本文以甘蓝型油菜一个抗病毒品种和一个感病毒品种为试材，利用转基因手段进行了油菜抗病毒病相关研究。利用乙烯、甲基茉莉酸、水杨酸类似物苯丙噻重氮3种化学物质诱导处理油菜叶片，提取处理前后各材料的RNA，标记探针后与拟南芥芯片进行杂交，通过对基因表达谱的分析，获得与抗病性相关的基因，从中选择3个与病毒抗性相关的基因BNP5、BNP7和BNP10。其中BNP7和BNP10为全长序列，BNP5 5'端部分序列缺失，通过5'-RACE的方法获得该基因全长序列，分别构建3个植物过表达载体pGA5、pGA7和pGA10和3个RNAi载体pGR5、pGR7和pGR10（过表达和RNAi载体均带有除草剂抗性基因bar）。采用本实验室发明的高通量花蕾原位转化法分别对所选材料进行转化。转基因当代植株收获的种子播种以后，幼苗期喷施除草剂进行筛选，并经PCR鉴定，存活幼苗80%以上为阳性植株。目前正在进行阳性植株T1代幼苗病毒抗性鉴定及相关的后续实验。

Zhuji Agricultural Technical Extension Center,Zhuji 311800,China水稻条纹叶枯病是由灰飞虱传播的发生严重的水稻病毒病。从2004年以来，浙江诸暨市的单季稻上条纹叶枯病发生明显上升，病害扩展蔓延速度快，对水稻安全生产构成严重威胁。为了调查探讨水稻条纹叶枯病发病流行规律，防范病害发生流行，从2004年起，我们对水稻条纹叶枯病发生情况、影响发病几个关键因素和上升原因进行调查分析，现将结果综合整理如下：从2004～2006年调查情况看，浙江诸暨市水稻条纹叶枯病发生具有以下特点：2005 年大田调查，平均丛发病率 0.93%（0～ 2.80%）， 株发病率 0.28%（0～0.740%）。2006 年面上调查109 块田，平均丛发病率为2.51%（0～16.8%）， 株发病率0.49%（0～3.64%）， 丛发病率大于2%的田块占42%，株发病率大于1%的田块占14%。2006 年观测区调查平均丛发病率为 0.85%（0.05%～1.9%）， 株发病率为 0.16%（0.004%～0.44%）， 而2005年平均丛发病率为0.19%，株发病率为0.05%。2006年发病比2005年明显加重，条纹叶枯病在本市正以较快的速度上升和扩展。单季稻是近年发病的主要稻作类型，而作为籼稻类型的早稻2006年也有条纹叶枯病发生。2006年5月30日在王家井会议桥机插（4月20日机插）早稻的早22品种上发现条纹叶枯病，5月底开始发病，开始是零星的发生，6月中旬加重，6月下旬调查平均丛发病率为2.33%（1.94%～2.74%），株发病率为0.06%（0.04%～0.07%）。在相同地点的连作晚稻（秀水09）上也发生了条纹叶枯病。据面上调查统计，2006年全市水稻条纹叶枯病发生面积在12万亩左右，比2005年6万亩扩大1倍以上。2006年单季稻条纹叶枯病6月中旬（常年则在7月上旬至中旬）在早播早插的制种田（浬浦镇大、小兼溪村）首先发病，其后各地在6月下旬至7月上旬相继发生，比往年提早10天左右，呈现出面较广、个别田块发生程度较重（丛发病率达到14%～30%）的状况，7月上旬为条纹叶枯病发病高峰期。调查表明，单季稻条纹叶枯病有随播种和移栽时间的提早而提早发病的趋势。早稻、单季稻和制种田及连作晚稻条纹叶枯病的发生定田定点观察，不同稻作类型条纹叶枯病发生消长趋势亦有不同。单季稻的条纹叶枯病发生如图1和图2所示，发病有两个高峰期；制种田的发病情况与单季稻相似，也有两个高峰，峰间相隔15～20天；早稻条纹叶枯病发生从6月2日开始上升，抽穗期达到最高峰；连作晚稻（秀水09）条纹叶枯病8月14日始见病株，其后丛发病数上升，株发病数则是达到一个高峰后开始下降，过段时间又上升，这可能是由于早发病株经过一段时间之后死亡，从而造成病株数下降，后又产生一发病高峰而再次上升，见图3。图1 单季稻条纹叶枯病丛、株发病动态图2 单季稻制种田条纹叶枯病发病动态图3 连作晚稻条纹叶枯病丛、株发病动态几年来对主要推广品种在不同示范方中的条纹叶枯病发生情况进行调查，结果见表1。从调查结果看，影响病害轻重的主要栽培因子有：2.1.1 播种或移栽时间 播种早的田块比播种迟的田块发病重，同一块秧苗不同时间移栽的迟移栽的重于早移栽田。如江藻镇汪王村、山下湖镇祥头村和枫桥镇择墅下村3个示范方种植秀优5号，王家井镇楼许村、山下湖镇义燕村和枫桥镇新店湾村3个示范方种植加优1号，阮市镇阮市村示范方种植秀水110，虽然种植的品种不同，但调查结果都表明，播种期越迟发病越轻，一般在5月底6月初播种的发病普遍轻于此前播种的。又如浬浦镇大、小兼溪村制种田5月8日播种，6月中旬就发病，6月下旬调查丛发病率为2.7%～3.6%，株发病率为0.6%，而马郦村制种基地6月5日播种，6月27日秧田仅见零星条纹叶枯病病株，月底移栽后发病很轻，丛发病率在0.1%以下。同一秧田的秧苗移栽早的田块发病要轻于移栽迟的田块，如枫桥毛家村毛国贤户有两块在同一地点的移栽田（品种秀水110，5月25日播种），分别在6月25日和6月30日移栽，7月24日调查，6月25日移栽田的条纹叶枯病丛发病率为14.5%，6月30日移栽的丛发病率达到30%，迟移栽的发病比早移栽的重1倍。分析原因可能是播种时间早，最易感病的秧苗期与灰飞虱一代成虫盛发迁入高峰期相吻合的机会多和时间长，被传毒的机率大，所以发病重；而迟播的则可能避开了成虫盛发迁入高峰期，因而发病轻。同一秧田的秧苗早栽田比迟栽田发病轻，则是由于受拔秧影响而使传毒灰飞虱集中到剩余秧苗上而大大增加被传毒的几率，靠近秧田旁边的稻苗发病重也是这个原因。示范地点栽培方式播种时间（月.日）调查块数丛发病率（%）株发病率（%）幅度平均幅度平均＞1%的田块数汪王直播6.10120～0.200.090祥头育秧6.01140～3.20.90～1.040.2641择墅下育秧5.2570.4～14.04.040.07～3.641.042楼许育秧6.0360.2～1.81.240.04～0.620.180义燕育秧5.25140.2～4.41.460.12～1.020.381新店湾育秧5.23101.2～6.22.860.2～1.450.641阮市育秧5.26151～10.45.040.27～2.771.066表1 水稻栽培方式与条纹叶枯病发生关系2.1.2 种植方式 育秧移栽的比直播田发病重。如秀优5号在汪王作直播种植的发病要比其他两个示范方轻得多，除了因播种时间不同而造成差异外；另一个重要原因是大部分直播的农户在播种前都要进行清园整田后才播种，使传毒媒介灰飞虱的生存场所和食料遭到破坏而减少传毒虫量，因而播种后迁入的带毒虫量少而发病较轻；相反，育秧移栽的由于播种到移栽有20多天的秧苗期，播种时大田不翻耕整理，秧田周围也不清园等，秧苗受到周围杂草上的带毒灰飞虱传毒的机会和时间大大增加，因而发病加重。2006年在陈潘和木桥进行秧田周围清园和不清园的比较试验，结果清园的水稻条纹叶枯病株发病率为0.032%和 0.039%，不清园的为1.153%和1.06%，清园比不清园的发病要轻。浬浦马郦制种基地条纹叶枯病发生轻，除播种时间比较迟外，播种之前6～7天，整个田畈用克芜踪防除杂草，以破坏灰飞虱的生存场所和断绝其食物链的清园工作。两种种植形式的发病程度不同，主要取决于秧苗周围是否有较多的带毒灰飞虱存在，破坏灰飞虱的生存场所和断绝它的食物链是减少毒源的主要措施。2.1.3 播种形式 采用常规水田育秧要比旱地（蔬菜地）育秧发病重。如10个展示品种的秀水63、E8、浙粳22、秀水09、秀优5号、春江026、浙优9号、加乐优2号、甬优5号、加优1号在枫桥择墅下和王家井楼许都是采用育秧移栽，但楼许点采用的是旱地育秧强化栽培，择墅下点仍是常规水田育秧，结果择墅下点除E8外所有参展品种都发病，而楼许点只有秀水63、浙粳22、秀水09、春江026、加优1号发病，且发病程度要比择墅下点轻。分析原因主要在于旱地上育秧，周围灰飞虱数量少。强化栽培育秧由于秧龄短（12天左右）、密播，可在房前屋后的旱地甚至在水泥地面（铺上一层泥）上育秧，从而避免受到较多灰飞虱的侵入而减少被传毒的机会，达到减轻病情的目的。几年调查结果表明，甬优系列品种对条纹叶枯病的感染率相对较低，在条纹叶枯病发生加重的情况下，可以以甬优系列中的一些品种作为过渡。同一地点、种植方式和播种时间相近，但不同品种间发病有较大差异。通过品试田及大田的调查观察，大多数晚粳糯品种（系）为条纹叶枯病感病品种（系），但品种间发病程度有较大差异。从2006年对品种感病情况调查的结果看，E8在多点调查或试验中都没有发现条纹叶枯病的发生，在引种品试中E44、F104、杂5和联检品试中春优59、05G364、浙优2611、05G361、05G227也没有条纹叶枯病的发生，大面积示范的甬优8号，以及种植多年的甬优6号也没有发生条纹叶枯病。从种质资源看，籼粳杂交基因类型的品种基本不发病，表现出较强的抗性，如甬优6号和E8。秀字、加字系列或一些浙粳类的粳糯稻品种发病相对较重，如秀水110等。集中育秧管理的好坏影响发病的轻重。阮市示范方和楼许示范方，采用集中浸种育秧，分户移栽，株发病率为1.06%；而楼许示范方也是集浸种育秧，但株发病仅为0.18%；除了楼许示范方播种时间比阮市示范方迟5天外，不同的是楼许点育秧前期搭棚覆盖地膜，出苗后喷施杀虫剂防治，而阮市点在秧田期管理比较粗放，针对性杀虫工作做得较差。水稻在发病后加强管理也可减轻病害损失，如枫桥毛家村毛贤佰户，种植的品种为秀水110，前期丛发病率为14%～30%，通过加强肥水管理，拔除病株，喷施菌克毒克的病毒钝化剂，后期调查丛发病率下降为9.8%～17%，株发病率下降为1.8%～3.4%，发病程度明显减轻。2.4.1 毒源地广，虫口基数高（1）种植模式的单一化造成毒源寄主多，传毒媒介昆虫生存条件好。自进入21世纪后本市水稻生产模式从原三熟制、二熟制转向大部分一熟制（单季晚稻）、部分二熟制的局面，大部分地区冬春两季都是荒芜休闲，田埂、道路、沟渠和田里杂草丛生，条纹叶枯病毒的越冬寄主广泛，为传毒媒介灰飞虱提供了良好的越冬场所。（2）灰飞虱种群数量持续上升①灯下诱虫量 2005～2006年灯下诱集灰飞虱情况如图4所示。前期虫量主要集中在6月下旬到7月上旬，出现较大诱虫峰；8月下旬诱集量增加，9月份出现全年数量最高峰。图4 2005～2006年灯下灰飞虱诱集情况②水稻秧田和本田灰飞虱发生情况 秧田灰飞虱虫量调查，6月8日平均亩虫量为8160头，均为成虫；6月16日调查，亩虫量为4140头，成虫占85.5%；6月26日调查，亩虫量为4300头，其中成虫占72%。6月12日和16日灰飞虱卵量调查，每百株秧苗有效卵分别为13粒和7粒。从单季稻3年的田间灰飞虱虫量消长调查情况看，2006年与2004年在7月上中旬都有较高的虫量，单季稻条纹叶枯病在7月29日左右有一个发病高峰期，两者发生较相吻合；7月下旬至8月上旬田间虫口数量下降，8月中旬又有所上升，到9月下旬末期灰飞虱虫量急增，为全年数量最高；进入10月灰飞虱迁入越冬场所，田间虫量下降，见图5。图5 单季稻田间灰飞虱虫量消长曲线③灰飞虱的越冬与越夏场所 初步调查结果，灰飞虱在田埂、路边的看麦娘等杂草上越冬，以3、4龄若虫为主。越冬代成虫高峰在3月24日～4月30日；一代成虫高峰在5月下旬至6月初；二代成虫高峰在6月下旬至7月上旬。灰飞虱越夏场所调查，千金子、稗草、狗牙根、马唐上发现较多灰飞虱，以成虫为主；其次为双穗雀稗、游草、狗尾草；蟋蟀草、莎草、丁香蓼上尚未见灰飞虱。从多年药剂试验的结果看，扑虱灵等对基部灰飞虱的防治效果不明显；从晚稻穗部灰飞虱的防治示范看，每亩用80%敌敌畏300ml，或用48%乐斯本100ml加水30kg，采用喷雾法的效果在70%～80%左右；毒死蜱类加异稻瘟净对灰飞虱有较好的防治效果。主治药剂吡虫啉对灰飞虱防治效果仅为40%～50%，有可能出现抗药性或耐药性。缺乏高效药剂，有利于虫源积累和上升。鉴于水稻条纹叶枯病和传毒媒介灰飞虱发生情况，影响发病因素调查分析在防控上要坚持“预防为主，综合防治”的植保方针，采取“切断毒链、治虫防病、综合治理”的对策，因地制宜地推广抗病品种，狠抓秧田和本田前期灰飞虱防治，以控制条纹叶枯病暴发为害。

水稻条纹叶枯病由灰飞虱传播的发生严重的病毒病，近几年来该病在诸暨市发生面积不断扩大，发病程度越来越重，对水稻安全生产构成重大威胁。抗性品种选育推广是防治条纹叶枯病最经济有效的措施，为此，我们对诸暨市引种试验的晚粳糯新品种（系）和在本市进行的全省联合检验的晚粳糯新品种（系）系，进行了条纹叶枯病田间自然发病的抗性测定，现将结果报告如下：分4组处理。第一组本地引进试种品种，E44、杂2、杂1、杂3、杂4、杂5、浙粳22、E8、F104、加优04-1、加优06-1等11个新品种，以甬优1号作对照品种；第二组12个全省联合检验品种（系）（简称联检），春优59、05G354、浙优2611、春优658、05G361、浙优0630、春优6172、05G227、嘉花一号、A/XR155、05G290、嘉优06-2、八优158、秀水63（对照）等13个品种；第三组作苗情观察，浙糯5号、春江糯2号、浙粳22、春江026、春江026、加优06-1、加优04-1、秀优5号、加优1号、E8、甬优2号、甬优1号等12个本地推广品种；第四组全省展示品种，秀水63、E8、浙粳22、秀水09、秀优5号、春江026、浙优9号、加乐优2号、甬优5号、加优1号等10个品种。由迁入试验小区的灰飞虱自然传毒接种。引种品试和联检在江藻镇陈潘村进行，每个品种重复3次种植，随机区组排列，5月30日播种，6月24日移栽，小区面积13.3m2，株行距品试为23.3cm×20cm，联检为30cm×16.7cm。苗情品种分别在江藻镇陈潘村和浣东街道泰南村种植作两地观察，5月30日播种，6月25日移栽，小区面积陈潘村100m2，种植2352丛，泰南村20m2，种植516丛。展示品种分别在王家井镇楼许村和枫桥镇择墅下村两地种植，每个品种种植667m2以上，择墅下点在5月22～23日播种，6月18～20日移栽，楼许点6月2～3日播种旱地育秧，6月18日左右移栽。所有处理除条纹叶枯病没有进行专门预防外，其他病虫均进行常规防治，每个试验或观察区肥水管理基本一致。8月下旬水稻未抽穗时调查；调查数量为，品试或联检试验及苗情观察的品种全小区调查，展示品种每块田调查500丛，记载发病丛数、株数和5丛的苗数。计算丛发病率和株发病率，并作统计分析。引种试验品种和联检品种的条纹叶枯病发生况调查结果见表1和表2。引种试验品种中的E44、E8、F104、杂5等没有条纹叶枯病的发生，与其他品种相比达显著或极显著差异，而杂1、加优06-1、浙粳22、杂4和加优04-1等品种的丛发病率和株发病率分别在1%和0.2%以上，浙粳22和加优04-1发病程度最重，对照品种甬优1号发病最轻。联检品种中代号1、2、3号和8号没有条纹叶枯病发病，代号9、10、11、12号丛发病率和株发病率分别在1%和0.2%以上；另外，丛发病率在1%、株发病率在0.2%以上的还有代号4号和7号。联检品种中除代号10发病程度重，与其他品种比较有显著性差异外，其他品种间差异不显著。苗情点品种条纹叶枯病抗性测定结果见表3。在两地种植都没有发生条纹叶枯病的有E8，而丛发病率和株发病率分别在1%、0.2%以上的品种有浙糯5号、春江糯2号、加优06-1、加优04-1和加优1号，其中春江糯2号发病最重，与E8比较有显著差异，但与其他品种间无显著差异；秀优5号丛发病率1%、株发病率0.2%。品种平均发病丛发病率（%）株发病率（%）E440.00cB0.000cD杂20.86bAB0.210bBCD杂11.05abA0.257bABC加优06-11.05abA0.140bcCD浙粳221.63aA0.407aABE80.00cB0.000cD杂30.09cB0.009cD甬优1号0.09cB0.018cD杂41.21abA0.257bABCF1040.00cB0.000cD杂50.00cB0.000cD加优04-11.48abA0.427aA表1 引种试验品种条纹叶枯病发生情况表（浙江诸暨，2005～2006）品种代号平均发病丛发病率（%）株发病率（%）10.00bA0.000bB20.00bA0.000bB30.00bA0.000bB40.79abA0.340bAB50.00bA0.000bB60.32bA0.097bB70.95abA0.207bAB80.00bA0.000bB91.27abA0.510bAB101.90abA1.227aA111.11abA0.207bAB121.43abA0.253bAB130.48abA0.050bB表2 联检品种条纹叶枯病发生情况表 （浙江诸暨，2005～2006）品种丛发病率（%）株发病率（%）陈泮点泰南点平均陈泮点泰南点平均浙糯5号0.461.931.195aA0.080.410.245abA春江糯2号0.565.232.895aA0.150.780.465aA浙粳220.38—0.380.075—0.075春江026选0.04—0.040.007—0.007春江0260.17—0.170.016—0.016加优06-10.173.41.785aA0.0240.520.272abA加优04-10.531.871.2aA0.430.340.385abA秀优5号1.020.940.98aA0.240.160.20abA加优1号0.852.641.745aA0.130.420.275abAE8000.00aA000.00bA甬优2号0.510.340.425aA0.0760.030.053abA甬优1号0.170.0850.128aA0.0180.0290.024abA表3 苗情点品种条纹叶枯病发病情况（浙江诸暨，2005～2006）展示点品种抗条纹叶枯病测定结果见表4。在展示的10个品种中，E8在两地都没有发现病苗，丛发病率1%、株发病率0.2%以上的品种有浙粳22、秀水09、春江026和加优1号，这4个品种在两地都有发病，择墅下点重于楼许点；而秀优5号、浙优9号、加乐优2号和甬优2号在枫桥择墅下点均有发病，分析发病程度差异的原因可能与播种时间和方式不同有关。品种丛发病率（%）株发病率（%）楼许点枫桥点平均楼许点枫桥点平均秀水630.20.60.4aA0.010.060.035aAE8000.0aA000.000aA浙粳2212.81.9aA0.120.630.375aA秀水091.23.22.2aA0.170.560.365aA秀优5号010.5aA00.140.07aA春江02622.22.1aA0.240.490.365aA浙优9号01.20.6aA00.290.145aA加乐优2号00.60.3aA00.070.035aA甬优5号00.20.1aA00.040.02aA加优1号0.63.82.2aA0.121.210.665aA表4 展示品种发病情况调查表（浙江诸暨，2005～2006）从多点试验可以看出，多数晚粳糯品种（系）不抗条纹叶枯病，只是发病程度有轻重而异，而E8在多点调查或试验中都没有发现条纹叶枯病的发生，从种质资源看它是一个籼粳交品种，2006年浙江诸暨市进行较大面积示范种植，显示出产量较高、品质较优、抗病性较好、但耐肥能力较差的特性，具有一定的推广价值。其他如E44、F104、杂5等也有较好抗病表现。调查观察表明，甬优6号和甬优8号没有发生条纹叶枯病，甬优系列的其他品种发病也较轻，如甬优1号、甬优2号、甬优5号，几年调查结果趋势基本一致。但是秀优5号、加优1号和秀水09等品种，对条纹叶枯病比较容易感染，且发病程度较重，对这些品种种植区，条纹叶枯病的防范要采取更加严格的措施。

灰霉病是番茄栽培中的重要病害，长期依赖农药防治该病严重污染环境和产品。利用诱导抗性是植物病害可持续控制的一条有效途径。E.A.Achuo和K.Audenaert等用适宜浓度的BTH处理土壤或叶片，显著降低番茄灰霉的发病程度[1]。众多研究表明，诱导植株下位叶片，可增强诱导叶和其上非诱导叶的抗病性[2～4]；而诱导上位叶片对诱导叶及其下位非诱导叶的抗病性的影响鲜见报道。本试验比较了5种化学物质诱导不同部位叶片对番茄灰霉病发生程度的影响，为诱抗剂的使用技术提供参考和依据。番茄品种为L402，灰霉菌（Botrytis cinerea）由田间分离所得。供试化学物质分别为：CaCl2（Calcium chloride，Ca），上海化学试剂公司生产；水杨酸（Salicylic acid，SA），沈阳化学试剂厂生产；茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MJ）、龙胆酸（Gentisic acid，GeA）和β-氨基丁酸（3-Aminobutyric acid，BABA），购自Sigma公司。番茄穴盘育苗，苗期管理与一般生产相同。6叶期用20mmol/L的CaCl2，3mmol/L的SA、MJ、GeA和9mmol/L的BABA涂抹第3叶片（下位叶）或第5叶片（上位叶）。5天后用浓度为106个孢子/ml的灰霉菌孢子悬液接种第4真叶的前5片小叶，接种方法采用微量注射法[7]。接种后第5天调查发病程度并计算病指数。病害分级标准为：0级，无病斑；1级，病斑面积占叶面积5%以下；3级，病斑面积占叶面积5%～15%；5级，病斑面积占叶面积15%～25%；7级，病斑面积占叶面积25%～50%；9级，病斑面积占叶面积50%以上[7]。每处理3次重复，数据均用SPSS软件进行统计分析。无论是诱导第3叶片还是第5叶片，番茄灰霉病发生程度均显著低于对照。其中CaCl2、SA和GeA 诱导第3叶片和诱导第5叶片，番茄灰霉病发生程度之间没有显著差异；而MJ和BABA诱导第3叶片番茄灰霉病发生程度显著低于诱导第5叶片的发病程度（图1）。这一现象说明，CaCl2、SA、GeA、MJ和BABA诱导番茄的抗病信号既可以向上传递，也可以向下传递；而CaCl2、SA和GeA诱导的抗病信号向上和向下传递的能力相同，MJ和BABA诱导番茄的抗病信号向上传递能力高于向下传递能力。Figure 1 Disease index after induced leaves at different positions of tomato试验结果表明，CaCl2、SA、GeA、MJ和BABA均可诱导番茄抗病性增强，而且诱导的抗病信号可以在植株中进行双向传递，但诱导的抗病信号向植株下部传递能力不高于向上传递能力。蔡新忠等用叶霉菌非亲和小种4诱发接种番茄第3叶片，5天后用其亲和小种5挑战接种第3叶和第4叶，结果表明，诱导植株的第3叶和第4叶发病程度均显著低于对照，发病面积下降率分别为90%和85%[2]。童蕴慧等发现，用拮抗细菌处理番茄叶片可诱导番茄抗灰霉性增加，处理叶的上一叶位叶片中PAL、POD、PPO、SOD活性均显著高于对照，处理叶和上一叶位叶片中SA含量分别是对照的2.6倍和1.6倍[3]。张穗等用井冈霉素A处理珊西烟，处理叶和其上位叶片中几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶的活性均比对照植株相同叶位叶片显著增加，而这两种酶活性与TMV引起的烟草叶片枯斑数目呈负相关[4]。上述研究结果与本试验结果一致。所以在所用诱抗剂价格昂贵或数量不足时，建议用少量诱抗剂处理植株下位叶片来达到防病目标。

苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus，ASPV）主要侵染苹果和梨，且分布范围十分广泛，可导致其产量明显下降和品质改变。本研究从湖北省农业科学院果茶蚕桑研究所国家砂梨资源圃采集砂梨样品52份，采用试管捕捉反转录-聚合酶链式反应（TC-RT-PCR）对这些样品中的苹果茎痘病毒进行了检测，其中33份样品的ASPV检测结果为阳性，带病毒率为63.5%。取RT-PCR检测为阳性的13个样品，在温室汁液摩擦接种草本指示植物西方烟，对该病毒的生物学特性进行了分析，大部分样品的病毒分离物在西方烟叶片上表现褪绿斑点或褪绿斑、坏死斑或坏死线或网状褪绿纹。从上述样品中选取5个分离物，接种不同的草本鉴别寄主植物，以明确其寄主范围。5个分离物在昆诺藜、心叶烟、本氏烟和克利夫兰烟上均产生明显的症状，但分离物间在症状出现时间和症状类型上存在一定的差异。在昆诺藜上症状表现最早，本氏烟和克里夫兰烟次之，心叶烟最晚。5个分离物在昆诺藜上均产生褪绿斑或斑点；在心叶烟主要产生褪绿斑；在本氏烟上主要产生褪绿斑点；在克里夫兰烟上只有个别分离物在叶片上产生边缘浅黄色，中间绿色的环斑；在千日红叶片上有不规则的凹陷的白斑；在苋色藜上没有明显症状。而心叶烟和苋色藜的ASPV检测结果为阴性，其他草本植物的ASPV检测结果为阳性。以上结果表明，ASPV可以侵染昆诺藜、本氏烟、克利夫兰烟和千日红。取症状表现明显的两个分离物进行了致死温度的测定，接种后观察症状表现发现两个分离物在处理55℃时仍表现症状，而在处理58℃和高于58℃的温度时都不表现症状，可以初步推测该病毒的致死温度为58℃。

黄皮原产于我国华南，在我国至少已有1500年的栽培历史，目前主要分布于广东、广西、福建、海南、台湾、四川、云南等地。越南、印度、泰国、马来西亚以及美国的佛罗里达州等有零星栽种。黄皮属于芸香科黄皮属植物，与柑橘同科，过去一直认为黄皮不会感染黄龙病病原。2006年8月，作者在广东罗定索龙镇柑橘园附近发现有些黄皮的叶片变黄，而且黄化的叶片一般从植株的顶端开始，逐渐向下扩展直至中部，这与柑橘黄龙病的黄化症状及发病规律很相似，那么黄皮的黄化症状是不是由黄龙病病原（Candidatus Liberobacter spp.）所引致的呢？黄皮是芸香科植物，同时也是柑橘木虱的寄主植物，究竟黄皮是否会发生黄龙病？其病原与柑橘黄龙病病原有何异同？值得进一步的探讨和研究。本研究从田间采集叶脉表现黄化症状的黄皮叶片，用CTAB法提取叶脉组织DNA。以α亚纲细菌的通用引物27F/1500R为外套引物，取2μl待测黄皮样品进行第一轮的PCR扩增，用已感染了柑橘黄龙病的病叶材料提取的DNA为阳性对照，健康黄皮材料提取的DNA模板为阴性对照，第一轮的PCR先进行10个循环；再以OI1/OI2c为内嵌引物，取第一轮扩增的2μl PCR为模板，在内嵌引物的引导下进行第二轮Nested-PCR扩增。通过Nested-PCR的扩增，在表现黄化症状的2个黄皮样品中则有1160bp的特异条带扩增，初步证明在表现黄化症状的黄皮样品中含有黄龙病病原。XbalⅠ酶切显示，该片段可被切成大小分别约为640bp和520bp的两个片段，初步证明黄龙病病原为亚洲种（Candidatus Liberobacter asiaticus）。扩增产物经纯化，与pMD18-TVector连接，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH 5α，筛选克隆重组子。对PCR产物进行测序及序列分析，结果表明黄皮黄龙病病原16SrDNA片段序列与柑橘黄龙病亚洲种16SrDNA片段序列的同源率为：98.3%～99.6%；与非洲种16SrDNA片段序列的同源率为96.8%；与美洲种16SrDNA片段序列的同源率为94.1%～94.6%；与非洲种亚种的16SrDNA片段序列的同源率94.5%。而与其他的根瘤菌、难培养菌和另外的α亚纲细菌的同源率都在87%～89%之间。因此，认为黄皮叶脉黄化的症状是由黄龙病病原引致的，称之为黄皮黄龙病，而且该黄皮黄龙病病原属于柑橘黄龙病病原亚洲种中的一个成员。系统进化树分析显示，黄皮黄龙病病原与中国柑橘黄龙病病原亲缘关系最近，推测是直可能来自柑橘黄龙病病原。过去人们对黄皮黄龙病关注较少，本研究从分子水平上证实了黄皮确实会感染黄龙病，建议今后在黄皮生产上应重视黄龙病的问题。但由于黄皮植株内的黄龙病病原含菌量却要比柑橘植株体内的要低得多，而且黄皮也较少表现柑橘黄龙病的典型的斑驳症状，这是否和黄皮的生理特性或者是其体内的某种物质有关，值得深入研究和探讨。

桑叶是家蚕的唯一饲料，桑树是蚕丝产业的物质基础。桑树生长在各种不同气候和地貌的生态环境，桑树萎缩病是蚕桑生产最严重的病害之一，主要有黄化型、萎缩型和花叶型3种类型，分布于中国、日本、韩国、格鲁吉亚、越南等蚕桑生产国，特别是中国和日本受害最为严重。桑树萎缩病在我国主要蚕桑区江浙、湖广及北方的山东、陕西等省均有分布，对蚕桑生产造成严重甚至毁灭性的危害，且防治比较困难。本研究对山东省发生的症状为萎缩型的桑萎缩病，采用PCR技术对其16S rDNA、延伸因子和核糖体蛋白基因片段进行扩增和直接测序，并且与已知的植原体各组中代表的植原体序列进行同源性比较，确定了该分离物的亚组分类地位。现将研究结果报道如下。表现萎缩型症状的发病桑树材料采自山东省宁阳市。克隆载体pMD18-T、PCR产物回收试剂盒、限制性内切酶及其他酶类等分子生物学试剂产品均购自TaKaRa公司。提取方法参照漆艳香等[1]的方法进行，总DNA于-20℃保存备用。植原体16S rDNA基因扩增采用Lee等[2]报道的通用引物R16mF2/R16mR1，植原体延伸因子基因的引物对fTufu/rTufu序列及核糖体蛋白（rp）基因的引物对rpF1/rpR1序列分别根据Schneider等[3]和Lim等[4]文献设计合成（Table 1）。以提取得病组织总DNA为模板进行PCR扩增。NamePrImersequenceTm(℃)ReferencesR16mF25′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′60[3]R16mR15′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′60[3]fTufu5′-CCTGAAGAAAGAGAACGTGG-3′50[4]rTufu5′-CGCAAATAGAATTGAGGACG-3′50[4]rpF15′-GGACATAAGTTAGGTGAATTT-3′55[5]rpR15′-ACGATATTTAGTTCTTTTTGG-3′55[5]Table 1 Primers used in this research to amplify three genePCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用PCR纯化试剂盒进行纯化回收。PCR产物回收后与pMD18-T连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取筛选平板上的白色菌落培养，提取质粒，经PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒送上海英骏生物技术有限公司测序。将所得DNA 序列输入GenBank进行Blast检索，采用DNAMAN和MEGA3.1软件对所得到的核苷酸序列与GenBank中收录的相应基因的核苷酸序列进行比对分析，并构建系统进化树。以带有桑萎缩病原（Mulberry dwarf-Ningyang，MDNY）的发病桑树病组织总DNA为模板，16S rDNA引物经直接PCR扩增，得到长度为1.5kb的片段，延伸因子基因引物经PCR扩增，得到长度为0.8kb的片段，PCR扩增核糖体蛋白基因，得到长度为1.2kb的片段，与预期的结果一致，表明该病组织中存在植原体。对含有目标外源片断的重组质粒进行序列测定，扩增得到16S rDNA基因片断为1431bp；延伸因子基因片断为842bp，共编码280个氨基酸；核糖体蛋白基因片断为1249bp，DNAMAN软件分析表明该序列包括部分rps19和全部rp122和rps3基因。将MDNY的16S rDNA序列与GenBank中22个植原体分离物16S rDNA的核苷酸序列进行比对和构建系统进化树，该分离物与植原体的16S rI组处于同一个分支，与16S rI-B和16S rI-D亚组同源性最高。该分离物MDNY的延伸因子基因序列与GenBank中植原体16S rI组的7个亚组分离物延伸因子基因的核苷酸序列进行比对和构建系统进化树（Figure 1）。从系统进化树中可以看出，该分离物MDNY与16S rI-B和16S rI-D亚组处于同一分支，同源性最高，与16S rDNA的结果一致。Figure 1 Phylogenetic tree of MDNY based on the elongation factor gene sequences using neighbor-joining in MEGA3.1该分离物MDNY的核糖体蛋白基因（rp）序列与GenBank中植原体16S rI组的6个亚组分离物核糖体蛋白基因的核苷酸序列进行比对并构建系统发育树（Figure 2），从系统进化树中可以看出，该分离物与16S rI-D 的Paulownia witches-broom处于同一分支，同源性最高，确定了该分离物的亚组分类地位。Figure 2 Phylogenetic tree of MDNY based on the rIbosomal protein gene sequences using neighbor-joining in MEGA3.1夏志松等对桑黄化性萎缩病病原体16S rRNA基因序列进行了分析[5]，而刘清神等对广州桑萎缩病植原体进行检测时确定所检测的桑树植原体属于16S rI组[6]，没有确定桑萎缩植原体的亚组分类地位。本研究对分离物MDNY的16S rDNA和延伸因子基因构建系统发育树，确定该分离物与16S rI-B和16S rI-D的同源性最高。通过核糖体蛋白基因构建系统发育树表明该分离物MDNY属于16S rI-D亚组，进一步明确了其亚组分类地位。20世纪80年代至今，由于分子生物学技术，特别是分子克隆和PCR技术的应用大大加快了包括植原体在内的细菌系统学研究进展。目前植原体的分类16S rDNA是一种非常有效的手段，但对于16S rDNA类群内的进一步划分，用16S rDNA类群作为分类标准显得过于保守，延伸因子和核蛋白基因序列可以作为系统学研究的依据。Schneider等[7]对STOL类群和AY类群的16S rRNA和延伸因子基因进行序列分析，利用延伸因子基因比16SrRNA序列建立的遗传距离要远。Lee等[8]对植原体各亚组的16S rRNA和核糖体蛋白基因进行了分析，证明16S rRNA和核糖体蛋白基因序列分析可以作为植原体鉴定和分类的依据。本试验以16S rDNA基因，延伸因子基因及核糖体蛋白基因作为分类依据，在亚组水平明确了桑树萎缩病的分类地位，为今后研究桑树萎缩病植原体的来源、进化关系及其致病的分子机理提供了理论依据。

1.利用柑橘溃疡病菌细胞悬浮液免疫BALB/c小鼠，免疫后小鼠抗血清效价为2500倍左右。提取小鼠脾细胞mRNA，构建的单链抗体文库重链DNA大小为350bp左右，轻链为650bp左右，经linker（Gly3Ser）4连接后单链抗体DNA大小为1.2kb左右。将单链抗体文库DNA克隆到大肠杆菌JM109中，随机挑选了9个克隆子测序表明，9条单链抗体序列都是开放阅读框，其重链分别属于VH1、VH2、VH3基因家簇，轻链属于VKⅠ、VKⅢ、VKⅣ亚基因家簇。每个单链抗体的互补决定区（CDRs）都为不同的CDR，其中氨基酸序列变化多样，说明构建的单链抗体文库多样性好，适合于进一步进行单链抗体的筛选。2.采用核糖体展示技术对构建单链抗体文库进行了进化和富集。结果显示第一轮核糖体展示后回收的mRNA量非常少，分光光度计已测不出其浓度，反转录RCR后，扩增得到的条带非常弱，说明在原始未筛选的抗体文库中，能与柑橘溃疡病菌O-特异性脂多糖作用的单链抗体数量较少。经过三轮筛选后，得到的mRNA量逐渐增多，经RT-PCR后，产生了比较亮的扩增条带。说明在核糖体展示过程中，抗原阳性的单链抗体得到了富集。3.将未经过核糖体展示的原始单链抗体文库DNA和经过三轮展示的单链抗体文库DNA与噬菌体表达载体pCANTAB5E相连接后，转入大肠杆菌TG1中小量表达，表达后用间接ELISA测定单链抗体与抗原的结合活性。结果表明：从未经过筛选的原始单链抗体文库中随机挑取的60个克隆子表达产物与柑橘溃疡病菌O-特异性脂多糖几乎没有结合能力；而从经过三轮展示后的单链抗体文库中挑取的60个克隆子中有30%与柑橘溃疡病菌O-特异性脂多糖有较好的结合能力。从三轮展示后的单链抗体文库中共挑取了180个克隆子，用间接ELISA法初筛到60株抗原阳性的单链抗体；然后用生物分子相互作用技术（biosensor，biacore）对筛选的抗原阳性的单链抗体进行了复筛，筛选了3株高亲和力的单链抗体（GX13、GX44和GX95）以用于下一步的表达鉴定。4.将筛选的高亲和力抗原阳性的克隆子从大肠杆菌TG1中转入高表达菌株HB2151中进行可溶性表达。单链抗体表达后，其表达产物主要集中于细胞周质提取物中，具有抗体活性。将浓缩的周质提取物进行SDS-PAGE电泳，显示在32 kDa处有一蛋白条带产生。将表达产物纯化后进行SDS-PAGE电泳显示，在32 kDa处有单一蛋白条带产生。为了进一步验证表达的蛋白即目的蛋白，将表达产物进行了Western blot 杂交，结果显示，与纯化后的电泳结果一致，在32 kDa处有单一的条带产生，说明表达纯化的蛋白即目的蛋白。5.将筛选的抗原阳性单链抗体进行了特性研究。单链抗体（GX95、GX44、GX13）特异性强、亲和力高。其与柑橘溃疡病菌近源种Xanthomonas oryzae pv.oryzae（Xooc）；Xanthomonas campestris pv.campestri（Xcc）；Xanthomonas oryzae pv.oryzicola（Xoc）；及从柑橘叶片上分离的10种腐生黄单孢菌及Bacillus subtilis；E.coli 都没有交叉反应。Biacore 分析其亲和力表明，单链抗体GX95、GX44和GX13的亲和常数分别为1.98×1010 M-1、1.89×1010 M-1、3.43×1010 M-1。6.对筛选的单链抗体进行了测序。用DNAplot 软件分析单链抗体序列。结果表明：单链抗体 GX44 和GX13重链分别属于VH1基因家簇，GX95 重链属于VH3基因家簇；GX44和GX13轻链属于Vk IV亚基因家簇，GX95轻链属于Vk III亚基因家簇。用Vector NTI软件对筛选的单链抗体的序列同源性进行了分析，表明GX44 和GX13重链有89.67%的同源性，GX95和GX13具有92.53%的同源性。