芽孢杆菌属（Bacillus spp.）是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤、植物体表面及水体中，其在工业、农业、医学、军事和科学研究中有广泛的应用价值。在《Bergey氏鉴定细菌学手册》第8、第9版中，蜡样芽孢杆菌的分类地位为芽孢杆菌属的第I群，该群有22个种。根据营养型菌细胞的宽度分为两类，蜡样芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌属“大细孢菌种”。蜡样芽胞杆菌是一种杆状、产内生芽孢的革兰氏阳性细菌，由于蜡样芽孢杆菌自然界分布甚广，常存在于土壤、灰尘、腐草和空气中，极易在食品加工、运输、贮存、销售过程中，通过苍蝇、蟑螂等昆虫和不卫生的用具和手污染，通常被认为是一种条件致病菌，在临床上可导致脓肿、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎等报道，但最常见的是导致两种不同类型的食物中毒：腹泻型和呕吐型。关于B.c.引起非肠道感染及食物中毒的例子很多，从1898年起，就有B.c.造成泌尿系统感染及肠胃炎的记载，有些感染的病例甚至很严重，以致造成死亡。在微生物发展的早期，好氧芽孢杆菌就被怀疑可造成食物中毒，Lubenau1906年描述了发生在一家医院的严重的食物中毒事件，300名医务人员及病人用餐后出现急性肠胃炎，对剩余的食物进行检测，发现含有大量的好氧芽孢杆菌，该污染菌为B.c.。Seitz 1913 年从一例患肠炎与腹泻的病人分离出B.c.。Brekenfeld 分别于1926年及1959年报道了两起B.c.造成的食物中毒事件。1936～1942年，瑞典卫生部对367例食物中毒事件综合分析，证实117例是由B.c.引起，并且认识到被B.c.污染的食物，储藏温度不当时，可能会造成食物中毒，在1973年Bulyba等人报道了污染蜡样芽孢杆菌的乳制品引起食物中毒。由于Smith、Gorden 及其同事在芽孢杆菌分类学上的进展，Hauge 经过对4起食物中毒事件的调查，于1995年首次确认B.c.是一种引起食物中毒的致病菌。目前大部分国家对各类食品中的蜡样芽孢杆菌数量有所限定，多数情况下，引起食物中毒的食品中蜡样芽孢杆菌的数量在105～108 CFU/g，常因食用肉类、海鲜、乳品和蔬菜等食物引起，潜伏期一般为6～15h，一般持续24h；而致呕吐的毒素是该菌在食物中预先产生的，该毒素非常稳定，进入人体后在胃中与其受体5-HT3 结合，导致呕吐。呕吐型食物中毒的潜伏期一般为0.5～6h，一般限于富含淀粉质的食品，特别是炒饭和米饭。主要症状为恶心、呕吐，有时有腹泻、头晕、发烧和四肢无力等症状，引起这两种食物中毒的食品通常都是经过热加工处理的，但蜡样芽孢杆菌具有耐热的芽孢，能在食品加工及烹饪后残留下来，热处理诱发芽孢的萌发，在没有其他微生物与之竞争的条件下，大量生长繁殖，产生毒素并引起食品的腐败。蜡样芽孢杆菌产生的呕吐毒素（cereulide，1.2kD）是一种小的十二边形的热稳定性环状毒素，分子式为（D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val）3。其结构、性质和毒理与缬氨霉素很相似，是特异性的钾离子载体，能将K 转入线粒体内，破坏线粒体的氧化还原能力。该毒素非常稳定，目前的各种食品加工方法，包括灭菌，均无法使其失活（能耐受126℃ 90min），而且还耐强酸（pH 2.0）、耐蛋白酶水解。N.Agata等对多种食品中呕吐毒素的产量进行了检测，发现对B.cereus NC7401来说，在煮熟后的米饭中其产毒量很高，在富含淀粉质的食物中的产毒量也足以引起食物中毒；而在肉类、蛋品和密封的液体食品如牛奶和豆奶中虽可以检测到该毒素，但其含量较低。还发现在与醋、蛋黄酱及酱类一起煮的食物中，该菌株的生长和产毒都受到抑制，推测这可能是醋导致pH 降低的缘故。在12～15℃时该毒素的产量却明显高于30℃时的产量，而且该毒素的产生与芽孢的产生没有相关性。还有报道称该毒素只有在有氧条件下才能产生，所以缺氧条件如：充氮包装和真空包装能有效地防止该毒素的产生和积累。因为该毒素的分子量很小，无抗原性，这使其检测比较难，到目前为止尚缺乏一种快速可靠的检测方法。最常用是采用HEp-2 细胞进行细胞培养分析。近年来用分子生物学手段检测产毒菌株的报道也较多，如P F Horwood 等人根据NRPS基因的两个可变区的序列，针对产呕吐毒素的菌株设计了特异性的引物，进行PCR 以检测蜡样芽孢杆菌是否产毒，取得了良好的效果，该法灵敏度高，而且检测速度快。在呕吐食物中毒事件中分离的蜡样芽孢杆菌均产生呕吐毒素，而且有着共同的独特表型特征，对其基因进行分析发现它们同源性很高。B.c.所造成的腹泻型食物中毒的致病因子是肠毒素，目前至少已经发现4 种不同的肠毒素，包括2 个三联体肠毒素：溶血素BL和非溶血素Nhe；2个单一亚基肠毒素：细胞毒素K（cytK）、肠毒素T（bceT）。2.2.1 溶血素BL（HBL）Beecher1991年从B.c.菌株中分离提纯了一种具有活性的三亚基肠毒素，命名为溶血素BL（hemolysinBL），能够引起家兔肠段的液体积累，可以改变豚鼠皮肤血管的通透性，具有对vero细胞的溶细胞毒性。其由一个结合亚基B（37.5kD）、两个溶血亚基L1（38.2kD）及L2（43.5kD）组成，编码3个亚基的基因hblA、hblD、hblC经克隆、测序与分析，表明其在同一个mRNA中受一个操众子调控转录如图1。这些组分的物理化学性质非常相似，等电点（pI）为5.34，5.33和5.33。其中hblA编码结合亚基B，hblD、hblC分别编码溶血亚基L1及L2，hblB编码B’蛋白，hblC和hblD仅隔37bp个碱基，B、L1、L2蛋白分别有31、30、32个氨基酸的信号肽，hblD和hblA之间最少有100bp碱基，hblA和 hblB有381 bp的碱基隔开，B’蛋白与B蛋白开始的158个氨基酸非常相似，但其功能尚未清楚。Douglas J.Beecher等人利用等电聚焦电泳技术和快速蛋白液相层析技术证明单独成分的溶血素亚基并不会在血平板上产生溶血环，只有当3个亚基结合后，才会产生溶血环。图1 芽孢杆菌溶血素BL操纵子图谱2.2.2 非溶血素肠毒素（Nhe）非溶血素肠毒素（Nhe）由45、39和105kD的蛋白组成，其蛋白成分已被分离出来。1999年Granum等给出了nhe操纵子的序列，该操纵子有3个开放式阅读框，相应的3个基因分别是：nheA、nheB和nheC。前两个基因的产物分别为45kD和39kD 蛋白，而nheC 的产物尚未纯化出来，其功能未知。Nhe与Vero细胞相互作用的研究表明105kD蛋白是复合物的结合部位，而其他两个组分是无法单独结合到细胞上去。该105kD 蛋白是一种金属蛋白，具有分解明胶和胶原的活力。与hbl 基因不同，编码该毒素的基因位于质粒上。图2 芽孢杆菌非溶血素Nhe操纵子图谱溶血素BL（HBL）与非溶血素肠毒素（Nhe）同时受到PlcR的调控。2.2.3 肠毒素T（entertoxin T）肠毒素T为单一亚基的蛋白质，由 bceT基因编码，日本学者Agata对其基因克隆、测序和分析表明其由336个氨基酸组成。并认为其有细胞毒性，可导致家兔肠段的液体积累，可以改变豚鼠皮肤血管的通透性，具有对vero细胞的溶细胞毒性。其产物属于肠毒素蛋白。该毒素同溶血素BL无同源性，而且认为肠毒素T 不会导致食物中毒。2.2.4 细胞毒素K 早期在法国报道过食物中毒，其氨基酸序列显示它属于β-桶孔形成毒素，能在磷脂双分子层中形成直径至少为7A°的孔，该孔具有微弱的离子选择性，已证实它对人类肠道Caco-2上皮细胞具有毒性。PlcR是条件性人类病原菌B.cereus和共生病原菌B.thuringiensis细胞外毒性因子的一个多效调节子，它在细胞进入稳定期时诱导生长。受到PlcR调节的基因有：plcA编码一个专一性磷脂酰肌醇磷脂酶C（PI-PLC），Plc编码一个改良的磷脂酰胆碱磷脂酶 C（PC-PLC），nhe编码一个无溶血性的肠毒素，hbl编码一个溶血性的肠毒素 BL（HBL）；以及推定为S-层类似表面蛋白的基因，以及一个推定为细胞外RNA酶。通过分析37.1kb的hbl，plcA和plcR周围的DNA序列，推定存在28个ORF。3条新基因推定受到PlcR 的调节并编码一个中性蛋白酶，subtilase家族丝氨酸蛋白酶（Sfp）以及一个推定的细胞壁水解酶（Cwh）得到确认。相应的sfp和cwh 基因定位于plcA的上游调节区域，能同时受到位于逆转录基因之间的PlcR结合位点的调控。Sylvie Salamitou等构建plcR基因缺失的突变菌株，该基因编码一个多效细胞外因子的调节子。幼虫期同时取食亲本菌株产生的106孢子亚致死浓度的Cry1C毒性导致70%死亡率，如果使用plcR突变体的孢子，则只有7%的死亡率。小鼠鼻腔灌入108的孢子，亲本菌株导致了100%的死亡率，而灌入相同数量的突变体孢子，死亡率大大降低，甚至没有死亡。应用营养体细胞代替孢子也可以达到相同的效果。导致死亡的原因未知，不可能是由于小鼠内细菌的实际增长所导致。由于受B.thuringiensis 过量突变体感染的小鼠产生的病变，说明溶血素参与其中，发生了作用。B.thuringiensis和B.cereus具细胞溶解毒性的特性。这种细胞溶解毒性的水平在plcR基因缺失的菌株中剧烈下降。表明 B.thuringiensis407菌株和B.cereusATCC14579的致病性受到PlcR的调控。由于蜡样芽孢杆菌及其芽孢广泛存在于周围的环境中，它极易污染食物而引起食物中毒，因此需要发展一种快速的检测方法来实现对致病性蜡样芽孢杆菌的检测，目前对该类蜡样芽孢杆菌的检测主要采用生化检测方法是一项费时费力的方法，需要长时间的选择性培养过程。现在有两种试剂盒可供选择，但由于价格昂贵且不太灵敏，有些致病菌不能够检测。王利国等人对实验室14株芽孢杆菌溶血素BL的检测结果表明，8株蜡样芽孢杆菌全部检测到溶血素BL的基因且产生溶血环，而其他的蜡样芽孢杆菌只检测到hblA基因以外的基因且不产生溶血环，表明只要检测到hblA基因，证明其为致病性菌株，所以通过设计hblA基因特异引物用PCR或通过血平板培养的方法是既经济又快速的检测方法。对其他毒素的检测目前主要是通过设计特异性引物来检测。所以对蜡样芽孢杆菌毒素的检测还需要进一步对其研究，确定最佳的检测方法。

由灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.）侵染引起的番茄灰霉病是当前番茄生产上重要病害，尤以设施栽培条件下发生较重，一般引起产量损失20%～30%。灰葡萄孢的寄主很广，已经报道过的寄主至少有235种，能为害多种粮食作物、经济作物、蔬菜、果树和观赏植物[1]。随着高效农业的发展，温室中蔬菜、花卉、果树轮作、间作日渐频繁，使得同种作物间、不同种作物间交互感染成为可能[2～3]。为了明确来自其他寄主植物的灰葡萄孢菌株能否侵染番茄，不同寄主来源的菌株对番茄的致病力是否存在差异，从而为生产上包括番茄灰霉病在内的灰葡萄孢所致植物灰霉病的综合治理提供参考依据，作者对不同寄主来源的灰霉菌株对番茄的致病力及其分化进行了研究。2005～2007年，从合肥市、蚌埠市、长丰县、和县等地区的番茄、辣椒、草莓、葡萄等发病寄主上分离鉴定获得18个灰葡萄孢菌株，采用菌丝块创伤接种法，分别测定了上述不同寄主来源的灰葡萄孢菌对番茄果实和叶片的致病力。结果表明，所有供试菌株接种番茄果实后均可引起发病，但不同菌株所致病斑的平均直径有显著差异，提示灰葡萄孢菌株间对番茄果实的致病力存在明显分化。按照在番茄果实上所致病斑的平均直径大小可将供试菌株划分为致病力较强、致病力中等和致病力较弱3种类型。总体来说，来自番茄的菌株对番茄果实的致病力较强，来自草莓、葡萄和辣椒的菌株对番茄果实的致病力较弱，但来自相同寄主的菌株间致病力也存在差异，菌株致病力差异与菌株地域来源无明显相关。供试灰葡萄孢菌株接种番茄叶片后，除CF1外，均可引起番茄叶片发病，但不同菌株所致番茄叶片病斑的平均直径也有显著差异，但菌株致病力差异与菌株的寄主和地域来源无显著相关。本文关于灰葡萄孢不同菌株致病力存在差异的研究结果与Kersises[4]的报道一致。Lorenz[5]和Kersises[4]认为灰葡萄孢不同菌株致病力分化的原因可能与异核现象有关。作者也曾采用细胞核染色法观察到部分灰葡萄孢菌株菌丝细胞内存在多核现象，但这种多核现象与异核现象乃至致病力分化之间的关系尚不清楚。因此，有关灰葡萄孢不同菌株致病力分化的机制尚需进一步研究。灰葡萄孢菌株对番茄果实和叶片的致病力测定结果比较表明，除FQ外，其余各供试菌株对番茄果实所致病斑直径均比叶片病斑直径大，但各供试菌株接种番茄果实和叶片后所致病斑直径之间没有明显的相关性。作者认为，采用菌丝块创伤接种法测定灰葡萄孢菌对番茄的致病力时，以接种果实为宜；由于不同菌株的致病力差异较大，所以在番茄抗病性测定时，宜选用强菌株或混合菌株。本研究结果指出，来自辣椒、草莓、葡萄等其他寄主植物的灰葡萄孢菌株能够侵染番茄果实和叶片，意味着上述植物上的灰霉病菌（灰葡萄孢）可以成为番茄灰霉病的侵染来源，建议在番茄灰霉病的综合治理中应予以注意。

姜（Zingiber officinale Rosc.）为姜科（Zingiberaceae）、姜属（Zingiber），多年生草本植物，是一种既能作为调味蔬菜，又能入药的重要的经济作物。山东省是我国姜的主要产区，近年来，由于多数品种长期无性繁殖及连年重茬种植，出现了一种严重影响姜产量和质量的病害，该病害主要为害姜叶部，发病初期呈现水浸状小斑点，随后变成黄色，逐渐扩大成为椭圆形、近圆形或不规则形的白色病斑，边缘则为黄褐色，病斑继而彼此融合，导致整叶干枯；在老熟病斑上可见大量黑色小颗粒。目前国内外有关文献报道认为，引起姜叶斑病的病原菌为姜叶点霉（Phyllosticta zingiberiHori）[1]，白金铠[2]在《中国真菌志》中描述过Phyllosticta zingiberi的形态特征，而Mathur[3]曾提到Phyllosticta zingiberi T.S.Ramakr.为Phoma zingiberi Khune的基原异名，但关于Phoma zingiberi的产孢细胞等形态特征及ITS序列分析未见报道。由于茎点霉属（Phoma）真菌与叶点霉属（Phyllosticta）真菌有诸多类似的地方，如分生孢子器和分生孢子的形态、颜色、大小等。因此，Phoma和Phyllostica两属间的分类及属下种的分类问题一直存在着许多争议。Saccardo[4]认为，两者的主要区别在于寄生部位的不同，即Phoma寄生于植物叶以外的部位，而Phyllosticta寄生于植物叶片上，这种主观的划分受到许多真菌学家的批评。由于产孢方式是Phyllosticta和Phoma两属共同具有的稳定特征。因此，目前已作为被多数学者所接受的分类标准。对于植物病原真菌，传统的分类方法多以真菌的形态特征为依据，而近年来分子生物学手段的应用为真菌的分类鉴定提供了更多遗传信息方面的依据。核糖体基因内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，简称ITS）在真菌种间存在丰富的差异，已广泛应用于真菌亲缘关系较近分类群的系统发育研究。目前，对于形态学上难以区分的Phoma和Phyllosticta两属真菌，尚未开展ITS序列的比对研究，其ITS序列资源也有待进一步丰富。本文发现的病害症状与已报道的由Phyllosticta zingiberi引起的姜叶斑病症状基本一致。为了正确鉴定分离到的姜叶斑病的致病菌，本文利用传统的形态学观察并结合分子手段对该病原菌的分类归属进行了研究。姜病叶采自山东省生姜主要产地莱芜市姜田。1.2.1 病菌的培养及光镜观察 将发病叶片表面消毒后置于PDA培养基上培养4～5天，从菌落边缘取直径为5mm的菌落圆片进行纯培养，在Olympus光学显微镜下观察并描述分生孢子器、分生孢子、产孢细胞形态特征，用显微测量尺测定分生孢子器及分生孢子的大小。1.2.2 透射电镜样品制备与观察 将新鲜的感病叶片切成小于0.5cm×0.5cm的材料，固定于3%戊二醛中，再用1%锇酸二次固定，乙醇梯度脱水、Epon812树脂浸透、包埋、超薄切片，经醋酸双氧铀、柠檬酸铅双重染色，JEM-1200EX透射电镜观察、拍照。将配制好的孢子悬浮液（低倍镜下每视野约30个孢子）喷洒在4～5叶期健康的姜新叶上，接种后套袋保湿48h。定期观察并记录发病情况和症状特点。取病斑上产生的子实体镜检，并从发病组织中再次分离致病菌，观察并描述病原菌形态特征。菌丝染色体DNA的提取参照何月秋[5]的方法并做适当的修改，质粒提取采用碱裂解法，大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态制备、连接、转化等参考《分子克隆实验指南》（第三版）[6]。以总DNA为模板，以通用引物ITS1：5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′和ITS2：5′-GCT GCG TTC ATC GAT GC-3′，ITS3：5′-GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC-3′和ITS4：5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′分别扩增ITSI和ITSII片段。PCR反应程序如下：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1min，50 ℃退火1min，72 ℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物连接到pMD18-T（大连宝生物工程有限公司），转化E.coli DH5α，经鉴定的重组质粒送上海英俊生物技术公司测序。该病原菌在PDA培养基上菌丝初为白色，后变为褐色，25 ℃培养20～25天后，逐渐出现分生孢子器。光镜观察分生孢子器为球形、扁球形，暗褐色，直径55～135μm，高75～130μm，器壁褐色，由3～5层细胞组成，壁厚9～13μm，内壁形成产孢细胞，上着生分生孢子；分生孢子椭圆形、卵形，无色，单胞，两端各含有一油球，5～8.5μm×2～4.5μm，其形态与报道的Phyllosticta zingiberi基本一致（Figure 1），但光镜和透射电镜观察其产孢方式为内壁芽生瓶梗式（eb-ph）（Figure 2）。Figure 1 Picnidium(Micro)(×400)Figure 2 Morphology of conidiogenous cell(Micro)(×1 000)用分生孢子悬浮液接种姜嫩叶后，发病症状和病原菌形态特征与自然发病株相同。取病健交界处组织再分离，其培养性状和形态特征与第1次分离结果一致。根据柯赫氏法则，接种菌即为姜叶斑病的致病菌。2.3.1 菌丝染色体DNA的提取与核糖体DNA ITS的PCR扩增 用改进的CTAB法提取该菌染色体DNA，琼脂糖凝胶电泳检测。采用真菌核糖体基因ITS区域通用引物ITS1和ITS2、ITS3和ITS4分别扩增了茎点霉的ITSI和ITSII，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果均为单一条带，大小分别为224bp和343bp。2.3.2 核糖体DNA ITS序列分析 将克隆到的ITSI和ITSII测序后进行拼接，确定了ITS片段的核苷酸序列（Genbank登录号为EF408240）。用DNAStar软件对所得序列进行编辑和排序比对，得出该病原菌ITS序列与叶点霉的同源性最高为58.7%，与茎点霉的同源性最高为95.6%。利用MEGA3.1软件分析核苷酸组成并计算种间遗传距离，结果显示该病原菌与茎点霉亲缘性更大。以往报道认为，引起姜叶斑病的病原为Phyllosticta zingiberi Hori，Hara记载并描述了Phyllosticta zingiberi Hori的形态特征：叶上病斑圆形、不规则形，中央灰白色，直径1～3mm；分生孢子器球形、扁球形，暗褐色，直径50～120μm，分生孢子椭圆形、卵形，单胞，无色，两端各含有一油球，5～9μm×2.5～3.5μm。后人Sawada[7]对中国台湾省姜叶上的Phyllosticta zingiberi Hori、戚佩坤等[8]对广东姜叶上的Phyllosticta zingiberi Hori以及本研究对分离菌的描述与上述基本一致，应视为同种。Ramakrishnan[9]描述的印度姜叶上的Phyllosticta zingiberi T.S.Ramakr.的形态特征为，叶上病斑卵圆形，中央灰白色，可形成穿孔，9～10μm×3～4μm；分生孢子器球形，78～150μm，分生孢子无色，椭圆形，3.7～7.4μm×1.2～2.5μm，两端各含有一油球，此形态与Phyllosticta zingiberi Hori基本一致。因此，Phyllosticta zingiberi T.S.Ramakr.应视为Phyllosticta zingiberi Hori的同物异名。Sutton[10]通过对Phoma和Phyllosticta产孢方式的研究，认为Phoma是内壁芽生瓶梗式（eb-ph），Phyllosticta是全壁芽生单生式（hb-sol），这与Dictionary of the fungi第九版[11]对两属产孢方式的描述一致，而吕国忠电镜观察结果显示，两属的产孢方式相同，均为全壁芽生环痕式（hn-ann），同样，王琪[12]对龙眼叶点霉（Phyllosticta dimocarpi）研究结果也是全壁芽生环痕式（hn-ann），周永力[13]则认为Phyllosticta为内壁芽生瓶梗式（eb-ph）。因此，有关两属的产孢方式目前尚有争论。本研究对该病原菌的光镜和电镜观察结果表明，其产孢方式为内壁芽生瓶梗式（eb-ph），符合Kendrick等对Phoma产孢细胞特征的描述，ITS序列分析结果发现，该菌与Phoma ITS序列同源性高达95.6%，远远高于与Phyllosticta ITS序列的同源性（58.7%）。本研究结果支持Mathur的观点，认为Phyllosticta zingiberi T.S.Ramakr.为Phoma zingiberi Khune的基原异名。由于Phyllosticta zingiberi T.S.Ramakr.是Phyllosticta zingiberi Hori的同物异名。因此，引起姜叶斑病的病原菌应为姜茎点霉（Phoma zingiberi Hori）。致谢：山东农业大学张天宇教授、张修国教授对本研究提供了热情帮助，并对论文修改提出了建议。

多数苹果属植物野生种或栽培种的花和果都具有观赏价值，在观赏园艺花卉树木中占有重要地位。20世纪以来，国外植物学家从我国引种并进行了大量杂交选育工作，培育了一系列具观赏用途的海棠品种，统称为观赏海棠（Malus spp.）。近年来，国内学者从国外引进的观赏海棠品种几十个，它们姿态各异，色彩斑斓，大量果实点缀枝头直到深冬，丰富了景观内容。但是，这些观赏海棠不少品种的植株枝干上往往产生大量轮纹状、马鞍形的瘤状突起，严重时，病斑相连，导致树皮粗糙，严重影响树势甚至引起枝干坏死。本研究对其病原进行了初步研究，以期为进一步研究其发生发展规律和防治技术奠定基础。观赏海棠（M.spp.）植株为山东省泰安市区栽植树种。在6月份从病树上采集病斑，显微切片观察其病原形态，并对其大小进行测定。按常规方法，进行分离培养并纯化。观察其培养性状和产孢特征。在6月底，将分离纯化的病原菌分别采用烫伤接种法、针刺接种法、喷雾接种法对健康的海棠枝条进行接种，定期观察其发病情况，确定其致病性。设置不同温度条件（5℃、15℃、25℃、28℃、37℃、40℃）、不同pH值条件（pH值4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）、不同培养基条件（琼脂、蛋白胨、LB、BPY、PMA、PSA、PDA），用菌碟法分别测定不同条件下病原菌的菌丝生长状况；并在以上不同温度、不同pH值条件以及不同营养条件（0.5%、1%、2%葡萄糖，0.5%、1%、2%蔗糖）下，采用凹穴法测定病原菌孢子萌发情况。受害海棠枝干从皮孔开始发病，以皮孔为中心形成近圆形斑点，暗褐色，凹陷，边缘稍隆起；随后病斑中央突起，呈瘤状，质地坚硬，成为灰白色；病健交界处发生龟裂，病皮翘起，有点呈马鞍状，或呈轮纹状；病斑表面产生黑色的小粒点。严重时，病斑相连，病皮粗糙，导致部分枝干死亡。对病斑上黑色粒点切片镜检，发现：子座扁球形，其上分生孢子器1～3个，分生孢子器扁圆形或椭圆形，大小为（142～284）μm×（162～289）μm；内壁密生分生孢子梗，分生孢子梗棍棒状，单胞，顶端着生分生孢子；分生孢子单细胞，无色，纺锤形或长椭圆形，一端钝圆，一端截平，大小为（20.1～32.9）μm×（7.6～9.8）μm。从发病枝干上分离培养获得病原菌纯培养，菌落初灰白色，逐渐呈灰黑色，气生菌丝浓密，呈絮状隆起，后期菌落中产生灰黑色子座。对病原菌进行致病性测定，通过不同方法对海棠进行接种试验，发现烫伤接种法和针刺接种法处理的海棠发病率为100%，而喷雾接种法处理的海棠则几乎没有发病。其症状表现为，伤口先凹陷变黑，后形成褐色小突起。同时发现，在山东省泰安市，在6月底接种，该病原菌侵染的潜伏期为7～10天。经鉴定，认为该病害的病原为Botryosphaeria berengeriana，病害为观赏海棠轮纹病。25～28℃、pH值4.0～7.0、BPY和PDA培养基等条件，最适合菌丝生长，菌落生长快，且菌丝白色浓密呈絮状隆起，易产生黑色分生孢子器。28℃、pH值7.0、1%蔗糖条件最适合病原菌分生孢子萌发，12h观察孢子萌发率能达到80%左右，孢子萌发芽管较短、粗，多数两端萌发。观赏海棠轮纹病发病严重，目前对其病原鉴定方面未见报道。本研究初步确定其病原为Botryosphaeria berengeriana，并测定了其部分生物学特性。结果也显示该病原菌从形态和生物学特性上与引起苹果轮纹病的病原菌[1]和梨轮纹病[2，3]的病原菌有一定的差异。该菌的寄主范围、对苹果属、梨属植物的致病性、ITS的序列测定等工作正在开展中，这些信息对于该菌分类地位的进一步确定有重要价值。

主要步骤如下。（1） 将 800 μl 提取缓冲液 CTAB buffer （内含 2%CTAB、100 mmol/L Tris-HCl pH值8.0、20 mmol/L EDTA、1.4 mol/L NaCl、2%PVP30、1%的β-巯基乙醇） 加入2 ml的离心管内65℃预热。（2） 从-70℃超低温冰箱中取0.2 g ‘富士’ 和 ‘金冠’ 及其杂交群体单株的嫩叶，放入研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状，并迅速转移到装有预热的提取缓冲液的离心管内，并上下颠倒混匀。（3） 65℃水浴中保温3 min，数次颠倒使内含物充分混匀。（4） 将离心管取出，加800 μl氯仿∶异戊醇 （体积比为24∶1）。颠倒充分混合，温和震荡2～3 min。（5） 在高速离心机上离心10 min （14000 r/min），将上清液转移到1.5 ml离心管中。（6） 加入6 μl RNase （10 mg/ml） 充分混匀，在37℃恒温箱内温育1 h，再用氯仿∶异戊醇抽提1次。（7） 加500 μl 事先在-20℃冰箱内预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后，于4℃冰箱中沉淀 DNA 10～25 min。（8） 在高速离心机上 14000 r/min 离心 3 min，然后弃掉上清，得到沉于离心管底部的DNA。（9） 用500 μl 75%乙醇洗 DNA沉淀两次。倒掉乙醇，注意不要将DNA倒出。（10） 在超净工作台上干燥 DNA 2 h。（11） 将吹干的DNA溶于100 μl超纯水中。1.缓冲液的的制备取适量50×TBE缓冲液配制成1×TBE稀释缓冲液，待用。2.胶液的制备称取1 g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入 100 ml 1×TBE 稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，制成1%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。3.胶板的制备待凝胶温度稍低后加入5 μl EB （溴化乙锭），混匀，然后倒入模具中 （注意不要有气泡），加上合适的梳子形成加样孔，梳子的位置应该在托盘底面上0.5～1.0 mm。4.待胶完全凝固后拔出梳子注意不要损伤梳底部的凝胶，将模具放入电泳槽内并加入1×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。5.加样取10 μl DNA稀释液，用微量移液枪小心加入样品槽中。每加完一个样品要更换 tip 头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。6.电泳加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。DNA 应该向阳极泳动，用120 V电压电泳15～30 min，停止电泳。1.6%非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法（1） 胶板的制备。先用水将平板和耳朵板冲洗干净，将其平放在桌面上，用餐巾纸将其擦干之后，用 95%酒精擦洗 2 次，待其干后，将0.5%的 Banding silane 溶液均匀的倒在平板上，用餐巾纸迅速将其涂匀，待其晾干，然后将洗干净的梳子和压条整齐的摆在平板之上，将2%的 Repel silane溶液均匀的涂在耳朵板上 （此项操作应在通风橱中进行），待其晾干后，将其整齐摆放在平板之上，用夹子将其夹好。（2） 凝胶的制备。取50%的PA胶50 ml，加入60 μl的TEMED，120 μl 10%的过硫酸铵 （APS），温和混匀。（3） 灌胶。将混合好的胶沿着玻璃板的灌胶口缓缓灌入，注意使灌入的胶基本上沿着一条直线灌入，如不整齐，可用手轻轻拍打胶板，使胶保持同一直线灌入，避免气泡的产生。胶灌入到底部之后，迅速将梳子平面插入到两玻璃板之间，插好梳子之后，用夹子夹好，让其聚合1h后用于电泳。（4） 电泳。加入电极缓冲液lxTBE，50 W恒功率，预电泳10 min后，清除气泡，插入梳齿，将扩增好的 PCR 产物，加入6 μl的溴酚蓝，混匀95℃变性5 min，之后用微量加样器取6 μl，进行电泳1 h左右 （根据分子量的大小调整电泳时间）。2.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染方法 （体积100 ml）（1） 固定。在磁盘中加入 10%的乙醇和 500 μl 冰乙酸，摇匀后加入凝胶，再平行摇动3～5 min。（2） 染色。在固定液中加入 1 ml 20%AgNO3 储备液后，平行摇动 5～8 min。（3） 漂洗。倒掉定影液，加入蒸馏水漂洗 2～3 次，洗净后，倒掉蒸馏水。（4） 显色。在磁盘中加入 100 ml 3%NaOH 溶液和 500 μl 甲醛，迅速振荡，使显影液均匀作用，然后平行摇动，直至显影。（5） 洗涤。清楚显影后，倒掉显影液，用自来水清洗凝胶 1～2次，彻底去掉显影液，以免保存时变色。1.胶回收（1） 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。（2） 在紫外灯下切出含有目的片段 DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的片段 DNA 部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高 DNA 回收率。胶块超过 300 mg时，使用多个 Column 进行回收，否则严重影响回收率。注：切胶时注意不要将 DNA 长时间暴露于紫外灯下，以防 DNA损伤。（3） 切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤 6 的胶块溶解时间，提高 DNA 回收率。（4） 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以 1 mg=1μl 进行计算。（5） 向胶块中加入胶块溶解液 Buffer GM，Buffer GM 的加量如下表。凝胶浓度BufferGM使用量1.0%3个凝胶体积量1.0%～1.5%4个凝胶体积量1.5%～2.0%5个凝胶体积量（6） 将不溶解液与胶块充分混合后，15～25℃溶解胶块 （胶浓度较大或比较难溶时可以在 37℃加热）。间断振荡混合，使胶块充分溶解 （5～10 min）。注：胶块一定要充分溶解，否则将会严重影响 DNA 的回收率。高浓度凝胶可以适当延长溶胶时间。（7） 当凝胶完全溶解后，观察溶胶液的颜色，如果溶胶液颜色由黄色变为橙色或粉色，向上述胶块溶解液中加入 3M 醋酸钠溶液（pH值5.2） 10 μl，均匀混合至溶液恢复黄色。当分离小于 400 bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为 20%的异丙醇。（8） 将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。（9）将上述操作步骤7的溶液转移至Spin Column中，12000r/min离心1min，弃滤液。注：如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高 DNA 的回收率。（10）将700μl的Buffer WB加入Spin Column中，室温12000r/min离心30s，弃滤液。注：确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100%乙醇。（11） 重复操作步骤 10。（12） 将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12000 r/min离心1 min。（13） 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Col-umn膜的中央处加入 30 μl 灭菌蒸馏水或 Elution Buffer，室温静置1 min。注：将灭菌蒸馏水或 Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。（14） 室温12000 r/min离心1 min洗脱DNA。2.大肠杆菌感受态的制备（1） 取大肠杆菌DH5α 在 LB 培养基上划线，37℃培养箱内过夜培养，长出单菌落。（2） 挑取单菌落，接种于4 ml不含抗生素的LB培养基上，37℃振荡 （轻摇） 培养过夜。（3） 过夜培养的菌液与 LB 培养基按 1∶50 的比例转入三角瓶，37℃振荡培养 （约3 h），至OD600=0.4～0.6。（4） 4℃，5000 r/min离心5 min，轻轻倒掉上清，用5 ml （1/5体积） 预冷的0.1 mol/L Mgcl2悬浮细胞 （0.95 g/100 ml）。（5） 4℃，5000 r/min 离心 5 min，轻轻倒掉上清，用 12.5 ml （1/2体积） 预冷的 0.1 mol/L CaCl2悬浮细胞，冰浴放置 20 min（1.1 g/100 ml）。（6） 4℃，5000 r/min离心5 min，轻轻倒掉上清，用2.5 ml预冷的 0.1 mol/L CaCl2 （含 10%的甘油） 悬浮细胞，分装，每管120 μl。（7） 液氮速冻，-80℃保存。3.目的基因连接载体pMD-19T simple 1 μl，目的 DNA 4 μl，solution Ⅰ 5 μl，混匀后于16℃金属浴中反应30 min。4.目的基因转化（1） 1.5 ml离心管中加入10 μl的连接产物和50 μl大肠杆菌感受态细胞。（2） 冰上放置30 min。（3） 42℃金属浴加热45 s 后，冰中放置1 min。（4） 加入 500 μl LB 液体培养基，37℃，200 r/min 振荡培养45 min。（5） 取100 μl菌液涂板 （LB+Amp+），37℃过夜培养。（6） 过夜培养之后，挑取单克隆菌落，加到 LB 液体培养基（Amp+100 mg/L） 中37℃，200 r/min振荡培养6～8 h。（7） 菌液PCR检测正确后，送测序。序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置1CH03g12GCGCTGAAAAAGGTCAGTTTCAAGGATGCGCATGTATTTGChr12CH05g08CCAAGACCAAGGCAACATTTCCCTTCACCTCATTCTCACCChr13Hi02c07AGAGCTACGGGGATCCAAATGTTTAAGCATCCCGATTGAAAGGChr14Hi07d08TGACATGCTTTTAGAGGTGGACGTTTGAGGGGTGTCCGTACAAGChr15Hi12c02GCAATGGCGTTCTAGGATTCGTTTCACCAACAGCTGGGACAAGChr16C10455AAGGCAATACAAGACGGACGTTCACACCGAAAGCCTCTCTChr17Hi21g05GACGAGCTCAAGAAGCGAACGTTTGCTCTTGCCATTTTCTTTCGChr18C13810CGTCCTAGATAGATGCCCCACAGGACTCTAAGGACTGCCGChr1附表1 实验所用已发表SSR引物列表序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置9C13280CTCCTCCTCCCTCAGTACCCCCTTCACTCACCTTTCTCGCChr110C16757AATGGGACCCAACTGGTACATCGACCATACAAATTGCTGCChr111C6948CTTGGAGCTGTGAGAGTCCCCAAACCTCTCATCGCAACCTChr112KA4bAAAGGTCTCTCTCACTGTCTCCTCAGCCCAACTCAAAGCCChr113CH02a04GAAACAGGCGCCATTATTTGAAAGGAGACGTTGCAAGTGGChr214CH02b10CAAGGAAATCATCAAAGATTCAAGCAAGTGGCTTCGGATAGTTGChr215CH02c02aCTTCAAGTTCAGCATCAAGACAATAGGGCACACTTGCTGGTCChr216CH02c06TGACGAAATCCACTACTAATGCAGATTGCGCGCTTTTTAACATChr217CH02f06CCCTCTTCAGACCTGCATATGACTGTTTCCAAGCGATCAGGChr218CH03d01CGCACCACAAATCCAACTCAGAGTCAGAAGCACAGCCTCChr219CH03d10CTCCCTTACCAAAAACACCAAAGTGATTAAGAGAGTGATCGGGGChr220CH05e03CGAATATTTTCACTCTGACTGGGCAAGTTGTTGTACTGCTCCGACChr221Hi02a07TTGAAGCTAGCATTTGCCTGTTAGATTGCCCAAAGACTGGGChr222Hi05g12TCTCTAGCATCCATTGCTTCTGGTTTGTGTGTTCTCTCATCGGATTCChr223Hi07d12GGAATGAGGGAGAAGGAAGTGGTTTCCTCTTCACGTGGGATGTACCChr224Hi08f05GTGTGGGCGATTCTAACTGCGTTTCCTTTATTCTAAACATGCCACGTCChr225Hi08g12AGTTCGGTCGGTTCCGTAATGTTTAGGGCAAGGGGAAAGAAGTChr226Hi22d06CCCCGAGCTCTACCTCAAACATTATGTTTCCGGTTTTTGGChr227Hi24f04CCGACGGCTCAAAGACAACTGAAAAGTGAAGGGAATGGAAGChr228AJ251116GATCAGAAAATTGCTAGGAAAAGGAGAGAACGGTGAGCTCCTGAChr229AT000400CTCCCTTTGCTCCCTCTCTTAGGATGTCAGGGTTGTACGGChr230CN444636CACCACTTGAGTAATCGTAAGAGCGTTTGCCAGTTAAGGACCACAAGGChr231CN493139CACGACCTCCAAACCTATGCGTTTATGAAAGTACGGCACCCATCChr232CN581493GCTTTTCATGGTGGAAAAACTGGTTTGACTCTCCGCTCTGATGGACChr233NH033bGTCTGAAACAAAAAGCATCGCAACTGCCTCGTCTTCCTCCTTATCTCCChr234CH03e03GCACATTCTGCCTTATCTTGGAAAACCCACAAATAGCGCCChr335CH03g07AATAAGCATTCAAAGCAATCCGTTTTTCCAAATCGAGTTTCGTTChr336MS14h03CGCTCACCTCGTAGACGTATGCAATGGCTAAGCATAChr3附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-1序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置37Hi03d06TCATGGATCATTTCGGCTAAGTTTGCCAATTTTATCCAGGTTGCChr338Hi03e03ACGGGTGAGACTCCTTGTTGGTTTAACAGCGGGAGATCAAGAACChr339Hi04c10TGCGCATTTGATAGAGAGAGAAGTTTAACAAAGAACGACCCACCTGChr340Hi05f12TTTGGGTTTGGGTAGGTTAGGGTTTGTGCAGCGCATGCTAATGChr341Hi07e08TTCGTGCTAGGGAGTTGTAGCGTTTGCCTCCATAGGATTATTTGACChr342Hi15b02TATGGTGGCAACAGTGGAGAGTTTCGCCACCTCCACTTAACATCChr343Hi15h12GAACAAGAAGGACGCGAATCGTTTGGGCCTCGTTATCACTACCAChr344AU223657TTCTCCGTCCCCTTCAACTACACCTTGAGGCCTCTGTAGCChr345HGA8bAACAAGCAAAGGCAGAACAACATAGAGAAAGCAAAGCAAAChr346GD12CTAACGAAGCCGCCATTTCTTTTTGAGGTGTTTCTCCCATTGGAChr347IPPN15AACCATGGCATTGGATTGATGAAGCACTCAATGGGGAAAAChr348NZmsCN943818TGAACAGCTCATCGTCGGTACGGGAAGAGGAAATGTGATTChr349C9312TCCACCAGTGACAAGAGCTGAGGATTCAATCAGCTACGCCChr350C6359CGGAAATGGTCACTGGAACTTGGGACGGACACACACACChr351CH01b12CGCATGCTGACATGTTGAATCGGTGAGCCCTCTTATGTGAChr452CH01d03CCACTTGGCAATGACTCCTCACCTTACCGCCAATGTGAAGChr453CH02c02bTGCATGCATGGAAACGACTGGAAAAAGTCACACTGCTCCChr454CH02h11aCGTGGCATGCCTATCATTTGCTGTTTGAACCGCTTCCTTCChr455CH04e02GGCGATGACTACCAGGAAAAATGTAGCCAAGCCAGCGTATChr456CH05d02AAACTCCCTCACCTCACATCACAATAGTCCAATGGTGTGGATGGChr457Hi01e10TGGGCTTGTTTAGTGTGTCAGGTTTGGCTAGTGATGGTGGAGGTGChr458Hi07b02ATTTGGGGTTTCAACAATGGGTTTCGGACATCAAACAAATGTGCChr459Hi08e04GCATGGTGGCCTTTCTAAGGTTTACCCTCTGACTCAACCCAACChr460Hi08h03GCAATGGCGTTCTAGGATTCGGTGGTGAACCCTTAATTGGChr461Hi23d11bGACAGCCAGAAGAACCCAACGTTTATTGGTCCATTTCCCAGGAGChr462Hi23g02TTTTCCAGGATATACTACCCTTCCGTTTCTTCGAGGTCAGGGTTTGChr463Hi23g08AGCCGTTTCCCTCCGTTTGTTTGTGGATGAGAAGCACAGTCAChr464AT000420TTGGACCAATTATCTCTGCTATTGATGTGGTCAGGGAGAGGAGChr4附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-2序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置65MSS6CGAAACTCAAAAACGAAATCAAACGGGAGAGAAACTCAAGACCChr466C12595ATGAAAACCCACAAAACCCAAAACCATACACAACGCCACAChr467C13146CTGGGAAAAATGGGGAAAATGCTTTCCCTTTCCTTCTTCAAChr468C15TTGCGAGAAAGCTAAAAACCACAGACTCTGCAACCCCTCTCChr469CH01d07AGTCGAAATCCCGAACAATCAAAATCCAGTTTTCCACCTCChr470NZ01a6TTAGACGACGCTACTTGTCCTAGGATTGCTGGAAAAGGAGGChr471GD162AAAATGTAACAACCCGTCCAAGTGGAGGCAAGTGACAAAGAAAGATGChr472NH011bTTTGCCGTTGGACCGAGCGGTTCACATAGAGAGAGAGAGChr473CH02a08GAGGAGCTGAAGCAGCAGAGATGCCAACAAAAGCATAGCCChr574CH02b12GGCAGGCTTTACGATTATGCCCCACTAAAAGTTCACAGGCChr575CH03a04GACGCATAACTTCTCTTCCACCTCAAGGTGTGCTAGACAAGGAGChr576CH03a09GCCAGGTGTGACTCCTTCTCCTGCAGCTGCTGAAACTGGChr577CH04e03TTGAAGATGTTTGGCTGTGCTGCATGTCTGTCTCCTCCATChr578CH04g09TTGTCGCACAAGCCAGTTTAGAAGACTCATGGGTGCCATTChr579CH05e06ACACGCACAGAGACAGAGACATGTTGAATAGCATCCCAAATGGTChr580CH05f06TTAGATCCGGTCACTCTCCACTTGGAGGAAGACGAAGAAGAAAGChr581Hi01c04GCTGCCGTTGACGTTAGAGGTTTGTAGAAGTGGCGTTTGAGGChr582Hi02a03GACATGTGGTAGAACTCATCGGTTTAGTGCGATTCATTTCCAAGGChr583Hi04a08TTGAAGGAGTTTCCGGTTTGGTTTCACTCTGTGCTGGATTATGCChr584Hi04d02TTCGTGGCTGAGAAAGGAGTGTTTGTACGGTGCATTGTGAAAGChr585Hi08a04TTGTCCTTCTGTGGTTGCAGGTTTGAAGGTAAGGGCATTGTGGChr586Hi08h08TGAACAAATTCCACCACGAAGTTTGCCAAGGCTACAATTTTCAChr587Hi09b04GCGATGACCAATCTCTGAAACTGGGCTTGAATTGGTGAATCChr588Hi11a03GGAATTGGAGCTTGATGCAGGTTTCATACGGAATGGCAAATCGChr589Hi15e04AAACCTCTGCATTCCGTCTCCTCATACTCCTCCCACATTGTCChr590Hi21c08TTCTTCTCCTCCACCACCTCGTTTGTCACTGAGAAGGCGGTAGCChr591Hi22a07CTCTTCCTTCTCCGCCTCTTGTTTCACTCAGAATGCCTCACAGCChr592Hi22f12GGCCTCACCCAGTCTACATTGTTTGGTGTGATGGGGTACTTTGCChr5附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-3序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置93AU223670GGACTCAATGCCTTTTCTGGAGGATGGCAGCAATCTTGAAChr594CN445599TCAAATGGGTTCGATCTTCACGTTTGCCTGGCTGTAACTGTTTGGChr595CN496002TCAGAATCTCAAGCAAGATCCTCGTTTGATTGATCGTGGCGATATGChr596CH03d07CAAATCAATGCAAAACTGTCAGGCTTCTGGCCATGATTTTAChr697CH03d12GCCCAGAAGCAATAAGTAAACCATTGCTCCATGCATAAAGGGChr698CH05a05TGTATCAGTGGTTTGCATGAACGCAACTCCCAACTCTTCTTTCTChr699Hi03a03ACACTTCCGGATTTCTGCTCGTTTGTTGCTGTTGGATTATGCCChr6100CH01b11AACCTAACCAAACACGTACGGTTCGGCTGTACTCTTTGAGChr6101Hi04d10AAATTCCCACTCCTCCCTGTGTTTGAGACGGATTGGGGTAGChr6102Hi05d10AATGGGTGGTTTGGGCTTAGTTTCTTTGGCTATTAGGCCTGCChr6103Hi07b06AGCTGCAGGTAGAGTTCCAAGGTTTCATTACCATTACACGTACAGCChr6104Hi08g03ATTCACTTCCACCGCCATAGGTTTGGAATGATTGCGAGTGAAGCChr6105CN445290TCTCAGTTGCTCTGGCTTTGGTTTGCAATCAATGCCACTCTTCChr6106U78949TTTGTCTACCTCTGATCTTAACCAACAGCATCGCAGAGAACTGAGChr6107CH04e05AGGCTAACAGAAATGTGGTTTGATGGCTCCTATTGCCATCATChr7108Hi01d05GGTATCCTCTTCATCGCCTGTTAGATTGACGTTCCGACCCChr7109Hi03a10GGACCTGCTTCCCCTTATTCGTTTCAGGGAACTTGTTTGATGGChr7110Hi12f04ATTGTCCCCACAAAATTGGATGTTCGATGTGACTTCAATGCChr7111CN444794CATGGCAGGTGCTAAACTTGAAACTGAAGCCATGAGGGCChr7112CH02b11CACAACGCAGTTCGATCACTACCTTACCTGGTAGAGAGAGAChr7113EMPc111CCGATCAGAAAGAGCTGTGAGTCAAACCTTCCAACCTCAACAATChr7114Hi05b09GTTTCTAACGTGCGCCTAACGTGAAACCCAACCCAAAGAGTGGChr7115MS06c09AATATAAGAGCCAGAGGCACTATTGGAGTAAGTCGAChr7116Z38126AAGAGGGTGTTCCCAGATCCAATTCCAATTTCAGAACAGGChr7117CH01c06TTCCCCATCATCGATCTCTCAGGAGGGATTGTTTGTGCACChr8118CH01f09ATGTACATCAAAGTGTGGATTGCAAACAAACCAGTACCGCAAChr8119CH01h10TGCAAAGATAGGTAGATATATGCCATTTTGACCCCATAAAACCCACChr8120CH02g09TCAGACAGAAGAGGAACTGTATTTGGTTTGAGTTTGATCTCCAACATTACChr8附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-4序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置121CH05a02GTTGCAAGAGTTGCATGTTAGCGTTTGAGCAGAGGTTGCTGTTGCChr8122Hi01c11TTGGGCCACTTCACAACAGGGTGCGCTGTCTTCCATAAAChr8123Hi04b12CCCAAACTCCCAACAAAGCGTTTAGTTGCTAATGGCGTGTCGChr8124Hi04e05AAGGGTGTTTGCGGAGTTAGGTTTGTCTACAACTGTCTGATGGTAGCChr8125Hi20b03AAACTGCAATCCACAACTGCGTTTAAAGGGGCCCACAAAGTGChr8126Hi22g06GAAAGGACCGAATTTCATGCGGACATGGATGAAGAATTGGAChr8127Hi23g12CCCTTCCCTACCAAATGGACCTCCCCGGCTCCTATTCTACChr8128Z71980TCTTTCTCTGAAGCTCTCATCTTTCATCTTTTGGTGCTCCCACACChr8129CH01f03bGAGAAGCAAATGCAAAACCCGGGATGCATTGCTAAATAGGATChr9130CH01h02AGAGCTTCGAGCTTCGTTTGTGATTGCCACATGTCAGTGTTChr9131CH05c07TGATGCATTAGGGCTTGTACTTGTTTACCAATTAGGACTTAAAGCTGChr9132CH05d08TCATGGATGGGAAAAAGAGGGTTTCATGTCAAATCCGATCATCACChr9133Hi01d01CTGAAATGGAAGGCTTGGAGATTTATGGTGATGGTGTGAACGTGChr9134Hi04a05GGCAGCAGGGATGTATTCTGGTTTCAAGAACCGTGCGAAATGChr9135Hi05e07CCCAAGTCCCTATCCCTCTCGCTTAATAGAAACATCGCTGAChr9136Hi23d06TTGAAACCCGTACATTCAACTCGTTTGCAGTGGATTGATGTTCCChr9137AJ320188AACGATGCTTGAGGAAGAACACCTCCCGTCTCCCACCATATTAGChr9138CN444542ATAAGCCAGGCCACCAAATCCGTTTTTGGAGCGTAGGAACChr9139NH029aGAAGAAAACCAGAGCAGGGCAGCAAAAACCACAGGCATAACChr9140CH02a10ATGCCAATGCATGAGACAAAACACGCAGCTGAAACACTTGChr10141CH02b03bATAAGGATACAAAAACCCTACACAGGACATGTTTGGTTGAAAACTTGChr10142CH02b07CCAGACAAGTCATCACAACACTCATGTCGATGTCGCTCTGTTGChr10143CH02c11TGAAGGCAATCACTCTGTGCTTCCGAGAATCCTCTTCGACChr10144CH03d11ACCCCACAGAAACCTTCTCCCAACTGCAAGAATCGCAGAGChr10145COLAGGAGAAAGGCGTTTACCTGGACTCATTCTTCGTCGTCACTGChr10146MS01a03AGCAGTATAGGTCTTCAGTGCGTAGATAACACTCGATChr10147MS02a01CTCCTACATTGACATTGCATTAGACATTTGATGAGACTGChr10148MS06g03CGGAGGGTGTGCTGCCGAAGGCCCAGCCCATATCTGCTChr10附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-5序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置149Hi01a03CGAATGAAATGTCTAAACAGGCAAGCTACAGGCTTGTTGATAACGChr10150Hi01b01GCTACAGGCTTGTTGATAACGCACGAATGAAATGTCTAAACAGGCChr10151Hi02d04TGCTGAGTTGGCTAGAAGAGCGTTTAAGTTCGCCAACATCGTCTCChr10152Hi03c04CGTAAATAGCGAATCCGATACCGTTTCAACATCTGTGGGTCATTGCChr10153Hi03f06ACGATTTGGTGATCCGATTCGTTTCGTCGCATTGTGCTTCACChr10154Hi04f08CGTGAAAACTCTAACTCTCCGTTTGAAAAGCGCATCAAAGTTCCChr10155Hi05b02GATGCGGTTTGACTTGCTTCGTTTCTCCAGCTCCCATAGATTGCChr10156Hi08g06AATCGAACCAGCACAGGAAGGTTTAGATGGAGGTCGTGGTTACGChr10157Hi08h12GAAGGAAATCATCATCAAGACGGTTTCAAGACCATGGAACAACTTGGChr10158Hi21f08GAGAAAACGCAGAAGCATTGAGTAATGATTTCATCGCGAGTCChr10159Hi22f04TCAATCCTCTGCTCTTCAAGGGTTTAATCACCTGCTGCTGCTTGChr10160AF057134ACTACCCAATGCCCACAAAGTATCCTCGCCCAAAAGACTGChr10161AU223548ACCACCACTGCAGAGACTCAGACGCACCCATTCATCTTTTChr10162CH02d08TCCAAAATGGCGTACCTCTCGCAGACACTCACTCACTATCTCTCChr11163CH02d12AACCAGATTTGCTTGCCATCGCTGGTGGTAAACGTGGTGChr11164CH03d02AAACTTTCACTTTCACCCACGACTACATTTTTAGATTTGTGCGTCChr11165CH04a12CAGCCTGCAACTGCACTTATATCCATGGTCCCATAAACCAChr11166CH04d07TGTCCTCCAATCTTAACCCGCACACAGACGACACATTCACCChr11167CH04d10GAGGGATCTGTAGCTCCGACTGGTGAGTATCTGCTCGCTGChr11168CH04g07CCCTAACCTCAATCCCCAATATGAGGCAGGTGAAGAAGGAChr11169CH04h02GGAAGCTGCATGATGAGACCCTCAAGGATTTCATGCCCACChr11170Hi01d06GGAGAGTTCCTGGGTTCCACAAGTGCACCCACACCCTTACChr11171Hi02a09ATCTCTAAGGGCAGGCAGACCTGACTCTTTGGGAAGGGCChr11172Hi02c06AGCAAGCGGTTGGAGAGAGTTTGCAACAGGTGGACTTGCTCTChr11173Hi04g11CAGAGGATTATCAATTGGACGCAAACTATCTCCAGTTATCCTGCTTCChr11174Hi06b06GGTGGGATTGTGGTTACTGGGTTTCATCGTCGGCAAGAACTAGAGChr11175Hi07d11CCTTAGGGCCTTTGTGGTAAGGTTTGAGCCGATTAGGGTTTAGGGChr11176Hi07g10TATTGGGTTTTGGGTTTGGAGTTTCAACCCTTTTGGTTGTGAGGChr11附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-6序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置177Hi09a01GAAGCAACCACCAGAAGAGCGTTTCCCATTCGCTGGTACTTGAGChr11178Hi16d02AACCCAACTGCCTCCTTTTCGTTTCGACATGATCTGCCTTGChr11179Hi23d02CCGGCATATCAAAGTCTTCCGTTTGATGGTCTGAGGCAATGGAGChr11180CN491050CGCTGATGCGATAATCAATGGTTTCACCCACAGAATCACCAGAChr11181CH01d09GCCATCTGAACAGAATGTGCCCCTTCATTCACATTTCCAGChr12182CH01f02ACCACATTAGAGCAGTTGAGGCTGGTTTGTTTTCCTCCAGCChr12183CH01g12CCCACCAATCAAAAATCACCTGAAGTATGGTGGTGCGTTCChr12184CH03c02TCACTATTTACGGGATCAAGCAGTGCAGAGTCTTTGACAAGGCChr12185CH04d02CGTACGCTGCTTCTTTTGCTCTATCCACCACCCGTCAACTChr12186CH04g04AGTGGCTGATGAGGATGAGGGCTAGTTGCACCAAGTTCACAChr12187CH05d04ACTTGTGAGCCGTGAGAGGTTCCGAAGGTATGCTTCGATTChr12188CH05d11CACAACCTGATATCCGGGACGAGAAGGTCGTACATTCCTCAAChr12189CH05g07CCCAAGCAATATAGTGAATCTCAATTCATCTCCTGCTGCAAATAACChr12190MS14b04CCTTAAGAATCATGTGATACTAATGGCACAAAGATTGTChr12191Hi02b07TGTGAGCCTCTCCTATTGGGTGGCAGTCATCTAACCTCCCChr12192Hi02d05GAGGGAGAATCGGTGCATAGCATCCCTCAGACCCTCATTGChr12193Hi03b03TGAATTGAGTTTGAGAATGGAATGGTTTGTCAGGACGGGTAATCAAGGChr12194Hi07f01GGAGGGCTTTAGTTGGGAACGTTTGAGCTCCACTTCCAACTCCChr12195CN496913TGCCTTTGAGAATCGAAATGTGTTTGTCAATTTCTTGGAACTCChr12196CH03a08TTGGTTTGCTAGGAAAAGAAGGAAGTTTATCGGGCCTACACGChr13197CH03h03AAGAAATCGGATCCAAAACAACTCCCTCAAAGATTGCTCCTGChr13198CH05c04CCTTCGTTATCTTCCTTGCATTGAGCTTAAGAATAAGAGAAGGGGChr13199CH05f04GATGATGGTGCTCTCGGTTATTTTATGTTGGGTAATGTCTTCCGChr13200Hi03e04CTTCACACCGTTTGGACCTCGTTTCATATCCCACCACCACAGAAGChr13201Hi04a02TTCGTGGAAACCTAATTGCAGGTTTCCTCTGCTTCTTCATCTTTGCChr13202Hi04f09ACTGGGTGGCTTGATTTGAGGTTTCAACTCACACCCTCTACATGCChr13203Hi04g05CTGAAACAGGAAACCAATGCGTTTCGTAGAAGCATCGTTGCAGChr13204Hi08e06GCAATGGCGTTCTAGGATTCGTTTGGCTGCTTGGAGATGTGChr13附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-7序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置205Hi08f06CTTAGAGCATAGATGACCTGCAAGTTTAGAAATCCAACGGCCAAAGChr13206AU223486TGACTCCATGGTTTCAGACGAGCAATTCCTCCTCCTCCTCChr13207GD147TCCCGCCATTTCTCTGCGTTTAAACCGCTGCTGCTGAACChr13208NH009bCCGAGCACTACCATTGACGTCTGTTTACCGCTTCTChr13209CH01e01GGTTGGAGGGACCAATCATTCCCACTCTCTGTGCCAGATCChr14210CH01g05CATCAGTCTCTTGCACTGGAAAGACAGAGTAAGCTAGGGCTAGGGChr14211CH03a02TTGTGGACGTTCTGTGTTGGCAAGTTCAACAGCTCAAGATGAChr14212CH03d08CATCAGTCTCTTGCACTGGAAATAGGGCTAGGGAGAGATGATGAChr14213CH03g04ATGTCCAATGTAGACACGCAACTTGAAGATGGCCTAACCTTGTTChr14214CH04c07GGCCTTCCATGTCTCAGAAGCCTCATGCCCTCCACTAACAChr14215CH04f06GGCTCAGAGTACTTGCAGAGGATCCTTAAGCGCTCTCCACAChr14216CH05d03TACCTGAAAGAGGAAGCCCTTCATTCCTTCTCACATCCACTChr14217CH05e05TCCTAGCGATAGCTTGTGAGAGGAAACCACCAAACCGTTACAATChr14218CH05g11GCAAACCAACCTCTGGTGATAAACTGTTCCAACGACGCTAChr14219MS01a05GGAAGGAACATGCAGACTTGATGTTTCATCTTTACAChr14220Hi01c09AAAGGCGAGGGATAAGAAGCGTTTGCACATTTGAGCTGTCAAGCChr14221Hi02d11GCAATGTTGTGGGTGACAAGGTTTGCAGAATCAAAACCAAGCAAGChr14222Hi08c05TCATATAGCCGACCCCACTTAGGTTTCACACTCCAAGATTGCATACGChr14223Hi21e04TGGAAACCTGTTGTGGGATTTGCAGAGCGGATGTAAGTTGChr14224Hi23b12TGAGCGCAATGACGTTTTAGGTTTCAGGCTTTCCCTTCAGTGTCChr14225AJ000761aCTGGGTGGATGCTTTGACTTTCAATGACATTAATTCAACTTACAAAAChr14226AJ000761bCCCTAAACACACAGCCTCCTGTTTCAGCATCGCAGAGAACTGAGChr14227U78948GATCGTCCGCCACCTTAATAGGGTTTTCATCATGCACATTChr14228CH01d08CTCCGCCGCTATAACACTTCTACTCTGGAGGGTATGTCAAAGChr15229CH02c09TTATGTACCAACTTTGCTAACCTCAGAAGCAGCAGAGGAGGATGChr15230CH02d11AGCGTCCAGAGCAACAGCAACAAAAGCAGATCCGTTGCChr15231CH03b06GCATCCTTGAATGAGGTTCACTCCAATCACCAAATCAATGTCACChr15232CH03b10CCCTCCAAAATATCTCCTCCTCCGTTGTCCTGCTCATCATACTCChr15附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-8序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置233CH04g10CAAAGATGTGGTGTGAAGAGGAGGAGGCAAAAAGAGTGAACCTChr15234Hi01c06TTAGCCCGTATTTGGACCAGGTTTCACCTACACACACGCATGGChr15235Hi02d02TTCCTAGGCTACCCGAAATATGGTTTCTGGCATGGACATTCAACCChr15236Hi02f06TAAATACGAGTGCCTCGGTGGCAGTTGAAGCTGGGATTGChr15237Hi02g06AGATAGGTTTCACCGTCTCAGCGACCTCTTTGGTGCGTCTGChr15238Hi03a06TGGTGAGAGAAGGTGACAGGGTTTAAGGCCGGGATTATTAGTCGChr15239Hi03g06TGCCAATACTCCCTCATTTACCGTTTAAACAGAACTGCACCACATCCChr15240Hi04c05AGGATGCTCTGCCTGTCTTCGTTTCTCACTCGCCTGCTCTATCCChr15241Hi06f09AACCAAGGAACCCACATCAGGTTTCACTTACACACGCACACACGChr15242Hi09f01CACCACCAAATTCTCCATCTTCGTTTACCGCCAAATGCTTTGTTACChr15243Hi11a01ACCGCCAAATGCTTTGTTACGTTTCCTCCATTAAACTCCTCAGTGChr15244Hi15c07TCACTTCCCATCATCACTGCGTTTCAATGTCGAGGCTGGTAATGChr15245Z71981GCACTTACCTTTGTTGGGTCACCGGCATTCCAAATGTAACTChr15246CH02a03AGAAGTTTTCACGGGTGCCTGGAGACATGCAGAATGGAGChr16247CH02d10aTGATTTCCTTTTTCGCAAGGTTCATCGTTCCCTCTCAAACChr16248CH04f10GTAATGGAAATACAGTTTCACAATTAAATGCTTGGTGTGTTTTGCChr16249CH05a04GAAGCGAATTTTGCACGAATGCTTTTGTTTCATTGAATCCCCChr16250CH05c06ATTGGAACTCTCCGTATTGTGCATCAACAGTAGTGGTAGCCGGTChr16251CH05e04AAGGAGAAGACCGTGTGAAATCCATGGATAAGGCATAGTCAGGAChr16252Hi01a08AAGTCCAATCGCACTCACGCGTAGCTCTCTCCCGATACGChr16253Hi02b10TGTCTCAAGAACACAGCTATCACCGCCGTTTCTTGGAGGCAGTAGTGCAGChr16254Hi02h08AACGGCTTCTTGTCAACACCGTTTGGCTGGGAATATATGATCAGGTGChr16255Hi04e04GACCACGAAGCGCTGTTAAGGTTTCGGTAATTCCTTCCATCTTGChr16256Hi08d09ACTCATACCCATCGTATTGGTTTACTGCATCCCTTACCACCACChr16257Hi08f12GGTTTGTAACCCGTCTCTCGGTTTCGTAGCTCTCTCCCGATACGChr16258Hi12a02GCAAGTCGTAGGGTGAAGCTCGTTTAGTATGTTCCCTCGGTGACGChr16259Hi15a13TTCTCCCCTTCTAAACCAACCGGTTTCTTGGCGTAACATTGChr16260Hi15g11TGACATGCATAGGGTTACATGCGTTTGGGTTCGTAATCGTTCTTGTGChr16附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-9序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置261Hi22f06CAATGGCGTCTGTGTCACTCGTTTACGACGGGTAAGGTGATGTCChr16262AU301431TCTTCCTCCTCCTCCTCCTCTCTTTTTCTTGGGGTCTTGGChr16263NB102aTGTTATCACCTGAGCTACTGCCCTTCCTCTTTATTTGCCGTCTTChr16264CH01h01GAAAGACTTGCAGTGGGAGCGGAGTGGGTTTGAGAAGGTTAChr17265CH02g04TTTTACCTTTTTACGTACTTGAGCGGCTTGGAAAAGGTCACTTGCChr17266CH04c06GCTGCTGCTGCTTCTAGGTTGGCAAAACTCTGCAAGTCCChr17267CH05g03GCTTTGAATGGATACAGGAACCCCTGTCTCATGGCATTGTTGChr17268Hi02f12ACATGGCCGAAGACAATGACGTTTCAACCTTTATCCCTCCATCTTTCChr17269Hi03c05GAAGAGAGAGGCCATGATACGTTTAACTGAAACTTCAATCTAGGChr17270Hi05c06TGCGTGTATGGTTGGTTTTGTGTTTTCTTTGGTTTTAGTTGGTGChr17271Hi07h02CAAATTGGCAACTGGGTCTGGTTTAGGTGGAGGTGAAGGGATGChr17272AF527800TGGAAAGGGTTGATTGACCTAACAGCGGGTGGTAAATCTCChr17273AJ001681CCTGAGGTTATTGACCCAAAACACTCAGTTGGAAAACCCTACAChr17274AT000174CGGAGGCCGCTATAATTAGGCCTGGAAAGAAAGTAAAAGGACAChr17275AY187627GAGGACTGAATTGGTTGAGGTCGTTTCTCACCCGTATATAGGCCAACChr17276CH05a09TGATTTAGACGTCCACTTCACCTTGATTGGATCATGGTGACTAGGChr17277BGA35AGAGGGAGAAAGGCGATTGCTTCATCACCGTCTGCTChr17278BGT23bCACATTCAAAGATTAAGATACTCAGCCTTTTTTTCCCACChr17279KA5CAACAACAACAAAAAACAGTAAAGCCTTAGAAATAGAAACAACAChr17280KA14ATGGCAAGGGATATTATTAGTCATTGTAGCATTTTTATTTTTChr17281KA16GCCAGCGAACTCAAATCTAACGAGAACGACGAGCGChr17282KB16GATTTTGTCCGCAGGTAAAGAACAGCAAGAACCAChr17283KU10AGTATGTGACAACCCCGATGTTAGAGTCGGTTGGGAAATGATTGChr17284NB103aTTGTAGGGAAAATGATGCCAGTGTTGATACTCTCTCTCTCChr17285NB105aAAACAACCGACTGAGCAACATCAAAATCTTAGCCCAAAATCTCCChr17286NB106aGTACGTCGACATGAGAGAGTCTCTTGTTCCTTCCTGCACChr17287NB109aATGCTCTATAAAACCCACCTACCAGAGGGACCATTGTGTTATTGTATChr17288NB110aTGATGATGTGATTTGATGGAGTGCCATTCCATTGTACGGATTChr17附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-10序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置289NB111aCCAAGCTGTGATTATAGGAAGAGGCTGAAAGATTGTAAGGTChr17290NB113aATGAAATATGTCGTGTTGCCCTTAGCCCTTCCTCAGCATGTTTCCTAGACChr17291NH007bACCTTGATGGGAACTGAACAATAGTAGATTGCAATTACTCChr17292NH019bGAGATGGAGTAGTAAAGAAGAAGGACGACATAGTGAAAACAGAAGChr17293NH020aGGATCAGCCAAGAGGAGGTGCGAGATGCAGAGGACGACGChr17294NH021aATCTCAATTTTCTCGGTAACCACTGATATCTCTCTGCACTCCCTChr17295NH022aCATGAAGTGCGTAGAAGTTGGTGTCCCAATAATGATAAGTTCCCAAAGChr17296NH023aGATGCTAGAAGGAAGGAATGATGGCTTTTCAACCCCTTCACCTTCTCChr17297NH024bACCAAAAGTAGAGAGAGAGACCCAACCAGACTAAAAGAGAChr17298NH025aCTGGACACAAACATTCAAGAGGGCACACCAGAAACTCCAAAACAGGChr17299NH027aTAATGTGTTGGGGAGAGAGAGGCTCTTGTTCCTTGCTCCTAAChr17300NH030aGCAACAGATAGGAGCAAAGAGGCTCCAAAGTTCAAChr17附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-111.基因MDP0000686092编码的氨基酸序列MSDDKMAHDIEXQLDNLSGLSPERCIYRVPERLRQVNEKAYTPQVV XVGPLHHGNGPLKAMEEHKLRYLKHFLSKTKVKLSDCLQKIQEQXKELR GFYAEPIXFDKGEFVRIVSVDAAFVIDLLLRFEVVNYREDEDDYIFSKPTM KSDVIRDLQLLENQLPFFILQDLFKLIPPQLQLQLPSLLEISYNFFQSXIDSE VKXEKFNKISSSGVEVKHFVDLIRILYLPLEPKXKPKTTATPKTRDXPNVT ELHQAGAKFKVGKGSSLFDIKFSCGILKIXKLRVDDTTDLKLRNLLAFEQC HHRKEEEDXLANYVFLMKRLAKTREDVQLLVEKGIIENWLGDTQKISNLL HDLGTGMIVDDWYYAPHXEKLIEYRXVLCRGWMVILKQKYFNTPWSTIS VAAAVILLILTLIQTACSYKSVPLL*2.基因MDP0000205432编码的氨基酸序列MAIEGRFNWSRTSHSFSALCKNRKAATLSRRNLRRESPPQPCKKTGI KSVGLKPTWSFSLLASCCCWTIGRAMRGLEETTCRWRRGGRKMKRKDY EELDDDFFSPSSKSRRLDAGLFATLNEDQSSAAQVFDEKPAPETSVVMQT DDLPTDPLPSGDEXALVLYNPTNTRIFKAPDSQDFSVIVNSDLIPGLREDX GSDEENKEVSNRCMAVVPWVAPNFPPASRDETQAASQSESMEVEMMDT DDNGYNGAEASGFGGTMMEGPGGIQYWQQQQLRWMEPQLFQNNITPVT3.基因MDP0000120033编码的氨基酸序列KNNWRVELSHNSRGGGGGRGGGGRGRSGGSDLKCYECGEPGHFAR ECRLRGGGGGGGGGGRRRSRTPPRYRRSPSYGRRSYSPRGRSPRRRSLT PRGNSRSRSPPYRGREELPYANGMTFHLIHAMMQWSEGSPPKQELRSAY MATWRCFRRYTGIKCCLVCLDISTTMFKLGDALSLYCLSDLVKFLPFLTLA GFIYLCKIGVGIRILKVSSASSASLVLFFCTPLAPGIFVLHYCPALGSSILNGC RSQPARASILCFCTLPGISSLPCYWDLQFXIVVDPSLLSAELLFSLNFVGSN APPSNYYSXICLIEQWVTPRMFLFYRSWRFGSDNRFSDPTPIFLPLIFNWIQ KYRNKFGSKGNLDHTETLTPCFVVG4.基因MDP0000864010编码的氨基酸序列MESEGTPYAPKSILITGAAGFIGSHVTNRLIKNYPSYKIVALDKIDYCS SFKNLRPCRSSPNFKFVKGDIACADLINHLLIADEIDTIMHFAAQTHVDNSF GNSFEFTNNNVYGTHVLLEACKVTQRVKRFIHVSTDEVYGETDMETNIGN PEASQLLPTNPYSATKAGAEMLVMAYHRSYGLPTITTRSNNVYGPHQYP EKLIPKFSLLAMKGEKLPIHGNGSNVRSYLYCDDVAEAFDVILHKGVIGH VYNIGTKKERSVLNVAEDICKMIGLNSKEAITFVQDRPFNDQRYFLDDQK LKRLGWDVRTSWEEGLKLTTEWYTKHADWWGDVSAALHPHPSFAVISR PNDDSWFFEYGFTRLSRTCNEGSNSSELKFLIYGRTGWIGGLLGKLCKGEG IXFEYGKGRLEDRKSLLEDITRVQPTHVFNAAGVTGRPNVDWCEXHKAQ TIRTNVAGTLNLADVCKDQGLLMMNFATGCIFEYDKEHPLGSGIGFKEED NPNFTGSFYSKTKAMVEELLKEYDKVCTLRVRMPISSDLSNPRNFITKIAR XDKVVNIPNSMTVLDELLPISIEMARRNCRGIWNFTNPGVISHNEILEMYR DYIDPKLKWQNFDLEEQAKVIVAPRSNNELDASKLKKEFPELLSIKDSIIK YVFEPIKKT*5.基因MDP0000945764编码的氨基酸序列MDVLVGPTFSLDVSSYGPAPTQDNRNRGGLYLNQDRGAAVAEEASS DSSSSIGVPDDSEEEEDSKGDNGDEVQSKFNGGGGGGLGSLGSFGSLEDSL PIKRGLSNYFSGKSKSFASLSEVSSTVSSVKEVEKQDNPFNKRRRVLIASK WSRRSSSSSSLYNWPNPKSMPLLALAEDGDEDDDEHDRDREGEGENASS EQSSSDEKEDQERRRXPQKLLDRRLKSFKSKSCYCLSDLQEHDEQ*引物名称正向引物序列反向引物序列SNP4970R：TGGACAAACAGGAAGCACGF：CAGCGACAGTGGCGACAASNP4236R：GCTTATCATAAAAAGCAAGACCACF：ATCATATAATTGTGTAATTTAGTAGAACASNP4257R：GGAGTCATAAGCCACAACGAGF：TCAGCTTTGAAGCATCCAATTSNP4336R：AGTTCGTTCTTTTCCGTTGCTF：GCGGTCCTGATTCAGGTACAGSNP3955R：CCCTTAAAAGCCATGGAAGAGF：GTTCTGCATAAAAACCTCGCASNP4094R：GGGTTTTGTGAGGAGGAGGAGF：CGAAGATTGCGACGGGATAGSNP3969R：CTCGTTAGGCCAAGACAAGCF：TTCAAAGAGTAGGTAGGAAGGGT附表2 SNP、InDel引物设计引物名称正向引物序列反向引物序列SNP4137R：GCACGAGTATGATGTTGCTAATGF：CCATCTTATGTCCCCAATTTGTAGSNP42992R：GGTTATACATAGAGGCACTTAGAGCF：GCACAAAACTTAGATCAAAGATGAGSNP42994R：TCAACTCATGTGCAGGAATTGGF：GCTGTGACATAAACCAGGTGAGASNP4376R：GTTTGCTGAGAAATTGATTGGAF：CCATTTCTCCTGGGGCATAGSNP4390R：AGGGCTTGGCTCACAATACTCF：TCAGGTCACAGTTGTTTTGGCSNP4432R：CGAGGAGCAAACGATAGTCAGF：ATTGGTCTCCGAATTAGAAGTCCSNP4782R：GGAGAGCGATTTATTCTACCCTACF：AGACGAAGAAAGCAACGAAAGASNP4842R：GGTCAAAATTGTCCTAGCCTATTTCF：TCCCTCATTTCCTCTTTTTACCTACSNP4878R：GAAGCAGCAGTGCAGGATGAGF：CCATAGCCCTTTGCTCTATTTGTSNP4903R：CTAGGCAAATTTAGGTAAATTTCTTAF：GACAGGTTATCAGTTTATAGCATCAAGSNP4960R：TGAGGCTATCACATTTCCAACGF：GGTTAGATGCAGCCCGATTTindel4199R：ATTGTGAAACCTTGATTGGGF：GAGATTATCCTTATTTTGTGGGindel4209R：ATGGAACGTAAGAACAAGGAF：TTGCTGAGAAGAGTACAAGTGindel4225R：AGGCGCGGTGTTGTCTAAF：CCTCAGGTGCAATAATCATCAindel4227R：AGCGTTGCTATGCTTCTAATGF：AAGATGGAAATGGTATGTGATindel4229R：AACAGAAACATTCGAGGCGTAF：TCCTTGAACTTCGTCGGTAGCindel4235R：GTGTGAAAGCTCAACTCTCCF：CAGCCTTCTCATCGGGTAGindel4246R：GGTAGCACATGCATACTGACAF：CGTTTTGGTAACTAAATCTCCindel4247R：ATGAATGTTTCGCCGAGCF：GTTCAACCATTTTATTGGATTTTindel4254R：ATAAAGTCACTTCTAGCACAAATAF：CGAAAAACGCTTTACTTAGGindel4268R：TCCACAGAAAACAACTAAAAAF：GTTTGCCAATGGGAATGindel42686R：GGCATGAATAGTTTCCACAGAF：TTTGCCAATGGGAATGTTTindel4273R：GAATGTAAGCCATGCCCTCTF：TTCCTACCATTTGTTGCCTCindel4273aR：AATGAAGAGGCAACAAATGGF：TTTTTTATCAAATCCAAATGTGindel4273bR：GTGGTTAAAGGGATTATGTCTF：TGCGAATAGGATTGAGGTindel4274R：TTGAGGGAATGAAATATGCTAF：TTGTTTATCGAATTGGGTTTindel4305R：GTAAACTCATTAAATTATGCTTGF：TGCTTTACTCCGATTCTTCindel4305aR：GTTACTTGGGCTTCCAGACAF：CCCCCAGAGAAATAGAGAGTTindel4307R：AGAAATCCGATCCTTACCACF：TGTTATCCCGTGGGTCTTindel4311R：AAACTGATAAACTTGGAGATTGF：GACGCCTACCGAACTACAindel4334R：ATACTATGAGGTGAAGGATTTAAF：GTATCTTCTACATTATCTTTCGTGindel4336R：CTCGTCGTCTATCGGTGTTF：GGGGTTTACTTGATTGGGA附表2 SNP、InDel引物设计（续）-1引物名称正向引物序列反向引物序列indel4341R：AGTCGGAAAATTCATTCATATF：GAGCTTACAGTTTTTGGTTTTindel4346R：GTTCACGGGATTAAGTCATGF：CAACGGCAAAAAATTATTATAindel4348R：GCTTATGCTCAGGGTCGTF：TTTTGATTTAAGTTATTATTTTCCAindel4349R：CAATCCATTTCAATTTTTCTGF：TTATTTTACCCCTACCCCATindel4362R：TTGAGGTTCGTTTTGGTATF：TTCAATTTTATCTCTTGGTCCindel4362aR：ACAAGTTAACAGATTTTCAAAGTF：GCTTGTAATTTGTTTTTTATGAAindel4371R：TTATTGTGTTTCTGTGCGTACF：CCAAATTATCGTTCACTGCTndel4372R：TTTGAAAACACCCTTGAATGF：TGGTTCCTGAGTGGGTAAAGindel4374R：TCAGTGACTTCGGCGTATTF：AGTTCAATCAATCTCCCAAA附表2 SNP、InDel引物设计（续）-2

早钟6号、长崎早生、森尾早生等。大五星、软条白沙、安徽大红袍、龙泉1号、龙泉6号、洛阳青、解放钟、大钟、太城4号、茂木、长红3号。枇杷喜温暖气候，要求年平均气温15～17℃,且无严寒，1月平均温度5℃,冬季最低温度不低于-5℃,少部分品种在年均温12℃以上即可正常生长；喜空气湿润，雨量充沛，要求年降水量在1000mm以上，夏末秋初干燥少雨天气有利花芽分化；光照充足有利于枇杷的花芽分化和果实发育；枇杷对土壤选择不严，一般沙质或砾质壤土、沙质或砾质黏土都能栽培；土壤pH值为5.0～8.5均可正常生长结果，最适宜pH值为6.0左右。育苗一般采用嫁接育苗。砧木可选择普通枇杷、石楠。砧木粗度达1cm左右时即可嫁接。常在春季2—4月进行；一般采用枝切接或枝腹接和剪顶留叶切接法。福建省农业科学院果树研究所试验推广的芽接育苗技术，效果很好。应选在土层深厚、土质疏松，坡度在30°以下的坡地。平地建园以选择在地势高，地下水位低，排水良好，土层深而疏松的沙质土壤上种植为好。坡地整地采用等高定点开坑或按等高线开垦成简易梯田后定点挖坑。种植前1～2个月要挖好种植坑，种植坑的规格为长1m、宽1m、深0.8m为好，先放进杂草、绿肥，并撒上石灰与表土拌匀，再放入农家肥与松细土拌匀回至高出地面30cm高。平地要把地下水位放在突出位置，多采用深沟高畦，开浅穴定植。枇杷定植可分为春植、冬植和秋植；在华南地区通常自12月至翌年2月进行冬植。在其他地区，春植在2—3月进行，秋植在9—10月进行。一般采用的种植株行距为:行距4～6m、株距3～4m。种植株数平地为每667m2 20～35株，山地为每667m2 35～40株；也可进行矮化密植。栽植苗木应选择品种纯正、粗壮、直立的嫁接苗，以营养杯苗或者带土团的苗木为好。栽苗时在种植坑中心挖一个小坑，把苗放入坑中，种下回土以不盖嫁接节位为宜，使根系均匀分布在坑底，同时，进行前后、左右对正，校准位置，使根系舒展。再将肥土分层填入坑中，每填一层都要用脚踏实，并随时将苗木稍稍上下提动，使根系与土壤密接，宜至定植穴上的土墩高出地面20～30cm。若栽前未剪成半叶的，应于栽后剪去叶片的一半。淋透定根水，并用杂草覆盖整个树盘保湿。施肥量以20～30kg/株的产量计算。(1)采果肥和基肥。5—6月采果后7～10d施厩肥30～40kg/株，麸肥2kg/株，磷肥2kg/株，钾肥1kg/株。(2)花前肥。8—9月施复合肥、麸肥各0.5～0.8kg/株。(3)壮果肥。2月上旬施复合肥、钾肥各0.6～1.0kg/株，麸肥1.0～1.5kg/株。枇杷采果后修剪的操作：疏剪过密枝、病虫害枝、枯枝、细弱的结果母枝，对远离主枝的结果母枝留基部10～15cm回缩更新，为避免结果部位外移，对抽发过长的春梢和强壮的结果母枝留基部5～6张叶片短截，促使腋芽萌发夏梢成为结果母枝，成枝力强的品种为培养健壮结果母枝，萌芽后要及时疏芽，留1～2个芽即可，结合疏花疏除结果母枝上抽发的部分秋梢和冬梢，每一结果母枝中只选留斜生、向外生长的新梢2个作翌年的结果基枝。基枝延伸以中心枝以下的第一侧枝作延长枝为主。(1)疏穗疏蕾。枇杷一般在10月中下旬至11月上旬进行疏花穗，疏花穗的时间在以部分花蕾露白而未开放时为宜；7～10年生植株全树留花穗80～100穗，对留下的花穗再疏部分花蕾；可摘除花穗上半部和基部支穗；每花穗保留中部相对集中的3～4个支穗；再把留下的支穗末端的花蕾摘除，只保留支穗基部的花蕾。(2)疏果。枇杷疏果一般在2月中下旬进行，大果品种每果穗保留端正果形、大小一致的果实3～4个；中果品种每果穗留果4～5个；小果品种每果穗留果6～9个。果实套袋的时期一般在最后一次疏果完毕，病虫害发生之前进行。套袋用的果袋，一般用旧报纸或牛皮纸制作。袋的形状大小依果的大小而定，一般为长方形，大小为20cm×13cm的，一张报纸可做8个；大小为30cm×20cm的，一张报纸可做4个，袋顶两角剪开，以利通气观察。不同熟期的果实，在套的袋上要有不同标志以便成熟时分期分批采收。套袋时宜从树顶开始，先把果穗基部3～4张叶片整理好束在果实上面，然后用纸直接包裹或制作成纸袋，把纸的长边对折成30cm×20cm，用订书机钉封住短边的一边即可，把果连叶包好。袋子口向下，用订书钉封口，纸袋要鼓起，避免套袋时果实与纸袋直接接触。

三月红、白蜡、冰糖荔、水东黑叶等。禾荔、黑叶、钦州红荔、糯米荔大造等。灵山香荔、桂味、糯米糍等。荔枝栽培适宜在年平均温度18～20℃的地区，1月平均温度10～17℃,绝对温度-2℃以上为宜。年雨量在1200mm以上，花期、小果期少雨。荔枝生长旺盛期和采果前，应无风害。对山地红壤、黄壤、平地沙壤、黏土、冲积土适应性较强。一般采用空中压条和嫁接。嫁接一般选用当地酸荔枝作糯米糍、妃子笑、大红袍的砧木。在4—5月进行嫁接。嫁接速度是影响嫁接成活的主要因素。一般选择土层深厚、疏松肥沃的山坳谷地及山地建园。一般选择春植(2—5月)和秋植(9—10月)。以选择在春季进行为佳，因为此时气温逐渐回升，雨水充足，日照又不太强，有利于苗木发根萌芽，成活率较高。其次是秋植，此时雨水少，气候干燥，必须注意淋水。定植规格可依据园地环境条件、栽培管理水平确定，一般株行距(4～5)m×(5～6)m；每667m2栽22～55株；配置授粉树。在定植前2个月左右挖好深宽各0.8～1m的定植穴，穴底填入绿肥或草皮20kg、厩肥30kg、过磷酸钙1kg及石灰0.5kg混合堆沤，使之在定植前腐解沉实。(1)保持土壤湿润，在定植1个月内，晴旱天气要经常淋水，一般3～7d淋一次。雨多时要注意排除树盘积水，特别要注意因穴土下沉而造成的植穴内积水。(2)在风大的地方宜用竹子或树枝支撑果苗，以防风吹摇动伤根而影响成活。(3)植后30d，可检查植株成活情况，未成活的及时补种。(1)中耕除草。每年中耕除草2～3次。第一次在采果前或采果后结合施肥进行，可促发新梢、加速树势恢复，宜浅耕10～15cm。第二次在秋梢老熟后进行，深可15～20cm，以切断部分吸收根、减少根群吸水能力、利于抑制冬梢萌发。第三次在开花前约1个月进行，宜浅，深约10cm。可疏松土层、促进根系的生长和吸收。(2)培土客土。在秋、冬季结合清园进行。于树冠下土面培泥，厚6～10cm。切忌堆积过厚，以防生根和土层积水缺氧伤根。(3)深翻改土。于树冠外围土层挖沟，深0～70cm，分层压入杂草、绿肥、垃圾，以改善土壤理化性状，促进根群生长。水分是荔枝生长发育过程中必不可少的，在抽梢的时候，施肥往往要结合灌溉，以促进根系的吸收，但在控梢的季节，不仅要控制水分的供应，而且还要通过翻土来达到控制水的目的，因为控制水分的供应，可以使枝梢生长缓慢或停止，以利于花芽分化。在1—2月，花芽形态分化期，若遇干旱，要灌水促花芽抽出。(1)修剪。采果时要一果两剪，先把果穗连同结果枝基部、甚至结果母枝下面的枝梢基部一起剪下，然后才剪下果穗。果穗下面的枝梢回缩多长，取决于结果母枝枝梢生长的好坏，生长好的回缩短些，生长差的回缩长些。采果施肥后立即进行修剪，剪去病虫枝、阴蔽枝、交叉枝、重叠枝、回缩衰退枝。修剪后，荔枝留枝梢20～25条为宜。(2)清园。修剪后在树冠滴水线下挖两个长1m，深、宽各30～40cm的坑，把修剪下来的枝叶和园内杂草埋入坑底，然后撒石灰0.5kg，上层用猪粪5～10kg、生物有机肥3～5kg、钙镁磷肥0.5～1kg拌表土将坑填至高出地面10～15cm，最后在地面撒石灰粉消毒。(3)杀虫。全园全面喷一次农药防治病虫害。可用10%吡虫啉3000倍液加64%杀毒矾600倍液等。(4)衰弱树更新。视衰退程度进行回缩修剪。衰退程度轻的剪除衰弱枝，平施肥料；衰退程度重的要回缩到较大的侧枝甚至主枝，同时进行根系更新，重施有机肥。(1)采果前肥。在采果前7～10d施下，作用是采果后加快恢复树势、促发秋梢、培养健壮结果母枝、奠定翌年丰产基础，此期以氮为主，磷、钾配合，氮施用量占全年施肥量45%～55%,磷、钾占30%～40%。应重视有机肥的使用，在秋季采果后和末春初施入。荔枝以土壤施肥为主，并根据各物候期的实际需要，辅以叶面喷肥。如用0.3%～0.4%尿素，0.3%～0.4%磷酸二氢钾，0.03%～0.05%复合型核苷酸，0.05%～0.1%硼酸，0.02%～0.05%硼砂，0.3%～0.5%硫酸镁。(2)适时放梢。健壮的秋梢是荔枝龙眼优良的结果母枝。通过科学的肥水管理，合理留果，修剪疏芽等综合措施，培养健壮的结果母枝。严格掌握放梢时间，使结果母枝能适时抽出，适时老熟，正常进入花芽分化。要根据不同品种、树龄、树势、挂果量、管理水平和气候特点，灵活安排采后留梢时间及次数。一般适龄树留梢二次，以秋梢作结果母枝；壮龄树留一次秋梢。在广西壮族自治区较适宜的荔枝结果母枝抽生时间是：早熟品种黑叶、香荔、糯米荔、桂味在9月中下旬；妃子笑和迟熟品种禾荔在9月下旬至10月上旬。常用的控梢促花技术除上述培养适时健壮的秋梢外还可采取断根、环割、环剥、摘除冬梢、喷施生长抑制剂等方法。(1)断根。在末次梢充分老熟后，结合施基肥，在树冠滴水线外挖浅沟压绿或施入有机肥，如果树势较旺，估计可能抽出冬梢的，可在整个树盘翻土锄断细根。(2)环割。多用于青壮年树，一般在11—12月进行，最好在直径6～10cm的大枝上环割，不要割树干，同时要注意掌握环割的深度，以刚达到木质部为准。(3)螺旋形环剥。对壮旺幼年结果树，可以使用螺旋形环剥。在末次梢老熟时可使用剥口宽0.2～0.3cm的环剥刀环剥1～1.5圈，深度以刚达到木质部为准，环剥部位从离地面25cm以上8～10cm粗的主干、主枝或分枝。(4)使用化学调控技术。使用化学药剂进行控梢促花，目前生产上采用的“荔枝专用促花剂”和“花果灵”等荔枝生长调节剂，经过多年多地区大面积使用，对提高荔枝花的质量，缩短花穗，提高雌花雄花的比例，提高坐果率和产量，均取得较显著效果。(1)施壮花肥。壮花肥一般在花穗抽出见到花蕾时施用(又称见花施肥)。施肥量视成花量及树势而定，一般每结果50kg的树面，施复合肥1kg加尿素0.2～0.5kg，或施尿素、过磷酸钙、氯化钾各0.5kg。另外，在开花前20d左右叶面喷施0.3%的磷酸二氢钾，或绿旺1号(高钾)1000倍液加0.05%的硼砂，可促进花穗发育。(2)合理控穗。生产实践表明，一般抽生早的花穗以及过长的花穗花质差，雌花比例低，坐果率低，特别是花穗大的品种(如妃子笑)，要合理调节和控制花量，以提高坐果率。1）人工短截花穗。短截花穗可减少花量，提高花质。花穗短截的轻重要视品种而定，对花穗再生能力强、易抽二次花穗的品种如妃子笑、三月红可重些。2）用于控穗的药物有荔枝丰产素、乙烯利等控制花穗。(3)防治病虫害。为害荔枝花穗的主要病虫害有荔枝椿象、荔枝瘿螨、尺蠖、蚜虫及荔枝霜疫霉病。可用克螨特、吡虫啉、灭百可、蚜力克和瑞毒霉锰锌、杀毒矾、大生M-45、甲霜灵等药物防治。(1)放蜂授粉。一般要求每3～5亩放一箱蜂。(2)人工辅助授粉。常用的人工辅助授粉的方法是：用湿毛巾在刚开放的雄花花穗上来回轻轻摇动，收集花粉，然后将毛巾置于清水中，反复多次，使花粉悬浮液呈淡黄色的混浊液，即喷洒到雌花上。人工授粉注意事项：一是应选择气温在16℃以上的晴天进行；二是配制的花粉液放置时间不能超过20min，否则花粉失去活力，影响授粉效果。(1)施壮果肥。花谢花后10～15d施壮果肥，作用是及时补充开花时的消耗、保证果实生长发育所需养分、减少第二次生理落果、促进果实增大、并避免树体养分的过度消耗、为秋梢萌发打下良好基础，此次以钾为主，氮磷配合，钾占全年施肥量40%～50%,氮、磷占30%～40%。要注意根外追肥。(2)环割。对生长壮旺的树进行，雌花谢花后10～15d开始割，在4～6cm粗的大枝上进行，割一圈，深至木质部。弱树不割。(3)应用植物生长调节剂。在果实绿豆大时用20mg/L赤霉素保果。(4)加强水分管理。干旱时要灌水，高温、日照强时，要对树冠喷水，雨多积水时要及时排水。(5)及时防治病虫害。荔枝果实发育期主要病害有荔枝霜疫霉病、荔枝煤烟病、荔枝炭疽病，主要虫害有荔枝蒂蛀虫、荔枝椿象、荔枝小灰蝶等。

柑橘是世界第一大果树。全世界柑橘年产量有1亿多吨，种植面积高达667万hm2。中国是柑橘最重要的原产中心之一，有着悠久的种植历史。在所有的水果中，其鲜食、加工性能均好，基本上可以做到没有废料。柑橘性喜微酸、湿润环境，最适宜的生长温度为29℃,最适合生长的湿度75%左右；平均生长寿命50年左右。柑橘树形比较矮小，树冠直立或呈自然圆头形或半圆头形。成枝力中等，枝条的顶端优势不强，分枝间势力均衡，常无明显主干，树形比较优美。柑橘的花芽为混合芽，可在生长健壮的各类梢的先端依次形成。如新梢多次生长，则花芽发生的部位随之上移。结果枝有带叶果枝和无叶果枝两种。柑橘的花为雌雄同花，多单生或丛生，为完全花，能自花授粉结实。抗性强、易栽、易管、丰产、品质优良和耐储运等是现代柑橘优良品种的主要特征。砂糖橘、本地早、温州蜜柑、梭柑、蕉柑、南丰蜜橘等。新会橙、柳橙、雪柑、伏令夏橙、血橙、香水橙、脐橙、冰糖橙等。沙田柚、琯溪蜜柚、文旦柚、葡萄柚类等。金弹、四季橘等。选择土壤肥沃、质地疏松、土层深厚、保水排水性好，心土松软的红壤、沙壤土建园。坡向以南向、东南或马蹄形山窝建园为好，西向北向要注意营造防护林。坡度选择5°～15°建园为佳。橘园附近必须有水源。现代柑橘建园技术推广宽行密株和宽行稀株两种模式。在方便管理的同时能大幅度提高柑橘品质，增加柑橘生产效益。宽行密株行距5～6m,株距2～3m,每667m2植38～67株。山地宜密，平地宜稀。一般柑橘苗春、秋两季都可定植，以春季定植为佳，一般在3月上旬橘芽萌发前定植为宜。容器苗全年均可定植，其最佳定植时间是春梢发生结束后。挖大穴，施足基肥。通常要求挖深0.8m，宽1m的定植穴，把心土和表土分开放，每穴施入腐熟有机肥30～50kg，石灰1.5～2.0kg,腐熟菜饼1kg,钙镁磷1.5～2kg，与表土充分混匀填入穴内，肥土要踏紧。定植时苗木置入定植穴后，再用小刀划开并取出营养袋，扶正苗木，填土踏实即可。(1)深翻。每年要进行一次深翻，对柑橘园20～40cm土层进行翻动，近树颈处浅些，树冠外深些，结合增施有机肥，以改良和活化土壤。萌芽期、花期尽量不要深翻。(2)培土覆盖。夏秋高温干旱，在树冠下每株培土高5～10cm防旱，冬季采果后，进行培土高30cm防寒。(3)中耕松土。成年橘园春节杂草容易滋生，雨后土壤板结，结合除草疏松表土，夏季中耕切断毛细管，减少水分蒸发。(1)早施基肥。早熟品种在10月中、下旬，中熟品种宜在11月中旬或采果后，每株施腐熟有机肥20～30kg,磷肥3～5kg，石灰1～1.5kg，复合肥1～2kg,施肥量占全年35%～40%,结果多，大树多施，小树少施。(2)巧施追肥。①春芽肥。一般在2月下旬至3月上旬春梢萌动期进行。以施用高比例的氮、磷复合肥为宜，配合施用腐熟的有机肥。株施尿素0.5～1.0kg，人粪尿20～30kg,复合肥2kg。施肥量占全年施肥的20%。②稳果肥。施肥量占全年10%，5月上中旬一般株施复合肥1kg,开花结果多的多施，结果少的不宜施。③壮果促梢肥。7月下旬至8月上旬株施腐熟饼肥1.5～2kg,人粪尿20～30kg,硫酸钾1～2kg，施肥量占全年的25%～30%。(3)施肥方法。①条状沟施肥。山地果园通常采用条状沟施肥方式，即在树冠滴水线处，开深20～30cm,宽30cm的条沟，沟长根据树冠而定。下次施肥在树冠的另外两侧开沟，施肥后盖土。②放射沟施肥。在树冠距树干1～1.5m处，按树冠大小，向外开放射状沟4～6条，沟深20cm，沟宽30cm，靠近树干处开浅些，逐步向外沿开深些，施肥后盖土。这方法适用于较窄的梯台。在谢花2/3时喷20mg/kg赤霉素或5406细胞分裂素800倍液+0.2%硼砂和0.2%磷酸二氢钾一次；5月上旬和6月中下旬各喷一次30mg/kg水溶性防落素或800倍液5406细胞分裂素+0.2%磷酸二氢钾和0.3%尿素，提高坐果率。供贮藏用的橘果采收时间一般应在九成熟，果面有2/3转黄时采收。短期贮藏或直接上市果实宜在果实全面着色，果实可溶性固形物和含量达到该品种应有的标准时采收。以晴天采收为佳。采收前15d内，应停止灌水、喷药。应该准备好采收工具，橘剪、橘梯、橘篓和橘筐。橘剪必须圆头平口，刀口锋利。特别需要提醒的是，采收人员采收果实时，不宜留指甲，应戴手套，以免采收时在果面上留下伤害。采收柑橘时，应遵照自下而上、由外及内顺序采摘。采果应将不同成熟度的果实分批采收，分批储藏和加工，保证果实品质的一致性。严格采用“一果两剪”法，即第一剪在离果蒂1～2cm处，第二剪把果柄剪至与果肩相平。千万不要从果树上一下把果肩剪平，把果蒂留在植株上，以免消耗更多的养分。采收时尽量不拉枝拉果，注意轻拿轻放。