姜（Zingiber officinale Rosc.）为姜科（Zingiberaceae）、姜属（Zingiber），多年生草本植物，是一种既能作为调味蔬菜，又能入药的重要的经济作物。山东省是我国姜的主要产区，近年来，由于多数品种长期无性繁殖及连年重茬种植，出现了一种严重影响姜产量和质量的病害，该病害主要为害姜叶部，发病初期呈现水浸状小斑点，随后变成黄色，逐渐扩大成为椭圆形、近圆形或不规则形的白色病斑，边缘则为黄褐色，病斑继而彼此融合，导致整叶干枯；在老熟病斑上可见大量黑色小颗粒。目前国内外有关文献报道认为，引起姜叶斑病的病原菌为姜叶点霉（Phyllosticta zingiberiHori）[1]，白金铠[2]在《中国真菌志》中描述过Phyllosticta zingiberi的形态特征，而Mathur[3]曾提到Phyllosticta zingiberi T.S.Ramakr.为Phoma zingiberi Khune的基原异名，但关于Phoma zingiberi的产孢细胞等形态特征及ITS序列分析未见报道。由于茎点霉属（Phoma）真菌与叶点霉属（Phyllosticta）真菌有诸多类似的地方，如分生孢子器和分生孢子的形态、颜色、大小等。因此，Phoma和Phyllostica两属间的分类及属下种的分类问题一直存在着许多争议。Saccardo[4]认为，两者的主要区别在于寄生部位的不同，即Phoma寄生于植物叶以外的部位，而Phyllosticta寄生于植物叶片上，这种主观的划分受到许多真菌学家的批评。由于产孢方式是Phyllosticta和Phoma两属共同具有的稳定特征。因此，目前已作为被多数学者所接受的分类标准。对于植物病原真菌，传统的分类方法多以真菌的形态特征为依据，而近年来分子生物学手段的应用为真菌的分类鉴定提供了更多遗传信息方面的依据。核糖体基因内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，简称ITS）在真菌种间存在丰富的差异，已广泛应用于真菌亲缘关系较近分类群的系统发育研究。目前，对于形态学上难以区分的Phoma和Phyllosticta两属真菌，尚未开展ITS序列的比对研究，其ITS序列资源也有待进一步丰富。本文发现的病害症状与已报道的由Phyllosticta zingiberi引起的姜叶斑病症状基本一致。为了正确鉴定分离到的姜叶斑病的致病菌，本文利用传统的形态学观察并结合分子手段对该病原菌的分类归属进行了研究。姜病叶采自山东省生姜主要产地莱芜市姜田。1.2.1 病菌的培养及光镜观察 将发病叶片表面消毒后置于PDA培养基上培养4～5天，从菌落边缘取直径为5mm的菌落圆片进行纯培养，在Olympus光学显微镜下观察并描述分生孢子器、分生孢子、产孢细胞形态特征，用显微测量尺测定分生孢子器及分生孢子的大小。1.2.2 透射电镜样品制备与观察 将新鲜的感病叶片切成小于0.5cm×0.5cm的材料，固定于3%戊二醛中，再用1%锇酸二次固定，乙醇梯度脱水、Epon812树脂浸透、包埋、超薄切片，经醋酸双氧铀、柠檬酸铅双重染色，JEM-1200EX透射电镜观察、拍照。将配制好的孢子悬浮液（低倍镜下每视野约30个孢子）喷洒在4～5叶期健康的姜新叶上，接种后套袋保湿48h。定期观察并记录发病情况和症状特点。取病斑上产生的子实体镜检，并从发病组织中再次分离致病菌，观察并描述病原菌形态特征。菌丝染色体DNA的提取参照何月秋[5]的方法并做适当的修改，质粒提取采用碱裂解法，大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态制备、连接、转化等参考《分子克隆实验指南》（第三版）[6]。以总DNA为模板，以通用引物ITS1：5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′和ITS2：5′-GCT GCG TTC ATC GAT GC-3′，ITS3：5′-GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC-3′和ITS4：5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′分别扩增ITSI和ITSII片段。PCR反应程序如下：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1min，50 ℃退火1min，72 ℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物连接到pMD18-T（大连宝生物工程有限公司），转化E.coli DH5α，经鉴定的重组质粒送上海英俊生物技术公司测序。该病原菌在PDA培养基上菌丝初为白色，后变为褐色，25 ℃培养20～25天后，逐渐出现分生孢子器。光镜观察分生孢子器为球形、扁球形，暗褐色，直径55～135μm，高75～130μm，器壁褐色，由3～5层细胞组成，壁厚9～13μm，内壁形成产孢细胞，上着生分生孢子；分生孢子椭圆形、卵形，无色，单胞，两端各含有一油球，5～8.5μm×2～4.5μm，其形态与报道的Phyllosticta zingiberi基本一致（Figure 1），但光镜和透射电镜观察其产孢方式为内壁芽生瓶梗式（eb-ph）（Figure 2）。Figure 1 Picnidium(Micro)(×400)Figure 2 Morphology of conidiogenous cell(Micro)(×1 000)用分生孢子悬浮液接种姜嫩叶后，发病症状和病原菌形态特征与自然发病株相同。取病健交界处组织再分离，其培养性状和形态特征与第1次分离结果一致。根据柯赫氏法则，接种菌即为姜叶斑病的致病菌。2.3.1 菌丝染色体DNA的提取与核糖体DNA ITS的PCR扩增 用改进的CTAB法提取该菌染色体DNA，琼脂糖凝胶电泳检测。采用真菌核糖体基因ITS区域通用引物ITS1和ITS2、ITS3和ITS4分别扩增了茎点霉的ITSI和ITSII，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果均为单一条带，大小分别为224bp和343bp。2.3.2 核糖体DNA ITS序列分析 将克隆到的ITSI和ITSII测序后进行拼接，确定了ITS片段的核苷酸序列（Genbank登录号为EF408240）。用DNAStar软件对所得序列进行编辑和排序比对，得出该病原菌ITS序列与叶点霉的同源性最高为58.7%，与茎点霉的同源性最高为95.6%。利用MEGA3.1软件分析核苷酸组成并计算种间遗传距离，结果显示该病原菌与茎点霉亲缘性更大。以往报道认为，引起姜叶斑病的病原为Phyllosticta zingiberi Hori，Hara记载并描述了Phyllosticta zingiberi Hori的形态特征：叶上病斑圆形、不规则形，中央灰白色，直径1～3mm；分生孢子器球形、扁球形，暗褐色，直径50～120μm，分生孢子椭圆形、卵形，单胞，无色，两端各含有一油球，5～9μm×2.5～3.5μm。后人Sawada[7]对中国台湾省姜叶上的Phyllosticta zingiberi Hori、戚佩坤等[8]对广东姜叶上的Phyllosticta zingiberi Hori以及本研究对分离菌的描述与上述基本一致，应视为同种。Ramakrishnan[9]描述的印度姜叶上的Phyllosticta zingiberi T.S.Ramakr.的形态特征为，叶上病斑卵圆形，中央灰白色，可形成穿孔，9～10μm×3～4μm；分生孢子器球形，78～150μm，分生孢子无色，椭圆形，3.7～7.4μm×1.2～2.5μm，两端各含有一油球，此形态与Phyllosticta zingiberi Hori基本一致。因此，Phyllosticta zingiberi T.S.Ramakr.应视为Phyllosticta zingiberi Hori的同物异名。Sutton[10]通过对Phoma和Phyllosticta产孢方式的研究，认为Phoma是内壁芽生瓶梗式（eb-ph），Phyllosticta是全壁芽生单生式（hb-sol），这与Dictionary of the fungi第九版[11]对两属产孢方式的描述一致，而吕国忠电镜观察结果显示，两属的产孢方式相同，均为全壁芽生环痕式（hn-ann），同样，王琪[12]对龙眼叶点霉（Phyllosticta dimocarpi）研究结果也是全壁芽生环痕式（hn-ann），周永力[13]则认为Phyllosticta为内壁芽生瓶梗式（eb-ph）。因此，有关两属的产孢方式目前尚有争论。本研究对该病原菌的光镜和电镜观察结果表明，其产孢方式为内壁芽生瓶梗式（eb-ph），符合Kendrick等对Phoma产孢细胞特征的描述，ITS序列分析结果发现，该菌与Phoma ITS序列同源性高达95.6%，远远高于与Phyllosticta ITS序列的同源性（58.7%）。本研究结果支持Mathur的观点，认为Phyllosticta zingiberi T.S.Ramakr.为Phoma zingiberi Khune的基原异名。由于Phyllosticta zingiberi T.S.Ramakr.是Phyllosticta zingiberi Hori的同物异名。因此，引起姜叶斑病的病原菌应为姜茎点霉（Phoma zingiberi Hori）。致谢：山东农业大学张天宇教授、张修国教授对本研究提供了热情帮助，并对论文修改提出了建议。

多数苹果属植物野生种或栽培种的花和果都具有观赏价值，在观赏园艺花卉树木中占有重要地位。20世纪以来，国外植物学家从我国引种并进行了大量杂交选育工作，培育了一系列具观赏用途的海棠品种，统称为观赏海棠（Malus spp.）。近年来，国内学者从国外引进的观赏海棠品种几十个，它们姿态各异，色彩斑斓，大量果实点缀枝头直到深冬，丰富了景观内容。但是，这些观赏海棠不少品种的植株枝干上往往产生大量轮纹状、马鞍形的瘤状突起，严重时，病斑相连，导致树皮粗糙，严重影响树势甚至引起枝干坏死。本研究对其病原进行了初步研究，以期为进一步研究其发生发展规律和防治技术奠定基础。观赏海棠（M.spp.）植株为山东省泰安市区栽植树种。在6月份从病树上采集病斑，显微切片观察其病原形态，并对其大小进行测定。按常规方法，进行分离培养并纯化。观察其培养性状和产孢特征。在6月底，将分离纯化的病原菌分别采用烫伤接种法、针刺接种法、喷雾接种法对健康的海棠枝条进行接种，定期观察其发病情况，确定其致病性。设置不同温度条件（5℃、15℃、25℃、28℃、37℃、40℃）、不同pH值条件（pH值4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）、不同培养基条件（琼脂、蛋白胨、LB、BPY、PMA、PSA、PDA），用菌碟法分别测定不同条件下病原菌的菌丝生长状况；并在以上不同温度、不同pH值条件以及不同营养条件（0.5%、1%、2%葡萄糖，0.5%、1%、2%蔗糖）下，采用凹穴法测定病原菌孢子萌发情况。受害海棠枝干从皮孔开始发病，以皮孔为中心形成近圆形斑点，暗褐色，凹陷，边缘稍隆起；随后病斑中央突起，呈瘤状，质地坚硬，成为灰白色；病健交界处发生龟裂，病皮翘起，有点呈马鞍状，或呈轮纹状；病斑表面产生黑色的小粒点。严重时，病斑相连，病皮粗糙，导致部分枝干死亡。对病斑上黑色粒点切片镜检，发现：子座扁球形，其上分生孢子器1～3个，分生孢子器扁圆形或椭圆形，大小为（142～284）μm×（162～289）μm；内壁密生分生孢子梗，分生孢子梗棍棒状，单胞，顶端着生分生孢子；分生孢子单细胞，无色，纺锤形或长椭圆形，一端钝圆，一端截平，大小为（20.1～32.9）μm×（7.6～9.8）μm。从发病枝干上分离培养获得病原菌纯培养，菌落初灰白色，逐渐呈灰黑色，气生菌丝浓密，呈絮状隆起，后期菌落中产生灰黑色子座。对病原菌进行致病性测定，通过不同方法对海棠进行接种试验，发现烫伤接种法和针刺接种法处理的海棠发病率为100%，而喷雾接种法处理的海棠则几乎没有发病。其症状表现为，伤口先凹陷变黑，后形成褐色小突起。同时发现，在山东省泰安市，在6月底接种，该病原菌侵染的潜伏期为7～10天。经鉴定，认为该病害的病原为Botryosphaeria berengeriana，病害为观赏海棠轮纹病。25～28℃、pH值4.0～7.0、BPY和PDA培养基等条件，最适合菌丝生长，菌落生长快，且菌丝白色浓密呈絮状隆起，易产生黑色分生孢子器。28℃、pH值7.0、1%蔗糖条件最适合病原菌分生孢子萌发，12h观察孢子萌发率能达到80%左右，孢子萌发芽管较短、粗，多数两端萌发。观赏海棠轮纹病发病严重，目前对其病原鉴定方面未见报道。本研究初步确定其病原为Botryosphaeria berengeriana，并测定了其部分生物学特性。结果也显示该病原菌从形态和生物学特性上与引起苹果轮纹病的病原菌[1]和梨轮纹病[2，3]的病原菌有一定的差异。该菌的寄主范围、对苹果属、梨属植物的致病性、ITS的序列测定等工作正在开展中，这些信息对于该菌分类地位的进一步确定有重要价值。

主要步骤如下。（1） 将 800 μl 提取缓冲液 CTAB buffer （内含 2%CTAB、100 mmol/L Tris-HCl pH值8.0、20 mmol/L EDTA、1.4 mol/L NaCl、2%PVP30、1%的β-巯基乙醇） 加入2 ml的离心管内65℃预热。（2） 从-70℃超低温冰箱中取0.2 g ‘富士’ 和 ‘金冠’ 及其杂交群体单株的嫩叶，放入研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状，并迅速转移到装有预热的提取缓冲液的离心管内，并上下颠倒混匀。（3） 65℃水浴中保温3 min，数次颠倒使内含物充分混匀。（4） 将离心管取出，加800 μl氯仿∶异戊醇 （体积比为24∶1）。颠倒充分混合，温和震荡2～3 min。（5） 在高速离心机上离心10 min （14000 r/min），将上清液转移到1.5 ml离心管中。（6） 加入6 μl RNase （10 mg/ml） 充分混匀，在37℃恒温箱内温育1 h，再用氯仿∶异戊醇抽提1次。（7） 加500 μl 事先在-20℃冰箱内预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后，于4℃冰箱中沉淀 DNA 10～25 min。（8） 在高速离心机上 14000 r/min 离心 3 min，然后弃掉上清，得到沉于离心管底部的DNA。（9） 用500 μl 75%乙醇洗 DNA沉淀两次。倒掉乙醇，注意不要将DNA倒出。（10） 在超净工作台上干燥 DNA 2 h。（11） 将吹干的DNA溶于100 μl超纯水中。1.缓冲液的的制备取适量50×TBE缓冲液配制成1×TBE稀释缓冲液，待用。2.胶液的制备称取1 g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入 100 ml 1×TBE 稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，制成1%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。3.胶板的制备待凝胶温度稍低后加入5 μl EB （溴化乙锭），混匀，然后倒入模具中 （注意不要有气泡），加上合适的梳子形成加样孔，梳子的位置应该在托盘底面上0.5～1.0 mm。4.待胶完全凝固后拔出梳子注意不要损伤梳底部的凝胶，将模具放入电泳槽内并加入1×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。5.加样取10 μl DNA稀释液，用微量移液枪小心加入样品槽中。每加完一个样品要更换 tip 头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。6.电泳加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。DNA 应该向阳极泳动，用120 V电压电泳15～30 min，停止电泳。1.6%非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法（1） 胶板的制备。先用水将平板和耳朵板冲洗干净，将其平放在桌面上，用餐巾纸将其擦干之后，用 95%酒精擦洗 2 次，待其干后，将0.5%的 Banding silane 溶液均匀的倒在平板上，用餐巾纸迅速将其涂匀，待其晾干，然后将洗干净的梳子和压条整齐的摆在平板之上，将2%的 Repel silane溶液均匀的涂在耳朵板上 （此项操作应在通风橱中进行），待其晾干后，将其整齐摆放在平板之上，用夹子将其夹好。（2） 凝胶的制备。取50%的PA胶50 ml，加入60 μl的TEMED，120 μl 10%的过硫酸铵 （APS），温和混匀。（3） 灌胶。将混合好的胶沿着玻璃板的灌胶口缓缓灌入，注意使灌入的胶基本上沿着一条直线灌入，如不整齐，可用手轻轻拍打胶板，使胶保持同一直线灌入，避免气泡的产生。胶灌入到底部之后，迅速将梳子平面插入到两玻璃板之间，插好梳子之后，用夹子夹好，让其聚合1h后用于电泳。（4） 电泳。加入电极缓冲液lxTBE，50 W恒功率，预电泳10 min后，清除气泡，插入梳齿，将扩增好的 PCR 产物，加入6 μl的溴酚蓝，混匀95℃变性5 min，之后用微量加样器取6 μl，进行电泳1 h左右 （根据分子量的大小调整电泳时间）。2.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染方法 （体积100 ml）（1） 固定。在磁盘中加入 10%的乙醇和 500 μl 冰乙酸，摇匀后加入凝胶，再平行摇动3～5 min。（2） 染色。在固定液中加入 1 ml 20%AgNO3 储备液后，平行摇动 5～8 min。（3） 漂洗。倒掉定影液，加入蒸馏水漂洗 2～3 次，洗净后，倒掉蒸馏水。（4） 显色。在磁盘中加入 100 ml 3%NaOH 溶液和 500 μl 甲醛，迅速振荡，使显影液均匀作用，然后平行摇动，直至显影。（5） 洗涤。清楚显影后，倒掉显影液，用自来水清洗凝胶 1～2次，彻底去掉显影液，以免保存时变色。1.胶回收（1） 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。（2） 在紫外灯下切出含有目的片段 DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的片段 DNA 部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高 DNA 回收率。胶块超过 300 mg时，使用多个 Column 进行回收，否则严重影响回收率。注：切胶时注意不要将 DNA 长时间暴露于紫外灯下，以防 DNA损伤。（3） 切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤 6 的胶块溶解时间，提高 DNA 回收率。（4） 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以 1 mg=1μl 进行计算。（5） 向胶块中加入胶块溶解液 Buffer GM，Buffer GM 的加量如下表。凝胶浓度BufferGM使用量1.0%3个凝胶体积量1.0%～1.5%4个凝胶体积量1.5%～2.0%5个凝胶体积量（6） 将不溶解液与胶块充分混合后，15～25℃溶解胶块 （胶浓度较大或比较难溶时可以在 37℃加热）。间断振荡混合，使胶块充分溶解 （5～10 min）。注：胶块一定要充分溶解，否则将会严重影响 DNA 的回收率。高浓度凝胶可以适当延长溶胶时间。（7） 当凝胶完全溶解后，观察溶胶液的颜色，如果溶胶液颜色由黄色变为橙色或粉色，向上述胶块溶解液中加入 3M 醋酸钠溶液（pH值5.2） 10 μl，均匀混合至溶液恢复黄色。当分离小于 400 bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为 20%的异丙醇。（8） 将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。（9）将上述操作步骤7的溶液转移至Spin Column中，12000r/min离心1min，弃滤液。注：如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高 DNA 的回收率。（10）将700μl的Buffer WB加入Spin Column中，室温12000r/min离心30s，弃滤液。注：确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100%乙醇。（11） 重复操作步骤 10。（12） 将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12000 r/min离心1 min。（13） 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Col-umn膜的中央处加入 30 μl 灭菌蒸馏水或 Elution Buffer，室温静置1 min。注：将灭菌蒸馏水或 Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。（14） 室温12000 r/min离心1 min洗脱DNA。2.大肠杆菌感受态的制备（1） 取大肠杆菌DH5α 在 LB 培养基上划线，37℃培养箱内过夜培养，长出单菌落。（2） 挑取单菌落，接种于4 ml不含抗生素的LB培养基上，37℃振荡 （轻摇） 培养过夜。（3） 过夜培养的菌液与 LB 培养基按 1∶50 的比例转入三角瓶，37℃振荡培养 （约3 h），至OD600=0.4～0.6。（4） 4℃，5000 r/min离心5 min，轻轻倒掉上清，用5 ml （1/5体积） 预冷的0.1 mol/L Mgcl2悬浮细胞 （0.95 g/100 ml）。（5） 4℃，5000 r/min 离心 5 min，轻轻倒掉上清，用 12.5 ml （1/2体积） 预冷的 0.1 mol/L CaCl2悬浮细胞，冰浴放置 20 min（1.1 g/100 ml）。（6） 4℃，5000 r/min离心5 min，轻轻倒掉上清，用2.5 ml预冷的 0.1 mol/L CaCl2 （含 10%的甘油） 悬浮细胞，分装，每管120 μl。（7） 液氮速冻，-80℃保存。3.目的基因连接载体pMD-19T simple 1 μl，目的 DNA 4 μl，solution Ⅰ 5 μl，混匀后于16℃金属浴中反应30 min。4.目的基因转化（1） 1.5 ml离心管中加入10 μl的连接产物和50 μl大肠杆菌感受态细胞。（2） 冰上放置30 min。（3） 42℃金属浴加热45 s 后，冰中放置1 min。（4） 加入 500 μl LB 液体培养基，37℃，200 r/min 振荡培养45 min。（5） 取100 μl菌液涂板 （LB+Amp+），37℃过夜培养。（6） 过夜培养之后，挑取单克隆菌落，加到 LB 液体培养基（Amp+100 mg/L） 中37℃，200 r/min振荡培养6～8 h。（7） 菌液PCR检测正确后，送测序。序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置1CH03g12GCGCTGAAAAAGGTCAGTTTCAAGGATGCGCATGTATTTGChr12CH05g08CCAAGACCAAGGCAACATTTCCCTTCACCTCATTCTCACCChr13Hi02c07AGAGCTACGGGGATCCAAATGTTTAAGCATCCCGATTGAAAGGChr14Hi07d08TGACATGCTTTTAGAGGTGGACGTTTGAGGGGTGTCCGTACAAGChr15Hi12c02GCAATGGCGTTCTAGGATTCGTTTCACCAACAGCTGGGACAAGChr16C10455AAGGCAATACAAGACGGACGTTCACACCGAAAGCCTCTCTChr17Hi21g05GACGAGCTCAAGAAGCGAACGTTTGCTCTTGCCATTTTCTTTCGChr18C13810CGTCCTAGATAGATGCCCCACAGGACTCTAAGGACTGCCGChr1附表1 实验所用已发表SSR引物列表序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置9C13280CTCCTCCTCCCTCAGTACCCCCTTCACTCACCTTTCTCGCChr110C16757AATGGGACCCAACTGGTACATCGACCATACAAATTGCTGCChr111C6948CTTGGAGCTGTGAGAGTCCCCAAACCTCTCATCGCAACCTChr112KA4bAAAGGTCTCTCTCACTGTCTCCTCAGCCCAACTCAAAGCCChr113CH02a04GAAACAGGCGCCATTATTTGAAAGGAGACGTTGCAAGTGGChr214CH02b10CAAGGAAATCATCAAAGATTCAAGCAAGTGGCTTCGGATAGTTGChr215CH02c02aCTTCAAGTTCAGCATCAAGACAATAGGGCACACTTGCTGGTCChr216CH02c06TGACGAAATCCACTACTAATGCAGATTGCGCGCTTTTTAACATChr217CH02f06CCCTCTTCAGACCTGCATATGACTGTTTCCAAGCGATCAGGChr218CH03d01CGCACCACAAATCCAACTCAGAGTCAGAAGCACAGCCTCChr219CH03d10CTCCCTTACCAAAAACACCAAAGTGATTAAGAGAGTGATCGGGGChr220CH05e03CGAATATTTTCACTCTGACTGGGCAAGTTGTTGTACTGCTCCGACChr221Hi02a07TTGAAGCTAGCATTTGCCTGTTAGATTGCCCAAAGACTGGGChr222Hi05g12TCTCTAGCATCCATTGCTTCTGGTTTGTGTGTTCTCTCATCGGATTCChr223Hi07d12GGAATGAGGGAGAAGGAAGTGGTTTCCTCTTCACGTGGGATGTACCChr224Hi08f05GTGTGGGCGATTCTAACTGCGTTTCCTTTATTCTAAACATGCCACGTCChr225Hi08g12AGTTCGGTCGGTTCCGTAATGTTTAGGGCAAGGGGAAAGAAGTChr226Hi22d06CCCCGAGCTCTACCTCAAACATTATGTTTCCGGTTTTTGGChr227Hi24f04CCGACGGCTCAAAGACAACTGAAAAGTGAAGGGAATGGAAGChr228AJ251116GATCAGAAAATTGCTAGGAAAAGGAGAGAACGGTGAGCTCCTGAChr229AT000400CTCCCTTTGCTCCCTCTCTTAGGATGTCAGGGTTGTACGGChr230CN444636CACCACTTGAGTAATCGTAAGAGCGTTTGCCAGTTAAGGACCACAAGGChr231CN493139CACGACCTCCAAACCTATGCGTTTATGAAAGTACGGCACCCATCChr232CN581493GCTTTTCATGGTGGAAAAACTGGTTTGACTCTCCGCTCTGATGGACChr233NH033bGTCTGAAACAAAAAGCATCGCAACTGCCTCGTCTTCCTCCTTATCTCCChr234CH03e03GCACATTCTGCCTTATCTTGGAAAACCCACAAATAGCGCCChr335CH03g07AATAAGCATTCAAAGCAATCCGTTTTTCCAAATCGAGTTTCGTTChr336MS14h03CGCTCACCTCGTAGACGTATGCAATGGCTAAGCATAChr3附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-1序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置37Hi03d06TCATGGATCATTTCGGCTAAGTTTGCCAATTTTATCCAGGTTGCChr338Hi03e03ACGGGTGAGACTCCTTGTTGGTTTAACAGCGGGAGATCAAGAACChr339Hi04c10TGCGCATTTGATAGAGAGAGAAGTTTAACAAAGAACGACCCACCTGChr340Hi05f12TTTGGGTTTGGGTAGGTTAGGGTTTGTGCAGCGCATGCTAATGChr341Hi07e08TTCGTGCTAGGGAGTTGTAGCGTTTGCCTCCATAGGATTATTTGACChr342Hi15b02TATGGTGGCAACAGTGGAGAGTTTCGCCACCTCCACTTAACATCChr343Hi15h12GAACAAGAAGGACGCGAATCGTTTGGGCCTCGTTATCACTACCAChr344AU223657TTCTCCGTCCCCTTCAACTACACCTTGAGGCCTCTGTAGCChr345HGA8bAACAAGCAAAGGCAGAACAACATAGAGAAAGCAAAGCAAAChr346GD12CTAACGAAGCCGCCATTTCTTTTTGAGGTGTTTCTCCCATTGGAChr347IPPN15AACCATGGCATTGGATTGATGAAGCACTCAATGGGGAAAAChr348NZmsCN943818TGAACAGCTCATCGTCGGTACGGGAAGAGGAAATGTGATTChr349C9312TCCACCAGTGACAAGAGCTGAGGATTCAATCAGCTACGCCChr350C6359CGGAAATGGTCACTGGAACTTGGGACGGACACACACACChr351CH01b12CGCATGCTGACATGTTGAATCGGTGAGCCCTCTTATGTGAChr452CH01d03CCACTTGGCAATGACTCCTCACCTTACCGCCAATGTGAAGChr453CH02c02bTGCATGCATGGAAACGACTGGAAAAAGTCACACTGCTCCChr454CH02h11aCGTGGCATGCCTATCATTTGCTGTTTGAACCGCTTCCTTCChr455CH04e02GGCGATGACTACCAGGAAAAATGTAGCCAAGCCAGCGTATChr456CH05d02AAACTCCCTCACCTCACATCACAATAGTCCAATGGTGTGGATGGChr457Hi01e10TGGGCTTGTTTAGTGTGTCAGGTTTGGCTAGTGATGGTGGAGGTGChr458Hi07b02ATTTGGGGTTTCAACAATGGGTTTCGGACATCAAACAAATGTGCChr459Hi08e04GCATGGTGGCCTTTCTAAGGTTTACCCTCTGACTCAACCCAACChr460Hi08h03GCAATGGCGTTCTAGGATTCGGTGGTGAACCCTTAATTGGChr461Hi23d11bGACAGCCAGAAGAACCCAACGTTTATTGGTCCATTTCCCAGGAGChr462Hi23g02TTTTCCAGGATATACTACCCTTCCGTTTCTTCGAGGTCAGGGTTTGChr463Hi23g08AGCCGTTTCCCTCCGTTTGTTTGTGGATGAGAAGCACAGTCAChr464AT000420TTGGACCAATTATCTCTGCTATTGATGTGGTCAGGGAGAGGAGChr4附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-2序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置65MSS6CGAAACTCAAAAACGAAATCAAACGGGAGAGAAACTCAAGACCChr466C12595ATGAAAACCCACAAAACCCAAAACCATACACAACGCCACAChr467C13146CTGGGAAAAATGGGGAAAATGCTTTCCCTTTCCTTCTTCAAChr468C15TTGCGAGAAAGCTAAAAACCACAGACTCTGCAACCCCTCTCChr469CH01d07AGTCGAAATCCCGAACAATCAAAATCCAGTTTTCCACCTCChr470NZ01a6TTAGACGACGCTACTTGTCCTAGGATTGCTGGAAAAGGAGGChr471GD162AAAATGTAACAACCCGTCCAAGTGGAGGCAAGTGACAAAGAAAGATGChr472NH011bTTTGCCGTTGGACCGAGCGGTTCACATAGAGAGAGAGAGChr473CH02a08GAGGAGCTGAAGCAGCAGAGATGCCAACAAAAGCATAGCCChr574CH02b12GGCAGGCTTTACGATTATGCCCCACTAAAAGTTCACAGGCChr575CH03a04GACGCATAACTTCTCTTCCACCTCAAGGTGTGCTAGACAAGGAGChr576CH03a09GCCAGGTGTGACTCCTTCTCCTGCAGCTGCTGAAACTGGChr577CH04e03TTGAAGATGTTTGGCTGTGCTGCATGTCTGTCTCCTCCATChr578CH04g09TTGTCGCACAAGCCAGTTTAGAAGACTCATGGGTGCCATTChr579CH05e06ACACGCACAGAGACAGAGACATGTTGAATAGCATCCCAAATGGTChr580CH05f06TTAGATCCGGTCACTCTCCACTTGGAGGAAGACGAAGAAGAAAGChr581Hi01c04GCTGCCGTTGACGTTAGAGGTTTGTAGAAGTGGCGTTTGAGGChr582Hi02a03GACATGTGGTAGAACTCATCGGTTTAGTGCGATTCATTTCCAAGGChr583Hi04a08TTGAAGGAGTTTCCGGTTTGGTTTCACTCTGTGCTGGATTATGCChr584Hi04d02TTCGTGGCTGAGAAAGGAGTGTTTGTACGGTGCATTGTGAAAGChr585Hi08a04TTGTCCTTCTGTGGTTGCAGGTTTGAAGGTAAGGGCATTGTGGChr586Hi08h08TGAACAAATTCCACCACGAAGTTTGCCAAGGCTACAATTTTCAChr587Hi09b04GCGATGACCAATCTCTGAAACTGGGCTTGAATTGGTGAATCChr588Hi11a03GGAATTGGAGCTTGATGCAGGTTTCATACGGAATGGCAAATCGChr589Hi15e04AAACCTCTGCATTCCGTCTCCTCATACTCCTCCCACATTGTCChr590Hi21c08TTCTTCTCCTCCACCACCTCGTTTGTCACTGAGAAGGCGGTAGCChr591Hi22a07CTCTTCCTTCTCCGCCTCTTGTTTCACTCAGAATGCCTCACAGCChr592Hi22f12GGCCTCACCCAGTCTACATTGTTTGGTGTGATGGGGTACTTTGCChr5附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-3序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置93AU223670GGACTCAATGCCTTTTCTGGAGGATGGCAGCAATCTTGAAChr594CN445599TCAAATGGGTTCGATCTTCACGTTTGCCTGGCTGTAACTGTTTGGChr595CN496002TCAGAATCTCAAGCAAGATCCTCGTTTGATTGATCGTGGCGATATGChr596CH03d07CAAATCAATGCAAAACTGTCAGGCTTCTGGCCATGATTTTAChr697CH03d12GCCCAGAAGCAATAAGTAAACCATTGCTCCATGCATAAAGGGChr698CH05a05TGTATCAGTGGTTTGCATGAACGCAACTCCCAACTCTTCTTTCTChr699Hi03a03ACACTTCCGGATTTCTGCTCGTTTGTTGCTGTTGGATTATGCCChr6100CH01b11AACCTAACCAAACACGTACGGTTCGGCTGTACTCTTTGAGChr6101Hi04d10AAATTCCCACTCCTCCCTGTGTTTGAGACGGATTGGGGTAGChr6102Hi05d10AATGGGTGGTTTGGGCTTAGTTTCTTTGGCTATTAGGCCTGCChr6103Hi07b06AGCTGCAGGTAGAGTTCCAAGGTTTCATTACCATTACACGTACAGCChr6104Hi08g03ATTCACTTCCACCGCCATAGGTTTGGAATGATTGCGAGTGAAGCChr6105CN445290TCTCAGTTGCTCTGGCTTTGGTTTGCAATCAATGCCACTCTTCChr6106U78949TTTGTCTACCTCTGATCTTAACCAACAGCATCGCAGAGAACTGAGChr6107CH04e05AGGCTAACAGAAATGTGGTTTGATGGCTCCTATTGCCATCATChr7108Hi01d05GGTATCCTCTTCATCGCCTGTTAGATTGACGTTCCGACCCChr7109Hi03a10GGACCTGCTTCCCCTTATTCGTTTCAGGGAACTTGTTTGATGGChr7110Hi12f04ATTGTCCCCACAAAATTGGATGTTCGATGTGACTTCAATGCChr7111CN444794CATGGCAGGTGCTAAACTTGAAACTGAAGCCATGAGGGCChr7112CH02b11CACAACGCAGTTCGATCACTACCTTACCTGGTAGAGAGAGAChr7113EMPc111CCGATCAGAAAGAGCTGTGAGTCAAACCTTCCAACCTCAACAATChr7114Hi05b09GTTTCTAACGTGCGCCTAACGTGAAACCCAACCCAAAGAGTGGChr7115MS06c09AATATAAGAGCCAGAGGCACTATTGGAGTAAGTCGAChr7116Z38126AAGAGGGTGTTCCCAGATCCAATTCCAATTTCAGAACAGGChr7117CH01c06TTCCCCATCATCGATCTCTCAGGAGGGATTGTTTGTGCACChr8118CH01f09ATGTACATCAAAGTGTGGATTGCAAACAAACCAGTACCGCAAChr8119CH01h10TGCAAAGATAGGTAGATATATGCCATTTTGACCCCATAAAACCCACChr8120CH02g09TCAGACAGAAGAGGAACTGTATTTGGTTTGAGTTTGATCTCCAACATTACChr8附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-4序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置121CH05a02GTTGCAAGAGTTGCATGTTAGCGTTTGAGCAGAGGTTGCTGTTGCChr8122Hi01c11TTGGGCCACTTCACAACAGGGTGCGCTGTCTTCCATAAAChr8123Hi04b12CCCAAACTCCCAACAAAGCGTTTAGTTGCTAATGGCGTGTCGChr8124Hi04e05AAGGGTGTTTGCGGAGTTAGGTTTGTCTACAACTGTCTGATGGTAGCChr8125Hi20b03AAACTGCAATCCACAACTGCGTTTAAAGGGGCCCACAAAGTGChr8126Hi22g06GAAAGGACCGAATTTCATGCGGACATGGATGAAGAATTGGAChr8127Hi23g12CCCTTCCCTACCAAATGGACCTCCCCGGCTCCTATTCTACChr8128Z71980TCTTTCTCTGAAGCTCTCATCTTTCATCTTTTGGTGCTCCCACACChr8129CH01f03bGAGAAGCAAATGCAAAACCCGGGATGCATTGCTAAATAGGATChr9130CH01h02AGAGCTTCGAGCTTCGTTTGTGATTGCCACATGTCAGTGTTChr9131CH05c07TGATGCATTAGGGCTTGTACTTGTTTACCAATTAGGACTTAAAGCTGChr9132CH05d08TCATGGATGGGAAAAAGAGGGTTTCATGTCAAATCCGATCATCACChr9133Hi01d01CTGAAATGGAAGGCTTGGAGATTTATGGTGATGGTGTGAACGTGChr9134Hi04a05GGCAGCAGGGATGTATTCTGGTTTCAAGAACCGTGCGAAATGChr9135Hi05e07CCCAAGTCCCTATCCCTCTCGCTTAATAGAAACATCGCTGAChr9136Hi23d06TTGAAACCCGTACATTCAACTCGTTTGCAGTGGATTGATGTTCCChr9137AJ320188AACGATGCTTGAGGAAGAACACCTCCCGTCTCCCACCATATTAGChr9138CN444542ATAAGCCAGGCCACCAAATCCGTTTTTGGAGCGTAGGAACChr9139NH029aGAAGAAAACCAGAGCAGGGCAGCAAAAACCACAGGCATAACChr9140CH02a10ATGCCAATGCATGAGACAAAACACGCAGCTGAAACACTTGChr10141CH02b03bATAAGGATACAAAAACCCTACACAGGACATGTTTGGTTGAAAACTTGChr10142CH02b07CCAGACAAGTCATCACAACACTCATGTCGATGTCGCTCTGTTGChr10143CH02c11TGAAGGCAATCACTCTGTGCTTCCGAGAATCCTCTTCGACChr10144CH03d11ACCCCACAGAAACCTTCTCCCAACTGCAAGAATCGCAGAGChr10145COLAGGAGAAAGGCGTTTACCTGGACTCATTCTTCGTCGTCACTGChr10146MS01a03AGCAGTATAGGTCTTCAGTGCGTAGATAACACTCGATChr10147MS02a01CTCCTACATTGACATTGCATTAGACATTTGATGAGACTGChr10148MS06g03CGGAGGGTGTGCTGCCGAAGGCCCAGCCCATATCTGCTChr10附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-5序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置149Hi01a03CGAATGAAATGTCTAAACAGGCAAGCTACAGGCTTGTTGATAACGChr10150Hi01b01GCTACAGGCTTGTTGATAACGCACGAATGAAATGTCTAAACAGGCChr10151Hi02d04TGCTGAGTTGGCTAGAAGAGCGTTTAAGTTCGCCAACATCGTCTCChr10152Hi03c04CGTAAATAGCGAATCCGATACCGTTTCAACATCTGTGGGTCATTGCChr10153Hi03f06ACGATTTGGTGATCCGATTCGTTTCGTCGCATTGTGCTTCACChr10154Hi04f08CGTGAAAACTCTAACTCTCCGTTTGAAAAGCGCATCAAAGTTCCChr10155Hi05b02GATGCGGTTTGACTTGCTTCGTTTCTCCAGCTCCCATAGATTGCChr10156Hi08g06AATCGAACCAGCACAGGAAGGTTTAGATGGAGGTCGTGGTTACGChr10157Hi08h12GAAGGAAATCATCATCAAGACGGTTTCAAGACCATGGAACAACTTGGChr10158Hi21f08GAGAAAACGCAGAAGCATTGAGTAATGATTTCATCGCGAGTCChr10159Hi22f04TCAATCCTCTGCTCTTCAAGGGTTTAATCACCTGCTGCTGCTTGChr10160AF057134ACTACCCAATGCCCACAAAGTATCCTCGCCCAAAAGACTGChr10161AU223548ACCACCACTGCAGAGACTCAGACGCACCCATTCATCTTTTChr10162CH02d08TCCAAAATGGCGTACCTCTCGCAGACACTCACTCACTATCTCTCChr11163CH02d12AACCAGATTTGCTTGCCATCGCTGGTGGTAAACGTGGTGChr11164CH03d02AAACTTTCACTTTCACCCACGACTACATTTTTAGATTTGTGCGTCChr11165CH04a12CAGCCTGCAACTGCACTTATATCCATGGTCCCATAAACCAChr11166CH04d07TGTCCTCCAATCTTAACCCGCACACAGACGACACATTCACCChr11167CH04d10GAGGGATCTGTAGCTCCGACTGGTGAGTATCTGCTCGCTGChr11168CH04g07CCCTAACCTCAATCCCCAATATGAGGCAGGTGAAGAAGGAChr11169CH04h02GGAAGCTGCATGATGAGACCCTCAAGGATTTCATGCCCACChr11170Hi01d06GGAGAGTTCCTGGGTTCCACAAGTGCACCCACACCCTTACChr11171Hi02a09ATCTCTAAGGGCAGGCAGACCTGACTCTTTGGGAAGGGCChr11172Hi02c06AGCAAGCGGTTGGAGAGAGTTTGCAACAGGTGGACTTGCTCTChr11173Hi04g11CAGAGGATTATCAATTGGACGCAAACTATCTCCAGTTATCCTGCTTCChr11174Hi06b06GGTGGGATTGTGGTTACTGGGTTTCATCGTCGGCAAGAACTAGAGChr11175Hi07d11CCTTAGGGCCTTTGTGGTAAGGTTTGAGCCGATTAGGGTTTAGGGChr11176Hi07g10TATTGGGTTTTGGGTTTGGAGTTTCAACCCTTTTGGTTGTGAGGChr11附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-6序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置177Hi09a01GAAGCAACCACCAGAAGAGCGTTTCCCATTCGCTGGTACTTGAGChr11178Hi16d02AACCCAACTGCCTCCTTTTCGTTTCGACATGATCTGCCTTGChr11179Hi23d02CCGGCATATCAAAGTCTTCCGTTTGATGGTCTGAGGCAATGGAGChr11180CN491050CGCTGATGCGATAATCAATGGTTTCACCCACAGAATCACCAGAChr11181CH01d09GCCATCTGAACAGAATGTGCCCCTTCATTCACATTTCCAGChr12182CH01f02ACCACATTAGAGCAGTTGAGGCTGGTTTGTTTTCCTCCAGCChr12183CH01g12CCCACCAATCAAAAATCACCTGAAGTATGGTGGTGCGTTCChr12184CH03c02TCACTATTTACGGGATCAAGCAGTGCAGAGTCTTTGACAAGGCChr12185CH04d02CGTACGCTGCTTCTTTTGCTCTATCCACCACCCGTCAACTChr12186CH04g04AGTGGCTGATGAGGATGAGGGCTAGTTGCACCAAGTTCACAChr12187CH05d04ACTTGTGAGCCGTGAGAGGTTCCGAAGGTATGCTTCGATTChr12188CH05d11CACAACCTGATATCCGGGACGAGAAGGTCGTACATTCCTCAAChr12189CH05g07CCCAAGCAATATAGTGAATCTCAATTCATCTCCTGCTGCAAATAACChr12190MS14b04CCTTAAGAATCATGTGATACTAATGGCACAAAGATTGTChr12191Hi02b07TGTGAGCCTCTCCTATTGGGTGGCAGTCATCTAACCTCCCChr12192Hi02d05GAGGGAGAATCGGTGCATAGCATCCCTCAGACCCTCATTGChr12193Hi03b03TGAATTGAGTTTGAGAATGGAATGGTTTGTCAGGACGGGTAATCAAGGChr12194Hi07f01GGAGGGCTTTAGTTGGGAACGTTTGAGCTCCACTTCCAACTCCChr12195CN496913TGCCTTTGAGAATCGAAATGTGTTTGTCAATTTCTTGGAACTCChr12196CH03a08TTGGTTTGCTAGGAAAAGAAGGAAGTTTATCGGGCCTACACGChr13197CH03h03AAGAAATCGGATCCAAAACAACTCCCTCAAAGATTGCTCCTGChr13198CH05c04CCTTCGTTATCTTCCTTGCATTGAGCTTAAGAATAAGAGAAGGGGChr13199CH05f04GATGATGGTGCTCTCGGTTATTTTATGTTGGGTAATGTCTTCCGChr13200Hi03e04CTTCACACCGTTTGGACCTCGTTTCATATCCCACCACCACAGAAGChr13201Hi04a02TTCGTGGAAACCTAATTGCAGGTTTCCTCTGCTTCTTCATCTTTGCChr13202Hi04f09ACTGGGTGGCTTGATTTGAGGTTTCAACTCACACCCTCTACATGCChr13203Hi04g05CTGAAACAGGAAACCAATGCGTTTCGTAGAAGCATCGTTGCAGChr13204Hi08e06GCAATGGCGTTCTAGGATTCGTTTGGCTGCTTGGAGATGTGChr13附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-7序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置205Hi08f06CTTAGAGCATAGATGACCTGCAAGTTTAGAAATCCAACGGCCAAAGChr13206AU223486TGACTCCATGGTTTCAGACGAGCAATTCCTCCTCCTCCTCChr13207GD147TCCCGCCATTTCTCTGCGTTTAAACCGCTGCTGCTGAACChr13208NH009bCCGAGCACTACCATTGACGTCTGTTTACCGCTTCTChr13209CH01e01GGTTGGAGGGACCAATCATTCCCACTCTCTGTGCCAGATCChr14210CH01g05CATCAGTCTCTTGCACTGGAAAGACAGAGTAAGCTAGGGCTAGGGChr14211CH03a02TTGTGGACGTTCTGTGTTGGCAAGTTCAACAGCTCAAGATGAChr14212CH03d08CATCAGTCTCTTGCACTGGAAATAGGGCTAGGGAGAGATGATGAChr14213CH03g04ATGTCCAATGTAGACACGCAACTTGAAGATGGCCTAACCTTGTTChr14214CH04c07GGCCTTCCATGTCTCAGAAGCCTCATGCCCTCCACTAACAChr14215CH04f06GGCTCAGAGTACTTGCAGAGGATCCTTAAGCGCTCTCCACAChr14216CH05d03TACCTGAAAGAGGAAGCCCTTCATTCCTTCTCACATCCACTChr14217CH05e05TCCTAGCGATAGCTTGTGAGAGGAAACCACCAAACCGTTACAATChr14218CH05g11GCAAACCAACCTCTGGTGATAAACTGTTCCAACGACGCTAChr14219MS01a05GGAAGGAACATGCAGACTTGATGTTTCATCTTTACAChr14220Hi01c09AAAGGCGAGGGATAAGAAGCGTTTGCACATTTGAGCTGTCAAGCChr14221Hi02d11GCAATGTTGTGGGTGACAAGGTTTGCAGAATCAAAACCAAGCAAGChr14222Hi08c05TCATATAGCCGACCCCACTTAGGTTTCACACTCCAAGATTGCATACGChr14223Hi21e04TGGAAACCTGTTGTGGGATTTGCAGAGCGGATGTAAGTTGChr14224Hi23b12TGAGCGCAATGACGTTTTAGGTTTCAGGCTTTCCCTTCAGTGTCChr14225AJ000761aCTGGGTGGATGCTTTGACTTTCAATGACATTAATTCAACTTACAAAAChr14226AJ000761bCCCTAAACACACAGCCTCCTGTTTCAGCATCGCAGAGAACTGAGChr14227U78948GATCGTCCGCCACCTTAATAGGGTTTTCATCATGCACATTChr14228CH01d08CTCCGCCGCTATAACACTTCTACTCTGGAGGGTATGTCAAAGChr15229CH02c09TTATGTACCAACTTTGCTAACCTCAGAAGCAGCAGAGGAGGATGChr15230CH02d11AGCGTCCAGAGCAACAGCAACAAAAGCAGATCCGTTGCChr15231CH03b06GCATCCTTGAATGAGGTTCACTCCAATCACCAAATCAATGTCACChr15232CH03b10CCCTCCAAAATATCTCCTCCTCCGTTGTCCTGCTCATCATACTCChr15附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-8序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置233CH04g10CAAAGATGTGGTGTGAAGAGGAGGAGGCAAAAAGAGTGAACCTChr15234Hi01c06TTAGCCCGTATTTGGACCAGGTTTCACCTACACACACGCATGGChr15235Hi02d02TTCCTAGGCTACCCGAAATATGGTTTCTGGCATGGACATTCAACCChr15236Hi02f06TAAATACGAGTGCCTCGGTGGCAGTTGAAGCTGGGATTGChr15237Hi02g06AGATAGGTTTCACCGTCTCAGCGACCTCTTTGGTGCGTCTGChr15238Hi03a06TGGTGAGAGAAGGTGACAGGGTTTAAGGCCGGGATTATTAGTCGChr15239Hi03g06TGCCAATACTCCCTCATTTACCGTTTAAACAGAACTGCACCACATCCChr15240Hi04c05AGGATGCTCTGCCTGTCTTCGTTTCTCACTCGCCTGCTCTATCCChr15241Hi06f09AACCAAGGAACCCACATCAGGTTTCACTTACACACGCACACACGChr15242Hi09f01CACCACCAAATTCTCCATCTTCGTTTACCGCCAAATGCTTTGTTACChr15243Hi11a01ACCGCCAAATGCTTTGTTACGTTTCCTCCATTAAACTCCTCAGTGChr15244Hi15c07TCACTTCCCATCATCACTGCGTTTCAATGTCGAGGCTGGTAATGChr15245Z71981GCACTTACCTTTGTTGGGTCACCGGCATTCCAAATGTAACTChr15246CH02a03AGAAGTTTTCACGGGTGCCTGGAGACATGCAGAATGGAGChr16247CH02d10aTGATTTCCTTTTTCGCAAGGTTCATCGTTCCCTCTCAAACChr16248CH04f10GTAATGGAAATACAGTTTCACAATTAAATGCTTGGTGTGTTTTGCChr16249CH05a04GAAGCGAATTTTGCACGAATGCTTTTGTTTCATTGAATCCCCChr16250CH05c06ATTGGAACTCTCCGTATTGTGCATCAACAGTAGTGGTAGCCGGTChr16251CH05e04AAGGAGAAGACCGTGTGAAATCCATGGATAAGGCATAGTCAGGAChr16252Hi01a08AAGTCCAATCGCACTCACGCGTAGCTCTCTCCCGATACGChr16253Hi02b10TGTCTCAAGAACACAGCTATCACCGCCGTTTCTTGGAGGCAGTAGTGCAGChr16254Hi02h08AACGGCTTCTTGTCAACACCGTTTGGCTGGGAATATATGATCAGGTGChr16255Hi04e04GACCACGAAGCGCTGTTAAGGTTTCGGTAATTCCTTCCATCTTGChr16256Hi08d09ACTCATACCCATCGTATTGGTTTACTGCATCCCTTACCACCACChr16257Hi08f12GGTTTGTAACCCGTCTCTCGGTTTCGTAGCTCTCTCCCGATACGChr16258Hi12a02GCAAGTCGTAGGGTGAAGCTCGTTTAGTATGTTCCCTCGGTGACGChr16259Hi15a13TTCTCCCCTTCTAAACCAACCGGTTTCTTGGCGTAACATTGChr16260Hi15g11TGACATGCATAGGGTTACATGCGTTTGGGTTCGTAATCGTTCTTGTGChr16附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-9序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置261Hi22f06CAATGGCGTCTGTGTCACTCGTTTACGACGGGTAAGGTGATGTCChr16262AU301431TCTTCCTCCTCCTCCTCCTCTCTTTTTCTTGGGGTCTTGGChr16263NB102aTGTTATCACCTGAGCTACTGCCCTTCCTCTTTATTTGCCGTCTTChr16264CH01h01GAAAGACTTGCAGTGGGAGCGGAGTGGGTTTGAGAAGGTTAChr17265CH02g04TTTTACCTTTTTACGTACTTGAGCGGCTTGGAAAAGGTCACTTGCChr17266CH04c06GCTGCTGCTGCTTCTAGGTTGGCAAAACTCTGCAAGTCCChr17267CH05g03GCTTTGAATGGATACAGGAACCCCTGTCTCATGGCATTGTTGChr17268Hi02f12ACATGGCCGAAGACAATGACGTTTCAACCTTTATCCCTCCATCTTTCChr17269Hi03c05GAAGAGAGAGGCCATGATACGTTTAACTGAAACTTCAATCTAGGChr17270Hi05c06TGCGTGTATGGTTGGTTTTGTGTTTTCTTTGGTTTTAGTTGGTGChr17271Hi07h02CAAATTGGCAACTGGGTCTGGTTTAGGTGGAGGTGAAGGGATGChr17272AF527800TGGAAAGGGTTGATTGACCTAACAGCGGGTGGTAAATCTCChr17273AJ001681CCTGAGGTTATTGACCCAAAACACTCAGTTGGAAAACCCTACAChr17274AT000174CGGAGGCCGCTATAATTAGGCCTGGAAAGAAAGTAAAAGGACAChr17275AY187627GAGGACTGAATTGGTTGAGGTCGTTTCTCACCCGTATATAGGCCAACChr17276CH05a09TGATTTAGACGTCCACTTCACCTTGATTGGATCATGGTGACTAGGChr17277BGA35AGAGGGAGAAAGGCGATTGCTTCATCACCGTCTGCTChr17278BGT23bCACATTCAAAGATTAAGATACTCAGCCTTTTTTTCCCACChr17279KA5CAACAACAACAAAAAACAGTAAAGCCTTAGAAATAGAAACAACAChr17280KA14ATGGCAAGGGATATTATTAGTCATTGTAGCATTTTTATTTTTChr17281KA16GCCAGCGAACTCAAATCTAACGAGAACGACGAGCGChr17282KB16GATTTTGTCCGCAGGTAAAGAACAGCAAGAACCAChr17283KU10AGTATGTGACAACCCCGATGTTAGAGTCGGTTGGGAAATGATTGChr17284NB103aTTGTAGGGAAAATGATGCCAGTGTTGATACTCTCTCTCTCChr17285NB105aAAACAACCGACTGAGCAACATCAAAATCTTAGCCCAAAATCTCCChr17286NB106aGTACGTCGACATGAGAGAGTCTCTTGTTCCTTCCTGCACChr17287NB109aATGCTCTATAAAACCCACCTACCAGAGGGACCATTGTGTTATTGTATChr17288NB110aTGATGATGTGATTTGATGGAGTGCCATTCCATTGTACGGATTChr17附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-10序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置289NB111aCCAAGCTGTGATTATAGGAAGAGGCTGAAAGATTGTAAGGTChr17290NB113aATGAAATATGTCGTGTTGCCCTTAGCCCTTCCTCAGCATGTTTCCTAGACChr17291NH007bACCTTGATGGGAACTGAACAATAGTAGATTGCAATTACTCChr17292NH019bGAGATGGAGTAGTAAAGAAGAAGGACGACATAGTGAAAACAGAAGChr17293NH020aGGATCAGCCAAGAGGAGGTGCGAGATGCAGAGGACGACGChr17294NH021aATCTCAATTTTCTCGGTAACCACTGATATCTCTCTGCACTCCCTChr17295NH022aCATGAAGTGCGTAGAAGTTGGTGTCCCAATAATGATAAGTTCCCAAAGChr17296NH023aGATGCTAGAAGGAAGGAATGATGGCTTTTCAACCCCTTCACCTTCTCChr17297NH024bACCAAAAGTAGAGAGAGAGACCCAACCAGACTAAAAGAGAChr17298NH025aCTGGACACAAACATTCAAGAGGGCACACCAGAAACTCCAAAACAGGChr17299NH027aTAATGTGTTGGGGAGAGAGAGGCTCTTGTTCCTTGCTCCTAAChr17300NH030aGCAACAGATAGGAGCAAAGAGGCTCCAAAGTTCAAChr17附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-111.基因MDP0000686092编码的氨基酸序列MSDDKMAHDIEXQLDNLSGLSPERCIYRVPERLRQVNEKAYTPQVV XVGPLHHGNGPLKAMEEHKLRYLKHFLSKTKVKLSDCLQKIQEQXKELR GFYAEPIXFDKGEFVRIVSVDAAFVIDLLLRFEVVNYREDEDDYIFSKPTM KSDVIRDLQLLENQLPFFILQDLFKLIPPQLQLQLPSLLEISYNFFQSXIDSE VKXEKFNKISSSGVEVKHFVDLIRILYLPLEPKXKPKTTATPKTRDXPNVT ELHQAGAKFKVGKGSSLFDIKFSCGILKIXKLRVDDTTDLKLRNLLAFEQC HHRKEEEDXLANYVFLMKRLAKTREDVQLLVEKGIIENWLGDTQKISNLL HDLGTGMIVDDWYYAPHXEKLIEYRXVLCRGWMVILKQKYFNTPWSTIS VAAAVILLILTLIQTACSYKSVPLL*2.基因MDP0000205432编码的氨基酸序列MAIEGRFNWSRTSHSFSALCKNRKAATLSRRNLRRESPPQPCKKTGI KSVGLKPTWSFSLLASCCCWTIGRAMRGLEETTCRWRRGGRKMKRKDY EELDDDFFSPSSKSRRLDAGLFATLNEDQSSAAQVFDEKPAPETSVVMQT DDLPTDPLPSGDEXALVLYNPTNTRIFKAPDSQDFSVIVNSDLIPGLREDX GSDEENKEVSNRCMAVVPWVAPNFPPASRDETQAASQSESMEVEMMDT DDNGYNGAEASGFGGTMMEGPGGIQYWQQQQLRWMEPQLFQNNITPVT3.基因MDP0000120033编码的氨基酸序列KNNWRVELSHNSRGGGGGRGGGGRGRSGGSDLKCYECGEPGHFAR ECRLRGGGGGGGGGGRRRSRTPPRYRRSPSYGRRSYSPRGRSPRRRSLT PRGNSRSRSPPYRGREELPYANGMTFHLIHAMMQWSEGSPPKQELRSAY MATWRCFRRYTGIKCCLVCLDISTTMFKLGDALSLYCLSDLVKFLPFLTLA GFIYLCKIGVGIRILKVSSASSASLVLFFCTPLAPGIFVLHYCPALGSSILNGC RSQPARASILCFCTLPGISSLPCYWDLQFXIVVDPSLLSAELLFSLNFVGSN APPSNYYSXICLIEQWVTPRMFLFYRSWRFGSDNRFSDPTPIFLPLIFNWIQ KYRNKFGSKGNLDHTETLTPCFVVG4.基因MDP0000864010编码的氨基酸序列MESEGTPYAPKSILITGAAGFIGSHVTNRLIKNYPSYKIVALDKIDYCS SFKNLRPCRSSPNFKFVKGDIACADLINHLLIADEIDTIMHFAAQTHVDNSF GNSFEFTNNNVYGTHVLLEACKVTQRVKRFIHVSTDEVYGETDMETNIGN PEASQLLPTNPYSATKAGAEMLVMAYHRSYGLPTITTRSNNVYGPHQYP EKLIPKFSLLAMKGEKLPIHGNGSNVRSYLYCDDVAEAFDVILHKGVIGH VYNIGTKKERSVLNVAEDICKMIGLNSKEAITFVQDRPFNDQRYFLDDQK LKRLGWDVRTSWEEGLKLTTEWYTKHADWWGDVSAALHPHPSFAVISR PNDDSWFFEYGFTRLSRTCNEGSNSSELKFLIYGRTGWIGGLLGKLCKGEG IXFEYGKGRLEDRKSLLEDITRVQPTHVFNAAGVTGRPNVDWCEXHKAQ TIRTNVAGTLNLADVCKDQGLLMMNFATGCIFEYDKEHPLGSGIGFKEED NPNFTGSFYSKTKAMVEELLKEYDKVCTLRVRMPISSDLSNPRNFITKIAR XDKVVNIPNSMTVLDELLPISIEMARRNCRGIWNFTNPGVISHNEILEMYR DYIDPKLKWQNFDLEEQAKVIVAPRSNNELDASKLKKEFPELLSIKDSIIK YVFEPIKKT*5.基因MDP0000945764编码的氨基酸序列MDVLVGPTFSLDVSSYGPAPTQDNRNRGGLYLNQDRGAAVAEEASS DSSSSIGVPDDSEEEEDSKGDNGDEVQSKFNGGGGGGLGSLGSFGSLEDSL PIKRGLSNYFSGKSKSFASLSEVSSTVSSVKEVEKQDNPFNKRRRVLIASK WSRRSSSSSSLYNWPNPKSMPLLALAEDGDEDDDEHDRDREGEGENASS EQSSSDEKEDQERRRXPQKLLDRRLKSFKSKSCYCLSDLQEHDEQ*引物名称正向引物序列反向引物序列SNP4970R：TGGACAAACAGGAAGCACGF：CAGCGACAGTGGCGACAASNP4236R：GCTTATCATAAAAAGCAAGACCACF：ATCATATAATTGTGTAATTTAGTAGAACASNP4257R：GGAGTCATAAGCCACAACGAGF：TCAGCTTTGAAGCATCCAATTSNP4336R：AGTTCGTTCTTTTCCGTTGCTF：GCGGTCCTGATTCAGGTACAGSNP3955R：CCCTTAAAAGCCATGGAAGAGF：GTTCTGCATAAAAACCTCGCASNP4094R：GGGTTTTGTGAGGAGGAGGAGF：CGAAGATTGCGACGGGATAGSNP3969R：CTCGTTAGGCCAAGACAAGCF：TTCAAAGAGTAGGTAGGAAGGGT附表2 SNP、InDel引物设计引物名称正向引物序列反向引物序列SNP4137R：GCACGAGTATGATGTTGCTAATGF：CCATCTTATGTCCCCAATTTGTAGSNP42992R：GGTTATACATAGAGGCACTTAGAGCF：GCACAAAACTTAGATCAAAGATGAGSNP42994R：TCAACTCATGTGCAGGAATTGGF：GCTGTGACATAAACCAGGTGAGASNP4376R：GTTTGCTGAGAAATTGATTGGAF：CCATTTCTCCTGGGGCATAGSNP4390R：AGGGCTTGGCTCACAATACTCF：TCAGGTCACAGTTGTTTTGGCSNP4432R：CGAGGAGCAAACGATAGTCAGF：ATTGGTCTCCGAATTAGAAGTCCSNP4782R：GGAGAGCGATTTATTCTACCCTACF：AGACGAAGAAAGCAACGAAAGASNP4842R：GGTCAAAATTGTCCTAGCCTATTTCF：TCCCTCATTTCCTCTTTTTACCTACSNP4878R：GAAGCAGCAGTGCAGGATGAGF：CCATAGCCCTTTGCTCTATTTGTSNP4903R：CTAGGCAAATTTAGGTAAATTTCTTAF：GACAGGTTATCAGTTTATAGCATCAAGSNP4960R：TGAGGCTATCACATTTCCAACGF：GGTTAGATGCAGCCCGATTTindel4199R：ATTGTGAAACCTTGATTGGGF：GAGATTATCCTTATTTTGTGGGindel4209R：ATGGAACGTAAGAACAAGGAF：TTGCTGAGAAGAGTACAAGTGindel4225R：AGGCGCGGTGTTGTCTAAF：CCTCAGGTGCAATAATCATCAindel4227R：AGCGTTGCTATGCTTCTAATGF：AAGATGGAAATGGTATGTGATindel4229R：AACAGAAACATTCGAGGCGTAF：TCCTTGAACTTCGTCGGTAGCindel4235R：GTGTGAAAGCTCAACTCTCCF：CAGCCTTCTCATCGGGTAGindel4246R：GGTAGCACATGCATACTGACAF：CGTTTTGGTAACTAAATCTCCindel4247R：ATGAATGTTTCGCCGAGCF：GTTCAACCATTTTATTGGATTTTindel4254R：ATAAAGTCACTTCTAGCACAAATAF：CGAAAAACGCTTTACTTAGGindel4268R：TCCACAGAAAACAACTAAAAAF：GTTTGCCAATGGGAATGindel42686R：GGCATGAATAGTTTCCACAGAF：TTTGCCAATGGGAATGTTTindel4273R：GAATGTAAGCCATGCCCTCTF：TTCCTACCATTTGTTGCCTCindel4273aR：AATGAAGAGGCAACAAATGGF：TTTTTTATCAAATCCAAATGTGindel4273bR：GTGGTTAAAGGGATTATGTCTF：TGCGAATAGGATTGAGGTindel4274R：TTGAGGGAATGAAATATGCTAF：TTGTTTATCGAATTGGGTTTindel4305R：GTAAACTCATTAAATTATGCTTGF：TGCTTTACTCCGATTCTTCindel4305aR：GTTACTTGGGCTTCCAGACAF：CCCCCAGAGAAATAGAGAGTTindel4307R：AGAAATCCGATCCTTACCACF：TGTTATCCCGTGGGTCTTindel4311R：AAACTGATAAACTTGGAGATTGF：GACGCCTACCGAACTACAindel4334R：ATACTATGAGGTGAAGGATTTAAF：GTATCTTCTACATTATCTTTCGTGindel4336R：CTCGTCGTCTATCGGTGTTF：GGGGTTTACTTGATTGGGA附表2 SNP、InDel引物设计（续）-1引物名称正向引物序列反向引物序列indel4341R：AGTCGGAAAATTCATTCATATF：GAGCTTACAGTTTTTGGTTTTindel4346R：GTTCACGGGATTAAGTCATGF：CAACGGCAAAAAATTATTATAindel4348R：GCTTATGCTCAGGGTCGTF：TTTTGATTTAAGTTATTATTTTCCAindel4349R：CAATCCATTTCAATTTTTCTGF：TTATTTTACCCCTACCCCATindel4362R：TTGAGGTTCGTTTTGGTATF：TTCAATTTTATCTCTTGGTCCindel4362aR：ACAAGTTAACAGATTTTCAAAGTF：GCTTGTAATTTGTTTTTTATGAAindel4371R：TTATTGTGTTTCTGTGCGTACF：CCAAATTATCGTTCACTGCTndel4372R：TTTGAAAACACCCTTGAATGF：TGGTTCCTGAGTGGGTAAAGindel4374R：TCAGTGACTTCGGCGTATTF：AGTTCAATCAATCTCCCAAA附表2 SNP、InDel引物设计（续）-2

高分辨熔解曲线 （High Resolution Melting，HRM） 分析技术是近年来国际上兴起的一种最新的应用于基因突变检测和 SNP 分析的方法。因为所用的荧光染料只能嵌入并结合到双链 DNA 上，因此利用实时 PCR 技术，就能通过实时检测双链DNA 熔解过程中荧光信号值的变化，将 PCR 产物中存在的差异以不同形状熔解曲线的方式直观地展示出来，并且可以借助于专业的分析软件对测试群体实现基于不同形状熔解曲线的基因分型或归类 （殷豪等，2011）。高分辨熔解 （HRM） 曲线分析技术具有三个突出的优势：一是高通量、高灵敏度、高特异性、低成本且不受检测位点的限制；二是操作简单、快捷、节省时间成本；三是闭管操作，无污染且 DNA 不受损伤，熔解分析后还可以进行凝胶电泳或测序分析。在 LightCycler ? 480分析仪上一次可以完成96个或348个样本的分析，从反应开始到数据生成仅需要90～120 min。目前HRM技术在果树的种质鉴别和基因分型研究中已有应用。吴波等 （2012） 引入高分辨率熔解曲线分型技术对柑橘进行SNP 分型；Ganopoulos等 （2013） 利用 HRM 技术对9个甜樱桃基因上的 SNP 位点进行分析，成功的实现了对21 个甜樱桃品种的鉴别，准确率达到 99.9%；Distefano 等 （2013） 第一次将HRM技术应用于对柑橘品种 SNP 及 InDel的检测，并利用21 个 SNP标记实现了对柑橘不同品种的区别。分子标记辅助选择育种 （marker assisted selection，MAS） 作为一种高效的现代分子育种技术，已被广泛应用于作物品种选育和遗传改良。它是利用与目标基因紧密连锁的分子标记，来鉴定不同个体的基因型，从而进行辅助选择育种。与通过表现型间接对基因型进行选择的传统育种方法相比，MAS具有更大的信息量，能有效结合基因型与表型鉴定结果，更加高效和准确，避免选育过程中的盲目性和不可预测性，能够将育种时间从传统的十几年缩短到几年时间，从而显著提高育种效率。分子标记对目标性状鉴定的准确性是影响分子标记辅助选择效率的一个重要条件。本试验利用HRM分析技术对上一章节所开发的SNP 和InDel标记进行筛选和验证，以获得与抗炭疽菌叶枯病基因 R gls位点紧密连锁的SNP 及InDel标记，对抗病基因进行精细定位，缩小抗性基因位点的区域范围，为基因克隆提供数据。同时利用筛选出的4 个与 R gls基因位点紧密连锁的分子标记对50 个苹果栽培品种和品系进行准确性鉴定，以验证分子标记的可靠性。选择青岛农业大学苹果试验基地 （山东省胶州市） 2009 年种植的，经过人工离体接种鉴定的 ‘金冠’ב富士’ 的F1 杂交群体207株实生树为材料用于验证 SNP、InDel标记及进行抗炭疽菌叶枯病基因的精细定位。所用群体与第三章SSR标记的开发与遗传定位为同一群体。选择该试验基地栽培的 50 个田间栽培品种和品系做为试材，经人工离体接种鉴定并提取DNA，用于分子标记准确性的验证。同第三章。用于引物设计的SNP 和 InDel位点来源于第四章中所筛选出的位于第15条染色体上3.9～4.9 Mb候选区域的18 个 SNP 位点和30 个InDel位点。从网站 https：//www.rosaceae.org/gb/gbrowse/malus_x_domestica/下载位于SNP 和InDel位点上游150 bp和下游150 bp距离内的contig 序列用于引物设计。引物设计的主要参数为：产物大小60～150 bp；引物退火温度 （Tm） 在 55～65℃，且上、下游引物 Tm相差不大于 2℃；引物 GC （%） 含量为 45%～55%，引物大小在60～160 bp。引物序列 （附表 5-1）。所有引物由生工生物工程 （上海） 股份有限公司合成。PCR扩增和高通量熔解曲线分析在 LightCycler ? 480Ⅱ荧光定量PCR 仪 （Roche） 上进行。反应试剂来自 LightCycler ? 480 High Reso-lution Melting Master试剂盒。反应体系为15 μl，内含10 ng/μl的基因组 DNA 1.0 μl，1×Master Mix 7.5 μl，2.0 mmol/L MgCl2 1.5 μl，左右引物为 0.2 μmol/L各0.5 μl。PCR扩增程序为95℃预变性10min，然后按95℃变性10min，55℃退火15s，72℃延伸10s的程序进行45个循环。在PCR循环结束后，立即对扩增产物进行HRM检测，程序为：95℃1min，40℃1min，65℃1s，在65℃升温至95℃的过程中，以25次/℃的频率收集荧光信息，最后降温至40℃。高分辨率熔解曲线分析用LightCycler?480的Gene Scanning软件（1.5version）进行。用18对 SNP 及30对InDel引物在亲本和抗感基因池中筛选，将出现不同分型的引物在分离群体上进行验证，以确定该标记是否与目的基因连锁。将筛选的多态性标记在重组个体上的基因型表现与重组个体的抗病表型进行统一分析，对抗炭疽菌叶枯病基因 R gls位点进行精细定位，缩小抗性基因位点的范围。为后续的候选基因筛选及图位克隆提供准确的信息。将进一步缩小的R gls位点区域内的基因进行统计并进行同源比对和GO功能富集分析，以筛选该区段内可能与抗病相关的候选基因。SSR标记的PCR产物利用3.5%的琼脂糖凝胶电泳进行标记基因型鉴定。SNP 和InDel标记利用HRM技术进行基因分型鉴定。通过对设计的引物进行 BSA 筛选，获得了与 Rgls基因位点连锁的6个SNP 及5个 InDel标记，分别为 SNP3955、SNP4236、SNP4257、SNP4299、SNP4336、SNP4432 和InDel4199、InDel4227、InDel4254、InDel4305、InDel4334。在6个SNP 位点中有A/G、G/A、T/C和C/G四种变换形式，其中发生A/G转换的占50.0%，发生G/A转换，T/C转换，C/G颠换的各占16.7%（表5-1）。引物名称引物序列序列长度参考碱基突变碱基位置SNP3955R：CCCTTAAAAGCCATGGAAGAGF：GTTCTGCATAAAAACCTCGCA133AGchr15∶3，955，630-3，955，763SNP4236R：GCTTATCATAAAAAGCAAGACCACF：ATCATATAATTGTGTAATTTAGTAGAACA114AGchr15∶4，236，220-4，236，353SNP4257R：GGAGTCATAAGCCACAACGAGF：TCAGCTTTGAAGCATCCAATT145GAchr15∶4，257，141-4，257，286SNP4299R：GGTTATACATAGAGGCACTTAGAGCF：GCACAAAACTTAGATCAAAGATGAG135TCchr15∶4，299，179-4，299，314表5-1 SNP、InDel引物筛选引物名称引物序列序列长度参考碱基突变碱基位置SNP4336R：AGTTCGTTCTTTTCCGTTGCTF：GCGGTCCTGATTCAGGTACAG133CGchr15∶4，336，382-4，336，515SNP4432R：CGAGGAGCAAACGATAGTCAGF：ATTGGTCTCCGAATTAGAAGTCC137AGchr15∶4，432，529-4，432，666indel4199R：ATTGTGAAACCTTGATTGGGF：GAGATTATCCTTATTTTGTGGG156AAAGchr15∶4，198，916-4，199，072indel4227R：AGCGTTGCTATGCTTCTAATGF：AAGATGGAAATGGTATGTGAT81TTCchr15∶4，227，569-4，227，650indel4254R：ATAAAGTCACTTCTAGCACAAATAF：CGAAAAACGCTTTACTTAGG119GGCchr15∶4，254，896-4，255，015indel4305R：GTAAACTCATTAAATTATGCTTGF：TGCTTTACTCCGATTCTTC134CCCAchr15∶4，305，342-4，305，476indel4334R：ATACTATGAGGTGAAGGATTTAAF：GTATCTTCTACATTATCTTTCGTG115TTAchr15∶4，334，597-4，334，712表5-1 SNP、InDel引物筛选（续）-1将获得的11个标记在207 株 F1 群体上检验其与抗炭疽菌叶枯病基因的连锁情况，结果表明，这11 个标记的扩增子熔解曲线形状明显不同，可据此区分抗病型和感病型植株 （附图5-1）。将从全基因组重测序中筛选出并经群体验证的与 R gls位点紧密连锁6个SNP 及4个InDel标记 （InDel4305标记在染色体上的物理位置与遗传位置不符，未用于精细定位分析），加上1 个 SSR标记，共11个标记与重组个体基因型及表型进行分析。结果显示，InDel4227、SNP4236和InDel4254标记与基因Rgls位点共分离，没有重组个体。标记InDel4199有一个重组个体 S29 和标记 SNP4257 有两个重组个体R16和R31，这三个关键的重组个体将基因 Rgls位点定位于 InDel4199和SNP4257 两标记之间，物理距离由 500kb 缩小为 58kb （附图5-2）。按照基因位置信息从蔷薇科基因组网站 GDR下载基因组15 号染色体4.1～4.3 Mb内基因45个。通过perl脚本整理基因组GFF文件，BLAST同源比对NR数据库，选取最优比对结果。获得目的区段内的45个基因，其中5 个基因功能未知，2 个为转录因子，另外40 个基因均有明确的注释信息 （表5-2）。序号MDP号码同源基因1MDP0000180944生长素诱导蛋白15A2MDP0000205434非病原性诱导蛋白3MDP0000148158生长素诱导蛋白15A4MDP0000177664蛋白酶体beta亚基5MDP0000177665转录共抑制因子LEUNIG6MDP0000215349转录共抑制因子LEUNIG7MDP0000664885抗烟草花叶病毒蛋白N8MDP0000877582抗烟草花叶病毒蛋白N9MDP0000200748转录因子10MDP0000481972抗烟草花叶病毒蛋白N11MDP0000481973抗烟草花叶病毒蛋白N12MDP0000381897转录因子13MDP0000297052抗烟草花叶病毒蛋白N14MDP0000700563黄瓜素15MDP0000242744阳离子运输调控蛋白216MDP0000551192阳离子运输调控蛋白217MDP0000242745转录因子18MDP0000153007来自转座子TNT1-94的反转录病毒Pol多肽蛋白19MDP0000130036未知功能转录因子20MDP0000199184未知功能转录因子21MDP0000489432三角状五肽链重复包含蛋白22MDP0000318360类LRR丝氨酸/苏氨酸受体蛋白激酶23MDP0000247898类LRR丝氨酸/苏氨酸受体蛋白激酶表5-2 区段内基因同源比对结果序号MDP号码同源基因24MDP0000811774核糖核酸酶H2亚基B25MDP0000309446未知功能线粒体蛋白26MDP0000272143单尿苷绑定蛋白1B；与mRNA3’-UTR绑定27MDP0000871880脱水响应蛋白RD2228MDP0000272145酪蛋白激酶Idelta小体29MDP0000167752结构域包含蛋白3430MDP0000167753核糖核酸酶H2亚基B31MDP0000596125核细胞溶解酶TIA-1小体32MDP0000201427拓扑异构酶I33MDP0000149447脱水响应蛋白RD2234MDP0000596128酪蛋白激酶Ideta小体35MDP0000201428UDP-糖转运蛋白36MDP0000201429环核苷酸离子通道蛋白1437MDP0000255274环核苷酸离子通道蛋白1438MDP0000120033丝氨酸精氨酸富集剪接因子。39MDP00001695343-酮脂酰-CoA合酶640MDP0000203647细胞分裂素-O-葡糖基转移酶341MDP0000864010鼠李糖生物合成酶142MDP0000279973肌氨酸氧化酶43MDP0000178030未知蛋白44MDP0000289536肌氨酸氧化酶45MDP0000272940转录因子WRKY11表5-2 区段内基因同源比对结果（续）-1为了对基因功能做进一步分析，提取区段内基因的 GO （gene on-tology） 信息，采用基因功能GO分类网站WEBGO （ http：//wego.ge-nomics.org.cn/cgi-bin/wego/index.pl） 进行基因分类。结果显示，这40个基因在细胞组成上涉及到4 个 GO 分类，包括细胞、细胞组分、细胞器组成以及大分子复合体的组成；在分子功能方面，该区段内基因涉及到电子传递、转运蛋白、水解、绑定、催化以及物质传递6 个GO分类；在生物过程方面，该区段内基因涉及到免疫过程、生物调控过程、细胞过程、色素沉着过程、程序性死亡过程、代谢过程、响应刺激过程、定位以及定位确立9个生物过程 （附图5-3）。经离体接种鉴定，50 个作为分子标记准确性鉴定材料的品种（系） 中有33 个抗病品种 （系） 和17 个感病品种 （系）。从与抗炭疽菌叶枯病基因紧密连锁的分子标记中挑选出4 个有代表性意义的分子标记SSR标记S0405127，S0304673，SNP 标记 SNP4236，InDel标记InDel4254作为鉴定标记。其中SSR标记 S0405127 与基因 Rgls位点的遗传距离为 0.5cM，S0304673 的遗传距离为 0.9 cM （见第三章），标记SNP4236和 InDel4254与目的基因共分离。鉴定结果显示，SSR标记 S0405127，S0304673，SNP 标记 SNP4236，InDel 标记 In-Del4254 鉴定抗感品种 （系） 的准确率分别为 90.0%，94.0%，98.0%，96.0%。在基因型与表型鉴定结果中，不相符的个数分别为5个，3个，1个，2 个。这 4 个分子标记鉴定结果的准确率均达到90%以上，可以应用于田间栽培品种、品系、种质资源以及杂种后代幼苗对炭疽菌叶枯病抗性的鉴定 （表5-3）。序号品种/系表型S0405127S0304673SNP4236InDel42541海棠RRSRR2斗南RRRRR3福丽RRRRR4福艳RRRRR5红勋1号RRRRS6华帅RRRRR7鲁加1号RRRRR8鲁加2号SSSSS9鲁加4号RRRRR10鲁加6号RRRRR11旭RRRRR12早杂1号RRRRR13威赛克旭RRRRR14五月金RRRRR15早翠绿RRRRR表5-3 四个分子标记对苹果栽培品种和品系的抗病性的鉴定结果序号品种/系表型S0405127S0304673SNP4236InDel425416国光RRRRR17霞光RRRSS18烟富1RRRRR19福早红SSSSS20嘎拉SSSSS21金冠SSSSS22秦冠SSSSS23华硕RSRRR24瑞丹SSSSS25乙女RRRRR26王林RSRRR27青农红SSSRR28秦冠SSSSS29瑞红SSSSS30赛金RSRRR31红肉1号RRRRR32双阳红SSSSS33望山红RRRRR34新红星RRRRR35青冠RRRRR36弘前富士RRRRR37富士RRRRR387C-102RRRRR39N2SSSSS40PinavaRRRRR417C-35SRRSS4295-161RRRRR4395-231RRRRR4495-232SSSSS4595-32RRRRR4695-93RRRRR477C-104SSSSS487C-105SSSSS497C-106SRRSS507C-107SSSSS表5-3 四个分子标记对苹果栽培品种和品系的抗病性的鉴定结果（续）-1精细定位通常采用的方法是侧翼分子标记法，对于有参基因组植物来说，就是根据对目的基因的初步定位结果，选择位于目的基因两侧的分子标记之间的碱基，用于设计合适的分子标记。筛选出的与目的基因连锁的分子标记，通过鉴定更大的群体来确定发生交换的重组单株，最终找到与目的基因紧密连锁的分子标记，从而实现对目的基因的精细定位。精细定位是图位克隆策略中重要的一步，可以通过开发新的分子标记，整合原来已有的遗传图谱来进行图谱加密，以实现对目的基因的精细定位。本研究利用全基因组重测序技术开发出的 SNP 及 InDel标记，结合Rgls基因初步定位结果，选出在 Rgls基因两侧的 SSR 标记 S0304673和S0405127之间的SNP 和InDel标记，通过HRM曲线分析技术对18个SNP 位点和30 个 InDel位点进行了分析，筛选出6 个 SNP 及5 个InDel标记与Rgls基因位点紧密连锁。并选择其中的10 个标记用于Rgls基因位点的精细定位。标记InDel4227、SNP4236和 InDel4254表现出与R gls基因位点共分离。由于所用群体规模的限制，所以筛选出的SNP 及InDel标记仍无法对R gls基因位点进行真正意义上的精细定位。由于现有的金冠苹果基因组数据库中可能存在组装错误，所以在对定位区域内的基因进行分析中，扩大 R gls基因位点区域。对苹果第15条染色体4.1～4.3 Mb距离内的基因进行统计分析，结果表明在该区段存在40个有功能注释的基因，涉及到细胞组成方面，分子功能方面，生物过程方面共18个GO分类。在细胞组成层面上，参与细胞组成的基因，一般是由主效基因或寡基因控制的质量性状，是个体保持组成性抗性的基础，影响着品种的垂直抗性。在分子功能层面上，植物个体抗性与电子传递、转运蛋白、水解、绑定、催化以及物质传递等生物过程密切相关。例如，植物受到病原菌侵染后，体内会产生并积累一些次生代谢物质，如植保素、酚类、木质素、菇类等化合物，对病原菌产生抵抗作用 （Pirie and Mullins，1976）。植物次生代谢途径尤其是苯丙烷类代谢途径是与植物抗病性密切相关，许多抗菌物质 （包括酚类、类黄酮、绿原酸、酮类等） 的生物合成都是通过这条途径完成的 （RalPhL，1992；Cole R.A，1985）。在生物过程层面上，程序性死亡过程，响应刺激过程以及免疫过程与抗病机制密切相关。细胞程序性死亡 （programmed cell death，PCD） 是细胞死亡的两种基本类型之一，是细胞接受某种信号或受到某些因素刺激后主动发生的由基因调控的死亡过程。植物与病原菌互作过程中发生的过敏性反应 （hypersensitive reaction，HR） 是PCD 的重要表现形式之一，是植物抵抗病原菌入侵的早期重要抗性反应，对植物抗病性有着重要意义。在该区域内存在着4个编码WRKY转录因子的基因MDP0000272940、MDP0000242745、 MDP0000381897、 MDP0000200748 以及5 个 TIR-NB-LRR 家族基因 MDP000066488、 MDP0000877582、 MDP0000481972、MDP0000481973、 MDP0000297052。许多研究结果表明，当植物受到病原菌入侵或植食性昆虫取食植物后，植物体内的一些WRKY 转录因子的表达水平会随之发生改变 （Hui et al.，3003；Zhao et al.，2007）。Huang等 （2002） 研究了一个茄科植物的 WRKY 蛋白 STHP-64，发现其在低温胁迫下表达增强，Rizhsky 等 （2004） 发现拟南芥的 At-WRKY25蛋白与氧化胁迫下胞液抗坏血酸过氧化物酶的表达有关。Li等 （2006） 通过对WRKY70蛋白过表达的转基因植株和变异植株的研究，证明过表达拟南芥 WRKY70 蛋白的转基因植株能提高水杨酸（SA） 介导的抗病性，但降低茉莉酸 （JA） 介导的抗病性。2006 年Ryu等对水稻WRKY 转录因子在不同生物胁迫下的表达量变化进行了研究。结果显示在45 个水稻 WRKY 转录因子中有15 个 WRKY 转录因子可以被稻瘟病病菌 （ Magnaporthe grisea） 诱导表达，其中12个可以同时被水稻白叶枯菌 （ Xanthomonas oryzae Dowson） 诱导表达。在对防御反应相关的信号分子对 WRKY 转录因子的影响的研究中发现OsWRKY10、OsWRKY82和OsWRKY85可以在经过茉莉酸诱导的叶片中表达，OsWRKY45 和 OsWRKY62 可以在经过水杨酸处理的叶片中诱导表达，OsWRKY30 和 OsWRKY82 可以同时被水杨酸和茉莉酸诱导表达，这说明WRKY 转录因子参与了植物的诱导防御反应。抗性基因 （R gene） 编码的蛋白大部分是 NB-LRR 蛋白，不同类别的 NB-LRR蛋白可以直接或间接的识别不同来源的病原菌效应子，从而激发相似的防御反应。这9个基因是人们重点关注的基因。进一步的基因功能研究及苹果与炭疽叶枯菌的分子互作机制研究将围绕着SNP 定位的5个候选基因及该区段内的相关基因展开。随着分子生物学技术的快速发展，特别是以DNA多态性为基础的分子标记技术在苹果育种中的应用，大大提高了目标性状早期选择的效率，缩短了育种周期，加快了新品种选育的速率。Tartarini 等（2000） 报道了利用获得的与抗苹果黑星病的显性单基因Vf紧密连锁的RAP D标记测验了携带该基因个体，淘汰错误率为3%，保留错选率仅为 0.02%。Cheng等 （1996） 利用与控制果色的Thd01基因紧密连锁的RAP D标记，在苹果实生苗发育早期进行了标记筛选，实现了对果色这一特定性状的早期选择，大大减少了人力物力的浪费。苹果柱型性状有利于形成集约高效的现代苹果栽培模式，能够降低生产成本，提高产量。Moriya等 （2012） 所得到的 3个与控制苹果柱型性状Co基因共分离的标记 Mdo.chlO.12、Mdo.chlO.13 和 Mdo.chlO.14，对于柱型苹果杂交育种中对群体材料的早期选择、基因的克隆及转化有着重要意义。王彩虹 （Wang caihong，et al.，2011） 通过SCARs标记和SSR标记对控制梨矮生性状基因 PcDw 进行了基因定位，对梨矮化育种有着重要的意义。随着不同果树基因组测序的完成，在果树方面陆续开展了相关 SNP 芯片研发和利用。Chagne等 （2012） 对27 个苹果品种进行低深度重测序检测并确认全基因组范围的 SNP，开发了苹果 8 K 的 SNP 芯片，可用于苹果幼苗大规模检测，这将会促进标记—位点—性状之间关联性的发现，进一步阐明质量性状的遗传结构特性，推动遗传变异研究。本实验利用四个紧密连锁的分子标记 S0405127、S0304673、SNP4236和 InDel4254对50个田间栽培品种和青岛农业大学选育出的优系进行了抗炭疽菌叶枯病的基因型鉴定，并结合其抗病的表型鉴定对四个标记的准确性进行了分析。结果表明四个标记的准确率分别为90.0%，94.0%，98.0%和96.0%，可以有效的应用于分子标记辅助育种。在第三章的研究结果中，SSR标记S0405127 与基因Rgls位点的遗传距离为0.5cM，而S0304673 的遗传距离为0.9 cM，理论上标记S0405127与抗性基因位点连锁的更紧密，准确性应该更高，而在品种群体验证中，标记 S0304673 鉴定抗感品种 （系） 的准确率为94%，而标记S0405127的准确率为90%。在利用重组个体对基因Rgls位点进行精细定位中，SNP4236 和 InDel4254 标记与目的基因共分离，在品种的群体验证中应该显示100%的准确性，但实际上还是有1～2个表型鉴定与基因型鉴定不符的个体。这种现象存在的原因一是可能由于用于鉴定的品种或品系数量有限，导致了结果的偏离。二是标记S0405127的条带显示为有和无的差异，在电泳时有可能存在读带误差。三是在对做图群体进行表型鉴定中，可能存在表型鉴定误差，导致遗传距离计算的偏差。四是在精细定位中，需要应用更大的群体筛选重组的单株以完成对目标基因的精细定位。而由于实验材料的限制，所用群体规模不是很大，所以可能导致定位结果的误差。这些问题尽管在实验中是不可以避免的，但是在以后进行更精细的遗传定位研究中，以更大规模的群体和更严谨的实验操作来进一步验证，可以减少这些误差的产生，提高遗传作图的精度。

常见的果实贮藏方式，按贮藏原理大体可分为低温贮藏和气调贮藏两大类，其中低温贮藏包括利用自然冷源贮藏的沟藏、窖藏、通风库储运和人工降温的冷库贮藏等；气调贮藏包括气调冷库贮藏、塑料薄膜封闭贮藏等。按储运设施不同可分为简易贮藏、通风库贮藏、冷库贮藏、气调贮藏和其他贮藏方式。(1)简易贮藏。简易贮藏是为调节果品供应期所采用的一类较小规模的贮藏方式，它不能人为地控制储温，而是根据外界温度的变化来调节或维持一定的贮藏温度。这类传统的贮藏方式历史悠久，大多来自民间经验的不断积累和总结。其贮藏场所形式多样，其中以堆藏、沟藏、窖藏颇具代表性。此类方式一般不需要特殊的建筑材料和设备，结构简单，具有利用当地气候条件、因地制宜的特点。由于其贮藏方式主要依靠自然温度的调节作用来维持一定的贮藏环境，故在使用上受到一定程度的限制。尽管如此，由于其简便易行，仍然是目前我国农村普遍采用的主要贮藏方式。①沟(埋)藏。沟藏是将水果堆放在田间挖的沟或坑内，达到一定的厚度时，用土覆盖。沟藏保温性、保湿性较好。在农村，板栗、核桃、山楂等多用此法保藏。苹果等水果也有采用此法贮藏的。由于沟藏受气温的影响很大，初期高温不易控制，贮藏期不便检查，故在使用上受到一定的限制。此法一般适宜于在较温暖地区的晚秋、冬季及早春贮藏，在寒冷地区只做秋冬时的短期贮藏，而在气温较高的地区则不宜使用。②窖藏。窖藏方法很多，有棚窖、窑洞、井窖等。多根据当地自然地理条件的特点建造。窖藏既能利用变化缓慢而稳定的土温，又能利用简单的通风设备来调节窖内的温度和湿度。果品可以随时入窖、出窖，也可较方便、及时地检查贮藏情况。因此，此法在我国南方北方都有较广泛的应用。③棚窖。棚窖是临时性贮藏所，是在地面挖一长方形窖身，窖顶用木料、秸秆、土壤等做棚盖，根据入土深浅可分为半地下式和地下式两类。较温暖地区或地下水位较高处多用半地下式，一般入土深1～1.5m,地上堆土墙高1～1.5m。较寒冷地区多用地下式，即窖身全部在地下，入土深2.5～3m,仅窖顶露出地面。④井窖和窑窖。在地下水位低、土质黏重的地区可修建井窖，井窖的窖身深入地下3～4m,再从井窖向四周挖数个窑洞，窑洞顶呈拱形，井筒口围土做盖，四周挖排水沟，有的在井盖处设通风口。窑窖是在土质坚实的山坡或山丘挖窑洞，窖口设门或挂帘。窖藏在我国农村运用较广。但除棚窖以外的其他窖型一般通风较差，尤其春季土温回升到一定程度时，窖温不能靠通风来降低。(2)简易贮藏的管理。由于简易储运受外界的影响很大，因此，在管理上应根据各种储运形式的特点和性能，结合各地气候条件，土壤条件，果品种类、品种，储期长短，数量多少，质量好坏等予以适当的管理。①场地选择。简易贮藏的地点应选在地势平坦、干燥、土质较黏重、地下水位低、排水良好、交通便利处。②沟、窖的方向。在寒冷地区，可采用南北朝向，以减少冬天的迎风面，使两侧受直射的阳光一致，内部温度较均匀。在冬季不太寒冷的地区，则可采用东西朝向，以增大迎北风面，提高初期的降温效果。在设置阴障或风障时，一般选择东西朝向。③产品的挑选与入储。简易贮藏的果品，一经入储，多数不易进行检查、挑选，如果与有病、伤、烂的混在一起，则会相互污染加重损失。所以，入储前必须严格挑选，凡不适合贮藏的病、虫、伤产品都应及时挑出，不得入储。不同的品种，应分门别类，分开储运，而成熟度不一致的，最好也能分开储运。适期入储在简易储运中十分重要。入储过早，由于较高的气温和地温，果品温度难以降下来，易腐烂变质；入储过晚，则果品在田间易受冻害。具体入储时间，应视各地的具体情况，尤其是应根据气候及各类果品的生物学特性来决定。④温度管理。温度管理的原则是在不受冻害的条件下，迅速达到低温状态，并在整个储运期使这种状态得以稳定地保持。在生产上，这一目的是通过有规律的分层覆盖与通风措施来实现的。通风库是窖藏的发展，主要是在有良好隔热保温性的库房内，设置良好的通风系统，利用昼夜温差，通过导气设备，将库外低温空气导入库内，再将库内的热空气、乙烯等不良气体排出库外，从而保持适宜的储运环境。通风储运库有地下式、半地下式、地上式三种类型。在冬季较温暖地区，则采用半地下式；在温暖地区，采用地下式；在地下水位较高的低洼地区，可采用地上式通风储运库。(1)通风库的建筑形式①小型通风贮藏库。这种库通常以一栋库房为建筑单位，建造时，在库墙的上、下部及库顶分别设置通风设备，使空气对流加快，这时储运效果较好。②二层楼式通风贮藏库。在小型通风库上再建一层库房成二层楼式，可充分利用空间，增加使用面积，又可使下层库顶避免日照，提高保温隔热性能。上层库房一般用来堆放包装容器，或作为临时储运所，果品在下层库房贮藏。③窑洞式通风贮藏库。这种库房一般建成地下式或半地下式。(2)通风库的管理。通风库的一般温、湿度管理与土窑洞类似，库房的消毒可用1%～2%福尔马林或漂白粉喷布，或按每立方米库体5～10g的用量燃烧硫黄熏蒸。也可用臭氧(含量为40mg/m3)，兼有消毒和除异味作用。进行消毒时可将容器、架杆等一并放在库内，密闭24～48h,再通风排尽残药。库墙、库顶等用石灰浆加1%～2%硫酸铜刷白。用5ml/L的仲丁胺熏蒸24～48h后通风12h，也有良好的灭菌效果。非一次性的菜筐、果箱等，应及时洗净，再用漂白粉或2%～5%硫酸铜浸渍，晒干备用。冷库贮藏是指机械制冷贮藏。因此，冷库贮藏需要永久性库房、机械制冷装置和绝缘隔热设备。有这些配套设施，用机械设备制冷后，可实现对果实的低温贮藏。根据所储果实的种类和品种的不同，进行温度调控，从而达到长期贮藏的目的。气调贮藏就是把果实放在一个相对密闭的环境中，同时调节环境中氧气、二氧化碳和氮气等气体成分的比例，并使这一比例稳定在一定范围内的贮藏方法。主要有以下几种形式。(1)气调冷藏库。除具有冷藏库的功能外，还有能降氧的氮气发生器、二氧化碳脱除器等设备，并具有较高的气密性，以维持气调库所需的气体浓度。气调结合冷藏，能抑制果品的呼吸强度，延缓生理性和传染性病害，延长储运保鲜期。同时，还能克服常规冷藏难以克服的许多问题。因此，它被认为是当前国内外现代化的贮藏方法。(2)塑料封闭气调法。塑料封闭气调法是在库内地面挖深、宽各10cm左右的小沟，扫净地面后，将塑料薄膜帐的帐底平铺地面，再将果筐堆成长方形果垛，将大帐扣在果垛上，大帐的下面与帐底四边用土埋入小沟内，并覆土、压实，以防漏气。另一种方法是将塑料薄膜制成袋，将果实装入后扎紧袋口即可。塑料袋可直接堆放于冷库或通风库内，也可将袋放入筐(箱)内，再堆码成垛贮藏。还可将果筐(箱)装入塑料袋内，再扎紧袋口，放入库内贮藏。目前，果品加工制品的种类主要有:果品干制品、果品罐藏制品、蔬菜腌制品、果品糖制品、果品汁制品、果品速冻制品、果酒和果酱酿造等。果品原料的种类即原料的特性决定着加工制品的种类。不同的原料加工成不同的制品，不同的制品需要不同的原料(表23-1)。加工制品种类加工原料特性果品原料种类干制品干物质含量较高，水分含量较低，可食部分多，粗纤维少，风味及色泽好的种类和品种枣、柿子、山楂、龙眼、杏、胡萝卜、马铃薯、辣椒、南瓜、洋葱、姜及大部分的食用菌等罐藏制品、糖制制品、冷冻制品肉厚、可食部分大、耐煮性好、质地紧密、糖酸比适当，色香味好的种类和品种一般大多数的果品均可进行此类加工制品的加工果酱类含有丰富的果胶物质、较高的有机酸含量、风味浓、香气足水果中的山楂、杏、草莓、苹果等，蔬菜类的番茄等果品汁制品、果酒制品汁液丰富，取汁容易，可溶性固形物高，酸度适宜、风味芳香独特，色泽良好及果胶含量少的种类和品种葡萄、柑橘、苹果、梨、菠萝、番茄、黄瓜、芹菜、大蒜、胡萝卜及山楂等表23-1 原料选用加工制品种类加工原料特性果品原料种类腌制品一般应以水分含量低、干物质较多、内质厚、风味独特、粗纤维少为好原料的要求不太严格，优良的腌制原料有芥菜类、根菜类、白菜类、榨菜、黄瓜、茄子、蒜、姜等表23-1 原料选用（续）-1通常将水果的成熟度分为3个阶段，即可采成熟度、加工成熟度和生理成熟度。可采成熟度是指果实充分膨大长成，但风味还未达到顶点。这时采收的果实，适合于贮运，经后熟方可达到加工的要求。加工成熟度是指果实已具备该品种应有的加工特征，又可分为适当成熟与充分成熟。根据加工类别不同而要求成熟度也不同。如制作果汁、果酒，要求原料充分成熟，色泽好，香味浓，酸低糖高，榨汁容易，吨耗率低。若用生的果品，则制品色淡，味酸，不易榨汁，澄清较困难。生理成熟度是指果实质地变软，风味变淡，营养价值降低，一般称这个阶段为过熟。这种果实除了可做果汁和果酱外，一般不适宜加工其他产品。另外，蔬菜收获期也要适时，收获太晚，蔬菜组织疏松，粗纤维增多，水分含量高，可溶性固形物含量下降。收获过早，组织太细嫩，营养物质积累不多，且影响产量。加工原料越新鲜，加工的品质越好，损耗率也越低。因此，从原料采收到加工时间应尽量缩短，这就是加工厂要建在原料基地附近的原因。果品蔬菜多属于易腐农产品，某些原料如葡萄、草莓及番茄等，不耐重压，易破裂，极易被微生物侵染，给以后的消毒杀菌带来困难。这些原料在采收、运输过程中，极易造成机械损伤，若及时进行加工，尚能保证成品的品质，否则这些原料严重腐烂，导致失去加工价值或大量损耗。如蘑菇、芦笋要在采后2～6h内加工；青刀豆、蒜薹不得超过1～2d；大蒜、生姜采后3～5d；甜玉米采后30h，就会迅速老化，含糖量下降近50%，淀粉含量增加，水分也大大下降，影响加工品的质量。而水果如桃采后若不迅速加工，果肉会迅速变软，因此要求在采后1d内进行加工;葡萄、杏、草莓及樱桃等必须在12h内进行加工;柑橘、梨、苹果应在3～7d内进行加工。总之，果品蔬菜要求从采收到加工的时间尽量短，如果必须放置或进行远途运输，则应采用一系列的贮藏措施。以各种新鲜果品蔬菜为原料，制成各种各样的加工制品，虽然不同的加工制品有不同的制作工艺，但在各类果品加工制品中对原料的选剔分级、洗涤、去皮、去心、破碎等处理方法，均有共同之处，可统称为常规处理法。另外，根据加工原料的特性不同和制品的特殊要求不同在制作工艺中通常还采用热烫处理、硬化处理、护色处理等方法。原料进厂后首先要对原料进行分类分级，即要剔除霉烂及病虫害果实，对残、次及机械损伤类原料要分别加工利用。然后再按形态的大小、成熟度及色泽等标准进行分级。原料的合理分级，不仅便于操作，提高生产效率，更为重要的是可以保证提高产品质量，得到均匀一致的产品。目的是洗去果品蔬菜表面附着的灰尘、泥沙和大量的微生物及部分残留的化学农药，保证产品清洁卫生。洗涤用水，除制果脯和腌渍类原料可用硬水外，其他加工原料最好使用经软化后的水。水温一般是常温，有时为增加洗涤效果，可用温热水，但温热水不适宜柔软多汁、成熟度高的原料。原料如有残留农药，还须用化学药剂洗涤。一般常用的化学药剂有0.5%～1.5%盐酸溶液，0.1%高锰酸钾或600mg/kg漂白粉液等。在常温下浸泡数分钟，再用清水洗去化学药剂。洗涤根据各种原料被污染程度、耐压耐摩擦的程度，以及表面形状的不同，采用不同的洗涤方法，有人工洗涤方法和机械洗涤方法。果品去皮是一个细致的工艺操作，其常用方法主要是手工法、半机械法，另外还有碱液法、热力法和真空去皮法、酶制剂去皮法、冷冻去皮法等。(1)手工去皮。手工去皮法应用较广泛，操作简单、细致、彻底，但效率低。(2)半机械去皮。对有一定强度并且外观呈圆形状的原料，大批量的生产常用旋皮机，将待去皮的原料插在能旋转的插轴上，靠近原料的旁边安上一把刀口弯曲的刀，刀柄由弹簧(或手)控制，使刀口紧贴在果体面上，插轴旋转时，刀就从旋转的果体表面上将皮削去。旋皮机的转动有手摇的、足踩的和电动的。去皮效率虽较快，但去皮不完全，还需加以修整，去皮损失率也较高。(3)碱液去皮。将果品在一定浓度和温度的强碱液中处理适当的时间，果皮即被腐蚀，取出后立即用清水冲洗或搓擦，果皮即脱落，并洗去碱液。此法适用于桃、李、杏、梨、苹果等去皮及橘瓣脱囊衣。常用的碱液为氢氧化钠或氢氧化钾溶液，亦可用碳酸钠加石灰的办法制成碱液。(4)热力去皮。果品在高温短时间的作用下，使其表面迅速受热，果皮膨胀破裂,果皮和果肉之间的果胶失去胶凝性，果皮与果肉分开。此法用于桃、杏、枇杷、番茄等薄皮果实的去皮。热去皮要求果实的成熟度要高。(5)冷冻去皮。将果品与冷冻装置的冷冻表面接触片刻，使其外皮冻结于冷冻装置上，当果品离开时，外皮即被剥离。冷冻装置的温度在-28～-23℃,这种方法可用于桃、杏、番茄等去皮。体积较大的果品原料在罐藏、干制、果脯、蜜饯加工及蔬菜腌制时，为加工成适当的形状，需要进行切分，切分的形状则根据原料自身的形态和产品的标准而定。核果类加工前需去核，仁果类需去心。枣、梅等加工蜜饯时为了煮透需划缝、刺孔。罐藏加工时为了保持良好的形状外观，需对果块在装罐前进行修整。热烫处理通常又称为烫漂。除供蔬菜腌制的原料外，供作糖制、干制、罐藏、制汁及冻藏等原料，大多需要进行烫漂处理。所谓烫漂就是已切分的新鲜原料在温度较高的热水、沸水或常压蒸汽中加热处理。一般所用的水温为沸点或接近沸点，个别组织很嫩的蔬菜如菠菜，为了保持其绿色可采用76℃的温度。烫漂时间随原料的种类而异，一般为2～10min。烫漂后必须立即用冷水浸漂，以防止余热持续作用。所谓硬化处理是指一些果品制品，要求具有一定的形态和硬度，而原料本身又较为柔软、难以成形、不耐热处理等，为了增加制品的硬度，常将原料放入石灰、氯化钙等稀溶液中浸泡。因为钙、镁等金属离子，可与原料细胞中的果胶物质生成不溶性的果胶盐类，从而提高制品的硬度和脆性。硬化剂的用量要适当，过少起不到硬化作用；过多则会使产品粗糙，质量低劣。常用的硬化剂有石灰水和氯化钙。一般进行石灰水处理时，其浓度为1%～2%，浸泡1～24h;用氯化钙处理时，其浓度为0.1%～0.5%。经过硬化处理的果品，必须用清水漂洗6～12h。果品原料去皮和切分之后，放置于空气中，很快会变成褐色，这一现象称之为褐变。发生褐变不仅影响外观，也破坏了产品的风味和营养价值，而且是加工品败坏不能食用的标志。一般护色措施均从排除氧气和抑制酶活性两方面着手，主要的处理方法如下。(1)热烫。将去皮切分的原料，迅速用沸水或蒸汽热烫3～5min，从而达到抑制酶的活性，即可防止酶褐变。热烫后取出迅速冷却，热处理的最大缺点是可溶性物质的损失，一般损失10%～30%，蒸汽处理损失较小。(2)食盐水。食盐溶于水中后，能减少水中的溶解氧，从而可抑制氧化酶系统的活性，食盐溶液具有高的渗透压也可使细胞脱水失活。食盐溶液浓度愈高，抑制效果愈好。工序间的短期护色，一般采用1%～2%的食盐溶液即可，浓度过高，会增加脱盐的困难。为了增进护色效果，还可以在其中加入0.1%柠檬酸。食盐溶液护色常在制作水果罐头和果脯中使用。同理，在制作果脯、蜜饯时，为了提高耐煮性，也可用氯化钙溶液浸泡，因为氯化钙既有护色作用，又能增进果肉硬度。(3)酸性溶液。酸性溶液既可降低pH值、降低多酚氧化酶活性，又使氧气的溶解度较小而兼有抗氧化作用，从而抑制氧化酶的活性。而且，大部分有机酸还是果品的天然成分，所以优点甚多。常用的酸有柠檬酸、苹果酸或抗坏血酸等。生产上多采用柠檬酸，浓度在0.5%～1%。(4)亚硫酸溶液。二氧化硫能与有机过氧化物中的氧化合，使其不生成过氧化氢，从而使过氧化酶失去氧化作用。浸泡溶液中二氧化硫含量为1×10-6mg/kg时，能降低褐变率20%，二氧化硫含量为10×10-6mg/kg时，完全不变色。此法对于各种加工原料工序间的护色都适用。(5)抽真空处理。某些果品如苹果、番茄等内部组织较疏松，含空气较多(表23-2)，对加工特别是罐藏或制作果脯不利，需进行抽真空处理，即将原料在一定的介质里置于真空状态下，使内部空气释放出来，代之以糖水或无机盐水等介质的渗入。从而抑制氧化酶的活性，防止酶褐变。常用的介质有糖水、食盐、柠檬酸等。种类含量（%，以体积计）种类含量（%，以体积计）桃3～4梨5～7番茄1.3～4.1苹果12～29杏6～8樱桃0.5～1.9葡萄0.1～0.6草莓10～15表23-2 几种果品组织中的空气含量

板栗根深叶茂，适应性强，较耐干旱和瘠薄，栽培容易，管理方便，适宜在山区发展。对山区经济的振兴和生态环境的改善效果非常显著。板栗多为高大乔木，寿命较长，但结果较晚，实生树一般5～8年开始结果，15～20年进入盛果期，50～60年生结实最多，盛果期可延续百年以上。嫁接树2～3年即能结果。板栗为深根性果树，主根可深达4m,但大多数根系分布在20～80cm的土层内，根系分布深浅受土层厚薄的影响。大树根系的水平分布可达1.5m以上，水平根扩展范围可为冠径的3～5倍，强大的根系是板栗抗旱耐瘠薄的重要因素。侧根细根发达，须根前端常有白色菌丝呈分枝状，为板栗的共生菌根，对板栗的生长和结果有显著的促进作用，同时也是板栗适应性强的重要原因。板栗根系受伤后再生能力弱，需经较长时间才能萌发新根，在栽植时要少伤根，特别是大根。板栗的芽按性质可分为叶芽、完全混合芽、不完全混合芽和副芽(休眠芽)四种。幼旺树叶芽着生在旺盛枝条的顶部和其中下部。进入结果期的树，多着生在各类枝条的中下部。芽体瘦小，芽顶尖，茸毛较多。多数品种不经短截不萌发或萌发形成弱枝。完全混合花芽着生于结果枝顶端及其以下数节，芽体肥大，发育充实、饱满，芽形钝圆，茸毛较少，外层鳞片较大，部分品种在枝条的中下部也能形成完全混合花芽。完全混合花芽翌春萌芽后抽生的结果枝既有雄花序也有雌花序。不完全混合花芽一般着生于完全混合花芽的下部或较弱枝的顶端及下部，芽体比完全混合花芽略小，萌发后抽生带花序的雄花枝。副芽又称休眠芽或饮芽，着生在各类枝条的基部短缩的位节上，芽体极小，一般不萌发，呈休眠状态，寿命长。遇刺激或前部枝条衰老时，萌发抽生徒长枝。板栗的枝条分为营养枝、结果枝、结果母枝和雄花枝四种。①营养枝由叶芽或副芽萌发而成，不着生雌花和雄花。根据枝条生长势不同，可将其分为徒长枝、营养枝和细弱枝三种。徒长枝由枝干上的副芽萌发而成，年生长量50～100cm,生长旺，节间长，组织不充实是老树更新和缺枝补空的主要枝条，一般30cm以上的徒长枝通过合理修剪，3～4年后也可开花结果；营养枝又称发育枝，由叶芽萌发而成，年生长量20～40cm,生长健壮，无混合芽，是扩大树冠和形成结果母枝的主要枝条，生长充实、健壮的枝可转化为结果母枝，来年抽梢开花结果；细弱枝由枝条基部叶芽抽生，生长较弱，长度在10cm以下，不能形成混合芽,翌年生长很少或枯死。②结果枝是结果母枝上完全混合花芽萌发抽生的、具有雌雄花序能开花结果的新梢。从结果枝基部第2～4节起，直到第8～10节止，每个叶腋间着生柔荑雄花序。在近顶端的1～4节雄花基部，着生球状雌花簇。③结果母枝是指着生完全混合芽的1年生枝条。大部分的结果母枝是由去年的结果枝转化而来。此外，雄花枝和营养枝也有形成结果母枝的，结果母枝顶端一至数芽为混合芽，抽生结果枝，下边的芽较弱，只能形成雄花枝和细弱营养枝。④雄花序由分化较差的混合芽形成，大多比较细弱，枝条上只有雄花序和叶片，不结果。一般情况下，当年也不能形成结果母枝。北方板栗适于冷凉干燥气候，南方板栗适于温暖湿润气候。板栗要求年平均气温为10～15℃,生长期(4—10月)平均气温16～20℃;冬季不低于-25℃;开花期为17～27℃。一般情况下北方板栗产量高，品质好。板栗为喜光树种。当内膛着光量占外围光照量的1/4时枝条生长势弱，无结果部位。光照不足6h的沟谷地带，树冠直立，枝条徒长，叶薄枝细，老干易光秃，株产低，坚果品质差。在板栗花期，光照不足则会引起生理落果。建园时，应选择日照充足的阳坡或开阔的沟谷地较为理想。板栗树虽较抗旱，但在生长期对水分仍有一定要求。新梢和果实生长期供应适量水分，可促进枝梢健壮和增大果实。一般年降水量500～1000mm的地方最适于板栗树生长。板栗树对土壤适应性广泛，以土层深厚、有机质多、保水排水良好的砾质壤土最适宜板栗树生长。其适宜的土壤含水量相当于田间持水量的30%～40%。超过60%，易烂根，低于12%,树体衰弱，降至9%时，树可枯死。板栗对pH值的适应范围是4.6～7.0，以pH值5.5～6.5最为适宜；pH值超过7.6则生长不良。板栗正常生长，要求含盐量在0.2%以下，且板栗是高锰作物。pH值增高，土壤中锰呈不溶状态，影响其对锰的吸收，树体发育不良，叶片发黄。板栗自然分布区地势差别较大，海拔50～2800m均可生长板栗。我国南北纬度跨度较大，但在海拔1000m以上的高山地带，板栗仍可正常生长结果。处于温带地区的河北、山东、河南等地，板栗经济栽培区要求海拔在500 m以下，海拔800 m以上的山地出现生长结果不良现象。在山地建园对坡地要求不太严格，可在15°以下的缓坡建园，15°～25°坡地建园要修建水土保持工程。30°以上陡坡，可作为生态经济林和绿化树来经营。花期微风对板栗树授粉有利，但板栗不抗大风，不耐烟害，空气中氯和氟等含量稍高，栗树易受害。板栗园地应选择土层深厚、排水良好、地下水位不高的沙壤土、沙土或砾质土及退耕地等。土壤宜微酸性，要求光照充足，空气干爽。在山坡地造林应选择南坡、东南坡或西南坡为宜。整地一般在板栗栽植前的3个月进行。整地方法常采用水平梯地整地和鱼鳞坑整地。水平梯地整地就是沿等高线修水平梯地。以等高线为中轴线，在中轴线上侧取土填到下侧，保持地面水平，然后在地上挖坑栽树。该法适用于坡度在20°以下的山地。在坡度较陡或地形复杂的栗园，则可采用鱼鳞坑整地。其方法是：按照需要栽植的株行距，以栽植点为中心。由上部取土修成外高里低、形似鱼鳞状的小台田。无论哪种整地方法，挖穴时要将生土和熟土分开堆放，然后施入农家肥或秸秆、杂草、油渣等，再将熟土回填。造林宜采用1～2年生大苗，苗高不低于1m，地径不小于0.8～1cm,根系发达完整，生长健壮，无病虫害，无机械损伤。板栗栽植密度要根据地形、土质条件及品种特性而定。一般栽植密度以3m×4m为宜。挖苗时应尽可能少损伤侧根和须根，已经损伤的根应剪平伤口，主根过长时可以截短一些。如果挖出的栗苗不能马上定植或需远距离运输时，应进行泥浆蘸根，然后再假植或包装运输。栽植穴宽80cm,深80cm。每穴施入充分腐熟的有机肥料30～50 kg,将肥料和熟土混合均匀、踏实即可。栽植在秋季落叶到春季萌发前均可进行。除寒冷地区外，以秋季栽植为好。栽植要求是树要栽端，土要踏实，根要舒展，树苗埋土一半时，将树苗向上轻轻提一下，可使根系舒展。栽植的深度，保持原来的入土深度，栽好后踏实树干基部周围的覆土，并及时进行浇水，以提高栽植成活率。选用2种以上优良品种混合栽植，一般主栽品种与授粉品种比例是(4～8)∶1。休眠期进行耕翻，萌芽前每667m2施纯氮12kg,以促进花的发育，施肥后灌水。枝条基部叶刚展开由黄变绿时，根外喷施0.3%尿素+0.1%磷酸二氢钾+0.1%硼砂混合液，新梢生长期喷50mg/kg赤霉素，以促进雌花发育形成。开花前追肥，每667m2追施纯氮6kg,纯磷8kg，纯钾5kg,追肥后浇水；清耕栗园进行除草松土，行间适时播种矮秆1年生作物或绿肥。7月下旬至8月初，果实迅速膨大期施增重肥，每667m2施纯氮5kg,纯磷6kg,纯钾20kg,根据土壤含水量浇增重水。种植绿肥的果园翻压肥田或刈割覆盖树盘。采收前1个月或半个月间隔10～15d喷2次0.1%磷酸二氢钾。果实采收后叶面喷布0.3%的尿素液。10月施基肥，每667m2施充分腐熟的土杂肥3000kg+纯氮5kg。对空苞严重的果园同时土施硼肥，方法是沿树冠外围每隔2m挖深25cm,长、宽各40cm的坑，大树施0.75kg,将硼砂均匀施入穴内，与表土搅拌，浇入少量水溶解，然后施入有机肥，再覆土灌水。雄花序长到1～2cm时，保留新梢最顶端4～5个雄花序，其余全部疏除。一般保留全树雄花序的5%～10%。采用化学疏雄的方法是在混合花序2cm时喷1次板栗疏雄醇。雄花序长到5cm时喷施0.2%尿素+0.2%硼砂混合液，空苞严重的栗园可连续喷3次。当1个花枝上的雄花序或雄花序上大部分花簇的花药刚刚由青变黄时，在5∶00前采集雄花序制备花粉。当一个总苞中的3个雌花的多裂性柱头完全伸出到反卷变黄时，用毛笔或带橡皮头的铅笔，蘸花粉点在反卷的柱头上。也可采用纱布袋抖撒法或喷粉法进行授粉；夏季修剪并疏栗蓬，及早疏除病虫、过密、瘦小的幼蓬，一般每个节上只保留1个蓬，30cm的结果枝可保留2～3个蓬，20cm的结果枝可保留1～2个蓬。

核桃是我国北方栽培面积广、经济价值较高的木本油料果树。其种子具有较高的营养价值和良好的医疗保健作用，尤其是其中的亚油酸，对软化血管、降低血液胆固醇有明显作用。除此之外，核桃既是荒山造林、保持水土、美化环境的优良树种，也是我国传统的出口商品。核桃为深根性果树，一般根系垂直分布在距地面2m的土层以上，但吸收根主要集中表土20cm以下距地面1m的土层内。水平分布较广，水平根系可达10m以上。核桃芽分叶芽、雌花芽、雄花芽和休眠芽四种。叶芽着生于枝条各节和顶端。雌花芽为混合芽，多着生于枝条先端1～3节。雄花芽为裸芽，多着生于顶芽以下2～10节。休眠芽位于枝条中下部，刺激后抽枝。潜伏芽着生于大枝皮层下，寿命长，更新能力强。生长枝。位于树冠外围，只抽枝长叶，长10～40cm。徒长枝。位于内膛骨干枝上，直立，长50cm以上。结果母枝。着生混合芽翌年抽结果枝的枝条，长5～40cm。雄花序着生于结果枝中下部或雄花枝上。雄花为风媒花，传粉距离100m以内。雌雄异熟性，一般雄花先开，1～5d后雌花开放。受精后，果实开始发育，通常经历两个时期:（1）果实迅速生长期。40～60d。（2）硬核期。60d左右落果。花后10～15d开始，幼果1～2cm，落果严重。进入硬核期后停止。核桃是喜温果树。普通核桃适宜生长的年平均温度为9～16℃。休眠期温度低于-20℃时幼树即有冻害，低于-26℃时大树部分花芽、叶芽受冻，低于-29℃枝条产生冻害。铁核桃只适应亚热带气候，耐湿热，不耐寒冷。一般年降水量为600～800mm且分布均匀的地区基本可满足核桃生长发育的需要。核桃对空气湿度适应性强，但对土壤水分较敏感。一般土壤含水量为田间最大持水量的60%～80%时比较适合于核桃的生长发育，当土壤含水量低于田间持水量的60%时(或土壤绝对含水量低于8%～12%)核桃的生长发育就会受到影响，造成落花落果，叶片枯萎。核桃属喜光树种。最适宜光照度为60000lx，结果期要求全年日照在2000h以上，低于1000h则核壳核仁发育不良。特别是雌花开花期，光照条件良好，可明显提高坐果率，若遇低雨低温天气，极易造成大量落花落果。核桃要求土质疏松、土层深厚、排水良好的土壤。在含钙的微碱性土壤上生长良好，适宜pH值为6.5～7.5，土壤含盐量应在0.25%以下，稍微超过即会影响生长结实。萌芽前15～20d，疏除树上90%～95%的雄花芽，以减少养分和水分消耗，提高坐果率。开花期去雄花，人工辅助授粉。去雄花最佳时期在雄花芽开始膨大时。疏除雄花序之后，雌花序与雄花数之比在1∶ （30～60）。但雄花芽很少的植株和刚结果的幼树，最好不疏雄花。人工辅助授粉花粉采集在雄花序即将散粉时（基部小花刚开始散粉） 进行。授粉最佳时期是雌花柱头开裂并呈八字形，柱头分泌大量黏液且有光泽时最好。具体方法是先用淀粉或滑石粉将花粉稀释成10～15倍，然后置于双层纱布袋内，封严袋口并拴在竹竿上，在树冠上方轻轻抖动即可。或将花粉与面粉以1∶10的比例配制后用喷雾器授粉或配成5000倍液后喷洒。具体时间以无露水的晴天最好，一般 9∶ 00—11∶ 00 时，15∶00—17∶00时效果最好。进入盛花期喷0.4%硼砂或30mg/L赤霉素，可显著提高坐果率。为提高果实品质，坐果后可进行疏果。核桃应在果皮由绿变黄绿或浅黄色，部分青皮顶部出现裂纹，青果皮容易剥离，有以上现象的果实已显成熟时采收。采收方法分人工采收和机械采收两种。人工采收是在核桃成熟时，用长杆击落果实。采收时应由上而下、由内而外顺枝进行。此法适合于零星栽植。发达国家多采用机械采收。具体做法是在采摘前10～20d，向树上喷洒500～2000mg/kg的乙烯利催熟，然后用机械振落果实，一次采收完毕。此法省工、效率高，但易早期落叶而削弱树势。果实从树上采下后，应尽快放在阴凉通风处，不应在阳光下暴晒。采收后要及时进行脱青皮、漂白处理。脱青皮多采用堆积法，将采收的核桃果实堆积在阴凉处或室内，厚50cm左右，上面盖上湿麻袋或厚10cm的干草、树叶，保持堆内温湿度、促进后熟。一般经过3～5d青皮即可离壳，切忌堆积时间过长。为加快脱皮进程也可先用3000～5000mg/kg乙烯利溶液浸蘸30s再堆积。脱皮后的坚果表面常残存有烂皮等杂物，应及时用清水冲洗3～5次，使之干净。为提高坚果外观品质，可进行漂白。常用漂白剂是:漂白粉1kg+水(6～8)kg或次氯酸钠1kg+水30kg。时间10min左右，当核壳由青红色转黄白色时，立即捞出用清水冲洗两次即可晾晒。

早钟6号、长崎早生、森尾早生等。大五星、软条白沙、安徽大红袍、龙泉1号、龙泉6号、洛阳青、解放钟、大钟、太城4号、茂木、长红3号。枇杷喜温暖气候，要求年平均气温15～17℃,且无严寒，1月平均温度5℃,冬季最低温度不低于-5℃,少部分品种在年均温12℃以上即可正常生长；喜空气湿润，雨量充沛，要求年降水量在1000mm以上，夏末秋初干燥少雨天气有利花芽分化；光照充足有利于枇杷的花芽分化和果实发育；枇杷对土壤选择不严，一般沙质或砾质壤土、沙质或砾质黏土都能栽培；土壤pH值为5.0～8.5均可正常生长结果，最适宜pH值为6.0左右。育苗一般采用嫁接育苗。砧木可选择普通枇杷、石楠。砧木粗度达1cm左右时即可嫁接。常在春季2—4月进行；一般采用枝切接或枝腹接和剪顶留叶切接法。福建省农业科学院果树研究所试验推广的芽接育苗技术，效果很好。应选在土层深厚、土质疏松，坡度在30°以下的坡地。平地建园以选择在地势高，地下水位低，排水良好，土层深而疏松的沙质土壤上种植为好。坡地整地采用等高定点开坑或按等高线开垦成简易梯田后定点挖坑。种植前1～2个月要挖好种植坑，种植坑的规格为长1m、宽1m、深0.8m为好，先放进杂草、绿肥，并撒上石灰与表土拌匀，再放入农家肥与松细土拌匀回至高出地面30cm高。平地要把地下水位放在突出位置，多采用深沟高畦，开浅穴定植。枇杷定植可分为春植、冬植和秋植；在华南地区通常自12月至翌年2月进行冬植。在其他地区，春植在2—3月进行，秋植在9—10月进行。一般采用的种植株行距为:行距4～6m、株距3～4m。种植株数平地为每667m2 20～35株，山地为每667m2 35～40株；也可进行矮化密植。栽植苗木应选择品种纯正、粗壮、直立的嫁接苗，以营养杯苗或者带土团的苗木为好。栽苗时在种植坑中心挖一个小坑，把苗放入坑中，种下回土以不盖嫁接节位为宜，使根系均匀分布在坑底，同时，进行前后、左右对正，校准位置，使根系舒展。再将肥土分层填入坑中，每填一层都要用脚踏实，并随时将苗木稍稍上下提动，使根系与土壤密接，宜至定植穴上的土墩高出地面20～30cm。若栽前未剪成半叶的，应于栽后剪去叶片的一半。淋透定根水，并用杂草覆盖整个树盘保湿。施肥量以20～30kg/株的产量计算。(1)采果肥和基肥。5—6月采果后7～10d施厩肥30～40kg/株，麸肥2kg/株，磷肥2kg/株，钾肥1kg/株。(2)花前肥。8—9月施复合肥、麸肥各0.5～0.8kg/株。(3)壮果肥。2月上旬施复合肥、钾肥各0.6～1.0kg/株，麸肥1.0～1.5kg/株。枇杷采果后修剪的操作：疏剪过密枝、病虫害枝、枯枝、细弱的结果母枝，对远离主枝的结果母枝留基部10～15cm回缩更新，为避免结果部位外移，对抽发过长的春梢和强壮的结果母枝留基部5～6张叶片短截，促使腋芽萌发夏梢成为结果母枝，成枝力强的品种为培养健壮结果母枝，萌芽后要及时疏芽，留1～2个芽即可，结合疏花疏除结果母枝上抽发的部分秋梢和冬梢，每一结果母枝中只选留斜生、向外生长的新梢2个作翌年的结果基枝。基枝延伸以中心枝以下的第一侧枝作延长枝为主。(1)疏穗疏蕾。枇杷一般在10月中下旬至11月上旬进行疏花穗，疏花穗的时间在以部分花蕾露白而未开放时为宜；7～10年生植株全树留花穗80～100穗，对留下的花穗再疏部分花蕾；可摘除花穗上半部和基部支穗；每花穗保留中部相对集中的3～4个支穗；再把留下的支穗末端的花蕾摘除，只保留支穗基部的花蕾。(2)疏果。枇杷疏果一般在2月中下旬进行，大果品种每果穗保留端正果形、大小一致的果实3～4个；中果品种每果穗留果4～5个；小果品种每果穗留果6～9个。果实套袋的时期一般在最后一次疏果完毕，病虫害发生之前进行。套袋用的果袋，一般用旧报纸或牛皮纸制作。袋的形状大小依果的大小而定，一般为长方形，大小为20cm×13cm的，一张报纸可做8个；大小为30cm×20cm的，一张报纸可做4个，袋顶两角剪开，以利通气观察。不同熟期的果实，在套的袋上要有不同标志以便成熟时分期分批采收。套袋时宜从树顶开始，先把果穗基部3～4张叶片整理好束在果实上面，然后用纸直接包裹或制作成纸袋，把纸的长边对折成30cm×20cm，用订书机钉封住短边的一边即可，把果连叶包好。袋子口向下，用订书钉封口，纸袋要鼓起，避免套袋时果实与纸袋直接接触。