近年来，随着城郊型农业的发展，天津市蔬菜尤其是保护地蔬菜得到很大发展，目前保护地蔬菜播种面积已超过2.5万hm2，其中又以黄瓜的栽培最为普遍，已占到保护地栽培面积的80%左右。由于保护地环境复杂多变，使得保护地黄瓜新病害不断发生，成为黄瓜生产的重要障碍，严重影响黄瓜的产量和质量，保护地黄瓜新病害的发生不仅给病害的识别和诊断带来困难，也给我们的防治策略提出新的挑战。该病害主要为害叶片，多从下部叶片向上部叶片发展。最初在叶背形成淡褐色病斑，病斑直径约为3～20mm左右，其中以8～15mm中型斑居多，病斑黄褐色，病斑中部灰白色。多数病斑的扩展受叶脉限制，呈不规则形或多角形，湿度大时病斑正、反两面均可产生稀疏灰褐色霉状物，为病菌的分生孢子梗和分生孢子，发病严重时，病斑连片，甚至引起整株枯死。发病症状易与霜霉病或炭疽病混淆。该病原菌为瓜棒孢菌[Corynespora cassiicola（Berk.&Curt.）Wei.]，属半知菌亚门真菌。湿度是诱发黄瓜褐斑病的主要因素，相对湿度达90%左右，10～35℃温度范围适宜该病侵入并引起发病。植株徒长、通风不良，或多年连作，均有利于发病。发病初期可喷施75%百菌清可湿性粉剂500倍液、50%福美双可湿性粉剂500倍液、25%咪鲜胺乳油800倍液或70%代森锰锌可湿性粉剂500倍液。多发生在大棚黄瓜生育中、后期。主要为害叶片，由下部向上部叶片发展，在叶片上产生2～50mm圆形、椭圆形或者不规则形状的浅黄褐色病斑，病健交界明显，病斑部常出现浅橙色霉状物，后期病斑处变薄容易破裂。严重时，可造成叶片大量枯死，引起化瓜。该病病原为Trichotchecium roseum（Bull.）Link，称粉红聚端孢菌，属半知菌亚门真菌。在25～30℃，湿度85%条件下，有利于发病，通风不良、光照不足时，有利于该病发生。病菌以菌丝体随病残体在土壤中越冬，翌春条件适宜时产生分生孢子，传播到黄瓜叶片上，由伤口侵入。发病后，病部又产生大量分生孢子，借风雨或灌溉水传播蔓延，进行再侵染。植株徒长、生长衰弱等原因易造成该病发生。可用64%恶霜·锰锌WP 500～600倍液或80%福·福锌WP 800倍液或25%三唑酮WP 1000～1500倍液或10%苯醚甲环唑水分散颗粒剂1000～1500倍液喷雾防治，发病初期熏百菌清烟雾剂，或喷10%百菌清粉尘剂，每1000平方米1.5kg，5～7天喷1次，连续3次，注意轮换用药。主要为害黄瓜茎蔓，也为害叶片和果实等部位。茎被害时，靠近节部呈现油渍状病斑，椭圆形或棱形，灰白色、干燥时病部干缩纵裂，表面散生大量小黑点。潮湿时病斑扩展较快，植株萎蔫枯死，病部腐烂。叶子上的病斑近圆形，有时呈“V”字形或半圆形，病斑上有许多小黑点。果实多在幼瓜期花器感染，果肉淡褐色软化，呈心腐症。该病病原为Mycosphaerella melonis（Pass.）Chiu et Walker甜瓜球腔菌，属子囊菌亚门真菌。病菌随残体在土壤中或附着在种子上越冬，成为来年的初侵染源，病菌可随风雨和灌溉水传播。病菌通过气孔、水孔或伤口侵入。土壤水分多，田间相对湿度大，都容易引起发病。瓜类重茬地，种植过密，田间通风透气不良，或肥料不足，长势衰弱都会加重病害的发生。发病初期喷洒40%百菌清悬浮剂600～800倍液；70%甲基硫菌灵可湿性粉剂800～1000倍液、50%多菌灵可湿性粉剂500倍液、40%福星乳剂5000～6000倍液、50%扑海因800～1000倍液。此外，还可以用上述药剂的50～100倍液涂黄瓜茎上的病斑。每隔4～5天喷一次，连续2～3次。黄瓜的茎、叶和果实均可染病。嫩茎染病，初现水浸状暗绿色梭型病斑，凹陷龟裂，湿度大时病斑上长出灰黑色霉层，即病菌的分生孢子梗和分生孢子；叶片染病，初为污绿色近圆形斑点，易穿孔；叶柄、瓜蔓染病，病部中心凹陷，形成疮痂状病斑，表面形成灰黑色霉层；瓜条染病，初发病时有流胶产生，后逐渐形成暗绿色凹陷斑，表面产生灰黑色霉层，形成疮痂状，病斑停止生长，形成畸形瓜。该病病原为Cladosporium cucumerinum Ell.et Arthum 称瓜疮痂枝孢霉，属半知菌亚门真菌。病菌主要以菌丝体随病残体在土壤中越冬，成为翌春初侵染源。病原菌可随种子进行远距离传播。病菌主要从叶片、果实、茎蔓的表皮直接侵入，低温高湿是该病害流行的重要条件。50%多菌灵可湿性粉剂500倍液浸种，或用0.3%的50%多菌灵可湿性粉剂拌种。发病初期喷施50%多菌灵可湿性粉剂800倍液；75%百菌清可湿性粉剂600倍液；12%腈菌唑EC 3000倍液。

水稻条纹叶枯病（Rice stripe virus，RSV）是一种以介体昆虫灰飞虱传播的病毒病。该病在我国最早发生于1964年。近年来由于耕作制度、气候条件、水稻品种等的变化，导致该病再次大范围流行，给水稻生产造成很大的损失。浙江省自2004年在湖州的部分晚粳稻上严重发生以来，其他地区相继发病，病情发展很快。浙江嘉兴市自2002年开始水稻条纹叶枯病零星发生，发病面积不断扩大，2004年发病面积0.33万hm2，2005年70%的乡镇发病，全市合计发病面积达1.26万hm2，占水稻种植面积的10%左右，2006年发病面积继续扩大，全市每个乡镇均有发病，发病面积达1.49万hm2，对水稻造成较大损失。目前水稻条纹叶枯病已成为浙江北部稻区影响水稻高产的主要病害之一。为此，我们从2005年起对水稻条纹叶枯病发病与产量损失的关系开展了研究，现将结果报道如下。选用目前浙江湖州、嘉兴等地种植面积较大的晚粳品种嘉991为供试品种，种子由嘉兴市农业科学院提供，试验在嘉兴市农业科学院试验田中进行。1.2.1 试验小区设置 选定3块播栽期一致、生长均匀的田块作为试验区，其中2块田作为单丛发病率测产，分别标记为A、B区；另1块田作为小区发病率测产，标记为C区。1.2.2 发病率调查 从水稻插秧后开始定期调查试验区的田间条纹叶枯病自然发病情况，直至病情稳定。病情稳定后在田间选定发病的单丛植株和小区。定点单丛试验区每个田块分别选500丛发病植株作为供试样本。调查每丛样本的病株数与总株数，计算其株发病率，对株发病率相同的样本，各测定指标计算平均值。然后比较不同株发病率下各个指标的变化趋势。并在选取发病样本的同时，每块田中分别选取20丛未发病的健康植株作为各自对照。小区发病率测产区在选定的田块上根据田间发病情况随机选取面积2～4m2的小区15个。其中13个为发病小区。统计每个发病小区内的病株数和总株数，计算每个小区发病株率；选定2个没有发病植株的小区作为对照区。1.2.3 水稻产量和经济性状考查 水稻成熟后，将选定的定点单丛和各小区样本分别收获，在实验室进行产量、秕谷率和千粒重等指标测定，定点单丛样本还进行有效穗数统计。小区样本产量统一折合成每平方米的产量，分析发病率与产量之间的关系。实验室测产结果：与对照相比，各发病样本有效穗数明显减少，且随着发病率的升高，穗数减少的比例也呈上升趋势，产量与有效穗数表现出相同的变化趋势。A、B两区的试验结果表明，单丛植株的株病率与减产率相当。其中A区的平均病株率与产量损失率之比为1：1.13，B区发病率与减产率比值为1：0.95，2区平均比值为1：1.04，株发病率与减产率接近1：1。病株率（%）有效穗数减穗率（%）产量（g）减产率（%）0.0010.20.0031.470.008.33101.9629.107.5312.50821.5731.300.5420.00460.7819.9036.7722.22641.1820.0036.4527.27911.7628.708.8028.575.546.0819.9036.7733.33641.1819.3338.5737.504.555.8811.7062.82表1 A区定点单丛条纹叶枯病发病率与水稻产量损失关系分析病株率（%）有效穗数减穗率（%）产量（g）减产率（%）38.46731.3729.107.5340.00641.1820.8033.9141.67641.1817.8043.4442.86460.7817.0045.9844.444.555.8813.6056.7850.00370.599.4569.9757.14370.5911.6063.1483.33190.201.9093.96续表1图1 A区发病率与有效穗数的关系图2 A区有效穗数和产量损失的关系在A区，全部发病样本的平均穗数为5.4个，对照有效穗数为10.2个。与对照相比，病丛有效穗数平均减少4.8个，减少率为47.30%。该区全部发病样本平均病株率为36.73%，产量损失率为41.64%。水稻条纹叶枯病发病率与减产率关系分析表明，平均株发病率每上升1%，产量损失就会增加1.13%。图3 A区发病率与产量损失的关系通过对水稻株发病率、减产率和有效穗数减少率之间的相关性分析，建立发病率（x）与有效穗数减少率（y）的回归方程为：y=1.0618x+6.9534，r=0.8446**；有效穗数减少率（x）与减产率（y）的回归方程为：y=1.0326x-7.8186，r=0.9322**；发病率（x）与减产率（y）的回归方程为y=1.1699x-3.1764，r=0.8400**。相关回归分析表明，有效穗数的减少与产量损失之间的关系最显著，呈正相关，相关系数r=0.9322**，说明引起产量损失的直接原因是有效穗数的减少。病株率（%）有效穗数减穗率（%）产量（g）减产率（%）0.009023.920.008.33811.1120.5014.3011.11722.2221.1011.7914.299023.302.5920.00455.569.0062.3722.227.516.6723.053.6425.00633.3316.6030.6027.279022.207.1928.57544.4416.2032.2733.33811.1123.352.3837.50544.4412.6047.3242.865.538.8920.4014.7250.003.561.118.8063.2155.56455.5613.3044.4057.14544.449.3061.1266.67366.678.9062.7971.43366.677.3069.4975.00277.784.3082.02100.0001000.00100.00表2 B区定点单丛条纹叶枯病发病率与水稻产量损失关系分析图4 B区发病率与产量损失的关系图5 B区发病率与有效穗数的关系B区，发病样本有效穗数平均为5.3个，比对照的平均有效穗数减少3.7个，减穗率达到41.11%。所有发病样本的平均株发病率为41.46%，产量损失率为39.57%。发病率与减产率比值为1：0.95。通过对该区的样本株发病率与减产率、减穗率间进行相关性分析，结果表明，发病率（x）与减产率（y）回归方程为：y=0.9912x-1.446，r=0.8451*；发病率（x）与穗数减少（y）之间回归方程为y=0.9482x+2.2316，r=0.8726*；穗数减少（x）与产量损失（y）之间的回归方程为y=1.0278x-3.121，r=0.9531*。回归分析表明，这几个因素之间存在相关性，其中穗数减少和产量损失之间关系最密切，相关达极显著水平。通过A、B两块田的试验发现，对于单丛发病植株而言，有效穗数的减少是造成产量损失的直接原因，减穗率与减产率之间关系密切。通过对小区样本各指标的田间调查和实验室测产结果，在13个供试发病小区中，所有发病小区单位面积产量都低于对照的产量，说明发病直接导致产量下降，而且从测产结果可以看出，大部分小区产量损失随发病株率上升逐渐加重。供试小区最高病株率为7.97%，减产率为7.08%。13个发病小区平均株发病率为4.79%，减产率为3.52%，即发病率每上升1%，相应减产率增加0.73%。图6 B区有效穗数与产量损失的关系通过对小区病株率和减产率的相关性分析，株发病率（x）与减产率（y）之间呈正相关关系，建立的回归方程为：y=0.9765x-1.2647，r=0.8665*。病株率（%）产量（g/m2）减少量（g）减产率（%）千粒重（g）秕谷率（%）0.0819.40.00.0023.8319.091.48818.21.20.1521.6521.442.75811.09.41.1524.0815.062.93799.220.22.4723.8220.183.17812.37.10.8724.0017.143.65782.736.74.4822.4820.744.38769.250.26.1324.3817.174.38815.53.90.4824.0217.475.74782.536.94.5023.0419.896.00811.57.90.9624.4415.616.33782.536.94.5022.1119.176.46770.548.95.9724.1221.277.08761.458.07.0823.2719.227.97762.257.26.9823.5020.15表3 定点小区条纹叶枯病发病率与水稻产量损失关系分析水稻条纹叶枯病是由介体昆虫灰飞虱传播的病毒病，在水稻秧苗期和分蘖初期最易感染条纹叶枯病毒引起水稻发病，植株一旦发病很难恢复，因此，为害损失极大。在本试验中，初步明确了田间株发病率与产量损失之间的关系，即随着株发病率的上升，产量损失率增大。水稻单丛发病率与产量损失的试验表明，水稻有效穗数减少是导致减产的主要原因，水稻株发病率与产量减少率基本相近。但从小区发病率与产量损失率的试验中可以看出，整个小区内的产量损失率略低于其株发病率，这可能与边际植株的补偿有关。该项试验研究结果，为水稻条纹叶枯病发生为害程度分级，制定水稻条纹叶枯病防治指标提供了科学依据。图7 C区发病率与产量损失的关系

由RSV引起的水稻条纹叶枯病最早于1897年在日本关东发现，后在朝鲜、乌克兰均有发生。1962年我国在江苏、浙江首先发现RSV。目前该病已经在全国16个省、市、自治区发生，在云南、辽宁、北京、河南、山东、江苏、上海十分常见，特别是云南的保山、楚雄、昆明，北京的双桥，河南原阳，山东济宁及江苏北部的姜堰、洪泽等地，发生更为普遍严重。RSV由介体灰飞虱（Laodelphax striatellus Fallen）传播，灰飞虱的带毒虫量是水稻条纹叶枯病发生流行的主要影响因子。因此，建立一种快速灵敏检测灰飞虱带毒率的方法对于预测水稻条纹叶枯病的流行及病害防治十分必要。目前国内外用于检测灰飞虱带毒率的方法主要有ELISA、RT-PCR和Northern杂交等。但RT-PCR和Northern杂交成本高，不适于大批量检测样品。用斑点免疫结合（DIBA）法检测快速灵敏，简单易行，适用于大批量检测，并且适合于基层工作人员直接检测灰飞虱携带的病毒，从而为病害的流行预测提供依据。为此，我们利用斑点免疫结合（DIBA）检测RSV的方法对浙江部分市县的灰飞虱进行了水稻条纹叶枯病毒带毒率测定，并与采用生物法测定的灰飞虱传毒率进行了比较。现将研究结果报道如下：1.1.1 供试虫源、水稻品种 2006年供试虫源为采自浙江长兴和嘉兴两地的灰飞虱虫源，2007年供试虫源为浙江湖州和嘉兴海盐、桐乡、秀洲等县区提供的灰飞虱。供试水稻植株为苗龄15天的嘉991和秀水110两个水稻品种，由嘉兴市农业科学院提供。1.1.2 供试抗体 RSV抗体由江苏省农业科学院植物保护研究所和浙江大学共同研制，效价为1：5000～10000；酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，由Sigma公司生产（PN为A4416），效价为1：5000～10000。1.2.1 生物法测定灰飞虱传毒率 选用长度15cm、直径2cm、两端开口的玻璃管，首先用纱布罩住管口一端。将事先育好的供试水稻秧苗置于其中，每管一株，然后接入一头供试灰飞虱，再用纱布罩上玻璃管的另一端。将玻璃管竖直放入盛有清水的育苗盘中，保证秧苗根部朝下刚好浸入水中。对每个玻璃管做好标记，记录灰飞虱采集地，并对每株秧苗进行编号。2006年供试水稻秧苗数量和灰飞虱虫量均为257，其中长兴虫源104头供试虫全部接在嘉991品种上，嘉兴市新丰虫源中73头供试虫接于嘉991品种上，80头供试虫接于秀水110品种上。2007年测定了湖州和嘉兴市海盐、桐乡、秀洲共4个不同地区的灰飞虱传毒率。其中湖州和桐乡供试虫口为123头和132头，均接于嘉991秧苗上取食；海盐和秀洲供试虫口分别为159和167头，接于秀水110秧苗上取食。待该批灰飞虱在供试秧苗上取食24h后，将活的灰飞虱按编号回收冷冻备用。同时将已被取食的供试秧苗按编号移栽到观测圃中，观察并记录回收活虫对应的植株发病情况。1.2.2 斑点免疫结合（DIBA）法测定灰飞虱带毒率 将生物测定法中收回的供试灰飞虱单头置于100μl碳酸盐包被缓冲液（0.05mol/L，pH值9.6）中，用木质牙签捣碎，5000r/min离心3min后取上清液作为待测样品备用。在NC膜方格上，每格加入3μl待测样品后在室温下晾干；将干燥的膜正面朝上浸入5%封闭液中，置于37℃水浴锅中30min后，用PBST洗涤3次，浸入用封闭液稀释1000倍的单抗液中置于37℃水浴锅中1.5h；用PBST洗涤3次后，将膜浸入用封闭液稀释5000倍的辣根过氧化物酶标记的二抗中，置于37℃水浴锅中1.5h，洗涤后加入固体显色底物液，置于37℃水浴锅中30min（参见马占鸿等的方法）。随后晾干，统计NC膜上显色格的数量，计算所检测灰飞虱的带毒率。在生物法测定灰飞虱传毒率的试验中，被取食供试苗最早于接虫后13天初见发病症状，首先从水稻叶脉附近出现褪绿的斑点，并且斑点排成和叶脉平行的直线，随后病斑逐渐增多，连成互相平行的多条病斑，最后整个叶片发黄直至卷曲。35天后供试苗不再出现新的发病植株。2006年利用生物法测定传毒率时观察秧苗发病率发现，供试的257株秧苗中有11株发病，发病率为4.28%，其中长兴虫源取食的104株供试苗中有7株发病，即有7头灰飞虱传播病毒，传毒率为6.73%；嘉兴新丰虫源在嘉991和秀水110上取食后的发病植株分别为2株，灰飞虱在嘉991和秀水110上的传毒率分别为2.74%和2.50%。各地平均传毒率为3.99%。2007年利用生物法测定传毒率观察秧苗发病率时发现，所测4个地区供试的581株秧苗中共有25株发病，发病率为4.30%，其中湖州虫源的传毒率最高，为6.50%；海盐、桐乡和秀洲3个地区的灰飞虱传毒率差异不大，分别为3.77%、3.79%和3.59%，各地平均传毒率为4.41%。利用在生物测定法中回收的供试虫源样本，在实验室采用斑点免疫结合（DIBA）法测定灰飞虱带毒率，试验发现采用斑点免疫结合（DIBA）法测定的灰飞虱带毒率要高于在生物测定法中的传毒率（秧苗发病率）。2006年采用斑点免疫结合（DIBA）法测定的供试样本平均带毒率为6.15%，其中取自长兴的104头灰飞虱中，检测发现其中11头呈阳性反应，带毒率为10.58%。采自嘉兴的虫源在取食嘉991和秀水110两个品种中分别回收活虫73头和80头，各有3头在检测中发生呈阳性反应，带毒率分别为4.11%和3.75%。对生物学和快速检测法检测结果比较发现，采用斑点免疫结合（DIBA）法检测的带毒率高于生物法测定的传毒率，两者之比平均为1：0.65，幅度为1：0.64～0.67，见表1。虫源地带毒率测定（DIBA测定）发病率观察（生物法测定）供试虫数反应点带毒率（%）对应检测株反应株传毒率（%）传毒率/带毒率长兴（秀水110）1041110.5810476.730.64嘉兴（嘉991）7334.117322.740.67嘉兴（秀水110）8033.758022.500.67各地平均6.153.990.65表1 2006年生物法测定结果与DIBA法测定结果比较2007年采用斑点免疫结合（DIBA）法测定的供试样本平均带毒率为8.68%，其中湖州和嘉兴秀洲虫源的带毒率最高，分别达到了13.01%和11.38%；海盐和桐乡带毒率也较高，分别为5.03%和5.30%。对生物法和快速检测法测定结果比较发现，采用斑点免疫结合（DIBA）法检测的带毒率高于生物法测定的传毒率，两者之比平均为1：0.57，幅度为1：0.32～0.75，见表2。虫源地带毒率测定（DIBA测定）发病率观察（生物法测定）供试虫数反应点带毒率（%）对应检测株反应株传毒率（%）传毒率/带毒率湖州（嘉991）1231613.0112386.500.50海盐（秀水110）15985.0315963.770.75桐乡（嘉991）13275.3013253.790.72秀洲（秀水110）1671911.3816763.590.32各地平均8.684.410.57表2 2007年生物法测定结果与DIBA法测定结果比较通过对不同地区虫源在两个不同水稻品种上的试验发现，在浙江嘉兴和湖州采集的灰飞虱供试虫源中均有一定数量的灰飞虱携带病毒并有传毒能力。通过2006年、2007年两年利用斑点免疫结合法和生物法对灰飞虱带毒率和传毒率检测试验表明，灰飞虱带毒率高于传毒率，而且传毒率与带毒率之比相对较为稳定，两年平均为0.61，其中2006年灰飞虱传毒率与带毒率之比为0.65，2007年灰飞虱传毒率与带毒率的比值为0.51。以上结论初步明确了浙江嘉兴、湖州两地越冬代灰飞虱体内水稻条纹叶枯病带毒率与传毒率之间的关系，为两种检测方法数值转换和病害预测提供科学依据，但其他世代灰飞虱带毒率与传毒率之比是否与此一致尚有待进一步研究。

朱槿（Hibiscus rosa-sinensis Linn.）又称扶桑、火红花、假牡丹和大红花等，属锦葵科黄槿属常绿灌木，原产于我国云南、广东及南美，也是马来西亚国花和我国南宁市市花。该植物在华南地区几乎可终年开花，是重要的园林花卉植物。但近期广东部分地区的朱槿植株表现曲叶或黄化曲叶症状，该症状与烟粉虱传双生病毒侵染植物引起的症状十分相似。为了明确其病因，作者对其开展了分子检测与鉴定。对广东各地朱槿进行调查，包括朱槿被为害情况、症状表现、介体烟粉虱发生情况等。在各病区随机采集表现为曲叶或黄化曲叶症状的朱槿病样5～10个，带回室内用于检测。用NaOH法提取病样总DNA[1]，并做适当改进，即：取待检病叶片100mg，在灭菌的研钵中加液氮速冻研磨成粉末，解冻前加入1ml 0.5N NaOH提取液，并在提取液使用前加入巯基乙醇（0.5%）；8000g×离心5min，上清液用0.1 mol/L Tris缓冲液（pH值7.0）稀释100倍，用作PCR模板。应用烟粉虱传双生病毒通用简并引物AV494 [2]和DeP3（也即CoPL[3]）对上述采集于各地的朱槿曲叶病样进行PCR检测。PCR扩增结束后，取10μl反应产物进行电泳，以检测PCR扩增结果。调查结果表明，目前仅在广州和佛山发生朱槿曲叶病，其他地方暂时还未发现该病害。病株典型症状为植株明显矮化，全株叶片向上卷曲、叶脉肿大明显、有耳突、叶质脆硬，随着病情的发展，病叶缘开始褪绿黄化，最终叶片大部分甚至整片叶黄化（图1）。植株感病后不再开花，或即使开花，花朵不正常。人工修剪后，病株难以长出新叶，或虽长出新叶，叶数量少、叶小且严重卷曲。自然界朱槿曲叶病扩散速度较快，短时间内会使较大范围内朱槿很快都被传染感病，完全失去园林和绿化价值。另外，朱槿上烟粉虱发生普遍。Figure 1 Symptoms of Hibiscus rosa-sinensis leaf curl disease in Guangdong对广东各地朱槿曲叶病样进行PCR检测，结果显示：从这些病样本中均能扩增出1条570bp特异片段，而健康的朱槿对照未扩增出任何条带，图2是其中1次的检测结果。这些检测结果说明，朱槿曲叶病样中存在烟粉虱传双生病毒。Figure 2 The result of the PCR with AV494 and DeP3对分离物G6 PCR扩增的特异片段进行克隆及序列测定，结果表明，该片段长为570bp；BLAST结果显示，与该片段有较高同源率的均为双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）病毒，与木尔坦棉花曲叶病毒（Cotton leaf curl Multan virus，CLCuMV）各分离物的同源率均大于95%，其中与CLCuMV分离物Okra（Genbank登陆号：AJ002459）序列同源率最高，为97%。刚刚完成的广州朱槿曲叶病毒分离物G6全基因组克隆结果显示，该病毒分离物与CLCuMV分离物62的序列同源率高达96.1%（另文发表），说明G6应该是CLCuMV的一个分离物。朱槿属多年生灌木，由于绿化和观赏需要，在广东省每年都要对其修剪1至多次。目前，在广州、佛山等地均有朱槿曲叶病发生。朱槿感病后，全株叶片即会卷曲，植株生长衰退；人工修剪后，病株难以长出新叶，或虽然长出新叶，叶数量少、叶小且严重卷曲，完全失去绿化价值。因此，该病害对市政园林绿化影响很大。应用先前建立的烟粉虱传双生病毒PCR检测技术[4～5]，从广东各地采集的朱槿曲叶病样中均能检测到该类病毒；而新近完成的朱槿曲叶病毒G6分离物基因组序列分析结果表明，其是CLCuMV一个分离物。因此，本研究初步表明，朱槿曲叶病可能是由CLCuMV侵染引起的，但还需要做更进一步深入研究加以验证。CLCuMV最先发现于巴基斯坦为害棉花，由烟粉虱传播，已给该国棉花生产造成了巨大的经济损失。该病毒也是我国的一个外检对象，但目前仅在广东朱槿上发现该病毒，应引起我们的重视。

苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus，ASPV）是侵染苹果和梨树的主要病毒之一，可导致苹果和梨的生长势下降，并影响其果实产量和品质。本研究在生物学、血清学和分子生物学鉴定的基础上，筛选出侵染砂梨的APSV毒源材料。参照已报道的ASPV全基因组核苷酸序列设计合成引物，以来源于砂梨（6-1-13）ASPV的 dsRNA为模板，RT-PCR扩增获得大小为1328bp特异性扩增条带，并对扩增产物进行纯化、克隆和序列测定。序列分析结果表明，其核苷酸序列与国外在GenBank上登录的14个ASPV分离株的同源率为82%～88%。将克隆获得的目的基因与pET28c连接得到原核表达载体pET28c-ASPV cp，并在大肠杆菌BL21（DE3）中成功诱导该基因表达，表达蛋白大小约44kDa。将表达正义链和反义链的该病毒分离物cp基因cDNA分别与植物表达载体pCAMBIA1301连接，转化大肠杆菌DH10B的感受态细胞，经过PCR和双酶切鉴定和筛选阳性克隆，成功构建了ASPV cp基因的正义链和反义链植物表达载体pCAMBIA1301-ASPV cp+和pCAMBIA1301-ASPV cp-。将重组质粒转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞后，采用叶盘共培养的方法转化5～6叶期的健康西方烟叶片，经潮霉素抗性筛选和PCR鉴定，获得88株西方烟转化植株，其中ASPV cp基因正义链的西方烟植株68株，表达cp基因反义链的西方烟植株20株。

2006年10月以来，浙江温州市乐清、瑞安、苍南、瓯海、龙湾等地的大棚番茄上相继发生了一种以前从未见过的病毒病。为此，我们立即分别从不同地点采集了较典型的罹病植株样本送浙江大学生物技术研究所鉴定，经该所用超薄切片电镜观察、ELISA和分子水平检测后确认是台湾番茄曲叶病毒（也称烟草曲叶病毒）（TLCV）所致。该病毒病在浙江省系首次发现，经检索国内也鲜有报道。台湾番茄曲叶病毒病是一种毁灭性的蔬菜新病害，是世界许多地区番茄生产上的重要限制因素，该病为害猖獗、蔬菜生产部门及有关方面须高度警惕。据调查，温州地区秋季定植的大棚番茄株发病率一般为3%～30%；严重田块株发病率高达95%以上，当地农民基本放弃管理或拉秧改种。初步统计温州各县（市、区）台湾番茄曲叶病毒病的发生面积约为333.3hm2，其中株发病率在50%的田块约为53.3 hm2以上，给各地番茄生产造成了严重损失。染病番茄植株矮化，生长缓慢或停滞，顶部叶片大多褪绿发黄、叶变小，边缘上卷，叶片增厚、变硬，叶脉呈紫色。生长发育早期染病的植株严重矮缩，不能正常开花结果；中后期染病的植株仅上部叶片和新芽表现症状，结果减少、果实变小，成熟期果实着色不均匀（红不透），商品价值低；生长发育后期，随着气温上升染病植株症状减轻。该病病原为Tomato leaf curl Tanwan virus，属双生病毒组的一种病毒，据资料报道该病毒只能由烟粉虱（Bemisia tabaci）传毒，土壤、种子和土壤均不传毒。近年来烟粉虱在温州地区的发生为害呈暴发态势，现已证实外来入侵生物B型烟粉虱的入侵蔓延并成为优势种是温州地区烟粉虱暴发的主要起因，估计台湾番茄曲叶病毒由B型烟粉虱带入的可能性较大。2006年秋冬，温州地区总体上呈高温干爽天气，对该病虫媒烟粉虱的发生、繁衍十分有利，虫量发生大、加上带毒种群及其携带病毒的多年积累和扩增，为台湾番茄曲叶病毒病的流行提供了病原数量基础，这可能是该病暴发的主要原因。此外，目前温州生产上推广的大多数番茄品种如红梅王、FA-189、516、托马雷斯、合作903等对该病毒病的抗性较差也是不可忽视的重要原因。据报道，该病极有可能在首次暴发后数年内迅速发展并导致大暴发，故须立即采取措施进行应急防控，以便将该病发生为害控制在最小限度内。抓紧引进、筛选抗耐病的优良品种，同时加强培育适合温州市栽培的抗病品种。对重发田实施与非茄科作物轮作，最好是水旱轮作。①育苗床与生产大棚要分开；②清洁消毒苗床；③使用30～40目防虫网隔离育苗，防止烟粉虱入侵；④苗床挂“黏虫色胶板”诱杀烟粉虱；⑤移栽时带药下田。①加强肥水管理，增强植株抗病能力；②地膜覆盖，去除边际杂草；③及时去除植株下部烟粉虱虫、卵枝叶；④收获后及时清洁棚室和周围环境。消灭虫媒，及时防治烟粉虱。可选用99.9%绿颖农用矿物油200～300倍稀释液、20%啶虫脒（兰宁）可溶性液剂3000倍稀释液、25%扑虱灵可湿性粉剂1000～1500倍稀释液、25%阿克泰水分散粒剂2000～3000倍稀释液、2.5%天王星乳油2000～3000倍稀释液、1.8%阿维菌素1500倍稀释液、1%甲胺基阿维菌素2000倍稀释液等进行防治。应在烟粉虱发生初期防治，并交替使用农药。

芽孢杆菌属（Bacillus spp.）是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤、植物体表面及水体中，其在工业、农业、医学、军事和科学研究中有广泛的应用价值。在《Bergey氏鉴定细菌学手册》第8、第9版中，蜡样芽孢杆菌的分类地位为芽孢杆菌属的第I群，该群有22个种。根据营养型菌细胞的宽度分为两类，蜡样芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌属“大细孢菌种”。蜡样芽胞杆菌是一种杆状、产内生芽孢的革兰氏阳性细菌，由于蜡样芽孢杆菌自然界分布甚广，常存在于土壤、灰尘、腐草和空气中，极易在食品加工、运输、贮存、销售过程中，通过苍蝇、蟑螂等昆虫和不卫生的用具和手污染，通常被认为是一种条件致病菌，在临床上可导致脓肿、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎等报道，但最常见的是导致两种不同类型的食物中毒：腹泻型和呕吐型。关于B.c.引起非肠道感染及食物中毒的例子很多，从1898年起，就有B.c.造成泌尿系统感染及肠胃炎的记载，有些感染的病例甚至很严重，以致造成死亡。在微生物发展的早期，好氧芽孢杆菌就被怀疑可造成食物中毒，Lubenau1906年描述了发生在一家医院的严重的食物中毒事件，300名医务人员及病人用餐后出现急性肠胃炎，对剩余的食物进行检测，发现含有大量的好氧芽孢杆菌，该污染菌为B.c.。Seitz 1913 年从一例患肠炎与腹泻的病人分离出B.c.。Brekenfeld 分别于1926年及1959年报道了两起B.c.造成的食物中毒事件。1936～1942年，瑞典卫生部对367例食物中毒事件综合分析，证实117例是由B.c.引起，并且认识到被B.c.污染的食物，储藏温度不当时，可能会造成食物中毒，在1973年Bulyba等人报道了污染蜡样芽孢杆菌的乳制品引起食物中毒。由于Smith、Gorden 及其同事在芽孢杆菌分类学上的进展，Hauge 经过对4起食物中毒事件的调查，于1995年首次确认B.c.是一种引起食物中毒的致病菌。目前大部分国家对各类食品中的蜡样芽孢杆菌数量有所限定，多数情况下，引起食物中毒的食品中蜡样芽孢杆菌的数量在105～108 CFU/g，常因食用肉类、海鲜、乳品和蔬菜等食物引起，潜伏期一般为6～15h，一般持续24h；而致呕吐的毒素是该菌在食物中预先产生的，该毒素非常稳定，进入人体后在胃中与其受体5-HT3 结合，导致呕吐。呕吐型食物中毒的潜伏期一般为0.5～6h，一般限于富含淀粉质的食品，特别是炒饭和米饭。主要症状为恶心、呕吐，有时有腹泻、头晕、发烧和四肢无力等症状，引起这两种食物中毒的食品通常都是经过热加工处理的，但蜡样芽孢杆菌具有耐热的芽孢，能在食品加工及烹饪后残留下来，热处理诱发芽孢的萌发，在没有其他微生物与之竞争的条件下，大量生长繁殖，产生毒素并引起食品的腐败。蜡样芽孢杆菌产生的呕吐毒素（cereulide，1.2kD）是一种小的十二边形的热稳定性环状毒素，分子式为（D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val）3。其结构、性质和毒理与缬氨霉素很相似，是特异性的钾离子载体，能将K 转入线粒体内，破坏线粒体的氧化还原能力。该毒素非常稳定，目前的各种食品加工方法，包括灭菌，均无法使其失活（能耐受126℃ 90min），而且还耐强酸（pH 2.0）、耐蛋白酶水解。N.Agata等对多种食品中呕吐毒素的产量进行了检测，发现对B.cereus NC7401来说，在煮熟后的米饭中其产毒量很高，在富含淀粉质的食物中的产毒量也足以引起食物中毒；而在肉类、蛋品和密封的液体食品如牛奶和豆奶中虽可以检测到该毒素，但其含量较低。还发现在与醋、蛋黄酱及酱类一起煮的食物中，该菌株的生长和产毒都受到抑制，推测这可能是醋导致pH 降低的缘故。在12～15℃时该毒素的产量却明显高于30℃时的产量，而且该毒素的产生与芽孢的产生没有相关性。还有报道称该毒素只有在有氧条件下才能产生，所以缺氧条件如：充氮包装和真空包装能有效地防止该毒素的产生和积累。因为该毒素的分子量很小，无抗原性，这使其检测比较难，到目前为止尚缺乏一种快速可靠的检测方法。最常用是采用HEp-2 细胞进行细胞培养分析。近年来用分子生物学手段检测产毒菌株的报道也较多，如P F Horwood 等人根据NRPS基因的两个可变区的序列，针对产呕吐毒素的菌株设计了特异性的引物，进行PCR 以检测蜡样芽孢杆菌是否产毒，取得了良好的效果，该法灵敏度高，而且检测速度快。在呕吐食物中毒事件中分离的蜡样芽孢杆菌均产生呕吐毒素，而且有着共同的独特表型特征，对其基因进行分析发现它们同源性很高。B.c.所造成的腹泻型食物中毒的致病因子是肠毒素，目前至少已经发现4 种不同的肠毒素，包括2 个三联体肠毒素：溶血素BL和非溶血素Nhe；2个单一亚基肠毒素：细胞毒素K（cytK）、肠毒素T（bceT）。2.2.1 溶血素BL（HBL）Beecher1991年从B.c.菌株中分离提纯了一种具有活性的三亚基肠毒素，命名为溶血素BL（hemolysinBL），能够引起家兔肠段的液体积累，可以改变豚鼠皮肤血管的通透性，具有对vero细胞的溶细胞毒性。其由一个结合亚基B（37.5kD）、两个溶血亚基L1（38.2kD）及L2（43.5kD）组成，编码3个亚基的基因hblA、hblD、hblC经克隆、测序与分析，表明其在同一个mRNA中受一个操众子调控转录如图1。这些组分的物理化学性质非常相似，等电点（pI）为5.34，5.33和5.33。其中hblA编码结合亚基B，hblD、hblC分别编码溶血亚基L1及L2，hblB编码B’蛋白，hblC和hblD仅隔37bp个碱基，B、L1、L2蛋白分别有31、30、32个氨基酸的信号肽，hblD和hblA之间最少有100bp碱基，hblA和 hblB有381 bp的碱基隔开，B’蛋白与B蛋白开始的158个氨基酸非常相似，但其功能尚未清楚。Douglas J.Beecher等人利用等电聚焦电泳技术和快速蛋白液相层析技术证明单独成分的溶血素亚基并不会在血平板上产生溶血环，只有当3个亚基结合后，才会产生溶血环。图1 芽孢杆菌溶血素BL操纵子图谱2.2.2 非溶血素肠毒素（Nhe）非溶血素肠毒素（Nhe）由45、39和105kD的蛋白组成，其蛋白成分已被分离出来。1999年Granum等给出了nhe操纵子的序列，该操纵子有3个开放式阅读框，相应的3个基因分别是：nheA、nheB和nheC。前两个基因的产物分别为45kD和39kD 蛋白，而nheC 的产物尚未纯化出来，其功能未知。Nhe与Vero细胞相互作用的研究表明105kD蛋白是复合物的结合部位，而其他两个组分是无法单独结合到细胞上去。该105kD 蛋白是一种金属蛋白，具有分解明胶和胶原的活力。与hbl 基因不同，编码该毒素的基因位于质粒上。图2 芽孢杆菌非溶血素Nhe操纵子图谱溶血素BL（HBL）与非溶血素肠毒素（Nhe）同时受到PlcR的调控。2.2.3 肠毒素T（entertoxin T）肠毒素T为单一亚基的蛋白质，由 bceT基因编码，日本学者Agata对其基因克隆、测序和分析表明其由336个氨基酸组成。并认为其有细胞毒性，可导致家兔肠段的液体积累，可以改变豚鼠皮肤血管的通透性，具有对vero细胞的溶细胞毒性。其产物属于肠毒素蛋白。该毒素同溶血素BL无同源性，而且认为肠毒素T 不会导致食物中毒。2.2.4 细胞毒素K 早期在法国报道过食物中毒，其氨基酸序列显示它属于β-桶孔形成毒素，能在磷脂双分子层中形成直径至少为7A°的孔，该孔具有微弱的离子选择性，已证实它对人类肠道Caco-2上皮细胞具有毒性。PlcR是条件性人类病原菌B.cereus和共生病原菌B.thuringiensis细胞外毒性因子的一个多效调节子，它在细胞进入稳定期时诱导生长。受到PlcR调节的基因有：plcA编码一个专一性磷脂酰肌醇磷脂酶C（PI-PLC），Plc编码一个改良的磷脂酰胆碱磷脂酶 C（PC-PLC），nhe编码一个无溶血性的肠毒素，hbl编码一个溶血性的肠毒素 BL（HBL）；以及推定为S-层类似表面蛋白的基因，以及一个推定为细胞外RNA酶。通过分析37.1kb的hbl，plcA和plcR周围的DNA序列，推定存在28个ORF。3条新基因推定受到PlcR 的调节并编码一个中性蛋白酶，subtilase家族丝氨酸蛋白酶（Sfp）以及一个推定的细胞壁水解酶（Cwh）得到确认。相应的sfp和cwh 基因定位于plcA的上游调节区域，能同时受到位于逆转录基因之间的PlcR结合位点的调控。Sylvie Salamitou等构建plcR基因缺失的突变菌株，该基因编码一个多效细胞外因子的调节子。幼虫期同时取食亲本菌株产生的106孢子亚致死浓度的Cry1C毒性导致70%死亡率，如果使用plcR突变体的孢子，则只有7%的死亡率。小鼠鼻腔灌入108的孢子，亲本菌株导致了100%的死亡率，而灌入相同数量的突变体孢子，死亡率大大降低，甚至没有死亡。应用营养体细胞代替孢子也可以达到相同的效果。导致死亡的原因未知，不可能是由于小鼠内细菌的实际增长所导致。由于受B.thuringiensis 过量突变体感染的小鼠产生的病变，说明溶血素参与其中，发生了作用。B.thuringiensis和B.cereus具细胞溶解毒性的特性。这种细胞溶解毒性的水平在plcR基因缺失的菌株中剧烈下降。表明 B.thuringiensis407菌株和B.cereusATCC14579的致病性受到PlcR的调控。由于蜡样芽孢杆菌及其芽孢广泛存在于周围的环境中，它极易污染食物而引起食物中毒，因此需要发展一种快速的检测方法来实现对致病性蜡样芽孢杆菌的检测，目前对该类蜡样芽孢杆菌的检测主要采用生化检测方法是一项费时费力的方法，需要长时间的选择性培养过程。现在有两种试剂盒可供选择，但由于价格昂贵且不太灵敏，有些致病菌不能够检测。王利国等人对实验室14株芽孢杆菌溶血素BL的检测结果表明，8株蜡样芽孢杆菌全部检测到溶血素BL的基因且产生溶血环，而其他的蜡样芽孢杆菌只检测到hblA基因以外的基因且不产生溶血环，表明只要检测到hblA基因，证明其为致病性菌株，所以通过设计hblA基因特异引物用PCR或通过血平板培养的方法是既经济又快速的检测方法。对其他毒素的检测目前主要是通过设计特异性引物来检测。所以对蜡样芽孢杆菌毒素的检测还需要进一步对其研究，确定最佳的检测方法。

由灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.）侵染引起的番茄灰霉病是当前番茄生产上重要病害，尤以设施栽培条件下发生较重，一般引起产量损失20%～30%。灰葡萄孢的寄主很广，已经报道过的寄主至少有235种，能为害多种粮食作物、经济作物、蔬菜、果树和观赏植物[1]。随着高效农业的发展，温室中蔬菜、花卉、果树轮作、间作日渐频繁，使得同种作物间、不同种作物间交互感染成为可能[2～3]。为了明确来自其他寄主植物的灰葡萄孢菌株能否侵染番茄，不同寄主来源的菌株对番茄的致病力是否存在差异，从而为生产上包括番茄灰霉病在内的灰葡萄孢所致植物灰霉病的综合治理提供参考依据，作者对不同寄主来源的灰霉菌株对番茄的致病力及其分化进行了研究。2005～2007年，从合肥市、蚌埠市、长丰县、和县等地区的番茄、辣椒、草莓、葡萄等发病寄主上分离鉴定获得18个灰葡萄孢菌株，采用菌丝块创伤接种法，分别测定了上述不同寄主来源的灰葡萄孢菌对番茄果实和叶片的致病力。结果表明，所有供试菌株接种番茄果实后均可引起发病，但不同菌株所致病斑的平均直径有显著差异，提示灰葡萄孢菌株间对番茄果实的致病力存在明显分化。按照在番茄果实上所致病斑的平均直径大小可将供试菌株划分为致病力较强、致病力中等和致病力较弱3种类型。总体来说，来自番茄的菌株对番茄果实的致病力较强，来自草莓、葡萄和辣椒的菌株对番茄果实的致病力较弱，但来自相同寄主的菌株间致病力也存在差异，菌株致病力差异与菌株地域来源无明显相关。供试灰葡萄孢菌株接种番茄叶片后，除CF1外，均可引起番茄叶片发病，但不同菌株所致番茄叶片病斑的平均直径也有显著差异，但菌株致病力差异与菌株的寄主和地域来源无显著相关。本文关于灰葡萄孢不同菌株致病力存在差异的研究结果与Kersises[4]的报道一致。Lorenz[5]和Kersises[4]认为灰葡萄孢不同菌株致病力分化的原因可能与异核现象有关。作者也曾采用细胞核染色法观察到部分灰葡萄孢菌株菌丝细胞内存在多核现象，但这种多核现象与异核现象乃至致病力分化之间的关系尚不清楚。因此，有关灰葡萄孢不同菌株致病力分化的机制尚需进一步研究。灰葡萄孢菌株对番茄果实和叶片的致病力测定结果比较表明，除FQ外，其余各供试菌株对番茄果实所致病斑直径均比叶片病斑直径大，但各供试菌株接种番茄果实和叶片后所致病斑直径之间没有明显的相关性。作者认为，采用菌丝块创伤接种法测定灰葡萄孢菌对番茄的致病力时，以接种果实为宜；由于不同菌株的致病力差异较大，所以在番茄抗病性测定时，宜选用强菌株或混合菌株。本研究结果指出，来自辣椒、草莓、葡萄等其他寄主植物的灰葡萄孢菌株能够侵染番茄果实和叶片，意味着上述植物上的灰霉病菌（灰葡萄孢）可以成为番茄灰霉病的侵染来源，建议在番茄灰霉病的综合治理中应予以注意。