氮是保证葡萄正常生长结果最主要的元素之一，是原生质和酶的必要成分。氮能调节生长及结实，当其他的任何一种元素缺乏时也不会和缺氮一样很快地引起生长的停止，任何一种元素作为肥料施入土壤时也不能像氮一样迅速而明显地起作用，甚至其他元素过量地施入，也不能和氮一样表现出相反的效果。因此，氮肥管理是葡萄施肥管理中的重点。氮供应充足时，可以大大促进植株或群体的光合总产量；但若过量施氮，可使叶片生长和发育过速，叶片内的含氮量“稀释”，并增加其他元素相对缺乏的可能性；同时枝叶旺长导致相互遮阴，光合效率下降，且枝叶旺长消耗大量营养，果实成熟期推迟、果实着色差、风味淡，不利于养分积累等，产生众多副作用。氮素缺乏常表现植株生长受阻、叶片失绿黄化、叶柄和穗轴呈粉红色或红色等，氮在植物体内移动性强，可从老龄组织中转移至幼嫩组织中，因此，老叶通常相对于幼叶会较早表现出缺素症状。在增施有机肥提高土壤肥力的基础上，葡萄生产上一般可在三个时期补充氮素化肥，即萌芽期、末花期后、果实采收后，每亩施尿素30～40千克或相当氮素含量的其他氮素化肥。磷元素参与生物基本代谢与合成，在能量代谢、促进碳水化合物的运转及遗传方面起重要作用。磷元素以磷酸根离子形式供植物吸收利用，有单价磷酸根离子()和二价磷酸根离子(233223)，土壤中磷酸根离子态受土壤pH值影响，当pH值小于7时，呈233223态，为主要吸收态，pH值大于7时呈233223态，易被吸附固定成不被植物利用状态，为缺素症发生的主要因素之一。改良土壤可使被吸附固定的磷重新被释放而被植物利用。磷在植物体内移动性良好，可再利用。磷元素参与生物基本代谢与合成，在能量代谢、促进碳水化合物的运转及遗传方面起重要作用。磷元素以磷酸根离子形式供植物吸收利用，有单价磷酸根离子()和二价磷酸根离子(233223)，土壤中磷酸根离子态受土壤pH值影响，当pH值小于7时，呈233223态，为主要吸收态，pH值大于7时呈233223态，易被吸附固定成不被植物利用状态，为缺素症发生的主要因素之一。改良土壤可使被吸附固定的磷重新被释放而被植物利用。磷在植物体内移动性良好，可再利用。磷元素参与生物基本代谢与合成，在能量代谢、促进碳水化合物的运转及遗传方面起重要作用。磷元素以磷酸根离子形式供植物吸收利用，有单价磷酸根离子()和二价磷酸根离子(233223)，土壤中磷酸根离子态受土壤pH值影响，当pH值小于7时，呈233223态，为主要吸收态，pH值大于7时呈233223态，易被吸附固定成不被植物利用状态，为缺素症发生的主要因素之一。改良土壤可使被吸附固定的磷重新被释放而被植物利用。磷在植物体内移动性良好，可再利用。磷元素参与生物基本代谢与合成，在能量代谢、促进碳水化合物的运转及遗传方面起重要作用。磷元素以磷酸根离子形式供植物吸收利用，有单价磷酸根离子()和二价磷酸根离子(233223)，土壤中磷酸根离子态受土壤pH值影响，当pH值小于7时，呈233223态，为主要吸收态，pH值大于7时呈233223态，易被吸附固定成不被植物利用状态，为缺素症发生的主要因素之一。改良土壤可使被吸附固定的磷重新被释放而被植物利用。磷在植物体内移动性良好，可再利用。葡萄植株缺乏磷元素时表现叶片较小、叶色暗绿、花序小、果粒小、果实小、单果重小、产量低、果实成熟期推迟等，一般对生殖生长的影响早于营养生长(彩图11-1-1)。葡萄磷元素的补充仍以土壤施入为主，在增施有机肥的基础上，宜在花期前后和果实采收后施入适当化肥，可选用磷酸铵、磷酸二氢钾或含磷的果树专用肥料等。每亩施过磷酸钙10～15千克或相当磷素的其他磷肥。钾与碳水化合物的形成、积累和运转有关，可提高果实含糖量、降低含酸量，促进芳香物质和色素的形成，有利浆果成熟，同时对细胞壁加厚和提高细胞液浓度有良好的作用，从而促进枝蔓成熟，加强养分的贮藏和积累，提高抗病力和抗寒性。钾还对葡萄花芽的分化、根系发育有促进作用。钾在植物体内移动性良好，可再利用。葡萄有“钾质植物”之称，在生长结实过程中对钾的需求量相对较大，缺钾时，常引起碳水化合物和氮代谢紊乱，蛋白质合成受阻，植株抗病力降低；枝条中部叶片表现扭曲，以后叶缘和叶脉间失绿变干，并逐渐由边缘向中间焦枯，叶子变脆容易脱落；果实小、着色不良，成熟前容易落果，产量低、品质差。钾过量时可阻碍钙、镁、氮的吸收，果实易得生理病害(彩图11-1-2)。葡萄钾元素的补充以土壤施入为主，在增施有机肥的基础上，宜在花期前后和果实采收后施入适当化肥，可选用硫酸钾或含钾的果树专用肥料等。每亩施入20千克硫酸钾或相当钾素量的其他钾肥。钙元素参与细胞壁形成、调节光合作用，是一些酶的激活剂，具有重要的生理功能。钙在植物体内移动性差，缺钙时新梢嫩叶上形成褪绿斑，叶尖及叶缘向下卷曲，几天后褪绿部分变成暗褐色，并形成枯斑。缺钙可使浆果硬度下降，贮藏性变差等。葡萄缺钙常发生在酸度较高的土壤上，同时过多的钾、氮、镁供应也可以使植株出现缺钙症状。葡萄根系对钙的吸收主要集中在花期到转色期，吸收量占全年总量的60%。可增施有机肥，调节土壤pH值，土壤施入硝酸钙或氧化钙，控制钾肥施入量，调节葡萄树体钾/钙比例。根据叶柄营养分析，使钾/钙比在1.2～1.5为宜，如果高于此值，减少钾或增加钙。钙也可通过叶面喷肥加以补充，缺钙严重的果园，一般可于葡萄生长前期、幼果膨大期和采前1个月叶面喷布钙肥，如硝酸钙、氯化钙等，浓度以0.5%为宜。钙在葡萄体内移动性差，因此，以少量多次喷布效果为佳。硼能促进葡萄花粉管的萌发和生长，促进授粉受精，提高坐果率，减少无籽小果比率，提高产量，促进芳香物质的形成，提高含糖量，改善浆果品质。同时，硼可以促进新梢和花序的生长，使新梢成熟良好。葡萄缺硼时可抑制根尖和茎尖细胞分裂，生长受阻，表现为植株矮小，枝蔓节间变短，副梢生长弱；叶片小、增厚、发脆、皱缩、向外弯曲，叶缘出现失绿黄斑，叶柄短、粗。根短、粗，肿胀并形成结，可出现纵裂。硼元素对花粉管伸长具有重要作用，缺乏时可导致开花时花冠不脱落或落花严重，花序干缩、枯萎，坐果率低，无种子的小粒果实增加(彩图11-1-3)。硼的吸收与灌溉有关，干旱条件下不利于硼的吸收，另一方面，雨水过多或灌溉过量易造成硼离子淋失，尤其是对于沙滩地葡萄园，由此造成的缺硼现象较为严重。硼缺素症的防治可在增施有机肥、改善土壤结构、注意适时适量灌水的基础上，在花前1周进行叶面喷硼，可喷21%保倍硼2000倍液或0.3%硼酸(或硼砂)等，在幼果期可以增喷一次。在秋季叶面喷硼效果更佳，一是可以增加芽中硼元素含量，有利于消除早春缺硼症状，二是此时叶片耐性较强，可以适当增加喷施浓度而不易发生药害。在叶面喷肥的同时应注意土壤施硼，缺硼土壤施硼宜在秋季每年适量进行，每亩每年施入硼砂500克，效果好于间隔几年一次大量施入。土壤施入硼时应注意均匀，以防局部过量而导致不良效果。锌元素参与多种酶促反应和植物激素的合成，尤其是与植物生长素和叶绿素的形成有关。缺锌时植株生长异常，新梢顶部叶片狭小，呈小叶状，枝条纤细，节间短。叶片叶绿素含量低，叶脉间失绿黄化，呈花叶状。果粒发育不整齐，无籽小果多，果穗大小粒现象严重，果实产量、品质下降。锌在土壤中移动性很差，在植物体内，当锌充足时，可以从老组织向新组织移动，但当锌缺乏时，则很难移动(彩图11-1-4、彩图11-1-5)。葡萄树栽植在沙质土壤、高pH值土壤、含磷元素较多的土壤上，易发生缺锌现象。防治缺锌症可从增施有机肥等措施做起，补充树体锌元素最好的方法是叶面喷施。茎尖分析结果表明，补充锌的效果仅可持续20天，因此锌应用的最佳时期为盛花期前2周到坐果期。可应用锌钙氨基酸、硫酸锌等。另外，在剪口上涂抹150克/升硫酸锌溶液对缺锌株可以起到增加果穗重、增强新梢生长势和提高叶柄中锌元素水平的作用。落叶前使用锌肥，可以增加锌营养的贮藏，对于解决锌缺乏问题非常重要和显著；落叶前补锌，开始成为重要的补锌形式。铁元素是植物许多蛋白和酶的组成成分，参与光合作用和呼吸作用，是植物叶绿素的重要组成物质，同时参与体内一系列代谢活动。铁在植物体内不易移动，葡萄缺铁时首先表现的症状是幼叶失绿，叶片除叶脉保持绿色外，叶面黄化甚至白化，光合效率差，进一步出现新梢生长弱，花序黄化，花蕾脱落，坐果率低(彩图11-1-6)。葡萄缺铁常发生在冷湿条件下，此时铁离子在土壤中的移动性很差，不利于根系吸收。同时铁缺乏还常与土壤较高pH值有关，在此条件下铁离子常呈不为植物所利用形态。克服铁缺素症的措施应从土壤改良着手，增施有机肥，防止土壤盐碱化和过分黏重，促进土壤中铁转化为植物可利用形态。同时可采用叶面喷肥的方法对铁缺素症进行矫正，可在生长前期每7～10天喷一次螯合铁2000倍液或0.2%硫酸亚铁溶液。铁缺乏症的矫正通常需要多次进行才能收到良好效果。葡萄气灼病，亦称为缩果病，是与特殊气候条件有直接或间接关系的生理性病害，为水分生理失调和高温环境共同作用引起的，属于“生理性水分失调症”之一。气灼病为红地球葡萄常见病害之一，尤其是果实套袋后发生较多；在其他葡萄品种上，气灼病也时有发生，有些年份非常严重。气灼病发生严重时，病穗率可在80%以上，产量损失可达10%～30%。在我国1998年的宁夏葡萄产区(贺兰山东麓)、2001年山西省晋南葡萄产区均发生了大范围的且比较严重的气灼病，损失惨重。在葡萄生产中，有些地区的果农把气灼病误认做“日烧病”。严格的讲，两者在发生时期、为害症状等方面均存在明显不同，应区别对待。气灼病一般发生在幼果期，从落花后45天左右，至转色前均可发生，以幼果期至封穗期发生最为严重。首先表现为失水、凹陷、浅褐色小斑点，并迅速扩大为大面积病斑，整个过程基本上在2小时内完成。病斑面积一般占果粒面积的5%～30%，严重时一个果实上会有2～5个病斑，从而导致整个果粒干枯。病斑开始为浅黄褐色，而后颜色略变深并逐渐形成干疤(几个病斑的果实，整粒干枯形成“干果”)。病斑常发生在果粒近果梗的基部或果面的中上部，在果粒的侧面、底部也可发生(彩图11-2-1至彩图11-2-3)。发生部位与阳光直射无关，在叶幕下的背阴部位、果穗的背阴部及套袋果穗上均会发生。如土壤湿度大(水浸泡一段时间后)、遇雨水(在葡萄粒上有水珠)后，若忽然高温，在有水珠的部分易出现气灼病。气灼病是由于“生理性水分失调”造成的生理病害，与特殊气候、栽培管理条件密切相关。任何影响葡萄水分吸收、加大水分流失和蒸发的气候条件、田间操作，都会引起或加重气灼病的发生。一般情况下，连续阴雨后，土壤含水量长期处于饱和状态，天气转晴后的高温、闷热天气，易导致气灼病发生。这可能是由于根系被水长时间浸泡后功能降低，影响水分吸收；而高温需要蒸腾作用调节体温，需要比较多的水分，植株需水与供水发生矛盾，导致水分生理失调而发生气灼病。气灼病发生情况在品种间有差异，如红地球、龙眼、白牛奶等品种气灼病相对较易发生。葡萄套袋，尤其是套袋前大量疏果会引起或加重气灼病的发生。土壤通透性差(土壤黏重、长期被水浸泡)、土壤干旱、土壤有机质含量低，会引起或加重气灼病的发生。葡萄气灼病的防治，从根本上是保持水分的供求平衡。因此，防治气灼病要从保证根系吸收功能的正常发挥和水分的稳定供应入手。首先要培养健壮、发达的根系，可采用增施有机肥来提高土壤通透性、调整负载量、防治根系和地上部病虫害等措施，有利于根系呼吸和根系功能正常，避免或减轻气灼病。水分的供应，包括土壤水分供应和水分在葡萄体内的输导两个方面。在易发生气灼病的时期(大幼果期)，尤其是套袋前后，要保持充足的水分供应。水分供应一般注意两个问题：第一，土壤不能缺水，缺水后要注意浇水。滴灌是最好的浇水方法，如果大水漫灌，要注意灌溉时间，一般在18：00至早晨浇水，避免中午浇水。第二，保持水分。有机质含量丰富、覆盖草或秸秆等，都有利于土壤水分的保持，减少或避免气灼病。另一方面，主蔓、枝条、穗轴、果柄出现问题或病害，会影响水分的输导，引起或加重气灼病的发生。尤其是穗轴、果柄的病害，如霜霉、灰霉、白粉等病害，及镰刀菌、链格孢为害，均影响水分传导。所以，花前花后病虫害的防治，尤其是花序和果穗的病害防治非常重要。从近几年的调查看，病虫害规范防治的葡萄园，可有效避免或减少穗轴、果柄伤害，能减轻或避免气灼病的发生。协调地上部和地下部的平衡关系。如果根系弱，要减少地上部的枝、叶、果的量，保持地上部和地下部的协调一致，会减轻或避免气灼病。主要发生在浆果近成熟期，表现为果皮开裂。裂果不仅影响果实的外观，而且会导致外源微生物的侵染，发生腐烂(酸腐病)，严重降低果实的商品价值(彩图11-3-1)。葡萄裂果一般是由于水分吸收不平衡而导致的果皮破裂，其发生的根本原因是葡萄果实在较长时间的干旱条件下突然大量吸水，引起果实含水量急剧增加，使果实皮层细胞的体积大幅度增加，而果实表皮细胞膨大较慢造成果实内外生长失调而形成裂果。引起葡萄裂果的原因还有果穗的粒间过于紧凑，后期因果实膨大而互相挤压造成裂果；病虫的为害和机械损伤，使果皮受到一定的损害，进而降低了果皮抗内压的能力，从而导致裂果；药害造成的果皮伤害，导致果皮韧性减小等。因此，影响葡萄裂果的主要因素如下。（1）水分供求平衡问题。尤其是在持续高温久旱的情况下，突遇大雨或大水灌溉，造成土壤和空气湿度急剧变化，使果肉细胞迅速膨大，易造成裂果。（2）与土壤条件有关。一般在地势低洼、易板结、排水不良、通透性差、易旱易涝的黏土上易裂果；土层厚、土质疏松、通透性好的沙壤土上裂果轻。（3）与品种有关。一般乍娜、里扎马特、香妃等品种裂果严重，而京亚、红地球等品种不易发生裂果。（4）与果皮强度有关。果皮强度随着果实成熟急剧下降，同一果粒不同部位降低的幅度不同。如玫瑰露葡萄，果粒密集，接触部位果皮薄，果皮强度降低幅度大；巨峰着色期，果顶部出现小龟裂或从蒂部到果粒中部产生纹状凹陷，这些部位果皮强度低，易裂果。（5）与某些病虫害有关。白粉病为害后，果皮硬化失去弹性，硬核期后从果顶纵裂。红蜘蛛为害后，果面形成褐色锈斑，多为果蒂纵裂。（6）与栽培管理有关。一般树势弱、光照差、通风不良及施氮肥过多的果园裂果重。负载量大、叶果比小、着色延迟，易诱发裂果。（7）与农药使用有关。幼果期，尤其是落花后的45天以内，农药的品种或使用不当，造成果皮伤害，后期容易裂果；喷布乙烯利或赤霉素易造成裂果。在易发生裂果的地区首先选择不易裂果的品种；栽培措施中应着重保持果实发育后期水分的供求平衡与水分供应的稳定性，防止土壤水分急剧变化现象的发生；做好花果管理工作，通过疏穗、疏粒控制负载量和果粒着生状况；易裂果品种不使用乙烯利或赤霉素；落花后农药品种的科学选择和使用；加强病虫害防控工作，减少病虫为害导致的裂果现象发生。葡萄成熟的果穗中有时会出现许多小粒果实，多数小粒果实不着色，但也有部分小粒果亦可着色、成熟，一般小粒果实中没有种子，但小粒果没有商品价值(彩图11-4-1)。果穗中出现较多小粒果的现象称为果实大小粒，它不仅影响果穗整齐度，使外观品质下降，也对产量有较大影响。在果实第一次速长期时，由于部分果实停止生长，果实体积不再增大，从而形成大小粒现象。葡萄大小粒的形成主要与授粉受精不良和树体营养及生长势有关。良好的授粉受精可使葡萄果实在发育过程中成为生长中心，可调运营养，满足果实的迅速生长发育之需，如授粉受精不良，导致果实发育受阻而形成小果。葡萄前期如果生长势过于旺盛，营养生长过强，营养生长与生殖生长不平衡，花芽分化过程中性细胞分化不良，常加重果实大小粒现象的发生。生产上前期若施氮肥过多、营养元素供应不平衡尤其是锌元素的缺乏、供水过多、修剪不合理等，易导致果实出现大小粒现象。合理修剪，调节树势。对新梢摘心时间和强度及副梢处理方式务必考虑品种特性，因品种而异。平衡施肥，控制氮肥施用量，对缺锌植株及时补充锌肥(参见锌肥施用方法)。花前或花期使用硼肥，促进授粉受精。合理灌溉，花前控制水分供应，减少枝梢旺长。及时进行花、穗管理，如修整果穗、掐穗尖、疏果等。葡萄上的药害分两个方面：葡萄园使用的药剂选择不当或使用不当造成的药害；葡萄园周围农田使用药剂，药液飘移造成的药害(彩图11-5-1至彩图11-5-11)。(1)代森锰锌。代森锰锌是混配型、安全性比较好的杀菌剂，但原药杂质高或质量不高(悬浮率等)时，容易造成药害。所以，注意选择使用质量比较好的品牌，或在花前及套袋前不使用，在套袋后及采收后使用。使用代森锰锌的混配制剂，代森锰锌原药的质量直接决定混配制剂的质量；如果代森锰锌原药选择不当，其混配产品产生药害的风险增大。(2)百菌清。在某些品种上有药害，用百菌清混配的制剂存在相同的药害风险。(3)溴菌腈(炭特灵)。在果皮比较薄的品种上产生药害。(4)三唑类。所有三唑类杀菌剂在葡萄上使用，几乎都存在药害的风险。最严重的药害是抑制果实、新梢、叶片的生长。其次是造成叶片的早衰。当然，这类产品差异性很大，有些比较安全。同时，葡萄的品种多，有些药剂对某些品种安全，但对另一些品种就存在比较大的药害风险。比较安全的三唑类农药有苯醚甲环唑、戊唑醇等。(5)克菌丹(开普敦)。我国在葡萄上很少使用，但国外报道在葡萄果实上使用克菌丹存在严重的药害，请谨慎选择和使用或避开幼果期使用。(6)硫制剂使用不当会在果实和叶片上存在药害。药害的发生，与产品质量、温度有直接关系：分散性、悬浮率不好，容易造成药害；温度高于30℃，容易产生药害。所以，我国一般在葡萄发芽前后、落叶前等时期使用硫制剂。(7)退菌特在葡萄上使用不当有药害。(8)赤霉素使用过量会影响花芽形成，影响第二年的产量和质量。(9)细胞分裂素。细胞分裂素类的物质往往造成叶片畸形。(10)其他。国外报道了乙烯菌核利、硫丹、甲基砷酸铁铵钠盐(田安)、百草枯、草甘膦、敌草隆、麦草畏、西玛津等对葡萄的药害。因我国在葡萄园使用比较少，不作介绍。由于分田到户，每家葡萄园面积不大，周围被其他人的农田包围；如果其他农田使用药剂(尤其是除草剂)，药剂飘移到葡萄园，造成药害。这种情况在东北地区非常严重，已经成为危害葡萄生产的重大问题，造成乡亲、邻里之间的矛盾和对立，不但影响葡萄生产和葡萄质量，还影响社会和谐。葡萄采收后，需要经过贮藏运输才能到达消费者手中。鲜食葡萄贮运期，会受到病害的困扰；发生的病害也有多种，归纳起来有两类：一类是侵染性病害，另一类是生理性病害。贮藏期的侵染性病害主要由真菌引起，按照病原菌对温度的适应范围，又可分为两类。即适于常温、亚常温和较低温度的一类病害，为了便于区别另一类病害，我们给这一类病害起名为低温病害，这类病害发生较多的有以下几种。1.葡萄灰霉病由于灰霉菌在-0.5℃仍可生长，因此，它是葡萄低温贮藏中的主要病害，也是鲜食葡萄贮藏中具毁灭性的病害。葡萄对此病的抵抗力很弱，各品种葡萄皆易感染。灰霉病在葡萄种植园的为害也时有发生，易在被侵染部位形成黑色的菌核，这些菌核在干燥或不利的条件下长期存活。菌核在潮湿的条件下则萌发产生大量分生孢子，这些孢子能侵染幼芽、花和浆果。在贮藏期间，目前尚无有效药剂可在防治灰霉病腐烂和总的适用性方面超过SO2的性能和效果。2.葡萄青霉病葡萄青霉病是葡萄贮运期间一种较常见的病害。（1）病原。青霉属真菌（Penicillium spp.），属半知菌亚门，丝孢纲。有几个不同的种，其中指状青霉（P.digitatum Sacc.）是较常见的种。在PDA培养基上生长茂盛；菌落绒状，暗黄绿色，后变榄灰色，背面无色或淡暗褐色，有特殊的香味，分生孢子梗较短，直径4～5微米，帚状枝大而不规则；小梗在不同的高度上形成，尺度为（14～21）微米×（2.8～6.5）微米。(2)症状。初期病原菌在葡萄上形成2～8毫米水浸状圆形凹斑，果面皱缩，果实软化，组织腐烂并有一种霉味。受害的果实，组织稍带褐色，逐渐变软腐烂，果梗和果实表面常长出一层相当厚的霉层。霉层开始出现时呈白色，较稀薄，为病菌的分生孢子梗和分生孢子，当其大量形成时，霉层变为青绿色，较厚实。受害果实均有腐败的气味。在密闭的包装箱里，一旦出现病果，腐烂便会迅速地扩展，造成大量葡萄果实腐烂，甚至全箱腐烂，危害甚为严重。(3)发病规律。青霉菌是弱寄生性菌，发生侵染的部位通常是因为操作粗放、包装过紧或其他原因造成的果实伤口。病害的扩展主要与湿度有关，在包装箱内湿度高的条件下，病菌侵入果实后，可以很快地繁殖，并扩散到烂果接触的邻近果实上。青霉菌的发生还与葡萄种类、环境温度有关。在鲜食和制干葡萄生产区，如果温度太高，不利于病菌的繁殖和扩散，青霉病就发生的少；对于冷凉地区的酿酒葡萄品种来说，由于葡萄穗上的果粒紧密，较低的温度又有利于病菌的扩展，青霉病一般发生较为严重。(4)预防措施。参考葡萄灰霉病。青霉菌在低温0℃以下生长缓慢。在运输和贮藏期间可用SO2杀死或抑制青霉菌发展。精细采收与贮运，也是防止伤果、防止青霉菌为害所不可忽视的有效措施。3.葡萄黑斑病(1)病原。由真菌引起的病害。主要有多枝孢霉(Cladosporium herbarum)、交链孢霉(Alternaria alternata)和葡柄霉(Stemphylium)，是葡萄贮藏后期的重要病害。各品种葡萄都易发生此病，其中以欧洲种葡萄发病为重。(2)症状。初期发病果实上有不规则近圆形浅褐色斑，表面光滑干燥，后形成黑色或浅绿色霉层；多发生在穗梗、果梗基部及果粒侧面，并使果梗迅速失水、干缩、失绿，易侵入果刷而导致果实落粒。(3)发病规律。病菌主要由采前经田间侵入，在1～2℃的冷库中仍然能发病。枯死的花易被侵染并成为传播源，孢子借空气传播。即使在无雨的条件下，病菌也能直接侵入健康的成熟果实组织，在潮湿条件下，葡萄果实会大量发病。(4)预防措施。参考葡萄灰霉病、炭疽病的防治。上述这些病害的特点，在环境温度0～2℃下分生孢子可以萌发，菌丝还可以缓慢生长，低温下危害较大，是长期贮藏防治的对象。这类病害的病原菌需在5℃以上的温度，菌丝才能生长并开始为害。随着温度不断升高，为害不断增强，是长途运输期的主要防治对象。常见的这类病害如下。1.葡萄黑霉病(1)病原菌。黑根霉(Rhizopus nigricans)。病原菌不能在-0.5～0℃条件下生长。它是在高温运输、存放或土窖贮藏时常出现的病害。常见于马奶、无核白等葡萄早、中熟品种。(2)症状。发病初期菌丝侵入果实，先出现褐色水浸状斑，后果实流汁、软烂，果皮易脱落，病组织可迅速感染健康组织。发病果实上长出绒毛状灰色黑头菌层，故称黑霉。病菌子实体出现之前，症状类似青霉菌引起的腐烂。(3)发病规律。黑根霉是一种喜温的弱寄生菌，它主要通过果实表面的伤口侵入，因此，葡萄园管理和采收、包装操作粗放，容易为病菌侵入创造条件，高温高湿的环境条件特别利于病害的发生和发展。病菌生活在土壤或植物残体中，其孢子借空气传播。初侵染多从伤口进入，可迅速传播并侵染邻近的健康果实。(4)预防措施。参考葡萄灰霉病。降低贮藏温度，防止果实碰伤和用SO2防腐均有明显的防治效果。采后葡萄迅速预冷可大大降低因根霉菌引起的腐烂。2.葡萄曲霉腐烂病（1）病原。引起黑粉病的主要病原菌是黑曲霉（Aspergillus niger V.Tieghem），属半知菌亚门，丝孢纲。分生孢子穗灰黑色至炭黑色，圆形至放射状，直径0.3～1毫米；分生孢子梗尺度为（200～400）微米×（7～10）微米；顶囊球形或近球形，表面生小梗两层；分生孢子成熟时球形，初光滑，后变粗糙或有细刺，有色物质表面沉积成瘤状、条状或环状，直径2.5～4微米；有时产生菌核。(2)症状。黑粉病的主要特征是烂果表面产生大量的黑粉或紫黑粉状物，这是病菌的分生孢子梗和分生孢子，烂果常有一股潮湿的腐败气味。葡萄成熟时开始发生，到收获时，烂果常剩下一层干壳，用手轻碰整个腐烂的果穗，便会释放出尘埃状的孢子粉末。(3)发病规律。黑曲霉也是一种喜温好湿的弱寄生菌，21～38℃的高温最有利于黑曲霉的扩展。因而，此病常见于湿热地区。黑曲霉的侵染需要伤口和高湿度。病菌的分生孢子存在于各种基质和空气中，但只有果皮破裂或受损伤才会侵染。(4)预防措施。葡萄在采收、包装、运输、贮藏过程中，应尽力避免机械伤。为此，应轻拿轻放，防止挤压，避免二次装箱和倒箱。病害防治方法参考葡萄灰霉病。鲜食葡萄采后在贮运过程中，由于环境条件不适宜，引起生理代谢失调，发生的病变，均属于生理病害。生理病害按其病变的原因，分以下几种。1.症状SO2是葡萄常用的防腐保鲜剂，使用不当极易使葡萄中毒，果皮出现漂白色，以果蒂与果粒连接处周围的果面或在果皮有裂痕伤处最严重，中毒葡萄粒上产生许多黄白色凹陷的小斑，与健康组织界限清晰；严重时一穗上大多数果粒局部成片褪色，甚至整粒果实呈黄白色，有时整穗葡萄受害。2.发病规律鲜食葡萄冷藏指南的国际标准(ISO 2168—1974)中明确提出，“为了防止真菌繁殖，特别是灰霉菌的繁殖，可使用杀菌剂。目前通常用二氧化硫进行预处理”。但在生产实践中发现，如果二氧化硫使用不当，特别是采用直接注入二氧化硫或点燃硫磺产生二氧化硫熏蒸时，往往因用量不当，二氧化硫与空气混合不均匀等原因，使葡萄褪色或出现异味。伤害程度取决于进入果粒的二氧化硫量。葡萄对二氧化硫忍耐最弱处是浆果与果柄之间的连接处。如果果粒表面有伤口，则二氧化硫也很容易从伤口处进入。一般来讲，果实温度高的葡萄吸收二氧化硫比果实温度低的葡萄快；未成熟的葡萄吸收二氧化硫比成熟的快；薄皮品种比厚皮品种吸收快；果穗松散的比紧密的吸收二氧化硫快。破碎、损伤、潮湿及发霉的葡萄吸收二氧化硫比自然状态良好的葡萄迅速；果蒂部对二氧化硫比果粒更敏感。研究和生产实践都表明，葡萄不同品种对二氧化硫的耐受性存在较大差异。巨峰、龙眼、玫瑰香、泽香、秋黑等葡萄品种较耐二氧化硫，而红地球、木纳格、马奶等品种对二氧化硫敏感。因此，耐二氧化硫的品种和对二氧化硫敏感的品种，在保鲜剂的使用量和配置方面是不相同的。以下情况会加速SO2释放而引起漂白和加重SO2对果实的污染：果箱袋内严重结露湿度过大；果箱垛码过紧，果箱间温度差异大，贮藏前期(15天)果实温度高于0℃；冷库预冷不达标，冷库温度波动大；药剂投放量偏多或使用粉剂型且释放速度快的药剂；药剂扎眼数多或孔很大；果实质量差，引起裂果和呼吸强度大；果实伤害较多，引起呼吸强度升高。3.防治措施对葡萄采用点燃硫磺产生二氧化硫的方法处理时，应采用低浓度、分次处理的方法。对于不耐二氧化硫的品种，一要使用较低的浓度，并要先做剂量试验，以免造成较大的损失。研究指出，导致葡萄吸收5～18毫克/千克的二氧化硫熏蒸处理，足以控制灰霉病的发生，在连续作用条件下，空气中二氧化硫的浓度应保持在80～300毫克/千克，这样宽的浓度幅度在实际应用时就应充分考虑，根据不同品种和其他情况灵活掌握。如果采用亚硫酸盐缓释剂与葡萄一起放入保鲜袋，则果实封袋前对葡萄必须进行良好的预冷处理，必须把果实的温度在尽量短的时间内降到0℃后(正常年份巨峰葡萄的预冷时间一般不得超过12小时，红地球葡萄的预冷时间一般不超过24小时)，再扎紧袋口。贮藏期间保持-1～0℃的恒定低温，以保证袋内不结露和出现水汽，就可使二氧化硫的挥发缓慢均匀，减免二氧化硫伤害。必须注意不同的品种对二氧化硫的忍耐性相差很大，绝不能把贮藏巨峰、龙眼等葡萄的保鲜剂用量，用于不耐二氧化硫的红地球等品种上。根据运输距离决定是否使用保鲜剂；用于贮运的葡萄分别使用运输用保鲜剂和贮藏用保鲜剂，注意药剂种类、品种选择等以控制二次污染；注意SO2型防腐保鲜剂在箱内的均匀摆放与药剂释放量的调控。总之，不要采摘成熟不良或采前灌水的葡萄用于贮藏；对SO2较敏感的品种如里扎马特、牛奶、粉红葡萄、皇帝、无核白、红地球等，要通过增加预冷时间、降低贮藏温度、控制药剂用量和包装膜扎眼数量或者使用复合保鲜剂，适当减少SO2释放量；减少人为碰伤，一旦果皮破伤或果粒与果蒂间有肉眼看不见的轻微伤痕，都会导致SO2伤害而出现果粒局部漂白现象。另外，挤压伤也会引起褐变，压伤部位呈暗灰色或黑色，并因吸收SO2而被漂白。1.病状裂果是葡萄贮藏过程中最易发生的生理病害，多在果顶或梗附近发生果皮与果肉破开。2.发病原因及条件粉红葡萄、红马拉加、无核白、乍娜、里扎马特、美国黑大粒等品种易发生裂果。若采前灌水或成熟期多雨，即使果皮较厚的巨峰葡萄，在贮藏期间也会发生裂果，随贮藏期的延长而加重。此病应通过栽培措施加以控制。开裂的果实在贮藏过程中不但自身易腐烂和出现漂白斑点，而且裂果易造成“保鲜剂局部积累过多”，其余部分葡萄果实周围的“药劲不足”。3.防治措施采收前防止裂果，请参考生理性病害。在贮藏过程中要防止裂果，主要办法是：①降雨量大的年份，或者生长前期干旱后期降雨量大的年份应延迟采收并延长预冷时间。②采收前喷布100倍CT葡萄涂膜剂。③严禁有裂果的葡萄入库贮藏。④防止贮藏过程中保鲜袋内的结露。⑤采收及贮藏过程中要轻拿轻放，防止挤压、颠簸，包装容量不宜过大，应以单位重量5千克以下为宜。1.症状虽然略低于冰点的温度并不伤害果实，但可使果梗变成深绿色，呈水渍状态，贮藏时易受SO2侵害，出现浅褐色腐烂，最后造成果梗干缩变褐。果实受冻时可呈褐色、蔫软，或渗出果汁。冻害还导致霉菌侵染，引起霉变腐烂。2.发病原因及条件北方地区，晚熟、极晚熟品种会受各种因素影响而采收期推迟，常会在晚秋遇到早霜冻。冻害既可能发生在田间，也可能因冷库温度低于葡萄冰点引起冻害。在长城以北地区，极晚熟品种采收期极易遇早霜、轻霜，若持续时间不长，对果穗影响不大；经受重霜或霜冻危害的葡萄则不能用于贮藏。3.防治措施（1）采收期不宜过晚，应在早霜之前采收完毕。（2）贮藏过程中温度应严格控制在-0.5℃±0.5℃。（3）靠近冷风机附近的葡萄应加覆盖物。（4）及时观察库内的情况，一旦看到葡萄出现冻结情况应及时调控温度，如果冻结时间不很长，通过逐步升温可以缓解。1.症状葡萄果肉褐变在不同品种上的表现不同，红色品种褐变表现为果实色泽发暗，一些白色品种更易显现，如牛奶、无核白、意大利、白马拉加等欧洲种的脆肉型品种。这类品种在贮藏后期也易出现果肉内部褐变。一般是从维管束开始褐变向果肉扩展。2.发病原因及条件葡萄的褐变由多种因素引起，衰老也是褐变的一种表现，冻害或损伤也能引起果肉褐变。此外灰霉病等病菌的侵染，果实贮藏过程中气体不适也会引起果肉褐变。3.防治措施贮藏期应随时注意观察褐变的初始迹象，并及时出库销售。（1）贮藏温度过低，但未达到冰点，引起生理代谢失调，发生果皮、果梗及果穗褐变，属于冷害。（2）气调贮藏中，过低的O2（2%以下），过高的CO2（10%以上），产生的低O2和高CO2伤害。（3）贮藏温度过高，湿度过大，引起的大量脱粒；或采前使用催熟剂，发生脱粒。采前葡萄生育期的气候、栽培管理、病虫害防治、葡萄质量对采后各类微生物病害、生理病害均可产生影响(表11-1)。采前不利因素可能引起的贮藏病害花前多雨灰霉病菌侵入、潜伏，贮藏期发病霉烂果实成熟期多雨灰霉等病菌侵入、发病，贮藏期裂果、霉烂、SO2漂白果实熟期连续干旱裂果、干梗果实采前轻霜冻果梗SO2漂白、霉变黑梗产量过高或施氮过多裂果、SO2漂白、果穗内部腐烂花前花序拉长剂过量干梗果实熟期使用催熟、催红药脱粒、裂果后期感染霜霉病、白腐病、炭疽病干梗和果实腐烂采前灌水裂果、腐烂和SO2漂白表11-1 采前因素对葡萄贮藏病害的影响由于引起葡萄贮藏期果实腐烂的病原主要是一些由伤口侵染的弱寄生菌，其中有些是早期侵入后，由于寄主的抗性较强而潜伏于果实内，待果实成熟时才出现症状，引致腐烂；此外，多数是在高湿度和高温、不通风的贮藏条件下，有利于病害发展。因此，对这类病害的防治，应以做好早期的预防工作为主。1.采收前葡萄园应进行精细管理，通过修剪清除受伤和已发病的果实；使用一定浓度的赤霉素适当疏果，使果穗不要过于紧密，以防成熟前或成熟过程中，由于果粒膨大相互挤压造成果皮伤裂；在刚坐果和果实成熟时，应慎重用水，避免造成太大的田间湿度和在果实表面长时间留下自由水，而给病菌创造有利的侵染条件。此外，田间病虫害的防治，具有决定性作用。2.采收时采收时期过早，果实含糖量低、酸度高，会影响果实的品质和产量，采收过晚，有的品种易出现落粒现象，而且果实过熟往往不利于贮藏。因此，要根据品种的特性，市场的需要，选择相适宜的采收期。由于葡萄果实皮薄汁多，采收时，剪、拿、运、送等操作都要十分细致小心，尽量减少损伤，防止擦去果粉，采收的时间宜选择晴朗天气露水干后的上午或气温凉爽的傍晚，在露水未干的清晨、阴雨天，特别是雨后烈日暴晒的情况下不宜采收，不然会降低品质和不利于贮藏。3.采收后采收后应迅速将果实运送到阴凉处摊开散热，然后进行整修、分级包装。整修时应将所有病果、虫伤和机械损伤的果实剪除。装箱后要进行预冷，以消除田间带来的热气，及降低呼吸率，还可以预防果梗变干、变褐及果粒变软或落粒，利于延长贮存时间。贮藏前用二氧化硫熏蒸，不但能杀死果实表面各种可能引起果腐的病原菌，而且可以降低果实呼吸率，减少糖分的消耗，并能较长时间保持果色和保持果穗梗的新鲜状态。4.综合防治贮藏真菌病虫害防治的主要措施如下。(1)加强果园田间病害防治。(2)长期贮藏的葡萄可于采前对果穗喷一次杀菌剂。(3)采收时认真筛选栽培管理好的无病果园和挑选果穗，剔除病、虫、伤果。(4)轻拿、轻放、轻运，防止人为伤果。(5)迅速降低库温，保持温度稳定。(6)气调贮藏，选择适合不同品种的保鲜袋。(7)使用防腐保鲜剂。采后葡萄产品质量是葡萄贮藏病害防控的生命线。近年来我国葡萄质量虽有很大的进展，但与贮藏果品的质量要求还有差距。1.葡萄标准化栽培方面(1)整形修剪。葡萄果穗生长期间，可使用生长调节剂调控或进行整形修剪、疏花疏果，培育出适合的穗形和果粒。一般果穗在300～500克，大穗型在700～800克。亩产不超过1500～2000千克。(2)架式改良与机械化利用技术。通过架式以及栽培方式的改良，使得葡萄果实穗形、成熟度等各方面标准统一，既有利于采后葡萄果实外观以及品质质量，又方便机械化操作。(3)肥料使用技术。果穗生长期间，适量施用氮肥，适期多施有机肥和磷、钾肥。(4)节水灌溉技术。葡萄采前10～15天内停止灌溉，遇雨应推迟采收并及时排水。(5)病虫害综合防治技术。葡萄采前在田间病虫害的规范化防治，采前应喷1～2次食品添加剂级防腐保鲜剂。(6)植物生长调节剂安全使用技术。适量使用膨大剂和无核剂。严禁使用催熟、催红、催甜等激素。(7)葡萄栽培生产中，果实套袋管理。可调节果色，减少病虫污染和减少农药使用。(8)记录葡萄生产档案，建立质量追溯系统。控制葡萄源头的质量是确保物流中鲜食葡萄质量和安全的源头，建立质量可追溯系统，可实施产地标识，即在包装箱上清楚标记生产农户、产品名称、地点、产品标准、等级等，进行质量跟踪，提高安全意识。2.采收关键环节应在早晨露水干后或下午气温凉爽时采收，避免在雾天、雨天、烈日暴晒时采收。同一果园葡萄应多次采收。应选择果穗紧凑、穗形适宜，果粒均匀，且无病虫害的果实采收。人工采收应用圆头剪刀，一手握采果剪，一手提起主梗，贴近母枝处剪下，尽量带较长的主梗。轻采轻放，尽量避免机械伤害。采收同时，对果穗上的伤粒、病粒、虫粒、裂粒、日烧粒等进行剪除，并对果穗进行修整和挑选。落地果、残次果、腐烂果、沾泥果不能用于贮存。对田间经修整和挑选的葡萄，可直接放入贮藏容器或运输容器中，对未经修整和挑选的葡萄可放入采收容器中，运到包装间，进行修整和挑选处理。采收后，果实应放到阴凉处，或尽快运到包装间，避免日晒雨淋。果实随采、随运，采后田间停留不应超过2小时，应在6小时内进入预冷过程或冷藏环境。1.把好入贮质量关葡萄贮藏保鲜是葡萄生产的继续，提供代谢正常、田间带菌量低、质量好、耐贮藏、抗病强的葡萄入库贮藏，才能为产品长期贮藏获得良好的质量和效益奠定基础。要选择耐藏的优良品种。葡萄不同品种之间的耐藏性差异很大；一般情况晚熟品种比早熟、中熟品种耐贮藏，中熟品种比早熟品种耐贮藏。龙眼是北方常见的栽培品种，果实柔软多汁，味酸甜，果粉厚，果皮中厚，抗病，耐旱，耐贮运性很强；巨峰是各地主栽品种，果实味甜酸多汁，品质较好，果粒大，抗病力强，耐贮运性中上；玫瑰香属我国最早引入品种，果实含糖量高，味甜，有浓郁的玫瑰香味，鲜食品味极佳，果皮中厚且韧，耐藏性中等；牛奶品种肉质硬脆多汁，味甜无香味，品质上，皮薄，果粉薄，耐藏性中下；其他果皮厚韧，果面和穗轴含蜡质和含糖量高的晚熟优良品种：红提、秋黑、甲斐路、红宝石、红瑞宝耐藏性都较好；一些7月、8月份采收的莎巴珍珠、京亚、87-1、无核白鸡心等早熟品种，耐藏性差。2.库房消毒葡萄贮运设施(包括简易贮藏场所、通风库、机械冷藏库和运输车辆等)，是葡萄贮藏病害的主要初侵染源之一，对贮运设施进行清洁和消毒可有效地减少和杀灭贮运设施中的病原微生物，减少贮藏病害的发生。因而，在每次贮运产品前必须对贮运设施进行彻底清扫，地面、货架、塑料箱等应进行清洗，以达到洁净卫生。同时要对贮运设施、贮藏用具等进行消毒杀菌处理，常用的杀菌剂及使用方法如下。(1)高效库房消毒剂。CT高效库房消毒剂，为粉末状，具有杀菌谱广，杀菌效力强，对金属器械腐蚀性小等特点。使用时将袋内两小袋粉剂混合均匀，按每立方米5克的使用量点燃，密闭熏蒸4小时以上。(2)二氧化氯。该剂为无色无臭的透明液体，对细菌、真菌都有很强的杀灭和抑制作用。市售消毒用二氧化氯的浓度为2%。(3)过氧乙酸。是一种无色、透明、具有强烈氧化作用的广谱液体杀菌剂，对真菌、细菌、病毒都有良好的杀灭作用，分解后无残留，但腐蚀性较强。使用方法是，将市售的过氧乙酸消毒剂甲液和乙液混合后，加水配制成0.5%～0.7%的溶液，按每立方米空间500毫升的用量，倒入玻璃或陶瓷器皿中，分多点放置在冷库中，或直接在库内喷洒(注意保护操作人员的皮肤眼睛等，也不能将药液喷洒在金属表面)，密闭熏蒸。（4）高锰酸钾和甲醛的混合液（福尔马林含40%甲醛，使用时要折算成甲醛）。按1：1的重量比将高锰酸甲加入甲醛液体中，使用量为每百立方米1千克，操作时要注意安全，迅速撤离，密闭库房48小时以上。此法适用于污染较重的老库。(5)漂白粉溶液。贮运设施消毒常用4%的漂白粉溶液喷洒，在葡萄贮藏期间结合加湿，也可喷洒漂白粉溶液。3.温度、湿度、气体的控制在葡萄贮运保鲜过程中，温度、湿度、气体成分的控制与防腐保鲜剂的使用，是保持产品质量和延长贮运期限的四个必不可少的技术措施。葡萄贮藏的适宜低温为-1～0℃，适宜的低温在葡萄贮运保鲜的所有措施中可占60%～70%甚至更高的效应，这是因为低温能明显地降低葡萄的呼吸强度，延缓生理代谢过程，减少营养物质的消耗，提高葡萄对病菌侵染的抵抗力；低温对病菌孢子的萌发、生长和致病力有明显的抑制作用。葡萄保鲜的目的，从一个角度来理解，可认为是“保水”，水分散失较多，鲜度就会降低较多，通常当葡萄的水分散失量超过5%时，就会表现出明显的萎蔫皱缩，因此，葡萄贮运期间要求较高的相对湿度，一般应保持在90%～95%。气体调节可延缓葡萄的衰老，特别是葡萄果梗的衰老，并对病菌孢子的萌发、生长和致病力也有明显的抑制作用，将CO2控制在5%～8%尤为重要。葡萄在没有保鲜剂使用的情况下即使对温度、湿度和气体成分进行严格的控制，在不太长的贮藏期内其腐烂程度仍然是相当严重的，防腐保鲜剂的使用结合温度、湿度和气体成分的控制，才能对葡萄进行较长期的贮运保鲜，一般使用可控释放SO2的亚硫酸盐作为葡萄的保鲜剂。(1)冷藏。温度是一切水果和蔬菜贮藏的基础条件，一般说来，葡萄的最佳贮藏温度为0～10℃。葡萄粒的冰点为-3.7～-2℃，这种冰点差异主要来自于品种、成熟度以及果实的含糖量。如晚采的龙眼葡萄，含糖量达到15%以上时，其冰点为-3.5℃，这种葡萄即使贮藏在-3℃温度下，葡萄粒也不会遭受冻害。但当温度低于-1℃以下时，便会造成果梗和穗梗不同程度的冻害(果梗的冰点在-1.1℃，穗梗的冰点在-1.3～1.1℃)。所以，鲜食葡萄长期贮藏中，温度不宜过低，应在-1～0℃。但温度又不可过高，当贮藏温度长期在1℃以上时，便会加大病害的危害程度，腐烂率增高。这里简单介绍不同处理阶段的温度参数：①冷藏温度：-1～0℃。②变温贮藏：-1～10℃(不超过20天)。③预冷温度：1～3℃(12～18小时)。不同的品种适于冷藏或变温贮藏均有明显差异，以巨峰和龙眼两个品种为例，巨峰葡萄极适于冷藏，果实采后立即预冷(1～3℃)，将其贮藏在-1～0℃的条件下，效果较好。而龙眼葡萄则以变温贮藏效果最佳。鲜食葡萄贮运中的适宜相对湿度为90%～95%。(2)气调贮藏。应用气调进行鲜食葡萄的保鲜，虽然国外在生产上并未大量应用，而我国传统的贮藏方法中早已应用。民间采用的沙(土)埋、糠藏、囤藏以及后来的缸藏，均为气调贮藏的一种方式。目前，采用PVC或PE塑料小包装进行冷藏和变温贮藏，也是一种简易气调贮藏技术。试验证明，气调贮藏不但能保持果实水分和熏蒸防腐，更重要的是改变贮藏环境中的气体成分，抑制果实的呼吸强度，达到果实保鲜和果梗保绿，并防止果实脱粒。鲜食葡萄贮藏中的气体成分，不同品种之间虽然有一定的差异，但并不十分明显，大体趋势为：通常鲜食葡萄在气调贮藏过程中，对低氧和高二氧化碳是不敏感的，但过高的二氧化碳和过低的氧也会产生伤害。伤害的初期症状表现为，产生刺鼻的乙醇味，继而出现果皮褐变，果梗及穗梗发生浅褐色的病变。4.防腐保鲜葡萄柔软多汁，贮藏期内很易发生青霉病、灰霉病和褐腐病。在-1℃低温下仍可使病害传染，造成腐烂变质。多年贮藏实践总结的经验是葡萄贮藏必须配合使用防腐措施。(1)硫黄熏蒸。土窖和通风库入贮前，需每立方米用10～15克硫黄，窖内布点燃烧密闭熏蒸杀菌一昼夜，然后通风换气。采用装筐(箱)不封袋，或在窖内堆摆，或吊挂方法贮藏葡萄，入窖后按每立方米4克硫黄量熏蒸，前一个月10天熏1次，以后每月熏1次，用量为每立方米2克硫黄，开春3—4月，再增加到每立方米4克。(2)二氧化硫熏蒸。熏蒸应分次进行，首次可用0.5%的二氧化硫熏蒸20分钟，必须使二氧化硫迅速而均匀地达到每箱的每个果穗中，以确保防效而不致引起病害。再次熏蒸时，二氧化硫浓度用0.1%熏蒸30分钟。这种处理大约每隔7～10天进行一次。葡萄贮藏期用二氧化硫消毒，除了熏蒸法以外，还有其他多种处理方法，可参考其他的有关资料。(3)防腐保鲜片。采用衬薄塑料袋装箱，冷库堆垛的可在入库敞口预冷后或在田间按每千克葡萄加4片CT-保鲜片(每小袋2片，用大头针在小袋两层膜上扎2个透眼)。5.包装包装分为预包装、短期冷藏及运输包装和长期冷藏包装。预包装包括用软绵纸单穗包裹、用纸袋或用果实套袋单穗包装、用开孔塑料或塑料与纸做成的T-形袋、圆底袋或方形袋单穗包装。也有以300～500克装入塑料盒、塑料盘、纸盘和泡沫塑料盘，再用自粘膜或收缩膜进行裹包。短期冷藏及运输包装一般装入5～10千克。包括不衬塑料膜(袋)箱装和塑料膜(袋)衬里箱装。不衬塑料膜(袋)箱装是把无预包装或经预包装的葡萄单层放入瓦楞纸箱、塑料箱(筐)、泡沫塑料箱或木箱；塑料膜(袋)衬里箱装是用0.02～0.03毫米厚有孔或无孔塑料膜(袋)展开，衬放瓦楞纸箱、塑料箱(筐)、泡沫塑料箱或木箱后，再把无预包装或经预包装的葡萄单层放入。两者最后要进行托盘包装，也就是将葡萄包装箱摆放在托盘上，用拉伸(收缩)塑料膜或塑料网缠绕包裹。长期冷藏包装包括不衬塑料膜(袋)箱装和塑料膜(袋)衬里箱装。不衬塑料膜(袋)箱装是把无预包装的葡萄，单层直接放入瓦楞纸箱、塑料箱(筐)、泡沫塑料箱或木箱；塑料膜(袋)衬里箱装是用0.02～0.03毫米厚塑料膜(袋)展开，衬放瓦楞纸箱、塑料箱(筐)、泡沫塑料箱或木箱，再把无预包装的葡萄单层放入。

移栽棚室缓苗后开始（定植10～15天后）。

越冬一大茬茄子定植时间为10月，最晚不得超过11月上旬。选择晴天上午无风时定植。采用双行错位法定植，选择生长旺盛、整齐一致的苗，按40～50厘米株距栽苗，每亩1800～2200株，花蕾朝南，栽苗后浇透水，随水穴施硫酸铜2千克拌碳酸氢铵8千克，预防黄萎病。嫁接育成的苗，定植时接口要高出地面至少3厘米，防止接穗接触土壤，产生自生根，进而传染黄萎病，失去嫁接意义。土壤干湿适度时，进行中耕，增加土壤的通透性，提高土温，促使根系发育，俗话说“根深才能叶茂”。连锄两遍后，覆地膜，从地膜上划个小孔，把苗子掏出即可，目的是增温保湿。棚室冬早春茄子采取高畦覆地膜、大小行种植，大行距80～90厘米、小行距50～60厘米，株距40～50厘米。也可采用膜下暗灌形式。定植时选晴天上午，按一定的株距在膜上打孔，穴内浇水，而后坐水栽入苗坨，再填土整平，也就是人们熟知的“水稳苗”。栽苗深度以覆土后土坨在地下1厘米左右为宜。栽苗1～3天后地温稍有回升，再浇定植水。为了创造更有利于秧苗早发的环境，定植后要盖小拱棚。五 定植及设定密度棚室秋冬茄子定植时，大部分地区温室的棚膜尚未扣上，有一段或长或短的露地生长时间，亩栽2000～3000株。定植前一天给苗床浇大水，起苗时尽量少伤根，确保一次全苗。选阴天或晴天的傍晚突击定植，要随栽随顺沟浇大水，以防苗打蔫。浇完定植水后抓紧中耕。4～5天后再浇一次缓苗水，然后掌握由深到浅、由近到远，反复中耕2～3次，要锄透推绒，并注意向垄上培土，雨后及时松土。春茬大棚茄子定植密度依品种和整枝留果数而定，一般密度以每亩1500～2500株为宜。农大601或黑宝生长势强，果大，密度适当放稀，一般每亩1700～1900株为宜，高密度栽培不能超过2000株。一般棚内10厘米地温稳定在13℃以上即可定植。如果大中棚内有保温措施，如地膜小拱棚、中棚加盖草苫等，可适当提前1～2周定植。定植采用开沟或挖穴暗水稳苗方法。避免畦面浇大水降低地温，延迟缓苗。栽植宜深些，以畦面高出土坨1厘米左右为宜。秋茬大棚茄子当苗子3～5片真叶，苗龄30～40天时，即可定植，一般在7月底至8月上中旬。结合整地施肥，进行作畦。栽植密度因品种而异，一般亩栽1800～2500株，如黑茄王每株接3个茄子打顶，亩需1800～2200株。为防止苗日晒萎焉，定植时应选阴天或晴天的下午。定植水要浇足浇透。对徒长的幼苗，不要栽植过深，可采取卧栽的方法，以促成不定根的形成。五 定植及设定密度（续）-1

（1）症状：小麦白粉病在小麦各生育期均可发生，病菌为害叶片、叶鞘、茎秆和穗部。病部初期产生黄色小点，后逐步扩大为圆形或椭圆形病斑，表面覆盖一层白色粉状霉层，以后逐步变成灰白色，最后变为褐色，上面生有褐色小点。小麦白粉病为害小麦叶片小麦白粉病为害麦穗（2）药剂防治：可选用20%三唑酮乳油400倍液、30%己唑醇悬浮剂4000倍液、12.5%烯唑醇可湿性粉剂2500～5000倍液对水喷雾。（1）症状：腥黑穗病发生于穗部，抽穗前症状不明显，抽穗后至成熟期明显，病穗较短、直立，颜色较健穗深，初为灰绿，后为灰白，颖壳麦芒外张，露出全部或部分病粒。病粒较健粒短粗，初为暗绿，后变灰黑，外包一层灰色膜，内部充满黑色粉末，外部仅保留一层麦粒薄皮。破裂后散发出有鱼腥味的三甲胺挥发气体。小麦健穗（左）与小麦腥黑穗病病穗（右）小麦健粒（右）与小麦腥黑穗病病粒（左）（2）药剂防治：可选用50%多菌灵可湿性粉剂、60克/升戊唑醇种子处理悬浮剂在播种前按照种子重量2‰～3‰拌种。（1）症状：该病发生于穗部，病株较矮，病穗比健穗较早抽出。最初病穗外面包一层灰色薄膜，成熟后破裂，散出黑粉，黑粉吹散后，只残留裸露的穗轴。（2）药剂防治：同小麦腥黑穗病防治方法。小麦散黑穗病病株（1）症状：小麦赤霉病又称麦穗枯、烂麦头、红麦头，是一种流行性、暴发性病害。从幼苗到抽穗都可受害，可引起苗腐、茎基腐、秆腐和穗腐，其中为害最严重是穗腐。在小麦灌浆前呈现半个麦穗发白枯死症状。小麦扬花时，初在小穗和颖片上产生水浸状浅褐色斑，渐扩大至整个小穗，小穗枯黄。湿度大时，病斑处产生粉红色胶状霉层，用手触摸，有凸起感觉，不能抹去，籽粒干瘪并伴有白色至粉红色霉。小穗发病后扩展至穗轴，病部枯褐，使被害部以上小穗形成枯白穗。（2）药剂防治：可选用50%多菌灵可湿性粉剂400～600倍液、25%戊唑醇乳油800～1200倍液、12.5%烯唑醇可湿性粉剂1000～1500倍液对水喷雾。小麦赤霉病病穗（1）为害特点：幼虫附着在子房或刚灌浆的麦粒上，以口器刺伤麦粒表皮，吸食浆液。幼虫侵入越早为害越重，扬花期侵入，1头幼虫可使1粒麦粒受损，一般4头以上造成全穗损失。（2）形态特征：①成虫。雌成虫体长2～2.5毫米，翅展5毫米左右，体橘红色；前翅透明，有4条发达翅脉，后翅退化为平衡棒；触角细长，14节，触角呈念珠状，上生一圈短环状毛。雄虫体长2毫米左右；触角每节中部收缩使各节呈葫芦状，膨大部分各生一圈长环状毛。②卵。长0.09毫米，长圆形，浅红色。③幼虫。体长3～3.5毫米，椭圆形，橙黄色，头小，无足，蛆形，前胸腹面有1个“Y”形剑骨片，前端分叉，凹陷深。④蛹。长2毫米，裸蛹，橙褐色，头前方具白色短毛2根和长呼吸管1对。小麦吸浆虫成虫小麦吸浆幼虫为害灌浆籽粒（3）药剂防治：小麦拔节期可选用50%辛硫磷乳油250毫升/亩，加沙土20～30千克拌匀或3%辛硫磷颗粒剂5千克/亩，均匀撒施；扬花期可选用4.5%高效氯氰菊酯乳油300倍液、10%吡虫啉可湿性粉剂500倍液+80%敌敌畏乳油300倍液、22%噻虫·高氯氟微囊悬浮剂1000～1500倍液对水喷雾。（1）为害特点：小麦蚜虫分有翅蚜和无翅蚜两种。主要种类有：麦长管蚜、麦二叉蚜、禾缢管蚜、无网长管蚜，田间以麦二叉蚜和长管蚜为害为主。前期集中在小麦叶片的正面或背面，后期集中在穗上刺吸汁液。发生严重时，使受害小麦叶片变黄、生长缓慢、分蘖减少、千粒重下降。同时分泌蜜露可诱发煤污病，还可传播多种病毒病。小麦蚜虫集中在小麦旗叶为害小麦蚜虫集中在小麦穗部为害小麦蚜虫为害状（2）物理防治：使用高效信息素诱虫板监测和防治蚜虫发生。监测每亩悬挂3～5片，防治每亩悬挂20～30片。（3）药剂防治：可选用植物源农药0.5%藜芦碱可溶性液剂500～600倍喷雾防治；0.3%苦参碱水剂800倍喷雾防治；或选用4.5%高效氯氰菊酯乳油1500倍液、10%吡虫啉可湿性粉剂1500倍液+80%敌敌畏乳油1000倍液、22%噻虫·高氯氟微囊悬浮剂3000倍液对水喷雾。（1）为害特点：俗称拉拉蛄，属直翅目蝼蛄科。其成虫和若虫均可为害小麦，以春、秋两季为害较重。秋苗期串垄为害，造成麦根断裂，形成条状死苗；或为害小麦根茎，受害根部呈乱麻状。春季返青后继续为害，严重造成死苗或枯白穗。蝼蛄蝼蛄为害状（2）药剂防治：播种前拌种可选用种子重量2‰～3‰的40%辛硫磷乳油或48%毒死蜱乳油拌种；已发生为害且虫量较大时，选用40%辛硫磷乳油或48%毒死蜱乳油500～800倍液灌根处理。（1）为害特点：俗称白地蚕，是金龟甲总科幼虫的总称，种类很多，成虫通称金龟子。秋季为害小麦时，幼虫在地下为害，咬断幼苗根茎，切口整齐，造成幼苗枯死，严重地块造成缺苗断垄。蛴螬蛴螬为害状（2）药剂防治：同蝼蛄防治方法。（1）为害特点：俗称叩头虫、小黄虫，属鞘翅目叩甲科。以幼虫钻入幼苗根茎部取食为害，造成缺苗断垄。（2）药剂防治：同蝼蛄防治方法。金针虫为害状（1）为害特点：以成、若虫刺吸小麦叶片汁液进行为害，受害叶上出现细小白点，严重时整个叶片变灰白，后逐渐变黄、枯萎，造成植株矮小，严重的全株干枯，导致穗小粒轻、千粒重下降。（2）药剂防治：可选用植物源农药0.5%藜芦碱可溶性液剂500～600倍喷雾防治；或用0.3%苦参碱水剂800倍液喷雾防治；或用1.8%阿维菌素乳油3000倍液喷雾防治；或用20%哒螨灵可湿性粉剂1500倍液对水喷雾。小麦红蜘蛛为害状（1）杂草种类：麦田杂草简单的可以分为阔叶杂草和禾本科杂草，其中阔叶杂草发生主要有荠菜、播娘蒿、葎草、田旋花等；禾本科杂草主要有雀麦、马唐、芦苇等。播娘蒿田间为害状葎草田间为害状荠菜田旋花田旋花田间为害状雀麦茎雀麦小穗雀麦田间为害状（2）药剂防治：阔叶杂草在小麦分蘖期至拔节期前，杂草2～4叶期，可选用10%苯磺隆可湿性粉剂10克/亩，对水30～40千克进行茎叶喷雾处理；禾本科杂草如雀麦可在小麦播种后，雀麦2～3叶期，选择无风晴天，用70%氟唑磺隆水分散粒剂10000～15000倍液、10%精唑禾草灵乳油3000～4000倍液茎叶喷雾。

1.利用柑橘溃疡病菌细胞悬浮液免疫BALB/c小鼠，免疫后小鼠抗血清效价为2500倍左右。提取小鼠脾细胞mRNA，构建的单链抗体文库重链DNA大小为350bp左右，轻链为650bp左右，经linker（Gly3Ser）4连接后单链抗体DNA大小为1.2kb左右。将单链抗体文库DNA克隆到大肠杆菌JM109中，随机挑选了9个克隆子测序表明，9条单链抗体序列都是开放阅读框，其重链分别属于VH1、VH2、VH3基因家簇，轻链属于VKⅠ、VKⅢ、VKⅣ亚基因家簇。每个单链抗体的互补决定区（CDRs）都为不同的CDR，其中氨基酸序列变化多样，说明构建的单链抗体文库多样性好，适合于进一步进行单链抗体的筛选。2.采用核糖体展示技术对构建单链抗体文库进行了进化和富集。结果显示第一轮核糖体展示后回收的mRNA量非常少，分光光度计已测不出其浓度，反转录RCR后，扩增得到的条带非常弱，说明在原始未筛选的抗体文库中，能与柑橘溃疡病菌O-特异性脂多糖作用的单链抗体数量较少。经过三轮筛选后，得到的mRNA量逐渐增多，经RT-PCR后，产生了比较亮的扩增条带。说明在核糖体展示过程中，抗原阳性的单链抗体得到了富集。3.将未经过核糖体展示的原始单链抗体文库DNA和经过三轮展示的单链抗体文库DNA与噬菌体表达载体pCANTAB5E相连接后，转入大肠杆菌TG1中小量表达，表达后用间接ELISA测定单链抗体与抗原的结合活性。结果表明：从未经过筛选的原始单链抗体文库中随机挑取的60个克隆子表达产物与柑橘溃疡病菌O-特异性脂多糖几乎没有结合能力；而从经过三轮展示后的单链抗体文库中挑取的60个克隆子中有30%与柑橘溃疡病菌O-特异性脂多糖有较好的结合能力。从三轮展示后的单链抗体文库中共挑取了180个克隆子，用间接ELISA法初筛到60株抗原阳性的单链抗体；然后用生物分子相互作用技术（biosensor，biacore）对筛选的抗原阳性的单链抗体进行了复筛，筛选了3株高亲和力的单链抗体（GX13、GX44和GX95）以用于下一步的表达鉴定。4.将筛选的高亲和力抗原阳性的克隆子从大肠杆菌TG1中转入高表达菌株HB2151中进行可溶性表达。单链抗体表达后，其表达产物主要集中于细胞周质提取物中，具有抗体活性。将浓缩的周质提取物进行SDS-PAGE电泳，显示在32 kDa处有一蛋白条带产生。将表达产物纯化后进行SDS-PAGE电泳显示，在32 kDa处有单一蛋白条带产生。为了进一步验证表达的蛋白即目的蛋白，将表达产物进行了Western blot 杂交，结果显示，与纯化后的电泳结果一致，在32 kDa处有单一的条带产生，说明表达纯化的蛋白即目的蛋白。5.将筛选的抗原阳性单链抗体进行了特性研究。单链抗体（GX95、GX44、GX13）特异性强、亲和力高。其与柑橘溃疡病菌近源种Xanthomonas oryzae pv.oryzae（Xooc）；Xanthomonas campestris pv.campestri（Xcc）；Xanthomonas oryzae pv.oryzicola（Xoc）；及从柑橘叶片上分离的10种腐生黄单孢菌及Bacillus subtilis；E.coli 都没有交叉反应。Biacore 分析其亲和力表明，单链抗体GX95、GX44和GX13的亲和常数分别为1.98×1010 M-1、1.89×1010 M-1、3.43×1010 M-1。6.对筛选的单链抗体进行了测序。用DNAplot 软件分析单链抗体序列。结果表明：单链抗体 GX44 和GX13重链分别属于VH1基因家簇，GX95 重链属于VH3基因家簇；GX44和GX13轻链属于Vk IV亚基因家簇，GX95轻链属于Vk III亚基因家簇。用Vector NTI软件对筛选的单链抗体的序列同源性进行了分析，表明GX44 和GX13重链有89.67%的同源性，GX95和GX13具有92.53%的同源性。

稻曲病Usitilaginoidea vriens是影响水稻产量及品质的重要穗部病害。稻曲病厚垣孢子可以侵染水稻，引起稻粒发病[1，2]。陈永坚[2]用室内越冬的厚垣抱子接种水稻种子、芽鞘、苗期叶片、秧苗根系，穗苞均可引起稻曲病的发生，说明稻曲病很有可能在种子萌发或插秧时已侵染水稻，水稻生长后期穗部发病，是一种系统性侵染病害。也有研究认为稻曲病不是系统侵染的病害[3，4]。为进一步明确稻曲病的侵染方式问题，有必要用更严谨的试验加以研究，为稻曲病的防治及抗源筛选提供的理论指导。于2007年8月1日在湖北省宜昌市远安县莲花镇进行套袋试验。莲花镇海拔510m，峡谷地貌，7、8月份日平均温度低于30℃，8月份降雨量超过212mm，是稻曲病的重要疫区，田间累积了大量的厚垣孢子。供试水稻品种为“粤优938”，在水稻圆杆拔节期，用40cm×10cm的纸袋套住单株水稻，以避免田间厚垣孢子的自然侵染，套袋共计68穗，于水稻乳熟期回收套袋稻穗并逐一检查稻曲病的发病情况。1.2.1 供试菌源 将4℃保存的2006年中稻“粤优938”上采集的稻曲球粉碎后，用2%的蔗糖溶液配置为厚垣孢子悬浮液A，置于28℃的培养箱（LRH-250型，广东省医疗器械厂）中保存24h备用；将2007年采集的早稻“金优402”上的稻曲球，粉碎后用2%的蔗糖溶液配置为厚垣孢子的悬浮液B，过滤后加入少量土温-20，在涡漩振荡器上振荡5分钟，在28℃条件下保存24h。以上厚垣孢子悬浮液在100×显微镜下一个视野内有约1000个厚垣孢子。1.2.2 供试水稻 2007年5月9日将水稻种子“粤优938”在自然日光下暴晒8h后用杀菌剂浸泡72h，然后置于培养皿（φ=9cm）内在28℃培养箱（LRH-250型，广东省医疗器械厂）中催芽，72h后播种育苗，2007年6月8号移栽插秧。1.2.3 方法 试验地点位于湖北省农科院网室内，网室周边农田环境中没有稻曲病疫情发生。试验用土壤经200℃电热鼓风干燥箱（HN101-1型，南通沪南科学仪器有限公司）灭菌1h后，分装入瓷盆（φ=25cm，h=32cm）中备用，瓷盆置于聚乙烯薄膜棚（长×宽×高=4×3×1.5m）内，棚顶敞开，用遮阳黑网覆盖。供试水稻做作以下处理：1）种子带菌：经消毒后的种子催芽时用少量厚垣孢子液A浸泡，2007年6月8日移栽入装有无菌土的瓷盆中。2）根部带菌：年6月8日插秧时，用清水洗净秧苗根部，在厚垣孢子液A中浸泡8h后移栽入装有无菌土的瓷盆中。3）穗期接种：2007年9月4日下午6时，将处于破口或杨花初期的水稻用手提猴头喷雾器在穗部喷雾接种厚垣孢子液B，喷雾后用聚乙烯薄膜将稻穗封闭保湿48h。4）不做任何接种处理。以上每处理2个瓷盆，每瓷盆内3兜水稻，分蘖后期每瓷盆内水稻有30～40株。水稻生长期正常管理，同时在水稻孕穗期以后，每天喷水两次，保持环境的湿度，同时观察记录稻曲病的发病情况。田间套袋试验结果：在水稻乳熟期回收的68个套袋稻穗中发病稻穗有38个，病穗率为55.9%，按照唐春生[5]的病情分级标准，病情指数为24.58。网室盆栽试验结果：在水稻灌浆初期，浸根处理的水稻首先发病，稻粒内外颖壳接缝处出现白色的菌丝团，逐渐长成白色球状物，形成稻曲球，4d后露出黄色的厚垣孢子，厚垣孢子颜色由鲜黄色逐渐转暗。浸根处理发病一个星期后种子带菌及喷雾接种处理都开始出现稻曲球。种子带菌、根部带菌及破口期喷雾接种带菌的病穗率分别为：25.0%、1.6%、5.8%。王国良[1]认为稻曲病厚垣孢子主要在水稻破口前1～4天至破口时从水稻柱头侵入引起发病。本次田间套袋试验中，在水稻圆秆拔节期用纸袋隔离了田间厚垣孢子的自然侵染，但后期调查病穗率仍高达55.88%，说明稻曲病厚垣孢子在水稻生长早期可能已被上年累积在田间的厚垣孢子侵染。在网室试验中对土壤及种子都进行了严格消毒，土壤中无自然存在的稻曲病厚垣孢子；试验中对照没有发病排除了种子自身带菌的情况。在水稻育秧及移栽以后的生长阶段都实施了隔离措施，避免了未知自然侵染对结果的干扰。试验中无论是水稻营养生长期还是生殖生长期接种，在水稻生长后期都出现了稻曲病粒，而且试验结果以厚垣孢子接种水稻种子的发病率最高，进一步说明了厚垣孢子在水稻生长早期侵染的可能性。试验中接种水稻种子所用的厚垣孢子源于2006年的中稻稻曲病粒，穗部接种菌源是2007年早稻病粒，说明上茬水稻上的稻曲病厚垣孢子可能是田间的重要侵染源。以上两试验结果表明稻曲病厚垣孢子侵染水稻的方式至少包括两种：1）系统侵染：土壤中或依附于种子表面的厚垣孢子，在水稻种子萌发初期侵入水稻胚内或在插秧时侵染水稻根部，灌浆期出现穗部病症；2）局部侵染：在水稻孕穗期，直接侵染穗部，灌浆期发病，而且以系统侵染为主要侵染方式。因此郭荣华等根据水稻穗部接种的结果及王国良的试验结论认为稻曲病不是系统侵染病害值得商榷。王疏等[6]用Nested PCR方法成功检测出水稻生殖生长期稻曲病在植株茎秆、穗部的分布特征，为研究稻曲病的侵染提供了分子生物学方法。故对于本次试验中水稻材料，可以用分子生物学手段检测水稻不同生长期稻曲病菌在水稻根部、茎秆、叶片及穗部的分布情况从而进一步明确稻曲病的侵染方式。

Keywords:Magnaporthe grisea;pathogenicity;T-DNA insertional mutants;gene function稻瘟病菌[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr.，无性世代为Pyricularia grisea（Cooke）Sacc.]侵染水稻引起的稻瘟病是水稻“三大病害”之一[1，2]，严重限制世界水稻产量，但迄今为止对其致病性及其变异的机制了解得仍然不够透彻。已知水稻与稻瘟病菌之间的特异性互作，符合Flor提出的“基因对基因”关系假说[3]。对稻瘟病菌无毒基因的研究，将有助于进一步了解稻瘟病菌致病性变异的机制以及水稻与稻瘟病菌之间分子水平特异性互作的机制。目前，通过遗传分析或分子标记技术，已鉴定了至少30个稻瘟病菌无毒基因[4～7]，其中仅有5个无毒基因（PWL1、PWL2、AVR1-CO39、AVR-Pita、ACE1）被克隆[8～12]。此外，稻瘟病菌的侵染过程是一个错综复杂的循环过程，涉及一系列形态结构与生理生化的变化，故而除了无毒基因之外，与稻瘟病菌致病过程有关的基因的研究也是研究者关注的焦点，目前已经克隆和分析了包括MPG1，CPKA1，PTH11，PMK1，MPS1，MAGB，MAC1，PDE1，PSL1，TPS1等40余个参与稻瘟病菌生活史各个阶段的功能基因[13，14]。稻瘟病菌基因组全序列测定已经完成[15]，伴随着生物信息学的飞速发展，进一步以功能基因组学的研究方法从全基因组水平研究水稻与稻瘟病菌之间特异性互作的分子机制、诠释关键基因的功能已经成为解决持久抗瘟问题的关键所在。本研究正是通过接种筛选本实验室已建成的稻瘟病菌菌株FJ95054 B T-DNA插入突变体库，获得致病性变异稳定的突变体，运用TAIL-PCR方法获得了突变体被T-DNA标记的侧翼序列，并通过一系列表型分析、分子生物学实验及生物信息学分析初步分析了T-DNA插入区域的基因功能，为进一步获得相关病菌小种的无毒基因或与致病性相关的基因奠定良好的基础。稻瘟病菌菌株FJ95054B，是本研究的野生型对照菌株，由本实验室从福建田间单孢分离得到的菌株；供筛选的突变体菌株，是随机从本实验室已建成的稻瘟病菌菌株FJ95054B T-DNA插入突变体库中抽取的。供接种筛选的水稻品种CO39近等基因系：C101LAC Pi-1（t）、C101A51 Pi-2（t）、C104PKT Pi-3（t）、C101PKT Pi-4a、C105TTP-4L-23 Pi-4b及感病对照CO39，由国际水稻研究所提供。稻瘟病菌菌株的活化、扩大培养及产孢方法参照王宝华等[16]，育苗及接种方法参照张学博等[17]。接种后8～10 天，采用目测法调查并记载各品种水稻叶片上的病斑反应型。病斑反应型的记载标准参照Valent等[18]的方法，具体分级标准如下：0级：无病斑；1级：只有针尖大小的褐色斑点（病斑直径可达0.5cm）；2级：直径约0.5～1mm褐色病斑，病斑有明显黄褐色中心；3级：直径约为2mm的褐色眼状病斑，中央灰色，边缘褐色；4级：长约3～4mm中等大小的灰色梭形病斑，边缘褐色；5级：病斑达到最大（CO39的眼状病斑最长约为5mm），甚至多个病斑连片，叶枯死，如出现暗绿色急性病斑或叶节瘟也属于这一类型。其中，0～2级记为抗病反应，3～5级记为感病反应。参考李宏宇方法[19]，观察所获得突变体的形态特征及其生长发育过程，记录菌落直径、产孢量、孢子萌发率、附着胞形态和形成率以及洋葱表皮侵入情况。稻瘟病菌基因组DNA的提取参照何月秋方法[20]。TAIL-PCR反应使用的T-DNA左、右边界嵌套引物为：LB1：5'-GGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCATG-3'；LB2：5'-CATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCT-3'；LB3：5'-GAATTAATTCGGCGTTAATTCAGT-3'；RB1：5'-GGCACTGGCCGTCGTTTTACAAC-3'；RB2：5'-AACGTCGTGACTGGGAAAACCCT-3'；RB3：5'-CCCTTCCCAACAGTTGCGCA-3'。使用的随机引物为AD7：5'-TG（A/T）GNAG（A/T）ANCA（G/C）AGA-3'；AD9：5'-TCGTTCCGCA-3'；AD12：5'-（A/T）AGTGNAG（A/T）ANCANAGA-3'。以上引物由上海生工生物工程服务有限公司合成。10×PCR Bufer、dNTP、rTaq酶均购自宝生物公司（TAKARA）。TAIL-PCR反应程序参考文献[21]。将TAIL-PCR第2、3步扩增产物用0.5×TBE制备1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳电压为5 V/CM。电泳结束后，将凝胶放入含EB的0.5×TBE 中染色20～30min，用紫外透射反射仪观察并照相记录。TAIL-PCR扩增产物通过电泳分离后，回收目的片段，纯化后与pGEM-T Easy Vector（购自Promega公司）连接；连接产物通过热激转化到DH5α感受态细胞中，通过蓝白斑反应初筛转化子；采用碱裂解法少量提取转化子中的质粒DNA，通过PCR及酶切鉴定，挑选。将含正确插入的转化子的克隆，送由上海鼎安生物科技有限公司测序。测序获得的序列去除T-DNA载体序列后，将剩余的序列与GenBank数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）、稻瘟菌基因组数据库（http：//www.broad.mit.edu/annotation/fungi/magnaporthe/index.html）进行Blast比较分析及相关生物信息学分析，以推断T-DNA所插入的基因及其可能的功能。此外，应用SignalP 3.0 server（Http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）推断所获得的基因序列中是否含有信号肽（signal peptide，SNP）；应用Pfam（http：//www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/）推测基因编码的蛋白可能的结构域；应用TMHMM-v 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测基因编码的蛋白可能的跨膜结构域；应用Protcomp-v 6.0（http：//sun1.softberry.com/berry.phtml）对基因编码的蛋白质进行亚细胞定位，该软件可将蛋白质按细胞核、质膜、胞外分泌、细胞质、线粒体、内质网等归属进行划分；应用TargetP-v 1.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）进一步确定预测蛋白的亚细胞定位，其可将蛋白质的定位归属于线粒体、叶绿体、胞外分泌以及其他亚细胞定位。将随机选取的60个突变体与野生型菌株FJ95054B分别接种在国际水稻研究所提供的CO39近等基因系的6个水稻品种上，即C101LAC Pi-1（t）、C101A51 Pi-2（t）、C104PKT Pi-3（t）、C101PKT Pi-4a、C105TTP-4L-23 Pi-4b、CO39，每个突变体都进行3个平行以上的接种试验。接种后发病情况显示：野生型菌株FJ95054B对Pi-1（t）、Pi-2（t）、Pi-4a均无致病性，对Pi-3（t）、Pi-4b、CO39致病，而在随机选取的突变体中有3个突变体的致病性发生了稳定的变异，如表1、图1所示。其中，突变体2t-2 T940024501对水稻品种Pi-2（t）从无毒转变为有毒，突变体T940084501和T940086501在水稻品种CO39上的致病性减弱。菌株号IsolatesC101LACPi-1（t）C101A51Pi-2（t）C104PKTPi-3（t）C101PKTPi-4aC101TTP-4L-23Pi-4bCO39FJ95054B（WT）RRSRRS2t-2T940024501/++////T940084501/////—T940086501/////—表1 稻瘟病菌T-DNA插入致病性突变体接种CO39近等基因系的发病情况*Table 1 Virulence of T-DNA insertional pathogenicity mutants on CO39 NILs稻瘟病菌侵染过程中的任何一个环节被破坏均会导致致病性减弱或丧失，因此，对致病性减弱的突变体进行相关表型分析，有助于了解其致病性减弱的原因。筛选出的两个致病性减弱突变体的生长发育变化情况如表2所示。与野生型FJ95054 B相比，两个突变体均表现出生长速度减缓、单位面积产孢量显著减少、孢子萌发率和附着胞形成率降低的性状（在α=0.05水平上差异显著）， 这些都可能是造成突变体致病性减弱的原因。图1 稻瘟病菌致病性突变体的变化情况Figure 1 Pathogenicity of mutants of M.grisea compared with wildtype FJ95054B菌株Isolate菌落直径Colonydiameter（cm）产孢量Sporulation（105spores/cm2）8h孢子萌发率Percentageofsporegermination8hpi（%）16h附着孢形成率Percentageofappressoriumformation16hpi（%）95054B（WT）5.20±0.100.7499.0693.68T-9400845014.17±0.030.001287.9073.17T-9400865014.22±0.070.003383.8963.69表2 稻瘟病菌致病性减弱突变体的生长发育变化Table 2 Morphology and development of pathogenicity-decreased mutants of M.grisea此外，在洋葱表皮侵入实验中，野生型FJ95054B侵入正常，能形成正常的附着胞以及侵染栓，并能观察到菌丝在洋葱细胞内广泛蔓延。相比之下，突变体T940084501的孢子能够形成附着胞，但随后并未形成侵染栓侵入，未发现菌丝在洋葱细胞内蔓延；而突变体T940086501的部分孢子能够形成附着胞，但同样未能形成侵染栓侵入，也未发现菌丝在洋葱细胞内蔓延，还有部分孢子甚至不会形成附着胞。这些都可能是其致病性减弱的原因。实验结果如图2所示。图2 稻瘟病菌致病性减弱突变体的洋葱表皮侵入实验结果Figure 2 The results of onion penetration assays of pathogenicity-decreased mutants of M.grisea使用右边界嵌套特异引物RB与随机简并引物AD7组合，扩增出了突变体2t-2 T940024501的T-DNA侧翼序列（如图3A所示）；使用左边界嵌套特异引物LB与随机简并引物AD9组合，扩增出了突变体T940084501的T-DNA侧翼序列（如图3B所示）。突变体T940086501的T-DNA侧翼序列通过TAIL-PCR反应尚未获得。通过在稻瘟菌基因组数据库进行的比对分析，结果显示突变体2t-2 T940024501 T-DNA侧翼序列中的117～591 bp区段与稻瘟病菌基因组supercontig5.183的776534～777008 bp同源（同源率98%）， T-DNA 插入位点位于基因 MGG_07927.5 的外显子区，该基因位于Chromosome/Linkage GroupⅢ，编码一个假定蛋白（ hypothetical protein）， 该蛋白属于Glyco-syl hydrolases family 18（糖基水解酶家族18）。图3 TAIL-PCR第二步和第三步产物的电泳图谱Figure 3 Electrophoresis patterns of secondary and tertiary TAIL-PCR products（secondary and tertiary products of the same isolate are loaded side by side）分别利用SignalP 3.0、Protcomp-v 6.0、TMHMM-v 2.0、TargetP-v 1.1以及Pfam对该基因编码的蛋白进行分析。首先通过Signal IP 3.0预测，并不包含信号肽结构；继而经TMHMM-v 2.0预测，不含跨膜结构；通过Protcomp-v 6.0和TargetP-v 1.1分析表明，含有胞外分泌信号，是一种胞外分泌蛋白，在胞内无定位。另外，Pfam分析结果表明，该基因可能具有某种糖基水解酶活性。目前仅知该基因被T-DNA阻断后，突变体菌株对水稻品种Pi-2（t）从无毒转变为有毒，至于其在病原菌致病过程中的具体功能尚需通过进一步的基因敲除和功能互补实验加以确定。至于突变体T940084501的T-DNA侧翼序列，在稻瘟病菌基因组数据库中未比对到其同源序列，而在GenBank数据库中同样未比对到与稻瘟病菌相关的同源序列。由于该序列可能是FJ95054B菌株的特异序列，拟根据该序列扣除与载体有关序列及引物序列后的剩余序列设计引物，筛选FJ95054B BAC文库。对稻瘟病菌无毒基因以及致病过程有关基因的研究一直是了解稻瘟病菌致病性及其变异机制乃至水稻与稻瘟病菌特异性互作机制的关键所在，而研究某一个具体基因的功能最便捷的方法就是对该基因的突变体进行分析，这也正是本研究筛选T-DNA插入所致致病性突变体的初衷所在。获得致病性变异稳定的突变体是本研究的关键之一。本研究通过大量平行、重复实验初步筛选出致病性表型稳定的突变体，随后为避免由于菌株污染而造成的致病性变异的假象，还进一步将所获得的致病性突变体进行单孢分离，将分离的单孢与原菌株一同进行接种实验，结果显示单孢与原菌株的发病情况基本保持一致。这为进一步的分子水平的研究奠定了良好的基础。本研究对所获得的基因的功能还只是做了初步的预测，为了明确其功能尚需要借助进一步的基因敲除和功能互补实验。另外，为了明确致病性变异是否为单基因作用所致，尚且需要对致病性突变体的后代群体进行接种实验和潮霉素抗性分析，通过检测其后代的表型分离比率加以验证。

利用4个抗感杂交组合 （‘富士’ב金冠’ ‘金冠’ב富士’‘嘎拉’ב富士’ ‘富士’בQF-2’） 进行了苹果炭疽菌叶枯病抗性鉴定和遗传分析。结果表明，4 个群体中抗、感植株的分离比分别符合1∶1、1∶1、0∶1和1∶0的理论比值，初步推测苹果抗炭疽菌叶枯病性状受隐性单基因控制，抗病基因型为 rr，感病基因型为 RR和Rr。由此推测供试杂交群体的亲本品种 （系） ‘富士’ ‘金冠’‘嘎拉’ ‘QF-2’ 的基因型分别为rr、Rr、RR和rr。利用207株 ‘金冠’ב富士’ 的杂交后代为试材，构建了抗感基因池用于BSA分析。从HiDRAS和GenBank网站上下载了300 对均匀覆盖苹果染色体组的 SSR 引物，通过在亲本及抗感池中的初步筛选，将产生多态性条带的引物进行群体验证，获得了两个位于苹果15号连锁群上与抗病性状相关的分子标记 CH01d08 和 CH05g05。通过MapMarker 4.0 软件分析，将这两个标记定位于Rgls基因两侧，重组率分别为7.3%和 23.2%。依据苹果基因组 CH01d08 和 CH05g05 标记之间的序列，自行设计了276对SSR引物。经过亲本及抗感池的初步筛选及群体验证，最终筛选出 9 对与 R gls基因位点连锁的分子标记。将表型抗性鉴定结果与标记基因型数据相结合采用 JoinMap ver.4.0软件，完成了SSR标记与Rgls基因位点的连锁图谱。这11个标记覆盖了49.2 cM的遗传距离，最近的标记为 S0405127 遗传距离为 0.5 cM。Rgls基因位点两侧最近的两个标记 S0304673 和 S0405127 之间的物理距离为500kb。以‘金冠’和‘富士’及‘金冠’ב富士’的F1代群体中20株极端抗和20株极端感炭疽菌叶枯病的单株为材料，利用全基因组重测序（whole genome re-sequencing，WGR）技术，结合混合分组分析法（bulked szegregate analysis，BSA）共开发SNP位点3399950个，InDel位点573040个，SNP位点位于内含子上的465317个，位于外显子上的13029个，其中同义变异7330个，InDel位点位于内含子上的108996个，位于外显子上的19957个，其中插入或缺失3或3的整数倍的碱基，不改变蛋白质的编码框的有6928个。在全基因组范围内共得到33个候选的SNP位点及所对应的29个候选基因。通过对△（SNP-index）的筛选，将抗性基因位点快速定位于苹果第15条染色体的2～5Mb的区域内，结合SSR标记定位结果，最终锁定18个SNP位点、30个InDel位点，以及5个候选基因。通过对5个候选基因在接种病原菌后不同时间点的表达量差异及生物信息学分析，结果显示，基因MDP0000686092、MDP0000205432、MDP0000120033为功能未知蛋白，基因MDP0000945764具有CCHC型锌指结构，是丝氨酸/精氨酸富集剪接因子，具有核酸绑定、锌离子结合分子功能，参与RNA剪切生物过程，调节基因产物的表达。基因MDP0000864010具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸盐）NAD（P）绑定区域，属于NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族，具有辅酶绑定功能，可能与鼠李糖生物合成酶1有关。通过qRT-PCR验证，5个候选基因均不同程度的响应炭疽叶枯病病原菌的诱导，是苹果炭疽叶枯病抗病相关基因。通过高分辨熔解曲线 （HRM） 分析技术对SNP 及InDel标记进行验证。对SNP 及InDel引物在亲本和抗感基因池中进行初步筛选，将出现不同分型的引物在分离群体上进行验证，获得了6个SNP 及5 个InDel标记与Rgls基因位点紧密连锁。从中挑选了10 个标记对所检验出的重组个体进行了分析，将 Rgls基因位点定位于标记 InDel4199 和SNP4257之间，范围缩小为58 kb以内。以青岛农业大学苹果试验基地 （山东省胶州市） 栽培的50 个田间栽培品种和品系为试材，利用四个紧密连锁的分子标记 S0405127、S0304673、SNP4236和InDel4254验证了分子标记的可靠性。结果表明，SSR标记 S0405127，S0304673，SNP 标记 SNP4236，InDel标记InDel4254鉴定的准确率分别为 90.0%，94.0%，98.0%，96.0%，其鉴定结果的准确率均达到90%以上，可以应用于田间栽培品种、品系、种质资源以及杂种后代幼苗对炭疽菌叶枯病抗性的鉴定。一是通过对4个杂交组合的F1 群体及4个亲本进行苹果炭疽菌叶枯病抗性鉴定和遗传分析，推断出苹果抗炭疽菌叶枯病性状受隐性单基因控制，抗病基因型为rr，感病基因型为RR和Rr。二是通过300对均匀覆盖苹果染色体组的SSR引物和自行设计的276对SSR引物在亲本及抗感池中进行筛选，得到的多态性标记经作图群体验证，共获得了11个与Rgls基因位点连锁的分子标记，将抗病基因定位于苹果第15条染色体上，并完成了SSR标记与Rgls基因位点连锁图谱的构建。将 Rgls基因位点定位在 SSR 标记 S0304673 和S0405127之间，物理距离为500 kb，与最近的标记 S0405127 的遗传距离仅为0.5 cM。三是开发了与抗炭疽菌基因相关的 SNP 标记和 Indel标记，并对部分SNP 及 InDel 标记进行了验证，将 R gls基因位点进行精细定位，将抗病基因的范围进一步缩小至58 kb，并获得了14 个与抗病相关的候选基因。