%醚菌酯水分散粒剂3000～4000倍液、10%多抗霉素600～800倍液、30%氟菌唑可湿性粉剂1500～2000倍液喷雾防治。南瓜白粉病病叶黄瓜白粉病病叶正面黄瓜白粉病病叶背面（1）症状：主要为害根部，幼苗及移栽后的成株均可发病。受害植株表现为侧根和须根比正常植株增多，在幼嫩的须根上形成球形或不规则形瘤状物，大小随线虫寄生时间长短和数量而异，单生或串生。瘤状物初为白色，质地柔软，后呈褐色或暗褐色，表面粗糙、龟裂。受害植株多在结瓜后表现症状，地上部长势衰弱，叶片由下向上变黄、坏死，至全株萎蔫死秧。病害发生保护地重于露地，沙土常较黏土发生重。黄瓜根结线虫病地上部植株黄瓜根结线虫病植株根部（2）药剂防治：同茄科作物根结线虫病防治方法。（1）症状：苗期、成株期均可受害。可为害叶片、叶柄、卷须和果实，严重时也侵染茎蔓。子叶染病初呈水渍状近圆形凹陷斑，以后呈黄褐色坏死。真叶染病初为暗绿色水渍状多角形，以后变成淡黄褐色多角形病斑，湿度高时叶背溢出乳白色浑浊水膜状菌脓，干后留下白痕，病部质脆易破裂穿孔。茎蔓、叶柄、卷须染病，在病部出现水渍状小点，沿茎沟纵向扩展呈短条状，湿度高时溢出菌脓，严重时，纵向开裂呈水渍状腐烂，干燥时，茎蔓变褐干枯，表层留下白痕。瓜条染病呈现水渍状小斑，以后扩展成不规则形或连片，在病部溢出大量污白色菌脓，病菌侵入种子致种子带菌。在降水多、光照少、大水漫灌、地势低洼、排水不良、昼夜温差大及结露时间长的条件下，发病严重。黄瓜角斑病病叶正面黄瓜角斑病病斑破裂（2）药剂防治：可选用47%春雷霉素·王铜可湿性粉剂600～800倍液、72%农用链霉素可溶性粉剂4000～5000倍液、33.5%喹啉铜悬浮剂3000～4000倍液、20%噻菌铜悬浮剂500～600倍液喷雾防治。（1）症状：此病全生育期都可发生，主要为害叶片。子叶染病后初呈褪绿黄斑，扩大后呈黄褐色。真叶染病叶缘或叶背面出现水渍状病斑，逐渐扩大受叶脉限制呈多角形淡黄褐色或黄褐色斑块，湿度高时叶背面或叶面均长出灰黑色霉层，即病菌的孢囊梗和孢子囊。后期病斑连片致叶缘卷缩干枯，严重时植株一片枯黄。天气忽冷忽热、昼夜温差大、结露时间长、多阴雨、光照少的天气，以及地势低洼、浇水过多、种植过密的地块，均有利该病的发生和流行。黄瓜霜霉病病叶正面黄瓜霜霉病田间为害状甜瓜霜霉病病叶背面（2）药剂防治：可选用72%霜脲·锰锌可湿性粉剂600～800倍液、60%唑醚·代森联水分散粒剂1500～2500倍液、52.5%唑菌酮·霜脲氰水分散粒剂3500～4500倍液、72.2%霜霉威盐酸盐水剂600～800倍液喷雾防治。保护地也可选用45%百菌清烟剂0.5千克/亩熏烟防治。（1）症状：从幼苗到成株皆可发病，幼苗发病，多在子叶边缘出现半椭圆形淡褐色病斑，上有橙黄色点状胶质物；成叶染病，病斑近圆形，直径4～18毫米，灰褐色至红褐色，严重时，叶片干枯；茎蔓与叶柄染病，病斑椭圆形或长圆形，黄褐色，稍凹陷，严重时病斑连接，绕茎一周，植株枯死；瓜条染病，病斑近圆形，初为淡绿色，后成黄褐色，病斑稍凹陷，表面有粉红色黏稠物，后期开裂。（2）药剂防治：可选用70%甲基硫菌灵可湿性粉剂600倍液、60%苯醚甲环唑水分散粒剂6000～8000倍液、或60%唑醚·代森联水分散粒剂600～1000倍液喷雾防治。西瓜炭蛆病病叶黄瓜炭蛆病后期（1）症状：多在开花结瓜后陆续发病，病株初期表现为中下部叶片或植株一侧叶片褪绿，中午萎蔫下垂，早晚恢复，似缺水状，以后萎蔫叶片不断增多至逐渐遍及全株，最后整株枯死。茎蔓发病，在主蔓基部一侧形成长条形凹陷斑，湿度高时病茎纵裂，其上产生白色至粉红色霉层，剖茎可见维管束变褐，有时病部可溢出少许琥珀色胶质物。天气闷热潮湿，长期连作，管理粗放，施肥伤根等利于发病。甜瓜枯萎病黄瓜枯萎病病（左）健（右）维管束比较（2）药剂防治：可选用0.5%小檗碱水剂500倍液、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂400～500倍液、60%唑醚·代森联水分散粒剂600～1000倍液喷雾或灌根。（1）症状：全生育期均可发生，叶片、叶柄、茎蔓、瓜果均可受害，主要为害叶片和茎蔓。叶片病斑为近圆形或不规则形，或由叶缘向内发展呈“V”形或半圆形，茎蔓发病多在茎基和茎节附近，有时流出琥珀色或乳白色至红褐色胶状物，病茎纵裂呈乱麻状，维管束不变色；病部产生明显的小黑点。种子可带菌传播，条件适宜时病菌从气孔、水孔或伤口侵入引起发病，通过浇水、气流传播。黄瓜蔓枯病病茎（2）药剂防治：可选用80%代森锰锌可湿性粉剂600倍液、50%异菌脲可湿性粉剂800～1000倍液、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂600倍液喷雾或灌根。（1）症状：黄瓜绿斑驳花叶病毒病分绿斑花叶和黄斑花叶两种类型。绿斑花叶型苗期染病幼苗顶尖部的2～3片叶子现亮绿或暗绿色斑驳，叶片较平，产生暗绿色斑驳的病部隆起，新叶浓绿，后期叶脉透明化，叶片变小，引起植株矮化，叶片斑驳扭曲，呈系统性传染。瓜条染病现浓绿色花斑，有的也产生瘤状物，致果实成为畸形瓜，影响商品价值，严重的减产25%左右。黄斑花叶型其症状与绿斑花叶型相近，但叶片上产生淡黄色星状疱斑，老叶近白色。土壤黏重、偏酸，多年重茬，土壤积累病菌多的易发病。氮肥施用太多、生长过嫩、播种过密、株行间郁闭，抗性降低的易发病。肥力不足、耕作粗放、杂草从生的田块易发病。种子带菌或用易感病种子易发病。黄瓜病叶西瓜病叶（2）药剂防治：可选用20%盐酸吗啉胍·铜可湿性粉剂400～500倍液、6%寡糖·链蛋白可湿性粉剂600～800倍液、40%烯羟吗啉胍可溶性粉剂1000～1500倍液、0.5%菇类蛋白多糖水剂200～300倍液喷雾防治。（1）为害特点：此虫为黄瓜上常见害虫，成虫和若虫吸食植物汁液，被害叶片褪绿、变黄、萎蔫，除直接为害外，还可造成煤污病。粉虱成虫活动最适温度25～30℃。在生产温室条件下，一年可发生10余代，约1个月完成一代，冬季在室外不能存活，因此，冬季温室作物上的粉虱是露地蔬菜上的虫源，由春季至秋季持续发展，夏季高温多雨抑制作用不明显，到秋季数量达高峰。由于温室、大棚和露地蔬菜生产紧密衔接和相互交替，使粉虱周年发生，防治困难。烟粉虱为害黄瓜（2）药剂防治：同茄科作物烟粉虱的防治方法。（1）为害特点：主要以幼虫钻食叶肉组织，在叶片上形成由细变宽的蛇形弯曲隧道，多为白色，有的后期变为铁锈色，发生严重时叶片在很短时间内就被钻花干枯，至叶片坏死，严重影响植株的光合作用。温室可全年发生，大棚在初夏和秋季形成2个发生高峰期，露地7～9月为发生高峰期。潜叶蝇为害状（2）药剂防治：同茄科作物潜叶蝇防治方法。（1）为害特点：瓜蚜以成虫和若虫在瓜菜叶片背面和幼嫩组织上吸食作物汁液。瓜苗嫩叶和生长点受害后，叶片卷缩，瓜苗萎蔫，严重时导致植株枯死。老叶受害时，可使叶片提前老化枯死，缩短结瓜期或影响幼瓜生长，造成减产。除直接为害外，瓜蚜还可传播病毒病，造成进一步的为害和损失。黄瓜蚜虫（2）药剂防治：可选用10%吡虫啉可湿性粉剂1000～1500倍液、0.38%苦参印楝素500～750倍液、20%吡虫啉浓可溶剂4000倍液、5%桉油精乳油600～800倍液对水喷雾。（1）为害特点：以成虫和若虫锉吸瓜菜的嫩梢、嫩叶、花和果的汁液，使被害组织老化坏死，枝叶僵缩，植株生长缓慢，幼瓜表皮硬化变褐或开裂，严重影响产量与质量。蓟马为害黄瓜叶片（2）药剂防治：瓜菜生长期可选用1.8%阿维菌素乳油3000～4000倍液、10%吡虫啉可湿性粉剂2500倍液、60克/升乙基多杀菌素1500倍液、48%毒死蜱乳油1500倍液对水喷雾防治。

某市农药监督抽检工作中，在赵某门市部抽取的“高效氯氰菊酯”产品检出非登记农药成分马拉硫磷，含量为2.4%。根据检测结果，该“高效氯氰菊酯”产品被判定为假农药。该市农药执法人员收到检验报告后立即立案调查，查明赵某门市部购进该批次“高效氯氰菊酯”假农药80瓶，销售40瓶，销售收入400元。对此该市农业局依法给予行政处罚。（1）没收假农药高效氯氟氰菊酯40瓶；（2）没收违法所得400元整；（3）并处违法所得6倍罚款2400元整；罚没款合计2800元整。（1）假农药的判定依据为《农药管理条例》第三十一条：禁止生产、经营和使用假农药。下列农药为假农药：（一）以非农药冒充农药或者以此种农药冒充他种农药的；（二）所含有效成分的种类、名称与产品标签或者说明书上注明的农药有效成分的种类、名称不符的。赵某经营的高效氯氰菊酯中添加了马拉硫磷成分，与标签或者说明书上注明的农药有效成分种类、名称不符，因此判定为假农药。（2）处罚依据为《农药管理条例》第四十三条：生产、经营假农药、劣质农药的，依照刑法关于生产、销售伪劣产品罪或者生产、销售伪劣农药罪的规定，依法追究刑事责任；尚不够刑事责任的，由农业行政主管部门或者法律、行政法规规定的其他有关部门没收假农药、劣质农药和违法所得，并处违法所得1倍以上10倍以下的罚款；没有违法所得的，并处10万元以下的罚款；情节严重的，由农业行政主管部门吊销农药登记证或者农药临时登记证，由工业产品许可管理部门吊销农药生产许可证或者农药生产批准文件。（1）《中华人民共和国刑法》中的有关规定：第一百四十条【生产、销售伪劣产品罪】生产者、销售者在产品中掺杂、掺假，以假充真，以次充好或者以不合格产品冒充合格产品，销售金额五万元以上不满二十万元的，处二年以下有期徒刑或者拘役，并处或者单处销售金额百分之五十以上二倍以下罚金；销售金额二十万元以上不满五十万元的，处二年以上七年以下有期徒刑，并处销售金额百分之五十以上二倍以下罚金；销售金额五十万元以上不满二百万元的，处七年以上有期徒刑，并处销售金额百分之五十以上二倍以下罚金；销售金额二百万元以上的，处十五年有期徒刑或者无期徒刑，并处销售金额百分之五十以上二倍以下罚金或者没收财产。第一百四十七条【生产、销售伪劣农药、兽药、化肥、种子罪】生产假农药、假兽药、假化肥，销售明知是假的或者失去使用效能的农药、兽药、化肥、种子，或者生产者、销售者以不合格的农药、兽药、化肥、种子冒充合格的农药、兽药、化肥、种子，使生产遭受较大损失的，处三年以下有期徒刑或者拘役，并处或者单处销售金额百分之五十以上二倍以下罚金；使生产遭受重大损失的，处三年以上七年以下有期徒刑，并处销售金额百分之五十以上二倍以下罚金；使生产遭受特别重大损失的，处七年以上有期徒刑或者无期徒刑，并处销售金额百分之五十以上二倍以下罚金或者没收财产。（2）农业部公布的典型案件。农业部2014年1月公布的农资典型案件中，其中一起为某省某农化有限公司经营假农药案：2013年4月，某省一茶农投诉，称某农化有限公司经营假农药。经某省农业局调查，该公司销售的“甲氨基阿维菌素苯甲盐酸”为A省某农化有限公司生产，抽样送检结果为该农药含有未登记成分茚虫威，判定为假农药。茶农因使用该农药造成2.2万千克出口茶叶茚虫威残留超标，无法销售，经济损失20余万元。案件移送公安机关查处，A省某农化有限公司法定代表人被刑事拘留。某区农委接到群众举报，该区冯某的农资商店销售的“三唑酮”20%乳油产品销售价格低于其他同类产品，怀疑质量不合格。该区农委农药执法人员前往冯某的农资商店进行调查，查明冯某购进该批次“三唑酮”20%乳油产品32千克，已销售13.12千克，销售收入328元，并当场抽取“三唑酮”样品进行送检。检测结果显示“三唑酮”含量为8%，判定为劣质农药。对此该区农委进行了依法查处。（1）没收劣质农药“三唑酮”18.24千克；（2）没收违法所得人民币328元整；（3）处违法所得8倍罚款人民币2624元整。罚没款合计2952元整。劣质农药的判定依据是《农药管理条例》第三十二条：禁止生产、经营和使用劣质农药。下列农药为劣质农药：（一）不符合农药产品质量标准的；（二）失去使用效能的；（三）混有导致药害等有害成分的。此案中“三唑酮”产品中三唑酮的含量检测为8%，低于产品标准值20%，属于“不符合农药产品质量标准”，因此判定为劣质农药。（2）处罚依据是《农药管理条例实施办法》第三十八条第一项：生产、经营假农药的，劣质农药有效成分总含量低于产品质量标准30%（含30%）或者混有导致药害等有害成分的，没收假农药、劣质农药和违法所得，并处违法所得5倍以上10倍以下的罚款；没有违法所得的，并处10万元以下的罚款。《农药管理条例实施办法》对“不符合农药产品质量标准的”劣质农药在处罚上进行了分类，其第三十八条中规定：对生产、经营假农药、劣质农药的，由农业行政主管部门或者法律、行政法规规定的其他有关部门，按以下规定给予处罚：（一）生产、经营假农药的，劣质农药有效成分总含量低于产品质量标准30%（含30%）或者混有导致药害等有害成分的，没收假农药、劣质农药和违法所得，并处违法所得5倍以上10倍以下的罚款；没有违法所得的，并处10万元以下的罚款。（二）生产、经营劣质农药有效成分总含量低于产品质量标准70%（含70%）但高于30%的，或者产品标准中乳液稳定性、悬浮率等重要辅助指标严重不合格的，没收劣质农药和违法所得，并处违法所得3倍以上5倍以下的罚款；没有违法所得的，并处5万元以下的罚款。（三）生产、经营劣质农药有效成分总含量高于产品质量标准70%的，或者按产品标准要求有一项重要辅助指标或者二项以上一般辅助指标不合格的，没收劣质农药和违法所得，并处违法所得1倍以上3倍以下的罚款；没有违法所得的，并处3万元以下罚款。（四）生产、经营的农药产品净重（容）量低于标明值，且超过允许负偏差的，没收不合格产品和违法所得，并处违法所得1倍以上5倍以下的罚款；没有违法所得的，并处5万元以下罚款。某区农业局农药执法人员在市场检查中发现，甲公司销售的“氯虫酰胺”30%水分散粒剂，其标签标称生产企业为A农药生产公司，农药登记证号为LS20070268。经查LS20070268为B农药生产公司的“甲氨基阿维菌素苯甲酸盐”已过期农药临时登记证号。初步判定该“氯虫酰胺”30%水分散粒剂为未取得农药登记证或农药临时登记证产品。该公司销售“氯虫酰胺”30%水分散粒剂23400袋，销售收入合计11700元。执法人员依法对甲公司经营未取得农药登记证产品行为进行了立案查处。（1）责令停止经营未取得农药登记证的“30%氯虫酰胺水分散粒剂”农药；（2）没收违法所得人民币11700元整；（3）并处违法所得2倍的罚款人民币23400元整。罚没款合计35100元。（1）该案例违规行为判定依据为《农药管理条例》第三十条第二款规定：任何单位和个人不得生产、经营、进口或者使用未取得农药登记证或者农药临时登记证的农药。该“氯虫酰胺”30%水分散粒剂产品假冒了其他生产企业的农药临时登记证号，其标称的生产企业A农药生产公司涉嫌假冒农药临时登记证号，而甲公司经营该产品构成了“经营未取得农药登记证或农药临时登记证产品”行为，违反了《农药管理条例》第三十条第二款的规定。（2）处罚依据是《农药管理条例》第四十条：有下列行为之一的，依照刑法关于非法经营罪或者危险物品肇事罪的规定，依法追究刑事责任；尚不够刑事处罚的，由农业行政主管部门按照以下规定给予处罚：（一）未取得农药登记证或者农药临时登记证，擅自生产、经营农药的，或者生产、经营已撤销登记的农药的，责令停止生产、经营，没收违法所得，并处违法所得1倍以上10倍以下的罚款；没有违法所得的，并处10万元以下的罚款。（1）《农药管理条例》第四十二条对假冒、伪造农药登记证行为的责任与处罚作出如下相关规定：假冒、伪造或者转让农药登记证或者农药临时登记证、农药登记证号或者农药临时登记证号、农药生产许可证或者农药生产批准文件、农药生产许可证号或者农药生产批准文件号的，依照刑法关于非法经营罪或者伪造、变造、买卖国家机关公文、证件、印章罪的规定，依法追究刑事责任；尚不够刑事处罚的，由农业行政主管部门收缴或者吊销农药登记证或者农药临时登记证，由工业产品许可管理部门收缴或者吊销农药生产许可证或者农药生产批准文件，由农业行政主管部门或者工业产品许可管理部门没收违法所得，可以并处违法所得10倍以下的罚款；没有违法所得的，可以并处10万元以下的罚款。（2）农业部公布的典型案件。农业部2011年8月公布了一批农资典型案件，其中一起为某市农药公司冒证生产农药案件：2011年3月，某市农委查处了某农药有限公司冒证生产农药案。该公司2011年1—3月分别假冒农药登记证号LS20020422、PD20084475及PD20070031生产“3%辛硫磷”等7个农药品种，累计售出470.5吨，货值18.92万元。现场发现约15万只纸包装箱、70万个塑料包装袋、3万条编织袋，初步认定涉案金额360万元。此案移交公安机关立案侦查，该公司法人代表被刑事拘留。某区农业局农药执法人员在市场检查时，发现某农资店经营的“大黄素甲醚0.5%水剂”产品标签与登记备案的标签内容不符，属于擅自修改标签内容农药产品。执法人员随即依法立案调查，调查该农资店已销售擅自修改标签内容的“大黄素甲醚0.5%水剂”产品360瓶，获违法所得1800元。该区农业局依法对此进行了行政处罚。（1）给予警告；（2）没收违法所得1800元；（3）处违法所得2倍罚款3600元。罚没款合计5400元。本案处罚依据为《农药标签和说明书管理办法》第三十一条，以及《农药管理条例》第四十条。《农药标签和说明书管理办法》第三十一条第一款规定：经核准的标签和说明书，农药生产、经营者不得擅自改变标签内容。需要对标签和说明书进行修改的，报农业部重新核准。《农药管理条例》第四十条规定：有下列行为之一的，依照刑法关于非法经营罪或者危险物品肇事罪的规定，依法追究刑事责任；尚不够刑事处罚的，由农业行政主管部门按照以下规定给予处罚：……（三）生产、经营产品包装上未附标签、标签残缺不清或者擅自修改标签内容的农药产品的，给予警告，没收违法所得，可以并处违法所得3倍以下的罚款；没有违法所得的，可以并处3万元以下的罚款。（1）《农药管理条例》第十六条规定：农药产品包装必须贴有标签或者附具说明书。标签应当紧贴或者印制在农药包装物上。标签或者说明书上应当注明农药名称、企业名称、产品批号和农药登记证号或者农药临时登记证号、农药生产许可证号或者农药生产批准文件号以及农药的有效成分、含量、重量、产品性能、毒性、用途、使用技术、使用方法、生产日期、有效期和注意事项等；农药分装的，还应当注明分装单位。（2）常见的擅自修改标签内容现象主要有：农药标签上擅自扩大农药防治作物或对象的范围、擅自添加商品名称或未经备案的商标、擅自标注未通过备案的其他机构名称、擅自添加宣传广告用语、擅自修改安全间隔期等注意事项，等等。（3）常用农药登记及农药标签查询工具有：①中国农药信息网（http：//www.chinapesticide.gov.cn/）；②中国农药（微信公众号）。某市在蔬菜质量安全监测工作中发现，蔬菜种植户沈某直销的蒿菜甲基对硫磷严重超标，而该农药属于禁止使用的农药。当地农业执法机构于第一时间跟进调查，在沈某的种植现场查获标签标注有“甲基对硫磷”的农药2瓶，同时又对其种植的蒿菜、大白菜进行抽样送检，受检样品也被检出含有甲基对硫磷。根据《最高人民法院、最高人民检察院关于办理危害食品安全刑事案件适用法律若干问题的解释》，沈某涉嫌犯生产、销售有毒、有害食品罪，当地农业部门遂将此案依法移送公安机关。最终，沈某因犯生产、销售有毒、有害食品罪，被判处有期徒刑6个月，并处罚金1000元。根据《最高人民法院、最高人民检察院关于办理危害食品安全刑事案件适用法律若干问题的解释》，在食用农产品种植、养殖、销售、运输、贮存等过程中，使用禁用农药、兽药等禁用物质或者其他有毒、有害物质的，依照《中华人民共和国刑法》第一百四十四条的规定以生产、销售有毒、有害食品罪定罪处罚。因此，种植户沈某使用禁用农药甲基对硫磷的行为认定为“生产、销售有毒、有害食品罪”。《中华人民共和国刑法》第一百四十四条规定如下：第一百四十四条【生产、销售有毒、有害食品罪】在生产、销售的食品中掺入有毒、有害的非食品原料的，或者销售明知掺有有毒、有害的非食品原料的食品的，处五年以下有期徒刑，并处罚金；对人体健康造成严重危害或者有其他严重情节的，处五年以上十年以下有期徒刑，并处罚金；致人死亡或者有其他特别严重情节的，依照本法第一百四十一条的规定处罚。（1）种植过程中使用限用农药的定罪与处罚。依据《最高人民法院、最高人民检察院关于办理危害食品安全刑事案件适用法律若干问题的解释》第二十条：下列物质应当认定为“有毒、有害的非食品原料”：（一）法律、法规禁止在食品生产经营活动中添加、使用的物质；（二）国务院有关部门公布的《食品中可能违法添加的非食用物质名单》《保健食品中可能非法添加的物质名单》上的物质；（三）国务院有关部门公告禁止使用的农药、兽药以及其他有毒、有害物质；（四）其他危害人体健康的物质。”限用农药也应当认定为“有毒、有害的非食品原料”，同样依照《中华人民共和国刑法》第一百四十四条的规定以生产、销售有毒、有害食品罪定罪处罚。（2）种植过程中超限量或超范围滥用农药的定罪与处罚。依据《最高人民法院、最高人民检察院关于办理危害食品安全刑事案件适用法律若干问题的解释》第八条规定：在食用农产品种植、养殖、销售、运输、贮存等过程中，违反食品安全标准，超限量或者超范围滥用添加剂、农药、兽药等，足以造成严重食物中毒事故或者其他严重食源性疾病的，依照《中华人民共和国刑法》第一百四十三条的规定以生产、销售不符合安全标准的食品罪定罪处罚。