灰霉病（gray mold）是番茄生产中一种重要的气传病害，其病原为灰葡萄孢属（Botrytis cinerea）真菌，寄主范围广，再侵染频繁，为害严重。化学防治仍是目前生产中防控该病害的主要手段，其中以甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂为代表的呼吸作用抑制剂近年来在灰霉病防治实践中显现出了良好的防效，而线粒体作为真核细胞呼吸作用的主要场所，在线粒体上合成的ATP提供了细胞生命活动所需的大部分能量。为此，进行高纯度线粒体的分离对于开展呼吸抑制剂类杀菌剂的作用机制研究[1～5]具有十分重要的意义。至今，从病原真菌中分离获得高纯度线粒体的方法尚不成熟，国内外一般采用从动物或高等植物中分离得到的线粒体作为替代品来进行研究。本研究拟借鉴相关研究[6～7]方法，采用机械破壁及差速离心的方法从番茄灰霉病菌中分离获得线粒体，并对其进行呼吸测定，以确证获得的线粒体是否具备完整的结构和功能。现将研究结果报道如下。1.1.1 番茄灰霉病菌（B.cinerea）菌株NJ-9，由中国农业大学植物病理学系种子病理学和杀菌剂药理学实验室提供。1.1.2 供试药剂 α-酮戊二酸，NADHNa2（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐）为Roche公司产品，ADPNa2（5′-腺苷二磷酸二钠盐）为Sigma公司产品。线粒体分离液的配制[9]：0.5mol/L 蔗糖，5mmol/L半胱氨酸，1mmol/L 乙二胺四乙酸二钠盐，0.3%（w/v）牛血清白蛋白Ⅴ组分，0.1mol/L（pH值7.4）磷酸盐缓冲液；线粒体保持液（洗液）的配制[9]：0.5mol/L 蔗糖，1mmol/L 乙二胺四乙酸二钠盐，0.3%（w/v）牛血清白蛋白Ⅴ组分，0.1mol/L（pH 7.4）的磷酸盐缓冲液；线粒体呼吸测定的反应液[9]：0.5mol/L 蔗糖，10mmol/L KCl，5mmol/L MgCl2，1mmol/L 乙二胺四乙酸二钠盐，0.1%（w/v）牛血清白蛋白Ⅴ组分，0.01mol/L（pH 7.2）的磷酸盐缓冲液。1.1.3 菌体的培养 将浓度为8×106个/ml的孢子悬浮液接种到1L的复合盐液体培养基（SSY）[9]（10g可溶性淀粉，2g KH2PO4，1.5g K2HPO4，0.5g MgSO·7H2O4，1g（NH4）2SO4，2g 酵母粉，1L去离子水，pH 6.2）中，置于23℃，150rpm条件下摇培24h。1.1.4 供试仪器 Oxytherm氧电极（Hansatech Instruments Ltd.），DHZ-D冷冻恒温振荡器（江苏太仓实验设备厂），高速低温离心机（Beckman Coulter AvantiR J-E）。1.2.1 灰霉病菌孢子的获得 将菌株NJ-9接种至MEA（麦芽糖20g，酵母粉5g，琼脂粉14g，1L去离子水）培养基上，25℃下黑暗培养5～7 天后，放置于日光灯和长波长紫外灯（黑光灯）下，12h轮流交替照射7～14天，产生大量的分生孢子，备用[8]。1.2.2 线粒体的分离 通过真空抽滤的方法收集幼嫩菌丝，依次用4℃的去离子水冲洗两次，再用线粒体分离液冲洗。随后各操作中所用的器材必须在4℃下经过预冷处理，操作过程均需在0～4℃下进行。将用线粒体分离液预洗得到的菌丝悬浮在3倍体积的分离液中，分别采用以下两种方式进行破碎细胞壁：（1）杵状玻璃匀浆器法：每30～40g菌丝用100ml的分离液悬浮，用杵摩擦20次左右，混合到匀浆物均一、平滑即可。每次时间不要超过2～3min，整个样品处理的时间不要超过30min。立即将得到的匀浆物倒入50ml的离心管中，于2000g离心25min，取上清液于7000g转速下离心20min后取上清液于12000g再次离心15min，最后小心弃去上清，沉淀即为分离到的线粒体，外观为浅黄色胶状物。将线粒体悬浮在200μl的线粒体保持液中，置于冰上备用，放置时间不能超过3～4h，避免线粒体的降解。（2）高速组织匀浆器法：采用高速组织匀浆机（恒定功率220W），破碎菌丝，每次破碎时间15s，破碎3次，中间的隔1min（防止匀将机刀口发热影响线粒体的分离，将匀浆物用双层预冷的湿纱布快速过滤，过滤的时间不要超过30s，立即将匀浆物倒入50ml的离心管中，于1200g下离心20min；取上清于6000g离心20min后再取上清于12000g离心15min，小心弃去上清，沉淀即为分离到的线粒体。1.2.3 氧消耗量的测定 采用极谱法在25℃条件下使用Oxytherm氧电极进行测定，标准反应液2ml，加入线粒体50μl（蛋白质的含量大约为0.3mg），反应液中氧饱和的最大浓度是226μmol/L，所有的底物都溶解到反应液中，依据Estabrook[10]的方法计算RCR和P/O值。提取过程保持0～4℃低温条件下，杵状玻璃匀浆、高速组织匀浆两种破壁方法均可从番茄灰霉病菌幼嫩的菌丝中分离得到紧密偶联的线粒体。全玻璃杵状匀浆器手工破壁操作耗费人力，需要的菌丝量较少，从10g到几十克湿重菌丝都能分离到完整的线粒体。通常60～80g湿重菌丝即可以分离得到满足试验需要的线粒体。高速匀浆器省力快速，但是在匀浆器高速转动时易产热可导致分离物的降解，操作过程中持续时间不能过长，必要时应使用循环冷却水降温或置于低温环境下操作；同时该法需要的菌丝量也较多，以50g 以上的湿重菌丝为宜，菌丝量少时容易在破碎过程中使线粒体结构受到破坏，从而影响提取效果。番茄灰霉病菌线粒体的底物利用，呼吸控制率和磷氧值测定结果见表1。当以外源的NADH和α-酮戊二酸作底物被氧化时，状态3（在线粒体中加入底物及ADP后测定的线粒体呼吸速率）的呼吸数率明显增加，反映了在ADP刺激下线粒体功能增强的程度；两种底物的呼吸控制率（RCR）值都在3.1～3.3之间，高的呼吸控制率值表明线粒体中电子传递与氧化磷酸化紧密偶联；加入NADH做外源的呼吸底物时，磷氧比值（P/O）是1.3～1.7，表明有2个氧化磷酸化位点，即ATP生成有两个部位；α-酮戊二酸的磷氧比值（P/O）是2.2～2.5，表明有3个氧化磷酸化位点，即ATP生成有3个部位。图1表示两种破壁方法获得线粒体在外援NADH电子供体下呼吸特征图。以上研究结果表明分离的高纯度线粒体具有在活细胞中对等的生物功能，可作为线粒体生物学研究的适宜材料。MethodsofdisruptionSubstratesState3respirationrates(nmolO2/min)(mgprotein)Respiratorycontrolrations(RCR)ADP/OrationsAll-glassNADH90.16±203.8±0.11.7±0.2Potter-Elvehjemhomogenizerα-ketoglutarate175.43±453.3±0.62.2±0.1AwaringNADH118.96±303.5±0.71.3±0.1blendorα-ketoglutarate198.17±653.1±0.52.5±0.2Table 1 Respiration properties of mitochondrial isolated from mycelia of Botrytis cinereaaFigure 1 oxidation of NADH and α-ketoglutarate by mitochondrial isolated from mycelial of B.cinerea, Concentration of substrates were 10mmol/L α-ketoglutarate,2mmol/L NADHNa2, the ADP concentration was 200μmol/L and reaction were carried with 0.2~0.4mg mitochondrial protein本研究获得以下结论：（1）采用杵状玻璃匀浆器和高速组织匀浆机两种机械力可以有效破碎番茄灰霉病菌的细胞壁，借助梯度离心可以实现番茄灰霉病菌线粒体的有效分离；（2）使用本方法获得的番茄灰霉病菌线粒体结构完整、功能齐备，具有在活细胞中对等的生物功能，可作为线粒体生物学研究的适宜材料。（3）B.cinerea在培养液中生长很缓慢，选取生长代谢最旺盛的菌丝，有利于线粒体的分离。目前常用的破碎细胞方法包括传统的机械法（如匀浆、研磨、压榨、研磨、超声等）和非机械法（包括酶溶、冻融、化学等），都有其适用范围和优缺点，选择的原则是该方法不影响目标蛋白和产物的结构和功能。本文除采用上述两种机械破壁方法外，也曾尝试过超声波破壁方法以及采用蜗牛酶和纤维素酶进行酶解处理以获得原生质体的方法，但均没有获得理想的结果，推测可能与真菌细胞壁较厚，或使用的降解酶的降解特点有关。有关线粒体生物学和呼吸动力学的研究报道[9]表明，RCR 比ADP/O比值更能反映线粒体功能的完整性和氧化磷酸化的效率，ADP/O值是指线粒体每吸收一克原子氧的同时，生成ATP 的克分子数的比值，它反映线粒体的能量转化效率。RCR是表征线粒体结构、功能完整性及氧化磷酸化效率的指标。本文研究表明外源的NADH仅有2个氧化磷酸化位点，即只能生成2个ATP，然而，有文献报道[11]灰霉病菌的线粒体在氧化NADH的电子传递链中有3个磷酸化位点。因此，需要进一步研究不同的呼吸抑制剂和氧化磷酸化抑制剂在灰霉菌线粒体的电子传递链的各种抑制效果。

真菌病毒广泛存在于真菌中，其核酸类型多为dsRNA，也有少数为ssRNA。大多数真菌被侵染后不表现症状，但有些真菌病毒可以对寄主造成显著影响，如引致寄主真菌生长缓慢、菌落形态异常和致病力显著下降等，即弱毒现象（Hypovirulence）。由于真菌病毒在植物病原真菌间扩散可导致病原真菌群体出现致病力衰退。因此，与植物病原真菌衰退相关的真菌病毒在植物病害控制中有重要的作用。前期研究证实核盘菌Ep-1PN菌株的衰退与真菌病毒SsDRV（核盘菌致病力衰退相关病毒）有关。但是我们发现Ep-1PN菌株可以通过有性繁殖摆脱SsDRV的为害，而恢复生长和致病，通过RT-PCR检测，Ep-1PN菌株的子囊孢子子代不携带有SsDRV；在Ep-1PN菌株的菌核分离物中，也可以获得恢复正常表型的培养物，这些培养物或携带SsDRV或不携带SsDRV。这即表明，在自然界感染真菌病毒（SsDRV）的核盘菌仍然有可能摆脱SsDRV的影响。带毒真菌的这种脱毒作用对利用真菌病毒控制植物病害造成了潜在的风险。植物病原真菌周遍存在众多的微生物，它们是否对带毒真菌的脱毒作用目前并不明了。盾壳霉（Coniothyrium minitans）是核盘菌的重寄生菌，其所需的适宜温度与核盘菌的相似，随核盘菌生长而生长。我们推定盾壳霉可能对Ep-1PN菌株的脱毒作用存在一定影响。将核盘菌Ep-1PN菌株在PDA平板上于20℃培养2～4天后，形成小菌落，移走菌落中接种时遗留的Ep-1PN菌株的菌丝块，并在此部位接种盾壳霉ZS-1菌株的菌丝块，继续置于20℃培养7～10天。依据混合菌落边缘的特征将其分成4种类型：A.菌落边缘长出生长速度较快的核盘菌菌丝，出现的频率为16.3%；B.菌落边缘大部分是类似核盘菌Ep-1PN菌株的菌落，出现的频率为47.1%；C.菌落边缘大部分是盾壳霉ZS-1菌株菌落，出现的频率为28.8%；D.菌落边缘全部是ZS-1菌株的菌落，出现的频率为7.7%。对A型菌落，挑取核盘菌菌丝尖端进行继代培养。随机选择34株进行表型分析，测定其菌丝生长速度、致病力和观察其菌落形态。结果表明这些继代培养物均恢复为强毒力菌株的特性，称恢复菌株。这些恢复菌株的菌落形态正常、生长速度在1.7～3.0cm/天，其中17株培养物集中于2.2～2.4cm/天，8株培养物的生长速度大于2.4 cm/天。它们的致病力较强，病斑扩展速度在1.0～1.4cm/天之间，其中16株培养物的病斑扩展速度在1.15～1.3cm/天之间，有9株培养物的扩展速度大于1.3cm/天；而Ep-1PN菌株仅能形成微小的病斑，或不形成病斑。这些恢复菌株对SsDRV不具有抗性，与Ep-1PN菌株对峙培养后又重新被感染表现弱毒特性。对这些恢复菌株提取dsRNA发现大部分含有7.4 kb的片段，小部分菌株同时含有7.4kb和6.4kp的片段，还有一部分未检测出含任何dsRNA。未发现含有1.0kb或仅含6.4 kb，但不含7.4 kp片段的培养物。我们的研究证实核盘菌寄生真菌盾壳霉对Ep-1PN菌株摆脱SsDRV的影响具有一定的促进作用，盾壳霉促进Ep-1PN菌株摆脱SsDRV的影响的机理有待进一步研究。

辣椒的落叶、落花、落果通称“三落”。这是辣椒生产上的一个重要问题，对产量影响很大，一般落花率达20%～40%，落果率达10%左右，有的更为严重。引起三落的原因主要有3个方面：辣椒生长过程中要求中等强度的光照，光照过强或不足，会引起“三落”。强光直射会造成生长不良，易发生日灼病，导致“三落”；光照不足同样引起生长不良，引发“三落”。温度过低（低于15℃）或温度过高（高于35℃）影响授粉及花粉管的伸长，造成辣椒子房不能受精，引起落花。气候干燥，土壤干旱，造成授粉不良或引起病毒病流行，易引起“三落”。雨涝或灌水不当，根系吸收能力减弱，致使植株生理失调或伤根，引起“三落”或死株。1.4.1 实行间作 每4行辣椒种1行玉米，玉米种在畦埂上，株距1m，每穴2株。可防止强烈阳光直射，灼伤叶片；更重要的是阻止蚜虫迁飞传毒；诱集蛀果性害虫，集中产卵于玉米叶面上，集中处理，减轻蛀果性害虫为害。1.4.2 干旱时要浇水防旱，田间喷清水增加湿度 雨涝或田间有积水时要及时防涝排水。氮肥过多，磷、钾肥相对偏少，使枝叶徒长，营养生长与生殖生长不平衡，引起落花，落果。氮肥过少，使植株脱肥，叶黄枝瘦，造成“三落”。防治方法：要控制氮肥，增施磷钾肥，尤其要注意硫酸锌及磷酸二氢钾的叶面追肥。根据情况及时补充磷钾肥（上述两种物质，中、前期不少于3次，后期要增施1～2次）。3.1.1 病毒病 病毒病是辣椒的重要病害。轻型病毒病只出现花叶，不会造成畸形和落叶。重型病毒病会使叶片褪绿、黄化、蕨叶；造成植株矮化、形成丛枝，畸形，引起“三落”。3.1.2 辣椒细菌性斑点病 该病又名“落叶瘟”，属细菌性病害，常会引起早期大量“三落”，影响产量。一般情况会形成疮痂病斑，高温高湿条件下不形成疮痂，而是迅速扩展为叶缘焦枯，成长叶片上形成许多小斑点，之后引起大量落叶。重茬地，生长差的田快发病较重（抗性差）。3.1.3 辣椒疫病 这是辣椒生产中为害最大的病害。常会造成整株枯死，大片死亡。3.1.4 辣椒白粉病 该病能引起叶片早落，严重者可使全株叶片落尽。此病一般在叶背形成白粉状霉层，正面出现浅黄色斑，气温高相对湿度大的情况下发病重，且传播速度快。3.1.5 炭疽病 该病为害叶片和果实，以为害果实为主，严重时会引起大量果实腐烂，造成落果。高温多雨，田间湿度大，氮肥过多会加重此病。该病俗称“撒墨水”，最初病斑呈深绿色水浸状圆点，然后扩大成圆形至椭圆形，并形成同心轮纹黑褐色，湿度大时，果面病斑上出现黑色霉层。3.1.6 蛀果型害虫 主要有棉铃虫和烟青虫，蛀食会引起落果。培育壮苗，加强肥水管理，增强植株的抗性，特别在炎热的夏季要及时追肥、灌水和排水，及时防治病虫害。与非茄科作物轮作3年以上。①培育无病适龄壮苗。播种前要用10%的磷酸三钠浸种20～30min捞出，充分洗净（如不洗净会影响种子发芽，漂洗3～4次漂洗1～2h），再催芽播种；用无病土育苗，防蚜，适时定植，壮苗定植。②促发棵，壮棵。③增施有机肥。④搞好中耕除草，及时防治蚜虫（整个生育期都防治）。⑤及时清除田间病叶、果、株残体。4.4.1 病毒病可用1.5%植病灵水剂1000倍液喷雾或用20%病毒A可湿性粉剂400～500倍液喷雾。辣椒细菌性斑点病可用硫酸链霉素（200万单位）4000倍液，每隔7天喷一次，连续喷2～3次。辣椒疫病可用72%的杜帮克露800倍液喷雾防治或70%代森锰锌600倍液喷雾防治。辣椒白粉病、炭疽病用55%的可湿性粉剂500倍液进行叶面、叶被喷雾。4.4.2 蛀果型害虫可用半枯带叶杨、柳枝，10根一捆，每亩插放10捆，晚放晨收扑，可诱杀一定量成虫（杨、柳枝全枯时要更换）；用BT乳剂400～500倍液防治；用敌杀死、杀灭菊酯或灭扫利喷药防治。

近年来，水稻条纹叶枯病（Rice stripe Vir，RSV）在浙江嘉兴市呈快速上升态势，2007年全市发病面积达26.4万亩，对水稻安全生产带来严重威胁。影响水稻条纹叶枯病的发病流行的因素很多，如传毒媒介灰飞虱种群数量与带毒率、水稻品种抗病性、耕作制度、气候条件等。为了探索水稻播种期与灰飞虱迁移传毒和条纹叶枯病发病间的关系，为防治提供科学依据，2006～2007年进行了水稻不同播种期对病害发病程度的影响试验，现将结果综合整理如下。移栽单季晚稻，品种为秀水09。2006年与2007年均分4期播种，播种时间分别为5月15日、5月22日、5月29日和6月5日，每期间隔7天，每处理重复3次，每小区大田面积在0.5亩。播种前未做药剂浸（拌）种处理，按照处理要求时间，依次分期播种，待30天秧龄时依次分期移栽。秧田期、大田前期正常肥水管理，但不用杀虫剂、杀菌剂，让其自然发病。调查方法：秧苗移栽前调查病株率；大田期在移栽后至病情稳定期，各处理区用五点式取样法选定5点，每点40丛，计每区200丛，每隔5天调查1次，调查丛发病率与株病率，观察各处理区发病动态变化。秧田期各播种期间发病程度差异较为明显，2006年 5月15～22日播种的株病率高，分别为3.26%和2.25%，显著高于5月29日播种的0.24%，6月5日播种秧田未发病。2007年调查结果与2006年相似，见表1。调查试验表明，秧田期播种期越早，发病越重。年度播种期（月/日）5/155/225/296/520063.262.250.240.020074.205.300.370.33表1 水稻秧田不同播种期条纹叶枯病发病情况 （浙江嘉兴，2006～2007）在大田病情稳定期（7月中旬）调查，各播种期与病害的发生有着密切的关系，年度间、重复间基本一致。2006年的4个播种期中，从早到迟平均病丛率依次为18.5%、10.0%、5.67%和1.5%，平均病株率依次为4.07%、2.69%、1.89%和0.42%。随着播种期的推迟，病情递减。2007年的4个播种期中，前2个播种期病情重，病丛率分别为16.2%和16.67%，病株率分别为5.18%和7.31%，而后2个播种期的病丛率分别为2.7%和1.5%，病株率分别为1.9%和0.7%。试验进一步证实了播种期与发病程度间的密切关系，即播种期越早，发病越重，反之，则发病越轻。年度播种期（月/日）病丛率（%）病株率（%）重复1重复2重复3平均0.050.01重复1重复2重复3平均0.050.01200620075/1517.516.521.518.5aA4.163.164.884.07aA5/2210.510.59.010.0bB2.553.332.182.69bAB5/296.04.56.55.67cC2.021.072.571.89bBC6/52.00.52.01.5dD0.630.130.500.42cC5/1516.017.015.516.2aA6.225.214.115.18aA5/2218.015.516.516.67aA9.315.826.807.31aA5/293.03.02.02.7bB2.472.350.891.90bB6/52.01.01.51.5bB0.770.680.640.70bB表2 水稻播种期与大田条纹叶枯病发病关系调查 （浙江嘉兴，2006～2007）水稻不同播种期条纹叶枯病发病程度差异明显，分析原因主要是由传毒介体与条纹叶枯病的流行规律所决定的。条纹叶枯病是由灰飞虱为传毒媒介的病毒病，在一定的带毒虫源基数下，灰飞虱成虫高峰的早迟直接影响病害的流行与否。2006～2007年灰飞虱在嘉兴市的一代成虫高峰在5月中、下旬，如在此期间播种，出苗后正与一代成虫传毒高峰相吻合，此时水稻播种面积小，大量灰飞虱成虫迁移在秧苗上集中传毒，病害发生就重；而推迟至6月上旬播种，灰飞虱正处低龄若虫期或卵期，迁移能力不强，且随着气温的升高，灰飞虱数量减少，此时播种，传毒机率大为降低，病害发生就轻。观察表明，水稻条纹叶枯病与其他病害一样，经历始病期、剧增期、稳定期、下降期4个阶段。始病期随着播种期的不同而不同，播种越早，发病也越早，一般在移栽后2～7天开始出现病害症状；剧增期是病情急速发展的时期，各播种期间较为一致，2006年在6月25日～7月10日，历时15天；2007年在6月28日～7月12日，历时14天。病害稳定期各播种期间差异较小，2006年、2007年均在7月10日左右，此后病情开始缓慢下降，见图1、图2。图1 大田期各播种期条纹叶枯病发病动态（浙江嘉兴，2006）水稻播种期对条纹叶枯病发病有较大影响，在自然发病情况下，秧田期与大田期播种期早，病情重；播种期迟，病情轻。分析原因这与灰飞虱迁移和传毒特性有关，水稻播种期如与一代灰飞虱成虫高峰相吻合，发病就重。在浙江嘉兴市，一代灰飞虱成虫高峰一般在5月中下旬，此时播种容易造成集中传毒。水稻条纹叶枯病防治的根本措施是抗病品种的选育与推广，在目前缺乏抗病品种的情况下，适期播种是控制病害流行的最有效方法之一。水稻播种期的选择，应根据水稻品种的特性、灰飞虱成虫传毒高峰而定，在对水稻生长发育、产量、品质等影响较小和不受影响的前提下，水稻播种期应避开灰飞虱成虫传毒高峰期，应提倡适当推迟、同期播种，在浙江嘉兴市推迟至5月底至6月中旬播种较为适宜。图2 大田期各播种期条纹叶枯病发病动态（浙江嘉兴，2007）

本文以甘蓝型油菜一个抗病毒品种和一个感病毒品种为试材，利用转基因手段进行了油菜抗病毒病相关研究。利用乙烯、甲基茉莉酸、水杨酸类似物苯丙噻重氮3种化学物质诱导处理油菜叶片，提取处理前后各材料的RNA，标记探针后与拟南芥芯片进行杂交，通过对基因表达谱的分析，获得与抗病性相关的基因，从中选择3个与病毒抗性相关的基因BNP5、BNP7和BNP10。其中BNP7和BNP10为全长序列，BNP5 5'端部分序列缺失，通过5'-RACE的方法获得该基因全长序列，分别构建3个植物过表达载体pGA5、pGA7和pGA10和3个RNAi载体pGR5、pGR7和pGR10（过表达和RNAi载体均带有除草剂抗性基因bar）。采用本实验室发明的高通量花蕾原位转化法分别对所选材料进行转化。转基因当代植株收获的种子播种以后，幼苗期喷施除草剂进行筛选，并经PCR鉴定，存活幼苗80%以上为阳性植株。目前正在进行阳性植株T1代幼苗病毒抗性鉴定及相关的后续实验。

The term"programmed cell death"(PCD)is used to describe cell death that results from the activation of a cell suicide pathway that is encoded by the genome of the dying cell[1].So PCD is an important physiological mechanism for selective cell elimination during development or following damage in multicellular organisms[2].Characteristic morphological changes associated with PCD include cytoplasmic shrinking,chromatin condensation and nuclear DNA fragmentation[3].In plants,PCD is also an indispensable facet of development,defence response and architecture,which shares some characteristic features with animal apoptosis[4].Plant PCD is involved in anther,megagametophyte and vascular tissue development as well as in senescene,pollination,and sex determination[5].It is also employed as a controlled response to different biotic and abiotic stimuli[6,7].The hypersensitive response(HR)during the incompatible plant-pathogen interaction may be the most typical defence-related PCD process in plants[8].The PCD can be induced at the site of pathogen invasion as an attempt to isolate the pathogen and prevent it spreading to non-infected parts of the plant.Besides HR,plant also respond to a variety of externally added inducer by initiating PCD.These include elicitors(N-acetylchitooligosaccharides,chitosan)[9,10],signaling moleculars(hydrogen oxide, nitric oxide)[11,12] and environmental extremes(temperature stress,UV radition)[13,14].Chitosan and its fragments,the natural component of the fungi cell wall,have been shown to act as potent elicitor signals in several plant system.These include the induction of jasmonate synthesis[15],enhancement of cell wall lignification and phytoalexin production as well as to induce salicylic acid and PR proteins[16,17].In the present study,the events leading to the death of cultured tobacco cells treated with various doses of oligochitosan have been investigated.It is thus shown that oligochitosan can induce programmed cell death features in cultured tobacco cells including cell shrinkage,chromatin condensation,suggest the death process may be programmed.Oligochitosan with 85%N-deacetylation and polymerization degree from 2 to 10 was self-prepared by enzymatic hydrolysis method,solubilized(50mg/ml)in deionized water.Suspension cultures of tobacco(Samsun NN)were grown in Murashige and Skoog(MS)medium supplemented with 3%sucrose,0.5μg/ml 2,4-D.The culture were incubated with rotation(120rpm)at 25℃ with 16-hour photoperiod,on a 14 day growth cycle(10%v/v inoculum).After 12 days in culture,the cells were harvested,resuspended in fresh culture medium.All procedures were done under aseptic conditions.Oligochitosan used were sterilized by filtration through a millpore filter(0.22μm).Intracellular H2O2production was measured using 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate( DCFH-DA) as a probe.The cells were stained for 5 min with 2.5uM and then viewed under a fluorescence microscope with an excitation wavelength of 480nm.Cell viability was evaluated as described elsewhere[18],Briefly,cells in suspension culture were deprived of culture medium and incubated for 15min with 0.05%trypan blue.After several washings with deionized water to remove the excess of the dye,dye bound to dead cells was solubilized in 50%methanol/ 1%SDS and quantified spectrophotometrically by measuring the absorbance at 595nm.Hoechst 33342(HO)and Propidium Iodide(PI)was used to detect cellular change.After different times of treatment,the cells were incubated in the dark with 5μg/ml HO and 5μg/ml PI at room temperature for 30min and 15min respectively,then observed under fluorescent microscopy by using an excitation wavelength of 350nm and 570nm.Oligochitosan dose-dependently inhibited the growth of suspension-cultured cells of tobacco(Figure 1).Growth inhibition was estimated by determining the fresh weight of the cultures after 7 days of exposured to increasing concentrations of oligochitosan.In order to determine whether the antiproliferation effect of oligochitosan in tobacco suspension cultures was due to growth arrest or cell death,we analysed cell viability.Administration of 5～200μg/ml oligochitosan to tobacco cells for 6h and 24h caused cell death,as measured by trypan blue staining.The degree of cell death rose with the increase in elicitor concentration and length of treatment.The highest value was observed with 200μg/ml oligochitosan for 24h(about 55.6%),where as 50μg/ml caused about 30.6%cell death after the same time of elicitor incubation.5μg/ml is similar to control tobacco cell cultures exhibited about 5.3%of trypan blue stained cells(Fig-ure 2).Figure 1 Oligochitosan inhibits tobacco cells proliferation.Tobacco suspension(1g/100ml liquid medium),were treated with the indicated concentrations of oligochitosan, after 7 days of treatment, cell proliferation was determined by measuring the fresh weight.Figure 2 Effect of oligochitosan on viability of tobacco cells. Exponential growing cells(1g/100ml liquid medium),were treated with the indicated concentrations of oligochitosan, after 6h (closed bar) and 24h (open bar) treatment.The 100% value corresponds to heat treatment (30min 100℃).Data are means ±SD of three independent experiments.To further determine the nature of the cell death induced by oligochitosan,we analyzed the occurrence of the main PCD hallmarks recognized for plant cells such as morphological changes,nuclear morphology,and DNA fragmentation,focusing our attention on the concentration of 50μg/ml.Under light microscopy control cells showed a well defined structure with round nuclei, while oligochitosan-treated cells were found to undergo various progressive morphological changes.Cells treated for 24h with 50μg/ml,oligochitosan showed a cell disorganization with a gradual condensation of the cytoplasm and a consequent detaching of the plasma membrane from the cell wall(Figure 3 E).Different degrees of cell disorganization were found coexist,indicating a different sensitivityto the elicitor molecule in an asynchronized cell population.Treatment with 200μg/ml led to highly collapsed cells after 24h.Figure 3 Chromatin condensation and cytoplasm shrinkage induced by oligochitosan for 24h in tobacco cells. Aliquiots of both control (A,C) and oligochitosan-induced(B,D,E) cells were collected ,stained with Hoechst 33342(A,B) and Propidium Iodide(B,D),analyzed by fluorescence microscopy, or stained with trypan blue(E), and visualized under light microscopy. Pictures represent typical examples.To further investigate the cellular changes induced by oligochitosan a double staining of cells with HO/PI dyes were carried out.This staining allows the simultaneous detection of the early stages of apoptotic cells(HO+ and PI- nuclei)and of late apoptotic(HO+ and PI+ nuclei)or necrotic cells(mainly HO- and PI+ nuclei).As showen in Figure 3, Nuclei of tobacco control cells exhibited a large central nucleolus surrounded by uniformly stained chromatin,whereas the chromatin had a granular appearance with lobated nuclei in cells after oligochitosan treatment,resembling those observed during apoptosis in animals cells.Taken together the present data are suggestive of the induction by 50μg/ml oligochitosan of a cell death pathway showing some PCD-like features recognized for animal apoptosis.In the light of the crucial role played by ROS in PCD,we investigated production of ROS in oligochitosan-induced suspension-cultured tobacco cells by monitoring H2O2 production.Generation of H2O2,measured by following the fluorescence of the dye 2′,7′-dichlorofluorescin produced from the cell-permeable non-fluorescent probe 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate( DCFH-DA)in the presence of H2O2.Fluorescence occurred in the majority of cells immediately after oligochitosan treatment,as shown in Figure 4,whereas production of ROS in control cells was negligible.Figure 4 Production of H2O2 in tobacco cells induced by oligochitosan. The cells were stained with DCFH-DA.and H2O2 production was visualized by fluorescent microscopy as described in "Materials and Methods." Pictures represent typical examples.Plant cells can activate their intrinsically programmed cell death when respond to a variety of extracellular stimulus.This process may be related with plant resistance[1].Oligochitosan has been shown to be a potent elicitor,in this paper tobacco suspension cell cultures treated with exogenous oligochitosan showed some programmed cell death features including cell shrinkage,chromatin condensation,suggest the death process may be programmed.By contrast to the degradation of DNA to nucleosomal fragments observed in several plant PCD process,no detectable DNA ladder was observed in tobacco cells undergoing cell death in the considered time interval.Anna and his coworkers found that chitosan can induce programmed cell death in soybeans,and they do not observe DNA ladder either[10].Nevertheless,the lack of apoptotic bodies in plants is not surprising,if their fuction is to facilitate phagocytosis of their contents by neighboring cells.There is no way for typical apoptotic bodies to pass through the cell wall[19].Plants have an arsenal against the invasion of a broad array of environmental microorganisms.These include preexisting structure and chemical barriers as well as induced-defenses.Plants can combined different kinds of weapons to deal with enemies.Although PCD is a kind of death,it is still an active defense-related process which under plants control.Tobacco cells treated by oligochitosan produce ROS.This phenomenon has been reported already for cells subject both to pathogen attack or to abiotic stress[21,22].Oligochitosan may trigger the death program,which involve the alter of cellular redox homeostasis.It should be noted that in the cascade of events leading to cell death,the cellular level of ROS is critical.A threshold level of ROS is required to activate the signal transduction pathway that result in PCD,but at high doses,the process is subverted and death occurs rapidly by necrosis[23].These data are suggestive of the induction of PCD pathway depending on the amounts of ROS accumulated in given cells.On the whole our data suggest that tobacco cell suspension can trigger cell death program shared features with animal apoptosis when responded to oligochitosan,and it may be a kind of plant defense mechanism.

利用4个抗感杂交组合 （‘富士’ב金冠’ ‘金冠’ב富士’‘嘎拉’ב富士’ ‘富士’בQF-2’） 进行了苹果炭疽菌叶枯病抗性鉴定和遗传分析。结果表明，4 个群体中抗、感植株的分离比分别符合1∶1、1∶1、0∶1和1∶0的理论比值，初步推测苹果抗炭疽菌叶枯病性状受隐性单基因控制，抗病基因型为 rr，感病基因型为 RR和Rr。由此推测供试杂交群体的亲本品种 （系） ‘富士’ ‘金冠’‘嘎拉’ ‘QF-2’ 的基因型分别为rr、Rr、RR和rr。利用207株 ‘金冠’ב富士’ 的杂交后代为试材，构建了抗感基因池用于BSA分析。从HiDRAS和GenBank网站上下载了300 对均匀覆盖苹果染色体组的 SSR 引物，通过在亲本及抗感池中的初步筛选，将产生多态性条带的引物进行群体验证，获得了两个位于苹果15号连锁群上与抗病性状相关的分子标记 CH01d08 和 CH05g05。通过MapMarker 4.0 软件分析，将这两个标记定位于Rgls基因两侧，重组率分别为7.3%和 23.2%。依据苹果基因组 CH01d08 和 CH05g05 标记之间的序列，自行设计了276对SSR引物。经过亲本及抗感池的初步筛选及群体验证，最终筛选出 9 对与 R gls基因位点连锁的分子标记。将表型抗性鉴定结果与标记基因型数据相结合采用 JoinMap ver.4.0软件，完成了SSR标记与Rgls基因位点的连锁图谱。这11个标记覆盖了49.2 cM的遗传距离，最近的标记为 S0405127 遗传距离为 0.5 cM。Rgls基因位点两侧最近的两个标记 S0304673 和 S0405127 之间的物理距离为500kb。以‘金冠’和‘富士’及‘金冠’ב富士’的F1代群体中20株极端抗和20株极端感炭疽菌叶枯病的单株为材料，利用全基因组重测序（whole genome re-sequencing，WGR）技术，结合混合分组分析法（bulked szegregate analysis，BSA）共开发SNP位点3399950个，InDel位点573040个，SNP位点位于内含子上的465317个，位于外显子上的13029个，其中同义变异7330个，InDel位点位于内含子上的108996个，位于外显子上的19957个，其中插入或缺失3或3的整数倍的碱基，不改变蛋白质的编码框的有6928个。在全基因组范围内共得到33个候选的SNP位点及所对应的29个候选基因。通过对△（SNP-index）的筛选，将抗性基因位点快速定位于苹果第15条染色体的2～5Mb的区域内，结合SSR标记定位结果，最终锁定18个SNP位点、30个InDel位点，以及5个候选基因。通过对5个候选基因在接种病原菌后不同时间点的表达量差异及生物信息学分析，结果显示，基因MDP0000686092、MDP0000205432、MDP0000120033为功能未知蛋白，基因MDP0000945764具有CCHC型锌指结构，是丝氨酸/精氨酸富集剪接因子，具有核酸绑定、锌离子结合分子功能，参与RNA剪切生物过程，调节基因产物的表达。基因MDP0000864010具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸盐）NAD（P）绑定区域，属于NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族，具有辅酶绑定功能，可能与鼠李糖生物合成酶1有关。通过qRT-PCR验证，5个候选基因均不同程度的响应炭疽叶枯病病原菌的诱导，是苹果炭疽叶枯病抗病相关基因。通过高分辨熔解曲线 （HRM） 分析技术对SNP 及InDel标记进行验证。对SNP 及InDel引物在亲本和抗感基因池中进行初步筛选，将出现不同分型的引物在分离群体上进行验证，获得了6个SNP 及5 个InDel标记与Rgls基因位点紧密连锁。从中挑选了10 个标记对所检验出的重组个体进行了分析，将 Rgls基因位点定位于标记 InDel4199 和SNP4257之间，范围缩小为58 kb以内。以青岛农业大学苹果试验基地 （山东省胶州市） 栽培的50 个田间栽培品种和品系为试材，利用四个紧密连锁的分子标记 S0405127、S0304673、SNP4236和InDel4254验证了分子标记的可靠性。结果表明，SSR标记 S0405127，S0304673，SNP 标记 SNP4236，InDel标记InDel4254鉴定的准确率分别为 90.0%，94.0%，98.0%，96.0%，其鉴定结果的准确率均达到90%以上，可以应用于田间栽培品种、品系、种质资源以及杂种后代幼苗对炭疽菌叶枯病抗性的鉴定。一是通过对4个杂交组合的F1 群体及4个亲本进行苹果炭疽菌叶枯病抗性鉴定和遗传分析，推断出苹果抗炭疽菌叶枯病性状受隐性单基因控制，抗病基因型为rr，感病基因型为RR和Rr。二是通过300对均匀覆盖苹果染色体组的SSR引物和自行设计的276对SSR引物在亲本及抗感池中进行筛选，得到的多态性标记经作图群体验证，共获得了11个与Rgls基因位点连锁的分子标记，将抗病基因定位于苹果第15条染色体上，并完成了SSR标记与Rgls基因位点连锁图谱的构建。将 Rgls基因位点定位在 SSR 标记 S0304673 和S0405127之间，物理距离为500 kb，与最近的标记 S0405127 的遗传距离仅为0.5 cM。三是开发了与抗炭疽菌基因相关的 SNP 标记和 Indel标记，并对部分SNP 及 InDel 标记进行了验证，将 R gls基因位点进行精细定位，将抗病基因的范围进一步缩小至58 kb，并获得了14 个与抗病相关的候选基因。

菠萝在植物分类学上是凤梨科凤梨属，属于多年生草本植物，菠萝品种分为3类：皇后类、卡因类、西班牙类。目前，我国栽培的主要品种就属于这三大类。栽培品种有皇后、金皇后、菲律宾(巴厘)、纳塔尔、神湾、鲁比等；菲律宾(巴厘)是华南地区主栽品种。栽培品种有无刺卡因(又名“夏威夷”“沙捞越”)、台凤、希路等。栽培品种主要有西班牙、土种、新加坡罐用种、卡比宗那等。菠萝对环境条件的适应性比较强，但更适应于温暖湿润的气候，菠萝栽培区要求年平均气温20～27℃,冬季平均气温高于10℃;菠萝耐旱性较强，雨水过于集中对根系生长不利；光照不足，植株生长势弱，果小品质差，阳光过强时叶片变成红黄色，果实易受日灼；疏松、透气性好、pH值为4.5～6.0的土壤种植菠萝最适宜。利用老熟菠萝粗壮的顶芽、托芽和吸芽，通过假植培育后作种苗。菠萝组织培养苗一般由专业机构进行培育。组织培养苗适应性强，生长快速、成熟整齐、品质较好。园地应选择缓坡丘陵山地，排水良好，pH值为4.5～5.5疏松的酸性土，坡向以西南向为佳，东向次之。华南全年均可定植，5—8月是定植的主要季节，充分利用采果后摘下的各种芽体作种苗，且此时各种芽体老熟，高温多湿的气候也适宜定植后的幼苗生根和新叶生长。(1)耕翻。全园深翻20～30cm，多犁少耙，保持泥团直径5～8cm大小的块状，有利好气性的菠萝根系生长良好；土壤过碎，泥土易板结，大雨时泥土溅积到植株心部，妨碍植株新叶的生长发育。(2)整畦。方式有平畦、垒畦和浅沟畦三种：畦面宽度1.0～1.5m；畦沟宽0.3～0.4m、深0.2～0.25m。不易保水的沙地可开宽度1.0m、深0.30～0.35m的浅沟畦。要求选留一定面积土地作育苗地。(3)施基肥。整畦时施基肥，施入猪牛粪等优质有机肥20000～25000kg/hm2，过磷酸钙750kg/hm2，麸肥750kg/hm2，石灰1000kg/hm2，肥土混匀。(1)定植方式。可选用双行、3行和宽窄畦4行3种方式。(2)定植密度。卡因品种植45000～60000株/hm2；菲律宾种植60000～75000株/hm2；肥水充足时，密度大，单位面积产量高。但单果重则下降，抽蕾期、成熟期也晚半个月左右；小行距30～35cm，株距20～30cm。(3)种植方法。种苗要分级分地段种植，中等大小的种苗要健壮，叶肥厚浓绿，叶数8～12张。深耕浅种，以生长点不入土为原则，以免泥土溅入株心。生产上一般按顶芽入土3～4cm，吸芽入土4～5cm，大吸芽入土6～8cm进行浅种：入土后小苗要扶正压实。种后0～40d要查苗补苗。种苗要分级分地段种植，中等大小的种苗要健壮，叶肥厚浓绿，叶数8～12张。生长结果需钾量最多，氮居中，磷较少，氮、磷、钾三要素适宜比例为(3～4)∶1∶(3～4)。一般采果后施。施猪牛粪等优质有机肥20000～25000kg/hm2、过磷酸钙750kg/hm2、饼肥750kg/hm2。也可用三元复合肥1500kg/hm2代替上述肥料。(1)壮苗肥。密植园根际施肥不方便时，在施足基肥基础上，每月叶面追肥2次，肥料溶液参考配方为每3000kg水加尿素25kg、硫酸钾25～30kg、硫酸镁2kg、硫酸亚铁2kg、硫酸锌2kg溶解。如果追肥为根际施肥，壮苗肥在定植后20d左右施尿素或碳铵750kg/hm2。(2)促蕾肥。在定植后5～6个月施复合肥900kg/hm2，促进花芽分化。(3)壮果催芽肥。在定植后9～10个月施复合肥300kg/hm2；壮芽肥在采果后施尿素250～300kg/hm2、复合肥250kg/hm2。投产菠萝园一年至少施促蕾肥和壮芽肥。新开垦的菠萝园，杂草还比较少，一般一年除草4次左右，第一次在3—4月进行，浅锄轻铲；第二次除草在5—6月进行；第三次除草在正造果采收后即7—8月结合施重肥进行;第四次除草在秋冬季进行。已投产一年的菠萝地除草可减少至每年2次，一次在5—6月，另一次在秋冬季。但行间和畦面上的零星杂草每月至少拔除1次，以免杂草结籽散落在畦面和行间，造成危害。生长期间的培土，一般在雨后和采果后进行。采果后培土高度要盖过吸芽的基部。防止因雨水冲刷，导致一些根系裸露，使植株早衰和结果后倒伏。在雨后进行轻培土，即将被雨水冲到畦沟的表土培的畦面，盖住裸露的根系。被冲塌的叠畦壁，也应立即修复，等高畦内沟在雨季必须挖通，避免渍水造成菠萝烂根，导致凋萎或心腐。(1)封顶。新种植株营养生长达到催花标准时(“菲律宾”40cm长的叶片25张、卡因种34张时)即进行催花。当果实谢花后7d左右，顶芽长到5～7cm高时即进行封顶，具体做法是：一手扶果，另一手四指掌握幼果，扶稳，用大拇指将小顶芽推断。(2)托芽。果实发育的同时果柄上的托芽也大量萌生，常常影响果实正常发育，严重影响产量。因此，在托芽萌发到3～4cm长时则分期分批摘除，每次摘除1～2个，摘2～3次；用托芽作繁殖材料，卡因种可采取留近果柄基部2个芽，其余分批摘除。(3)激素催花。菠萝植株的催花标准是：“菲律宾”品种有长35cm以上、宽4.5cm的叶片30张以上，植株重为1.5kg以上；卡因种有长40cm以上、宽5.5cm的叶片35张以上，植株重为3.0kg以上。采用乙烯利进行催花：乙烯利的浓度和用量要根据季节气温变化和品种来决定：一般高温季节宜在阴天或傍晚进行，使用浓度稍低些，如在5—7月“菲律宾”品种一般用乙烯利1500倍液，即1ml乙烯利对水1.5kg，附加尿素15g，每株灌心20ml；卡因种则要用1000倍液，即1ml乙烯利对水1kg，附加尿素10g，每株灌心30ml。而开春和入秋气温偏低，浓度要高些，如2—4月或8月以后，“菲律宾”品种要用乙烯利1000倍液，每株灌心25ml；卡因种则需用乙烯利500倍液，每株灌心30ml。5d后花芽就开始分化，25～28d抽蕾，抽蕾率通常达90%以上，抽蕾和成熟期也比较一致。应用激素喷果，对菠萝果实的发育有明显的促进作用。另外，菠萝果实经激素处理后，还可以延长其成熟期。常用来喷果的激素有赤霉素、萘乙酸和萘乙酸钠。(1)赤霉素喷果。在菠萝上使用浓度为50mg/kg和70mg/kg，即1g赤霉素用5ml酒精溶解后,对水20kg或14.5kg，再加入0.1kg尿素混合拌匀喷果至湿润即可。喷后用草盖果则效果更好。大田生产通常喷2次，第一次在花蕾小花全部谢花时，可用50mg/kg浓度喷；喷后20d左右再以70mg/kg浓度喷第二次，可有效促进果实发育。(2)萘乙酸和萘乙酸钠喷果。通常在开花末期用万分之一喷第一次；隔15～20d再用万分之二喷第二次。每次都应加0.5%的尿素一起喷果，以提高激素的增产效果。应注意，萘乙酸及其钠盐，在浓度超过50mg/kg时，对吸芽有明显的抑制作用，使用时不能将药液喷到或流到叶腋和茎部，更不能喷到中小吸芽上，以免引起早抽蕾，果小，经济效益低。(3)乙烯利催熟。菠萝生产上常用乙烯利催熟，效果较好，特别是秋、冬果采用乙烯利催熟，不仅使果肉色泽良好，而且还能提早果实成熟，提前加工。同时，果实成熟一致，便于采收，降低生产成本。用乙烯利催熟时的果实成熟度，一般掌握在七成熟时进行。若按抽蕾至催熟时的天数计算，夏果约在100d，秋果110d左右，冬果则需120～130d。催熟过早，品质差，产量下降。