2006年10月以来，浙江温州市乐清、瑞安、苍南、瓯海、龙湾等地的大棚番茄上相继发生了一种以前从未见过的病毒病。为此，我们立即分别从不同地点采集了较典型的罹病植株样本送浙江大学生物技术研究所鉴定，经该所用超薄切片电镜观察、ELISA和分子水平检测后确认是台湾番茄曲叶病毒（也称烟草曲叶病毒）（TLCV）所致。该病毒病在浙江省系首次发现，经检索国内也鲜有报道。台湾番茄曲叶病毒病是一种毁灭性的蔬菜新病害，是世界许多地区番茄生产上的重要限制因素，该病为害猖獗、蔬菜生产部门及有关方面须高度警惕。据调查，温州地区秋季定植的大棚番茄株发病率一般为3%～30%；严重田块株发病率高达95%以上，当地农民基本放弃管理或拉秧改种。初步统计温州各县（市、区）台湾番茄曲叶病毒病的发生面积约为333.3hm2，其中株发病率在50%的田块约为53.3 hm2以上，给各地番茄生产造成了严重损失。染病番茄植株矮化，生长缓慢或停滞，顶部叶片大多褪绿发黄、叶变小，边缘上卷，叶片增厚、变硬，叶脉呈紫色。生长发育早期染病的植株严重矮缩，不能正常开花结果；中后期染病的植株仅上部叶片和新芽表现症状，结果减少、果实变小，成熟期果实着色不均匀（红不透），商品价值低；生长发育后期，随着气温上升染病植株症状减轻。该病病原为Tomato leaf curl Tanwan virus，属双生病毒组的一种病毒，据资料报道该病毒只能由烟粉虱（Bemisia tabaci）传毒，土壤、种子和土壤均不传毒。近年来烟粉虱在温州地区的发生为害呈暴发态势，现已证实外来入侵生物B型烟粉虱的入侵蔓延并成为优势种是温州地区烟粉虱暴发的主要起因，估计台湾番茄曲叶病毒由B型烟粉虱带入的可能性较大。2006年秋冬，温州地区总体上呈高温干爽天气，对该病虫媒烟粉虱的发生、繁衍十分有利，虫量发生大、加上带毒种群及其携带病毒的多年积累和扩增，为台湾番茄曲叶病毒病的流行提供了病原数量基础，这可能是该病暴发的主要原因。此外，目前温州生产上推广的大多数番茄品种如红梅王、FA-189、516、托马雷斯、合作903等对该病毒病的抗性较差也是不可忽视的重要原因。据报道，该病极有可能在首次暴发后数年内迅速发展并导致大暴发，故须立即采取措施进行应急防控，以便将该病发生为害控制在最小限度内。抓紧引进、筛选抗耐病的优良品种，同时加强培育适合温州市栽培的抗病品种。对重发田实施与非茄科作物轮作，最好是水旱轮作。①育苗床与生产大棚要分开；②清洁消毒苗床；③使用30～40目防虫网隔离育苗，防止烟粉虱入侵；④苗床挂“黏虫色胶板”诱杀烟粉虱；⑤移栽时带药下田。①加强肥水管理，增强植株抗病能力；②地膜覆盖，去除边际杂草；③及时去除植株下部烟粉虱虫、卵枝叶；④收获后及时清洁棚室和周围环境。消灭虫媒，及时防治烟粉虱。可选用99.9%绿颖农用矿物油200～300倍稀释液、20%啶虫脒（兰宁）可溶性液剂3000倍稀释液、25%扑虱灵可湿性粉剂1000～1500倍稀释液、25%阿克泰水分散粒剂2000～3000倍稀释液、2.5%天王星乳油2000～3000倍稀释液、1.8%阿维菌素1500倍稀释液、1%甲胺基阿维菌素2000倍稀释液等进行防治。应在烟粉虱发生初期防治，并交替使用农药。

RNA介导的病毒抗性主要是基于转录后基因沉默（Post-transcriptional gene silencing，PTGS）作用，在真菌、植物和动物中有PTGS相关的基因存在，这些基因沉默现象可统称为RNA干扰现象（RNA interference，RNAi）。许多证据表明，RNA沉默是由双链RNA（dsRNA）所引发的，且需要细胞内的多种酶参与。基于dsRNA在RNA沉默中的诱导作用，构建能转录后形成dsRNA的载体，转化植物后可有效诱发基因沉默。苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）是苹果、梨和多种核果类果树上发生普遍的一种病毒，可降低树势和影响果实品质。本研究根据GeneBank上已登陆的ACLSV序列设计合成了一对引物，根据载体pDS1301的限制性内切酶图谱，在引物的两端分别引入了两个不同的限制性内切酶识别位点。以总RNA或dsRNA为模板，通过RT-PCR扩增获得来源于砂梨的2个ACLSV分离物的大小为358bp的片段，该片段位于ACLSV cp基因高度变异区。将扩增片段克隆到载体pMD18-T，筛选阳性克隆后提取质粒，经Kpn I/Bgl II和Spe I/Sac I分别对目标片段及载体pDS1301酶切后，在T4连接酶作用下，将克隆片段以正向和反向方式分别插入植物表达载体pDS1301一内含子两端的多克隆位点，构建了可转录后形成dsRNA的载体pDR358-SMJ和pDR358-HH。将重组质粒转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞后，采用叶盘共培养的方法转化5～6叶期的健康西方烟叶片，经潮霉素抗性筛选获得转基因西方烟植株。从获得的转基因西方烟植株提取总DNA，根据载体pDS1301多克隆位点两侧的序列合成特异引物，采用 PCR方法对这些植株进行了鉴定，已得到了转R358-SMJ的西方烟49株、转R358-HH的西方烟12株（图1）。图1 部分转基因西方烟的PCR鉴定

甜菜花叶病毒（Beet mosaic virus，BtMV）属于马铃薯Y病毒属（Potyvirus）。它是一个世界性的病原，主要由蚜虫以非持久方式传播，并可以通过机械接种和嫁接方式传播，但不能通过种子以及花粉传播。20世纪50年代末德国首次报道了BtMV在甜菜上的发生[1]。1981年Liu等报道了BtMV在北京地区菠菜上的发生，是我国对BtMV的首次报道[2]。BtMV寄主主要是藜科植物，可系统侵染甜菜（Beta vulgaris），局部侵染菠菜（Spinacia oleracea）、苋色藜（Chenopodium amaranticolor）、昆诺藜（C.quinoa）等。目前仅有美国华盛顿分离物、德国分离物、中国新疆以及内蒙古分离物的全序列以及英国和斯洛伐克少数几个分离物3′端部分序列被报道，这些分离物均来源于甜菜[3，4]。莴苣（Lactuca sativa）属于菊科莴苣属，一年或两年生草本植物。莴苣是我国常见蔬菜之一，在我国大部分地区均有种植。2007年，我们在泰安郊区蔬菜种植区调查病毒病时，发现莴苣上发生病毒病较为严重。感病植株叶片呈黄绿相间的花叶症状，植株严重矮缩。初步的血清学试验表明，该分离物是马铃薯Y病毒属病毒。用针对该属病毒的兼并引物进行RT-PCR扩增，获得此病毒基因组3′端片段，经序列分析表明为BtMV。1.1.1 供试毒源 莴苣病叶样品采自山东泰安郊区菜田，经枯斑寄主昆诺藜（C.quinoa）单斑分离3次后繁殖保存于本生烟（Nicotiana benthamiana）上，并取发病叶用硅胶保存。1.1.2 载体、试剂与菌株 大肠杆菌DH5α由本实验室提供；Trizol购自invitrogen公司；PCR产物回收试剂盒购自博大泰克公司；M-MLV反转录酶、RNase抑制剂（HPRΙ）购自Promega公司；无RNase的水，克隆载体pMD18-T、Taq DNA 聚合酶购自TaKaRa公司；硝酸纤维素膜购自Pall Gelman公司产品；碱性磷酸酯酶标记的A蛋白购自Sigma公司；其他化学试剂均为国产分析纯；BtMV的血清由中国农业大学韩成贵教授提供，其余抗血清由本实验室制备。1.2.1 SDS-琼脂免疫双扩散试验 以常规琼脂双扩散法进行，1g病叶样品加1ml PB缓冲液再加1ml 3%SDS研磨，将汁液6000r/min离心5min。取上清液适量加到琼脂糖凝胶中，与黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）、马铃薯X病毒（Potato virus X，PVX）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）的抗血清反应，加样后在37 ℃下放置，12h后观察结果。1.2.2 RNA提取 采用 Trizol法（Invitrogen）提取总RNA。取0.2g具典型症状病叶于干热灭菌的研钵中，液氮研磨至粉末，迅速转移至1.5ml离心管中，加1ml Trizol剧烈振荡，静置10min；加200μl氯仿后充分振荡15s，静置5min，于4℃、12000r/min离心15min；将上清转移至另一1.5ml离心管中，加入等体积冰冷的异丙醇混匀，室温放置10min，4℃、12000r/min离心10min，沉淀用DEPC处理灭菌水配制的75%乙醇洗涤；室温干燥，加入适量无RNase的水溶解RNA，-80℃保存备用。1.2.3 RT-PCR扩增 以提取的总RNA为模板，在Oligo d（T）引物引导下利用M-MLV反转录酶合成第一链cDNA。用针对马铃薯Y病毒属病毒3′端序列设计的简并引物Sprimer和K11465（表1），扩增病毒RNA基因组的3′端序列。扩增条件如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.4 PCR产物的克隆与测序 PCR产物回收后与pMD18-T连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒，经PCR扩增和酶切鉴定为阳性的重组质粒送北京英俊有限公司测序。NamePrimersequenceTmReferencesOligod(T)5′-GGTCGACTGCAGGATCCAAGC(T)15-3′[5]K114655′-GGTCGACTGCAGGATCCAAGC-3′68[5]Sprimer?5′-ATAGGATCCCTGCAGGGBAAYAAYAGYGGDCARCC-3′69~78[6]Table 1 Primers used for cDNA synthesis, PCR amplification and DNA sequencing1.2.5 Western blotting分析 参考文献中[7，8]的方法，用Western blotting验证采集的莴苣样品、单斑分离后保存在本生烟上的样品与BtMV血清的关系。第一抗体为原核表达制备的抗血清，第二抗体为碱性磷酸酯酶标记的A蛋白，用BCIP/NBT显色。1.2.6 DNA序列比较与分析 将所得DNA序列输入GenBank进行BLAST检索，采用DNAStar和MEGA3.1软件对所得到的核苷酸序列与GenBank中收录的BtMV分离物的相应序列进行比较和分析，构建系统进化树。感病莴苣植株表现明显的矮缩症状，叶片呈黄绿相间的花叶症状，叶片变小并伴有明显的皱缩（图1）。Figure 1 Symptoms of lettuce infected by BtMV-SDSDS-琼脂扩散试验结果显示样品与TuMV抗血清和PVY抗血清均有沉淀反应，说明样品中含有马铃薯Y病毒属的病毒。以提取的病叶样品总RNA为模板，经RT-PCR扩增，得到长度约为1.7kb的目的片段（图2），与预期的大小相一致。扩增产物经纯化后克隆到pMD18-T载体上。经蓝白斑筛选和酶切鉴定，得到含有目的片段的重组子。Figure 2 RT-PCR amplification of 3′-cDNA of BtMV-SD通过测定2个PCR反应克隆到的片段序列，确定了插入片段的核苷酸序列长度1629bp。序列已登录GenBank，登录号为EF633501。扩增产物包含630bp NIb编码序列、831bp CP编码序列及168bp非编码区序列（3′-UTR）。在由此推导其氨基酸序列中，NIb与CP的切割位点为VTYQ/G，符合多数马铃薯Y病毒属病毒NIb与CP切割位点的保守基序为VXXQ的特征[9]。NIb氨基酸序列中存在依赖RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）保守氨基酸序列GDD。CP序列中含有蚜虫传播马铃薯Y病毒属病毒所必需的DAG基序。分离物BtMV-SD 3′ 端序列与GenBank中已登录的斯洛伐克（BtMV-SL，AF363639）、美国华盛顿（BtMV-Wa，AF206394）、中国内蒙古（BtMV-IM，DQ674263）、中国新疆（BtMV-XJ，DQ674264）、英国（BtMV-UK，AF203540）、中国新疆2（BtMV-XJ2，DQ345522）以及未登录的德国（BtMV-G）[10] 6个BtMV分离物的核苷酸序列同源性分别为98.8%、91.1%、98.6%、97.7%、98.5%、97.5%、98.8%，氨基酸序列同源性分别为99.2%、94.3%、99.5%、98.4%、99.4%、98.9%、99.5%。除了BtMV之外，马铃薯Y病毒属中的落葵皱缩花叶病毒（Basella rugose mosaic virus，BaRMV）（DQ394891）与BtMV-SD的核苷酸同源性最高，为63.5%。据CP编码序列构建的系统进化树表明，8个分离物可以分为两组：欧亚大陆组（Euroasia group）与美洲组（America group），结果与Xiang等[4]的相一致。其中美国华盛顿分离物BtMV-Wa位于美洲组，包括BtMV-SD在内的其他分离物位于欧亚大陆组（图3）。BtMV-SD与BtMV-SL位于同一分支，两者在进化关系上最为接近。Figure 3 Phylogenetic tree based on CP-coding sequence of 8 BtMV isolatesWestern blotting分析表明，自然发病的莴苣样品以及接种发病的本生烟样品均与BtMV血清有较强的特异性反应，而本生烟健康植株则无反应。Figure 4 Western blotting analysis of BtMV-SD在用有些病毒的多克隆抗体检测样品时，经常会出现交叉反应，这在马铃薯Y病毒属病毒中也非常普遍[11]。本研究的样品在SDS-琼脂免疫双扩散试验中与TuMV和PVY的抗血清均有沉淀反应，表明该分离物可能有马铃薯Y病毒属的病毒。通过比较病毒基因组3′端约1.7kb的序列，证明该病毒分离物为BtMV。Western blotting进一步证实了该结果。病毒病是莴苣生产中的主要病害之一。病毒的复合侵染在田间也非常普遍。已报道侵染莴苣的病毒有莴苣花叶病毒（Lettuce mosaic virus，LMV）、蒲公英黄花叶病毒（Dandelion yellow mosaic virus，DYMV）和CMV。先前报道BtMV寄主主要是甜菜、菠菜等藜科植物，而不易侵染莴苣。本文首次报道BtMV在自然条件下能够侵染莴苣并造成危害。

朱槿（Hibiscus rosa-sinensis Linn.）又称扶桑、火红花、假牡丹和大红花等，属锦葵科黄槿属常绿灌木，原产于我国云南、广东及南美，也是马来西亚国花和我国南宁市市花。该植物在华南地区几乎可终年开花，是重要的园林花卉植物。但近期广东部分地区的朱槿植株表现曲叶或黄化曲叶症状，该症状与烟粉虱传双生病毒侵染植物引起的症状十分相似。为了明确其病因，作者对其开展了分子检测与鉴定。对广东各地朱槿进行调查，包括朱槿被为害情况、症状表现、介体烟粉虱发生情况等。在各病区随机采集表现为曲叶或黄化曲叶症状的朱槿病样5～10个，带回室内用于检测。用NaOH法提取病样总DNA[1]，并做适当改进，即：取待检病叶片100mg，在灭菌的研钵中加液氮速冻研磨成粉末，解冻前加入1ml 0.5N NaOH提取液，并在提取液使用前加入巯基乙醇（0.5%）；8000g×离心5min，上清液用0.1 mol/L Tris缓冲液（pH值7.0）稀释100倍，用作PCR模板。应用烟粉虱传双生病毒通用简并引物AV494 [2]和DeP3（也即CoPL[3]）对上述采集于各地的朱槿曲叶病样进行PCR检测。PCR扩增结束后，取10μl反应产物进行电泳，以检测PCR扩增结果。调查结果表明，目前仅在广州和佛山发生朱槿曲叶病，其他地方暂时还未发现该病害。病株典型症状为植株明显矮化，全株叶片向上卷曲、叶脉肿大明显、有耳突、叶质脆硬，随着病情的发展，病叶缘开始褪绿黄化，最终叶片大部分甚至整片叶黄化（图1）。植株感病后不再开花，或即使开花，花朵不正常。人工修剪后，病株难以长出新叶，或虽长出新叶，叶数量少、叶小且严重卷曲。自然界朱槿曲叶病扩散速度较快，短时间内会使较大范围内朱槿很快都被传染感病，完全失去园林和绿化价值。另外，朱槿上烟粉虱发生普遍。Figure 1 Symptoms of Hibiscus rosa-sinensis leaf curl disease in Guangdong对广东各地朱槿曲叶病样进行PCR检测，结果显示：从这些病样本中均能扩增出1条570bp特异片段，而健康的朱槿对照未扩增出任何条带，图2是其中1次的检测结果。这些检测结果说明，朱槿曲叶病样中存在烟粉虱传双生病毒。Figure 2 The result of the PCR with AV494 and DeP3对分离物G6 PCR扩增的特异片段进行克隆及序列测定，结果表明，该片段长为570bp；BLAST结果显示，与该片段有较高同源率的均为双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）病毒，与木尔坦棉花曲叶病毒（Cotton leaf curl Multan virus，CLCuMV）各分离物的同源率均大于95%，其中与CLCuMV分离物Okra（Genbank登陆号：AJ002459）序列同源率最高，为97%。刚刚完成的广州朱槿曲叶病毒分离物G6全基因组克隆结果显示，该病毒分离物与CLCuMV分离物62的序列同源率高达96.1%（另文发表），说明G6应该是CLCuMV的一个分离物。朱槿属多年生灌木，由于绿化和观赏需要，在广东省每年都要对其修剪1至多次。目前，在广州、佛山等地均有朱槿曲叶病发生。朱槿感病后，全株叶片即会卷曲，植株生长衰退；人工修剪后，病株难以长出新叶，或虽然长出新叶，叶数量少、叶小且严重卷曲，完全失去绿化价值。因此，该病害对市政园林绿化影响很大。应用先前建立的烟粉虱传双生病毒PCR检测技术[4～5]，从广东各地采集的朱槿曲叶病样中均能检测到该类病毒；而新近完成的朱槿曲叶病毒G6分离物基因组序列分析结果表明，其是CLCuMV一个分离物。因此，本研究初步表明，朱槿曲叶病可能是由CLCuMV侵染引起的，但还需要做更进一步深入研究加以验证。CLCuMV最先发现于巴基斯坦为害棉花，由烟粉虱传播，已给该国棉花生产造成了巨大的经济损失。该病毒也是我国的一个外检对象，但目前仅在广东朱槿上发现该病毒，应引起我们的重视。

苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus，ASPV）是侵染苹果和梨树的主要病毒之一，可导致苹果和梨的生长势下降，并影响其果实产量和品质。本研究在生物学、血清学和分子生物学鉴定的基础上，筛选出侵染砂梨的APSV毒源材料。参照已报道的ASPV全基因组核苷酸序列设计合成引物，以来源于砂梨（6-1-13）ASPV的 dsRNA为模板，RT-PCR扩增获得大小为1328bp特异性扩增条带，并对扩增产物进行纯化、克隆和序列测定。序列分析结果表明，其核苷酸序列与国外在GenBank上登录的14个ASPV分离株的同源率为82%～88%。将克隆获得的目的基因与pET28c连接得到原核表达载体pET28c-ASPV cp，并在大肠杆菌BL21（DE3）中成功诱导该基因表达，表达蛋白大小约44kDa。将表达正义链和反义链的该病毒分离物cp基因cDNA分别与植物表达载体pCAMBIA1301连接，转化大肠杆菌DH10B的感受态细胞，经过PCR和双酶切鉴定和筛选阳性克隆，成功构建了ASPV cp基因的正义链和反义链植物表达载体pCAMBIA1301-ASPV cp+和pCAMBIA1301-ASPV cp-。将重组质粒转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞后，采用叶盘共培养的方法转化5～6叶期的健康西方烟叶片，经潮霉素抗性筛选和PCR鉴定，获得88株西方烟转化植株，其中ASPV cp基因正义链的西方烟植株68株，表达cp基因反义链的西方烟植株20株。

高分辨熔解曲线 （High Resolution Melting，HRM） 分析技术是近年来国际上兴起的一种最新的应用于基因突变检测和 SNP 分析的方法。因为所用的荧光染料只能嵌入并结合到双链 DNA 上，因此利用实时 PCR 技术，就能通过实时检测双链DNA 熔解过程中荧光信号值的变化，将 PCR 产物中存在的差异以不同形状熔解曲线的方式直观地展示出来，并且可以借助于专业的分析软件对测试群体实现基于不同形状熔解曲线的基因分型或归类 （殷豪等，2011）。高分辨熔解 （HRM） 曲线分析技术具有三个突出的优势：一是高通量、高灵敏度、高特异性、低成本且不受检测位点的限制；二是操作简单、快捷、节省时间成本；三是闭管操作，无污染且 DNA 不受损伤，熔解分析后还可以进行凝胶电泳或测序分析。在 LightCycler ? 480分析仪上一次可以完成96个或348个样本的分析，从反应开始到数据生成仅需要90～120 min。目前HRM技术在果树的种质鉴别和基因分型研究中已有应用。吴波等 （2012） 引入高分辨率熔解曲线分型技术对柑橘进行SNP 分型；Ganopoulos等 （2013） 利用 HRM 技术对9个甜樱桃基因上的 SNP 位点进行分析，成功的实现了对21 个甜樱桃品种的鉴别，准确率达到 99.9%；Distefano 等 （2013） 第一次将HRM技术应用于对柑橘品种 SNP 及 InDel的检测，并利用21 个 SNP标记实现了对柑橘不同品种的区别。分子标记辅助选择育种 （marker assisted selection，MAS） 作为一种高效的现代分子育种技术，已被广泛应用于作物品种选育和遗传改良。它是利用与目标基因紧密连锁的分子标记，来鉴定不同个体的基因型，从而进行辅助选择育种。与通过表现型间接对基因型进行选择的传统育种方法相比，MAS具有更大的信息量，能有效结合基因型与表型鉴定结果，更加高效和准确，避免选育过程中的盲目性和不可预测性，能够将育种时间从传统的十几年缩短到几年时间，从而显著提高育种效率。分子标记对目标性状鉴定的准确性是影响分子标记辅助选择效率的一个重要条件。本试验利用HRM分析技术对上一章节所开发的SNP 和InDel标记进行筛选和验证，以获得与抗炭疽菌叶枯病基因 R gls位点紧密连锁的SNP 及InDel标记，对抗病基因进行精细定位，缩小抗性基因位点的区域范围，为基因克隆提供数据。同时利用筛选出的4 个与 R gls基因位点紧密连锁的分子标记对50 个苹果栽培品种和品系进行准确性鉴定，以验证分子标记的可靠性。选择青岛农业大学苹果试验基地 （山东省胶州市） 2009 年种植的，经过人工离体接种鉴定的 ‘金冠’ב富士’ 的F1 杂交群体207株实生树为材料用于验证 SNP、InDel标记及进行抗炭疽菌叶枯病基因的精细定位。所用群体与第三章SSR标记的开发与遗传定位为同一群体。选择该试验基地栽培的 50 个田间栽培品种和品系做为试材，经人工离体接种鉴定并提取DNA，用于分子标记准确性的验证。同第三章。用于引物设计的SNP 和 InDel位点来源于第四章中所筛选出的位于第15条染色体上3.9～4.9 Mb候选区域的18 个 SNP 位点和30 个InDel位点。从网站 https：//www.rosaceae.org/gb/gbrowse/malus_x_domestica/下载位于SNP 和InDel位点上游150 bp和下游150 bp距离内的contig 序列用于引物设计。引物设计的主要参数为：产物大小60～150 bp；引物退火温度 （Tm） 在 55～65℃，且上、下游引物 Tm相差不大于 2℃；引物 GC （%） 含量为 45%～55%，引物大小在60～160 bp。引物序列 （附表 5-1）。所有引物由生工生物工程 （上海） 股份有限公司合成。PCR扩增和高通量熔解曲线分析在 LightCycler ? 480Ⅱ荧光定量PCR 仪 （Roche） 上进行。反应试剂来自 LightCycler ? 480 High Reso-lution Melting Master试剂盒。反应体系为15 μl，内含10 ng/μl的基因组 DNA 1.0 μl，1×Master Mix 7.5 μl，2.0 mmol/L MgCl2 1.5 μl，左右引物为 0.2 μmol/L各0.5 μl。PCR扩增程序为95℃预变性10min，然后按95℃变性10min，55℃退火15s，72℃延伸10s的程序进行45个循环。在PCR循环结束后，立即对扩增产物进行HRM检测，程序为：95℃1min，40℃1min，65℃1s，在65℃升温至95℃的过程中，以25次/℃的频率收集荧光信息，最后降温至40℃。高分辨率熔解曲线分析用LightCycler?480的Gene Scanning软件（1.5version）进行。用18对 SNP 及30对InDel引物在亲本和抗感基因池中筛选，将出现不同分型的引物在分离群体上进行验证，以确定该标记是否与目的基因连锁。将筛选的多态性标记在重组个体上的基因型表现与重组个体的抗病表型进行统一分析，对抗炭疽菌叶枯病基因 R gls位点进行精细定位，缩小抗性基因位点的范围。为后续的候选基因筛选及图位克隆提供准确的信息。将进一步缩小的R gls位点区域内的基因进行统计并进行同源比对和GO功能富集分析，以筛选该区段内可能与抗病相关的候选基因。SSR标记的PCR产物利用3.5%的琼脂糖凝胶电泳进行标记基因型鉴定。SNP 和InDel标记利用HRM技术进行基因分型鉴定。通过对设计的引物进行 BSA 筛选，获得了与 Rgls基因位点连锁的6个SNP 及5个 InDel标记，分别为 SNP3955、SNP4236、SNP4257、SNP4299、SNP4336、SNP4432 和InDel4199、InDel4227、InDel4254、InDel4305、InDel4334。在6个SNP 位点中有A/G、G/A、T/C和C/G四种变换形式，其中发生A/G转换的占50.0%，发生G/A转换，T/C转换，C/G颠换的各占16.7%（表5-1）。引物名称引物序列序列长度参考碱基突变碱基位置SNP3955R：CCCTTAAAAGCCATGGAAGAGF：GTTCTGCATAAAAACCTCGCA133AGchr15∶3，955，630-3，955，763SNP4236R：GCTTATCATAAAAAGCAAGACCACF：ATCATATAATTGTGTAATTTAGTAGAACA114AGchr15∶4，236，220-4，236，353SNP4257R：GGAGTCATAAGCCACAACGAGF：TCAGCTTTGAAGCATCCAATT145GAchr15∶4，257，141-4，257，286SNP4299R：GGTTATACATAGAGGCACTTAGAGCF：GCACAAAACTTAGATCAAAGATGAG135TCchr15∶4，299，179-4，299，314表5-1 SNP、InDel引物筛选引物名称引物序列序列长度参考碱基突变碱基位置SNP4336R：AGTTCGTTCTTTTCCGTTGCTF：GCGGTCCTGATTCAGGTACAG133CGchr15∶4，336，382-4，336，515SNP4432R：CGAGGAGCAAACGATAGTCAGF：ATTGGTCTCCGAATTAGAAGTCC137AGchr15∶4，432，529-4，432，666indel4199R：ATTGTGAAACCTTGATTGGGF：GAGATTATCCTTATTTTGTGGG156AAAGchr15∶4，198，916-4，199，072indel4227R：AGCGTTGCTATGCTTCTAATGF：AAGATGGAAATGGTATGTGAT81TTCchr15∶4，227，569-4，227，650indel4254R：ATAAAGTCACTTCTAGCACAAATAF：CGAAAAACGCTTTACTTAGG119GGCchr15∶4，254，896-4，255，015indel4305R：GTAAACTCATTAAATTATGCTTGF：TGCTTTACTCCGATTCTTC134CCCAchr15∶4，305，342-4，305，476indel4334R：ATACTATGAGGTGAAGGATTTAAF：GTATCTTCTACATTATCTTTCGTG115TTAchr15∶4，334，597-4，334，712表5-1 SNP、InDel引物筛选（续）-1将获得的11个标记在207 株 F1 群体上检验其与抗炭疽菌叶枯病基因的连锁情况，结果表明，这11 个标记的扩增子熔解曲线形状明显不同，可据此区分抗病型和感病型植株 （附图5-1）。将从全基因组重测序中筛选出并经群体验证的与 R gls位点紧密连锁6个SNP 及4个InDel标记 （InDel4305标记在染色体上的物理位置与遗传位置不符，未用于精细定位分析），加上1 个 SSR标记，共11个标记与重组个体基因型及表型进行分析。结果显示，InDel4227、SNP4236和InDel4254标记与基因Rgls位点共分离，没有重组个体。标记InDel4199有一个重组个体 S29 和标记 SNP4257 有两个重组个体R16和R31，这三个关键的重组个体将基因 Rgls位点定位于 InDel4199和SNP4257 两标记之间，物理距离由 500kb 缩小为 58kb （附图5-2）。按照基因位置信息从蔷薇科基因组网站 GDR下载基因组15 号染色体4.1～4.3 Mb内基因45个。通过perl脚本整理基因组GFF文件，BLAST同源比对NR数据库，选取最优比对结果。获得目的区段内的45个基因，其中5 个基因功能未知，2 个为转录因子，另外40 个基因均有明确的注释信息 （表5-2）。序号MDP号码同源基因1MDP0000180944生长素诱导蛋白15A2MDP0000205434非病原性诱导蛋白3MDP0000148158生长素诱导蛋白15A4MDP0000177664蛋白酶体beta亚基5MDP0000177665转录共抑制因子LEUNIG6MDP0000215349转录共抑制因子LEUNIG7MDP0000664885抗烟草花叶病毒蛋白N8MDP0000877582抗烟草花叶病毒蛋白N9MDP0000200748转录因子10MDP0000481972抗烟草花叶病毒蛋白N11MDP0000481973抗烟草花叶病毒蛋白N12MDP0000381897转录因子13MDP0000297052抗烟草花叶病毒蛋白N14MDP0000700563黄瓜素15MDP0000242744阳离子运输调控蛋白216MDP0000551192阳离子运输调控蛋白217MDP0000242745转录因子18MDP0000153007来自转座子TNT1-94的反转录病毒Pol多肽蛋白19MDP0000130036未知功能转录因子20MDP0000199184未知功能转录因子21MDP0000489432三角状五肽链重复包含蛋白22MDP0000318360类LRR丝氨酸/苏氨酸受体蛋白激酶23MDP0000247898类LRR丝氨酸/苏氨酸受体蛋白激酶表5-2 区段内基因同源比对结果序号MDP号码同源基因24MDP0000811774核糖核酸酶H2亚基B25MDP0000309446未知功能线粒体蛋白26MDP0000272143单尿苷绑定蛋白1B；与mRNA3’-UTR绑定27MDP0000871880脱水响应蛋白RD2228MDP0000272145酪蛋白激酶Idelta小体29MDP0000167752结构域包含蛋白3430MDP0000167753核糖核酸酶H2亚基B31MDP0000596125核细胞溶解酶TIA-1小体32MDP0000201427拓扑异构酶I33MDP0000149447脱水响应蛋白RD2234MDP0000596128酪蛋白激酶Ideta小体35MDP0000201428UDP-糖转运蛋白36MDP0000201429环核苷酸离子通道蛋白1437MDP0000255274环核苷酸离子通道蛋白1438MDP0000120033丝氨酸精氨酸富集剪接因子。39MDP00001695343-酮脂酰-CoA合酶640MDP0000203647细胞分裂素-O-葡糖基转移酶341MDP0000864010鼠李糖生物合成酶142MDP0000279973肌氨酸氧化酶43MDP0000178030未知蛋白44MDP0000289536肌氨酸氧化酶45MDP0000272940转录因子WRKY11表5-2 区段内基因同源比对结果（续）-1为了对基因功能做进一步分析，提取区段内基因的 GO （gene on-tology） 信息，采用基因功能GO分类网站WEBGO （ http：//wego.ge-nomics.org.cn/cgi-bin/wego/index.pl） 进行基因分类。结果显示，这40个基因在细胞组成上涉及到4 个 GO 分类，包括细胞、细胞组分、细胞器组成以及大分子复合体的组成；在分子功能方面，该区段内基因涉及到电子传递、转运蛋白、水解、绑定、催化以及物质传递6 个GO分类；在生物过程方面，该区段内基因涉及到免疫过程、生物调控过程、细胞过程、色素沉着过程、程序性死亡过程、代谢过程、响应刺激过程、定位以及定位确立9个生物过程 （附图5-3）。经离体接种鉴定，50 个作为分子标记准确性鉴定材料的品种（系） 中有33 个抗病品种 （系） 和17 个感病品种 （系）。从与抗炭疽菌叶枯病基因紧密连锁的分子标记中挑选出4 个有代表性意义的分子标记SSR标记S0405127，S0304673，SNP 标记 SNP4236，InDel标记InDel4254作为鉴定标记。其中SSR标记 S0405127 与基因 Rgls位点的遗传距离为 0.5cM，S0304673 的遗传距离为 0.9 cM （见第三章），标记SNP4236和 InDel4254与目的基因共分离。鉴定结果显示，SSR标记 S0405127，S0304673，SNP 标记 SNP4236，InDel 标记 In-Del4254 鉴定抗感品种 （系） 的准确率分别为 90.0%，94.0%，98.0%，96.0%。在基因型与表型鉴定结果中，不相符的个数分别为5个，3个，1个，2 个。这 4 个分子标记鉴定结果的准确率均达到90%以上，可以应用于田间栽培品种、品系、种质资源以及杂种后代幼苗对炭疽菌叶枯病抗性的鉴定 （表5-3）。序号品种/系表型S0405127S0304673SNP4236InDel42541海棠RRSRR2斗南RRRRR3福丽RRRRR4福艳RRRRR5红勋1号RRRRS6华帅RRRRR7鲁加1号RRRRR8鲁加2号SSSSS9鲁加4号RRRRR10鲁加6号RRRRR11旭RRRRR12早杂1号RRRRR13威赛克旭RRRRR14五月金RRRRR15早翠绿RRRRR表5-3 四个分子标记对苹果栽培品种和品系的抗病性的鉴定结果序号品种/系表型S0405127S0304673SNP4236InDel425416国光RRRRR17霞光RRRSS18烟富1RRRRR19福早红SSSSS20嘎拉SSSSS21金冠SSSSS22秦冠SSSSS23华硕RSRRR24瑞丹SSSSS25乙女RRRRR26王林RSRRR27青农红SSSRR28秦冠SSSSS29瑞红SSSSS30赛金RSRRR31红肉1号RRRRR32双阳红SSSSS33望山红RRRRR34新红星RRRRR35青冠RRRRR36弘前富士RRRRR37富士RRRRR387C-102RRRRR39N2SSSSS40PinavaRRRRR417C-35SRRSS4295-161RRRRR4395-231RRRRR4495-232SSSSS4595-32RRRRR4695-93RRRRR477C-104SSSSS487C-105SSSSS497C-106SRRSS507C-107SSSSS表5-3 四个分子标记对苹果栽培品种和品系的抗病性的鉴定结果（续）-1精细定位通常采用的方法是侧翼分子标记法，对于有参基因组植物来说，就是根据对目的基因的初步定位结果，选择位于目的基因两侧的分子标记之间的碱基，用于设计合适的分子标记。筛选出的与目的基因连锁的分子标记，通过鉴定更大的群体来确定发生交换的重组单株，最终找到与目的基因紧密连锁的分子标记，从而实现对目的基因的精细定位。精细定位是图位克隆策略中重要的一步，可以通过开发新的分子标记，整合原来已有的遗传图谱来进行图谱加密，以实现对目的基因的精细定位。本研究利用全基因组重测序技术开发出的 SNP 及 InDel标记，结合Rgls基因初步定位结果，选出在 Rgls基因两侧的 SSR 标记 S0304673和S0405127之间的SNP 和InDel标记，通过HRM曲线分析技术对18个SNP 位点和30 个 InDel位点进行了分析，筛选出6 个 SNP 及5 个InDel标记与Rgls基因位点紧密连锁。并选择其中的10 个标记用于Rgls基因位点的精细定位。标记InDel4227、SNP4236和 InDel4254表现出与R gls基因位点共分离。由于所用群体规模的限制，所以筛选出的SNP 及InDel标记仍无法对R gls基因位点进行真正意义上的精细定位。由于现有的金冠苹果基因组数据库中可能存在组装错误，所以在对定位区域内的基因进行分析中，扩大 R gls基因位点区域。对苹果第15条染色体4.1～4.3 Mb距离内的基因进行统计分析，结果表明在该区段存在40个有功能注释的基因，涉及到细胞组成方面，分子功能方面，生物过程方面共18个GO分类。在细胞组成层面上，参与细胞组成的基因，一般是由主效基因或寡基因控制的质量性状，是个体保持组成性抗性的基础，影响着品种的垂直抗性。在分子功能层面上，植物个体抗性与电子传递、转运蛋白、水解、绑定、催化以及物质传递等生物过程密切相关。例如，植物受到病原菌侵染后，体内会产生并积累一些次生代谢物质，如植保素、酚类、木质素、菇类等化合物，对病原菌产生抵抗作用 （Pirie and Mullins，1976）。植物次生代谢途径尤其是苯丙烷类代谢途径是与植物抗病性密切相关，许多抗菌物质 （包括酚类、类黄酮、绿原酸、酮类等） 的生物合成都是通过这条途径完成的 （RalPhL，1992；Cole R.A，1985）。在生物过程层面上，程序性死亡过程，响应刺激过程以及免疫过程与抗病机制密切相关。细胞程序性死亡 （programmed cell death，PCD） 是细胞死亡的两种基本类型之一，是细胞接受某种信号或受到某些因素刺激后主动发生的由基因调控的死亡过程。植物与病原菌互作过程中发生的过敏性反应 （hypersensitive reaction，HR） 是PCD 的重要表现形式之一，是植物抵抗病原菌入侵的早期重要抗性反应，对植物抗病性有着重要意义。在该区域内存在着4个编码WRKY转录因子的基因MDP0000272940、MDP0000242745、 MDP0000381897、 MDP0000200748 以及5 个 TIR-NB-LRR 家族基因 MDP000066488、 MDP0000877582、 MDP0000481972、MDP0000481973、 MDP0000297052。许多研究结果表明，当植物受到病原菌入侵或植食性昆虫取食植物后，植物体内的一些WRKY 转录因子的表达水平会随之发生改变 （Hui et al.，3003；Zhao et al.，2007）。Huang等 （2002） 研究了一个茄科植物的 WRKY 蛋白 STHP-64，发现其在低温胁迫下表达增强，Rizhsky 等 （2004） 发现拟南芥的 At-WRKY25蛋白与氧化胁迫下胞液抗坏血酸过氧化物酶的表达有关。Li等 （2006） 通过对WRKY70蛋白过表达的转基因植株和变异植株的研究，证明过表达拟南芥 WRKY70 蛋白的转基因植株能提高水杨酸（SA） 介导的抗病性，但降低茉莉酸 （JA） 介导的抗病性。2006 年Ryu等对水稻WRKY 转录因子在不同生物胁迫下的表达量变化进行了研究。结果显示在45 个水稻 WRKY 转录因子中有15 个 WRKY 转录因子可以被稻瘟病病菌 （ Magnaporthe grisea） 诱导表达，其中12个可以同时被水稻白叶枯菌 （ Xanthomonas oryzae Dowson） 诱导表达。在对防御反应相关的信号分子对 WRKY 转录因子的影响的研究中发现OsWRKY10、OsWRKY82和OsWRKY85可以在经过茉莉酸诱导的叶片中表达，OsWRKY45 和 OsWRKY62 可以在经过水杨酸处理的叶片中诱导表达，OsWRKY30 和 OsWRKY82 可以同时被水杨酸和茉莉酸诱导表达，这说明WRKY 转录因子参与了植物的诱导防御反应。抗性基因 （R gene） 编码的蛋白大部分是 NB-LRR 蛋白，不同类别的 NB-LRR蛋白可以直接或间接的识别不同来源的病原菌效应子，从而激发相似的防御反应。这9个基因是人们重点关注的基因。进一步的基因功能研究及苹果与炭疽叶枯菌的分子互作机制研究将围绕着SNP 定位的5个候选基因及该区段内的相关基因展开。随着分子生物学技术的快速发展，特别是以DNA多态性为基础的分子标记技术在苹果育种中的应用，大大提高了目标性状早期选择的效率，缩短了育种周期，加快了新品种选育的速率。Tartarini 等（2000） 报道了利用获得的与抗苹果黑星病的显性单基因Vf紧密连锁的RAP D标记测验了携带该基因个体，淘汰错误率为3%，保留错选率仅为 0.02%。Cheng等 （1996） 利用与控制果色的Thd01基因紧密连锁的RAP D标记，在苹果实生苗发育早期进行了标记筛选，实现了对果色这一特定性状的早期选择，大大减少了人力物力的浪费。苹果柱型性状有利于形成集约高效的现代苹果栽培模式，能够降低生产成本，提高产量。Moriya等 （2012） 所得到的 3个与控制苹果柱型性状Co基因共分离的标记 Mdo.chlO.12、Mdo.chlO.13 和 Mdo.chlO.14，对于柱型苹果杂交育种中对群体材料的早期选择、基因的克隆及转化有着重要意义。王彩虹 （Wang caihong，et al.，2011） 通过SCARs标记和SSR标记对控制梨矮生性状基因 PcDw 进行了基因定位，对梨矮化育种有着重要的意义。随着不同果树基因组测序的完成，在果树方面陆续开展了相关 SNP 芯片研发和利用。Chagne等 （2012） 对27 个苹果品种进行低深度重测序检测并确认全基因组范围的 SNP，开发了苹果 8 K 的 SNP 芯片，可用于苹果幼苗大规模检测，这将会促进标记—位点—性状之间关联性的发现，进一步阐明质量性状的遗传结构特性，推动遗传变异研究。本实验利用四个紧密连锁的分子标记 S0405127、S0304673、SNP4236和 InDel4254对50个田间栽培品种和青岛农业大学选育出的优系进行了抗炭疽菌叶枯病的基因型鉴定，并结合其抗病的表型鉴定对四个标记的准确性进行了分析。结果表明四个标记的准确率分别为90.0%，94.0%，98.0%和96.0%，可以有效的应用于分子标记辅助育种。在第三章的研究结果中，SSR标记S0405127 与基因Rgls位点的遗传距离为0.5cM，而S0304673 的遗传距离为0.9 cM，理论上标记S0405127与抗性基因位点连锁的更紧密，准确性应该更高，而在品种群体验证中，标记 S0304673 鉴定抗感品种 （系） 的准确率为94%，而标记S0405127的准确率为90%。在利用重组个体对基因Rgls位点进行精细定位中，SNP4236 和 InDel4254 标记与目的基因共分离，在品种的群体验证中应该显示100%的准确性，但实际上还是有1～2个表型鉴定与基因型鉴定不符的个体。这种现象存在的原因一是可能由于用于鉴定的品种或品系数量有限，导致了结果的偏离。二是标记S0405127的条带显示为有和无的差异，在电泳时有可能存在读带误差。三是在对做图群体进行表型鉴定中，可能存在表型鉴定误差，导致遗传距离计算的偏差。四是在精细定位中，需要应用更大的群体筛选重组的单株以完成对目标基因的精细定位。而由于实验材料的限制，所用群体规模不是很大，所以可能导致定位结果的误差。这些问题尽管在实验中是不可以避免的，但是在以后进行更精细的遗传定位研究中，以更大规模的群体和更严谨的实验操作来进一步验证，可以减少这些误差的产生，提高遗传作图的精度。

柑橘木虱是传播柑橘黄龙病的昆虫媒介，成虫群集吸食嫩芽和叶片的汁液，若虫群集于嫩芽和嫩叶吸取汁液，被害叶片扭曲畸形。若虫分泌的白色蜡丝状排泄物可引起柑橘煤烟病发生(图10-1、图10-2)。图10-1 柑橘木虱成虫、若虫和卵图10-2 黄皮上的柑橘木虱（1）抹除零星萌芽，统一放梢。（2）保护和利用天敌。（3）药剂防治。柑橘木虱防治必须在一定区域内统一药剂、统一时间喷药。防治适期:秋冬期（采果后）、春芽萌动前、春梢抽发期、夏梢抽发期和秋梢抽发期。防治次数:采果后和春芽萌动前各喷杀虫剂1次；各次梢期均以连喷2次药剂为宜，间隔时间7～10天。防治药剂:20%吡虫啉可湿性粉剂3000～4000倍液、10%联苯菊酯乳油3000～5000倍液、2.5%高效氯氟氰菊酯水乳剂1000～1500倍液、48%毒死蜱乳油1000～2000倍液、20%甲氰菊酯乳油1000～2000倍液等。（4）烟雾防治。烟雾防治工具为动力烟雾机。要求在日平均气温15℃以上，有下沉气流的早晚进行，气压较低时施药效果更佳，上午施药时间不能超过10时，下午施药要在16时以后进行。烟雾防治的时期为秋冬期（采果后）、春芽萌动前、春梢抽发期、夏梢抽发期和秋梢抽发期。烟雾防治的药剂及配比:80%敌敌畏乳油、48%毒死蜱乳油、柴油配制，药油配比为1∶1：6。主要为害当年春梢、夏梢、秋梢，成虫群集在嫩叶背面为害产卵，孵化的若虫密集于叶片背面吸食汁液，形成黄斑。若虫分泌蜜露诱发柑橘煤烟病，使枝叶发黑，生长减弱，抽梢减少，产量剧减(图10-3)。图10-3 柑橘粉虱成虫、卵和蛹壳（1）栽培管理。适当稀植，加强栽培管理，剪除病虫枝。（2）保护和利用天敌。（3）药剂防治。低龄若虫盛发期喷药，可选用药剂:48%毒死蜱乳油1000～1500倍液、99.8%矿物油乳剂200～250倍液加20%甲氰菊酯乳油1500倍液等。主要为害当年春梢、夏梢、秋梢嫩叶，成虫、若虫群集在新梢嫩叶背面吸食汁液。成虫在叶背分泌蜡粉薄层，若虫分泌蜜露诱发柑橘煤烟病，影响光合作用，使枝叶发黑，生长减弱，果实外观、品质、产量下降(图10-4、图10-5)。图10-4 柑橘粉虱成虫图10-5 柑橘粉虱座壳孢菌寄生状参照黑刺粉虱防治方法。成虫产卵于果实的瓤瓣和果皮之间，受害果实有针刺状小孔，常有汁液溢出凝成胶状物，小孔周围呈灰色或红褐色斑点，下陷并逐渐腐烂。幼虫蛀食果肉，引起果实未熟先黄，果肉腐烂，脱落(图10-6、图10-7)。图10-6 柑橘小实蝇成虫图10-7 柑橘小实蝇在温州蜜柑上产卵参照柑橘大实蝇防治方法。该虫为害柑橘叶片、枝干和果实，受害叶片卷曲变黄，枝条干枯，果实被害处四周黄绿色，严重时树干爆皮，树势衰退，植株死亡(图10-8、图10-9)。图10-8 矢尖蚧在叶片上的为害状图10-9 矢尖蚧在甜橙上的为害状（1）栽培管理。结合冬春修剪，剪除病虫枝，适当稀植，加强土、肥、水、栽培管理。（2）保护和利用天敌。在害虫虫口密度不大时，保护或人工释放天敌，在天敌繁殖盛期，尽量不用药或选择使用对天敌影响小的药剂。（3）药剂防治。选择在每年第一代卵的盛孵期（4月底至5月初）喷药，每隔10～15天喷1次，连喷2次，7月底至8月初和8月底至9月初发现第二、第三代幼虫时继续兼治。药剂可选用95%机油乳剂100～200倍液等。金柑受柑橘地粉蚧为害后，树冠内膛老叶(上一年春梢的叶片)呈斑驳状黄化，黄化部分始于叶片基部，并逐渐扩大，在主脉两侧各形成一个大小基本均等的大黄斑，黄斑进一步扩大，最后可导致全叶黄化(包括叶片侧脉)，但叶片主脉始终保持绿色。严重时除当年春梢叶片外，其基部以下的全部叶片都表现黄化，受害株树势衰退，新根极少，结果少，果小，产量明显减少(图10-10、图10-11)。图10-10 地粉蚧为害状 （基部黄斑）图10-11 柑橘地粉蚧 为害根部状施药时间掌握在越冬雌成虫产卵前或在连日大雨后。可选用的有效药剂、用量(6年生以上成年树用量及较小的树用量可酌减)及使用方法如下:24%螺虫乙酯悬浮剂50ml对水100kg，40%毒死蜱乳油50ml对水10kg，松土后每株4～5kg树盘泼施；3%辛硫磷颗粒剂100～150g/株，或10.2%阿维噻唑膦颗粒剂10～20g/株，将药剂与1kg干细土拌匀，均匀撒施于树盘后松土。严重发生的果园要用多种农药复配稀释后灌根，如毒死蜱、阿维菌素复配，阿维菌素、敌百虫、辛硫磷复配等。若虫、成虫群集在柑橘的芽、嫩梢、嫩叶、花蕾和幼果上吸食汁液，在嫩叶上多群集在叶背为害。新梢嫩叶受害状有所不同:绣线菊蚜为害幼芽，幼芽生长停滞，不能正常抽梢，为害嫩叶，叶片向叶背横向卷曲，为害新梢，新梢节间缩短，多个新梢集中成球状；橘蚜沿着枝梢和叶脉排列取食，发生严重时可布满枝梢和叶背，叶片畸形扭曲和黄化，但不形成卷叶，新梢不会卷缩成簇；棉蚜除为害嫩叶、嫩梢和芽外，亦可为害正在转绿的叶片；橘二叉蚜的为害症状与橘蚜相似，常造成枝叶卷缩硬化。蚜虫为害时常分泌蜜露诱发柑橘煤烟病，影响树势和翌年产量(图10-12、图10-13)。图10-12 蚜虫成虫、若虫（1）图10-13 蚜虫成虫、若虫（2）（1）栽培管理。结合冬春修剪，剪除虫枝和被害枝梢，降低越冬虫口基数。每次新梢抽发期，去零留整，统一放梢。（2）保护和利用天敌。5月以后田间蚜虫天敌数量逐渐增加，此时不喷药、少喷药或使用对天敌影响小的药剂，保护自然天敌，抑制蚜虫发生。（3）药剂防治。当25%～30%新梢有蚜虫为害时喷药防治，可选用药剂:10%吡虫啉可湿性粉剂2500～3000倍液、5%啶虫脒乳油2000～3000倍液、50%抗蚜威可湿性粉剂3000～6000倍液、4.5%高效氯氰菊酯乳油1500～3000倍液、20%氰戊菊酯乳油1000～2000倍液等。（4）黄板诱杀有翅蚜。悬挂黄板诱捕迁飞蚜虫。成虫刺吸幼嫩枝梢汁液，使之失水干枯死亡，造成落叶、落果，严重影响当年和翌年产量。雌成虫将产卵器插入柑橘结果母枝、当年春梢或夏梢的木质部，造成裂状产卵痕，长达5～10cm，并产卵其中，产卵痕破坏了水分、养分的输送，致使枝条枯死。若虫潜伏土中，吸食根部汁液，影响树势(图10-14、图10-15)。图10-14 黑蚱蝉成虫图10-15 黑蚱蝉蝉蜕药剂防治。用45%毒死蜱乳油400～500倍液淋树盘，毒杀土中若虫，或在成虫盛发期喷20%甲氰菊酯乳油1500倍液或2.5%高效氯氟氰菊酯乳油2000倍液杀灭成虫。幼虫啮食未老熟的新叶，咬成缺刻、孔洞状或仅存主脉(图10-16、图10-17)。图10-16 柑橘苗圃受害状图10-17 斜纹夜蛾高龄幼虫（1）诱杀、捕捉。使用频振式杀虫灯诱杀成虫，或人工摘除附有卵块的叶片并捏死幼虫。（2）药剂防治。幼虫盛发期喷药，可选药剂:48%毒死蜱乳油800～1000倍液、2.2%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐微乳剂1500～2000倍液、5%氯虫苯甲酰胺悬浮剂1000～1500倍液、2.5%高效氯氟氰菊酯乳油1000～1500倍液等。幼虫以卷叶、钻食果实为害植株生长，引起落果，影响产量和品质。幼虫体色为淡绿至黄绿色，受惊能迅速倒退或跳跃吐丝而逃。成虫多为小型蛾类，白天潜伏，夜间活动，趋光性强(图10-18至图10-20)。图10-18 卷叶蛾为害状图10-19 卷叶蛾卵图10-20 卷叶蛾高龄幼虫（1）农业防治。结合冬季修剪，剪除卷叶虫包，集中烧毁，以减少越冬虫口基数。（2）人工捉虫，摘除卵块。（3）利用天敌防治。在卷叶蛾成虫产卵盛期，释放松毛虫赤眼蜂来防治。（4）药剂防治。柑橘谢花至第二次生理落果期和果实着色期是防治关键时期，可选用药剂:90%敌百虫可溶性粉剂1200～1500倍液、2.5%溴氰菊酯乳油3000倍液、5%氯虫苯甲酰胺悬浮剂1000～1500倍液、2.5%高效氯氟氰菊酯乳油1000～1500倍液、48%毒死蜱乳油800～1000倍液、20%甲氰菊酯乳油3000倍液等。幼虫为害柑橘新梢、嫩叶、花蕾、幼果，甚至为害枝皮和果皮，严重时被害叶仅剩叶柄，形成秃枝(图10-21、图10-22)。图10-21 双线盗毒蛾幼虫图10-22 双线盗毒蛾成虫（1）人工捕杀。冬季摘除越冬卵块；生长季节虫口密度不大时，捕杀幼虫和蛹。（2）药剂防治。低龄幼虫盛发期喷药。可选用药剂:90%敌百虫可溶性粉剂1200～1500倍液、2.5%高效氯氟氰菊酯乳油2500～3000倍液、10%氯氰菊酯乳油2500～3000倍液、20%甲氰菊酯乳油800～1000倍液、2.5%溴氰菊酯乳油2000～3000倍液等。幼虫为害柑橘的嫩叶、新梢，常将嫩叶、嫩梢吃光或咬成缺刻状，严重时果园嫩梢可被吃光，影响枝梢的抽发(图10-23、图10-24)。图10-23 玉带凤蝶成虫图10-24 柑橘凤蝶大龄幼虫（1）人工捕杀。在成虫盛发期于早晨露水未干时用网捕杀成虫；人工抹除卵粒，查捉幼虫和清理虫蛹。（2）保护和利用天敌。凤蝶类害虫的天敌有寄生卵粒的赤眼蜂和凤蝶蛹金小峰，捕食幼虫的海南蝽、猎蝽等，应对其加以保护。（3）药剂防治。在幼虫幼龄期进行。可选用药剂:10%吡虫啉可湿性粉剂2000倍液、48%毒死蜱乳油1000～1500倍液、4.5%高效氯氰菊酯乳油1500～3000倍液、25%除虫脲可湿性粉剂800～1000倍液、90%敌百虫可溶性粉剂1200～1500倍液等。幼虫取食叶片，使其呈缺刻状，由于幼虫体型大、食量大，严重发生时，可将柑橘整枝、全株或整片橘园的新老叶片一起吃光(图10-25)。图10-25 大钩翅尺蛾雌成虫（左上）、雄成虫（左下）和幼虫（1）人工捕杀。在成虫羽化出土时，可用捕网网杀或用竹帚拍杀；在幼虫发生不多时，可人工捕杀；在成虫产卵盛期，刮除卵块；在越冬代幼虫入土化蛹后至翌年越冬蛹羽化出土前，中耕翻土，挖除越冬蛹，减少越冬虫源。（2）药剂防治。在低龄幼虫期，用90%敌百虫可溶性粉剂1000倍液喷雾，大龄幼虫可用2.5%溴氰菊酯乳油4000倍液或50%杀螟硫磷乳油1000～1500倍液喷雾。幼虫蚕食柑橘叶片，轻者造成缺刻，重者整片叶被吃光，只留下秃枝(图10-26、图10-27)。图10-26 大造桥虫幼虫及其 为害状（1）图10-27 大造桥虫幼虫及其 为害状（2）参考油桐尺蠖防治方法。幼虫为害离地0.5m以内的树干基部及主、侧大根，蛀成许多孔洞，严重阻碍植株养分和水分的输送，以致树势衰退，叶片黄萎，易被大风吹折，甚至整株树枯死(图10-28、图10-29)。图10-28 星天牛成虫图10-29 星天牛幼虫（1）捕杀成虫。成虫盛发期，在晴天的中午捕杀成虫，可减少产卵数量。（2）清除虫卵。在6月常检查柑橘树，树干基部出现稍隆起的产卵裂口或树皮呈湿润状时，用小刀刮开皮部清除卵粒或初孵幼虫。（3）钩杀或药杀幼虫。在幼虫蛀入木质部前，将木屑扒开，捉出幼虫；若已蛀入木质部且蛀道不长的，可用钢丝钩杀；不易钩杀的幼虫，用钢丝将虫孔内粪屑清除，用脱脂棉或废纸蘸药液塞入虫孔或用注射器进行虫孔灌药，再以湿泥封堵虫孔，或将1/8～1/6片磷化铝塞入虫孔，再用湿泥封堵，使幼虫中毒死亡。常用农药有80%敌敌畏乳油10～50倍液。幼虫在土下为害果苗主干，咬食或蛀食大部分木质部，仅留下外层，导致苗木枯死(图10-30、图10-31)。图10-30 蔗根土天牛成虫图10-31 蔗根土天牛幼虫（1）诱杀成虫。在成虫发生期，采用频振式杀虫灯诱杀成虫；或在果园内随机选点，挖掘直径30cm、深50cm的土坑，晚上可诱到成虫，清晨检查并将其杀死。（2）蔗地改种柑橘树时，应把园地全垦翻晒，清除蔗蔸并烧毁，以消灭蔗茎内的幼虫。（3）药剂防治。种植果树时，在植穴内撒施少量5%毒死蜱颗粒剂、3%辛硫磷颗粒剂、0.5%噻虫胺颗粒剂与周围土壤混匀，有较好的防治效果。成虫和幼虫为害嫩叶、嫩茎、花和幼果。成虫将叶片咬食成缺刻状或仅留叶面表皮，致叶片枯焦(似被火烧)而脱落，幼果被咬食出小洞造成落果。幼虫常多头集于一嫩叶片上取食并分泌黏液，排泄粪便负在虫背上，故称“牛屎虫”(图10-32、图10-33)。图10-32 柑橘恶性叶甲成虫图10-33 柑橘恶性叶甲幼虫及为害状（1）清除越冬成虫及幼虫化蛹场所。春季萌芽前，彻底清除柑橘树上的霉桩、苔藓、地衣、枯枝及橘园的落叶、杂草，以减少虫源；修平霉桩，残痕伤口可用石灰沙浆抹平，并用2～3波美度的石硫合剂喷布枝干或涂刷涂白剂。（2）捕杀成虫和幼虫。在成虫盛发期，通过振落捕杀成虫。在主干上捆扎稻草可诱集幼虫化蛹，在确认后将其集中烧毁。（3）喷药保梢。在开花前后幼虫大量出现和5月成虫大量取食时，喷药保护春梢。可喷2.5%溴氰菊酯乳油、2.5%三氟氯氰菊酯乳油2000～3000倍液、48%毒死蜱乳油1000倍液、80%敌敌畏乳油1000倍液等，每隔7～10天喷1次，连喷1～2次。主要取食叶片，花蕾和果实有时也受害。成虫取食叶背面叶肉和嫩芽，仅留叶面网状表皮。幼虫孵化后即钻入叶内潜食成隧道，其中有由幼虫排泄物形成的黑线。被成虫、幼虫为害的叶片不久便萎黄脱落，受害严重时全株嫩叶相继脱落(图10-34、图10-35)。图10-34 柑橘潜叶甲成虫 及为害状图10-35 柑橘潜叶甲幼虫叶内 潜食成隧道（1）减少越冬虫源和入土幼虫。在冬季、春季结合清园清除地衣、苔藓等成虫藏匿之地，在4—5月及时扫除落叶并将其集中烧毁。（2）捕杀成虫。在成虫盛发期，地面铺塑料薄膜，摇动树冠，收集落下的成虫，将其集中杀灭。（3）喷药保梢。在越冬成虫活动期和产卵高峰期各喷药1次。成虫取食嫩梢叶片和幼果，造成新梢叶片呈缺刻状，影响新梢生长和光合作用，被害幼果伤口凹陷，果肉暴露或果实脱落(图10-36、图10-37)。图10-36 灰象虫成虫图10-37 小绿象虫成虫（1）冬季深翻园土。冬季清园时，深翻园土，将越冬的蛹和幼虫翻出，破坏其生活环境以减少虫源。（2）人工捕杀。在成虫大量出现期，树下铺塑料薄膜，振动树枝，使其掉落在塑料薄膜上，收集并杀死掉落的成虫。（3）树干涂黏胶。3—4月成虫大量上树前，在树干上包扎或涂抹黏胶环，阻止成虫上树，并逐日清除胶环上的虫体，将其集中杀灭。但须注意，当胶环失去黏性时应及时更换或涂抹黏胶（黏胶用蓖麻油或桐油2kg、松香粉3kg、黄蜡0.05kg制作:先将油加热到约120℃时，再缓缓加入松香粉，搅拌至完全熔化，但温度不得超过130℃，最后加入黄蜡，完全熔化后冷却即成黏胶）。（4）药剂防治。成虫发生盛期用90%敌百虫晶体1000倍液或50%辛硫磷乳油800～1000倍液喷杀，也可在成虫出土期，在地面喷洒50%辛硫磷乳油200倍液，使出土在地面爬行的成虫触药死亡。若虫和成虫刺吸果实、嫩梢和叶片汁液，以果实受害为主。被害叶片枯黄、嫩梢变褐干枯。幼果受害后由于果皮油胞受到破坏，果皮紧缩变硬，果小汁少。后期受害果实变黄，引起落果(图10-38、图10-39)。图10-38 麻皮蝽老龄若虫图10-39 九香虫（瓜黑蝽）成虫（1）人工捕杀。阴雨天或清晨露水未干时捕捉栖息于枝叶上的成虫，5—9月摘除叶上的卵块和捕杀若虫。（2）药剂防治。在1～2龄若虫盛期，可选用80%敌敌畏乳油1000倍液、90%敌百虫可溶性粉剂800～1000倍液、2.5%溴氰菊酯乳油2000～3000倍液等喷雾防治。成虫和若虫在柑橘花期和幼果期为害嫩叶、嫩梢、花和幼果。嫩叶受害后叶片扭曲变形，叶肉增厚，叶片变硬，易碎裂、脱落；幼果果皮受害后，在果蒂的周围形成明显的灰白色环状疤痕，产生大量次品果(图10-40、图10-41)。图10-40 蓟马为害状图10-41 茶黄蓟马成虫（1）冬季彻底清除果园内的杂草及枯枝落叶，减少越冬虫源。（2）药剂防治。在低龄若虫盛发期前用药挑治1～2次。可选用以下药剂喷雾:20%吡虫啉可湿性粉剂3000～4000倍液、48%毒死蜱乳油1000～1500倍液等。成虫和若虫取食为害柑橘嫩叶、嫩梢、花和幼果，嫩叶受害后呈缺刻或孔洞状，少有将叶片吃光的情况(图10-42、图10-43)。图10-42 纺织娘成虫图10-43 纺织娘若虫（1）人工捕杀成虫和若虫。（2）药剂防治。一般蟲蟖类害虫为害柑橘较轻，不造成大的为害，偶尔数量较多。可在低龄若虫盛发期用药挑治，主要药剂有90%敌百虫可溶性粉剂1000～1500倍液或48%毒死蜱乳油1000～1500倍液。主要为害柑橘幼苗或衰弱树的树皮或根系，并可在树干表面修筑泥被，向上取食为害，影响树木生长，甚至导致树木死亡。嫁接的幼树常被该虫从接疤处蛀入剥食而死(图10-44、图10-45)。图10-44 黑翅土白蚁（有翅蚁）图10-45 黑翅土白蚁（兵蚁）（1）诱杀成虫。在4—6月的白蚁分飞季节，安装频振式杀虫灯诱杀有翅繁殖蚁。（2）土坑诱杀。在果园周边每隔10～15m挖一长宽各40～50cm、深30～40cm的土坑，坑内放芒萁草、松树枝、桉树皮等，然后用稻草盖上再覆盖泥土，每15～20天检查1次，发现有大量白蚁时，将坑内材料搬出，让鸡啄食白蚁，再换入新的材料继续诱杀。（3）药剂预防。在种植柑橘树苗时，用48%毒死蜱乳油50倍液淋根，可预防幼苗受害。成虫和若虫咬食新叶叶片，被害叶呈缺刻或孔洞状，严重时仅剩叶柄，形成秃枝。该虫在广西1年发生1代，以卵在土中越冬。5月初若虫孵化，6—7月若虫和成虫大量发生，8—9月为成虫交配产卵期。卵为块产，每头雌虫平均产卵2块，平均产卵量为126粒。若虫共有6龄，1～2龄若虫有群集为害习性，后逐渐分散为害(图10-46)。图10-46 棉蝗成虫（1）人工捕杀。在若虫发生季节，尚处聚集为害时，可用捕虫网将其捕杀。（2）药剂防治。在若虫盛发期选用以下药剂喷雾防治:90%敌百虫晶体800～1000倍液、2.5%溴氰菊酯乳油2000～3000倍液或4.5%高效氯氰菊酯乳油1500～3000倍液等。幼虫在柑橘嫩梢、嫩叶表皮下钻蛀为害，形成银白色的弯曲隧道。受害叶片卷缩或变硬，易于脱落。一般老树受害较轻，幼树、苗木受害较重；春梢受害轻，夏梢、秋梢受害特别严重。被害叶片常是卷叶蛾、红蜘蛛、锈壁虱、黄蜘蛛等害虫的越冬场所，幼虫造成的伤口利于柑橘溃疡病病菌的侵入(图10-47)。图10-47 柑橘潜叶蛾为害状（1）夏梢、秋梢去零留整，统一放梢。（2）药剂防治。当夏梢、秋梢抽发1.0cm长时开始喷药，每隔7天喷1次，连喷2～3次。可选用药剂:1.8%阿维菌素乳油3000～3500倍液、20%吡虫啉可湿性粉剂2000～3000倍液、25%除虫脲可湿性粉剂800～1000倍液。1～2年生幼树可用20%吡虫啉可湿性液剂原液涂树干，每株用药1～2ml。幼虫以蚕食叶片为害植株生长。低龄幼虫仅咬食叶肉，大龄幼虫咬食叶片成缺刻状，甚至仅留下叶柄(图10-48)。图10-48 刺蛾幼虫（1）人工捕杀幼虫，摘除虫叶，将其集中烧毁。（2）诱杀成虫。在成虫盛发期利用频振式广谱杀虫灯诱杀成虫。（3）药剂防治。在低龄幼虫期施药。可选用药剂:90%敌百虫可溶性粉剂1200～1500倍液、20%甲氰菊酯乳油800～1000倍液、5%氯虫苯甲酰胺悬浮剂1000～1500倍液、40%毒死蜱乳油800～1000倍液、2.2%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐微乳剂1500～2000倍液等。成虫咬食柑橘叶片、花，使叶片产生缺刻或孔洞，甚至将整片叶吃光。金龟子的幼虫为蛴螬，生活在土壤中，取食萌发的种子、幼根等(图10-49、图10-50)。图10-49 白星花金龟成虫图10-50 铜绿金龟子成虫（1）拉网捕杀成虫。成虫羽化高峰期，在果园四周挂尼龙渔丝网捕杀成虫，渔丝网高度超过树冠100cm。（2）人工捕杀。掌握各种金龟子羽化为害期，捕杀成虫。（3）冬耕翻土。柑橘园进行冬耕，可杀死土壤里的幼虫和成虫。（4）灯光诱杀。利用成虫有趋光的习性，夜间使用黑光灯、电灯等进行诱杀。（5）药剂防治。成虫盛发期，在树冠喷药，可选用药剂:50%辛硫磷乳油800倍液、45%马拉硫磷乳油1000倍液、90%敌百虫晶体800～1000倍液，或用50%辛硫磷乳油1000倍液灌根。

三月红、白蜡、冰糖荔、水东黑叶等。禾荔、黑叶、钦州红荔、糯米荔大造等。灵山香荔、桂味、糯米糍等。荔枝栽培适宜在年平均温度18～20℃的地区，1月平均温度10～17℃,绝对温度-2℃以上为宜。年雨量在1200mm以上，花期、小果期少雨。荔枝生长旺盛期和采果前，应无风害。对山地红壤、黄壤、平地沙壤、黏土、冲积土适应性较强。一般采用空中压条和嫁接。嫁接一般选用当地酸荔枝作糯米糍、妃子笑、大红袍的砧木。在4—5月进行嫁接。嫁接速度是影响嫁接成活的主要因素。一般选择土层深厚、疏松肥沃的山坳谷地及山地建园。一般选择春植(2—5月)和秋植(9—10月)。以选择在春季进行为佳，因为此时气温逐渐回升，雨水充足，日照又不太强，有利于苗木发根萌芽，成活率较高。其次是秋植，此时雨水少，气候干燥，必须注意淋水。定植规格可依据园地环境条件、栽培管理水平确定，一般株行距(4～5)m×(5～6)m；每667m2栽22～55株；配置授粉树。在定植前2个月左右挖好深宽各0.8～1m的定植穴，穴底填入绿肥或草皮20kg、厩肥30kg、过磷酸钙1kg及石灰0.5kg混合堆沤，使之在定植前腐解沉实。(1)保持土壤湿润，在定植1个月内，晴旱天气要经常淋水，一般3～7d淋一次。雨多时要注意排除树盘积水，特别要注意因穴土下沉而造成的植穴内积水。(2)在风大的地方宜用竹子或树枝支撑果苗，以防风吹摇动伤根而影响成活。(3)植后30d，可检查植株成活情况，未成活的及时补种。(1)中耕除草。每年中耕除草2～3次。第一次在采果前或采果后结合施肥进行，可促发新梢、加速树势恢复，宜浅耕10～15cm。第二次在秋梢老熟后进行，深可15～20cm，以切断部分吸收根、减少根群吸水能力、利于抑制冬梢萌发。第三次在开花前约1个月进行，宜浅，深约10cm。可疏松土层、促进根系的生长和吸收。(2)培土客土。在秋、冬季结合清园进行。于树冠下土面培泥，厚6～10cm。切忌堆积过厚，以防生根和土层积水缺氧伤根。(3)深翻改土。于树冠外围土层挖沟，深0～70cm，分层压入杂草、绿肥、垃圾，以改善土壤理化性状，促进根群生长。水分是荔枝生长发育过程中必不可少的，在抽梢的时候，施肥往往要结合灌溉，以促进根系的吸收，但在控梢的季节，不仅要控制水分的供应，而且还要通过翻土来达到控制水的目的，因为控制水分的供应，可以使枝梢生长缓慢或停止，以利于花芽分化。在1—2月，花芽形态分化期，若遇干旱，要灌水促花芽抽出。(1)修剪。采果时要一果两剪，先把果穗连同结果枝基部、甚至结果母枝下面的枝梢基部一起剪下，然后才剪下果穗。果穗下面的枝梢回缩多长，取决于结果母枝枝梢生长的好坏，生长好的回缩短些，生长差的回缩长些。采果施肥后立即进行修剪，剪去病虫枝、阴蔽枝、交叉枝、重叠枝、回缩衰退枝。修剪后，荔枝留枝梢20～25条为宜。(2)清园。修剪后在树冠滴水线下挖两个长1m，深、宽各30～40cm的坑，把修剪下来的枝叶和园内杂草埋入坑底，然后撒石灰0.5kg，上层用猪粪5～10kg、生物有机肥3～5kg、钙镁磷肥0.5～1kg拌表土将坑填至高出地面10～15cm，最后在地面撒石灰粉消毒。(3)杀虫。全园全面喷一次农药防治病虫害。可用10%吡虫啉3000倍液加64%杀毒矾600倍液等。(4)衰弱树更新。视衰退程度进行回缩修剪。衰退程度轻的剪除衰弱枝，平施肥料；衰退程度重的要回缩到较大的侧枝甚至主枝，同时进行根系更新，重施有机肥。(1)采果前肥。在采果前7～10d施下，作用是采果后加快恢复树势、促发秋梢、培养健壮结果母枝、奠定翌年丰产基础，此期以氮为主，磷、钾配合，氮施用量占全年施肥量45%～55%,磷、钾占30%～40%。应重视有机肥的使用，在秋季采果后和末春初施入。荔枝以土壤施肥为主，并根据各物候期的实际需要，辅以叶面喷肥。如用0.3%～0.4%尿素，0.3%～0.4%磷酸二氢钾，0.03%～0.05%复合型核苷酸，0.05%～0.1%硼酸，0.02%～0.05%硼砂，0.3%～0.5%硫酸镁。(2)适时放梢。健壮的秋梢是荔枝龙眼优良的结果母枝。通过科学的肥水管理，合理留果，修剪疏芽等综合措施，培养健壮的结果母枝。严格掌握放梢时间，使结果母枝能适时抽出，适时老熟，正常进入花芽分化。要根据不同品种、树龄、树势、挂果量、管理水平和气候特点，灵活安排采后留梢时间及次数。一般适龄树留梢二次，以秋梢作结果母枝；壮龄树留一次秋梢。在广西壮族自治区较适宜的荔枝结果母枝抽生时间是：早熟品种黑叶、香荔、糯米荔、桂味在9月中下旬；妃子笑和迟熟品种禾荔在9月下旬至10月上旬。常用的控梢促花技术除上述培养适时健壮的秋梢外还可采取断根、环割、环剥、摘除冬梢、喷施生长抑制剂等方法。(1)断根。在末次梢充分老熟后，结合施基肥，在树冠滴水线外挖浅沟压绿或施入有机肥，如果树势较旺，估计可能抽出冬梢的，可在整个树盘翻土锄断细根。(2)环割。多用于青壮年树，一般在11—12月进行，最好在直径6～10cm的大枝上环割，不要割树干，同时要注意掌握环割的深度，以刚达到木质部为准。(3)螺旋形环剥。对壮旺幼年结果树，可以使用螺旋形环剥。在末次梢老熟时可使用剥口宽0.2～0.3cm的环剥刀环剥1～1.5圈，深度以刚达到木质部为准，环剥部位从离地面25cm以上8～10cm粗的主干、主枝或分枝。(4)使用化学调控技术。使用化学药剂进行控梢促花，目前生产上采用的“荔枝专用促花剂”和“花果灵”等荔枝生长调节剂，经过多年多地区大面积使用，对提高荔枝花的质量，缩短花穗，提高雌花雄花的比例，提高坐果率和产量，均取得较显著效果。(1)施壮花肥。壮花肥一般在花穗抽出见到花蕾时施用(又称见花施肥)。施肥量视成花量及树势而定，一般每结果50kg的树面，施复合肥1kg加尿素0.2～0.5kg，或施尿素、过磷酸钙、氯化钾各0.5kg。另外，在开花前20d左右叶面喷施0.3%的磷酸二氢钾，或绿旺1号(高钾)1000倍液加0.05%的硼砂，可促进花穗发育。(2)合理控穗。生产实践表明，一般抽生早的花穗以及过长的花穗花质差，雌花比例低，坐果率低，特别是花穗大的品种(如妃子笑)，要合理调节和控制花量，以提高坐果率。1）人工短截花穗。短截花穗可减少花量，提高花质。花穗短截的轻重要视品种而定，对花穗再生能力强、易抽二次花穗的品种如妃子笑、三月红可重些。2）用于控穗的药物有荔枝丰产素、乙烯利等控制花穗。(3)防治病虫害。为害荔枝花穗的主要病虫害有荔枝椿象、荔枝瘿螨、尺蠖、蚜虫及荔枝霜疫霉病。可用克螨特、吡虫啉、灭百可、蚜力克和瑞毒霉锰锌、杀毒矾、大生M-45、甲霜灵等药物防治。(1)放蜂授粉。一般要求每3～5亩放一箱蜂。(2)人工辅助授粉。常用的人工辅助授粉的方法是：用湿毛巾在刚开放的雄花花穗上来回轻轻摇动，收集花粉，然后将毛巾置于清水中，反复多次，使花粉悬浮液呈淡黄色的混浊液，即喷洒到雌花上。人工授粉注意事项：一是应选择气温在16℃以上的晴天进行；二是配制的花粉液放置时间不能超过20min，否则花粉失去活力，影响授粉效果。(1)施壮果肥。花谢花后10～15d施壮果肥，作用是及时补充开花时的消耗、保证果实生长发育所需养分、减少第二次生理落果、促进果实增大、并避免树体养分的过度消耗、为秋梢萌发打下良好基础，此次以钾为主，氮磷配合，钾占全年施肥量40%～50%,氮、磷占30%～40%。要注意根外追肥。(2)环割。对生长壮旺的树进行，雌花谢花后10～15d开始割，在4～6cm粗的大枝上进行，割一圈，深至木质部。弱树不割。(3)应用植物生长调节剂。在果实绿豆大时用20mg/L赤霉素保果。(4)加强水分管理。干旱时要灌水，高温、日照强时，要对树冠喷水，雨多积水时要及时排水。(5)及时防治病虫害。荔枝果实发育期主要病害有荔枝霜疫霉病、荔枝煤烟病、荔枝炭疽病，主要虫害有荔枝蒂蛀虫、荔枝椿象、荔枝小灰蝶等。