黄皮原产于我国华南，在我国至少已有1500年的栽培历史，目前主要分布于广东、广西、福建、海南、台湾、四川、云南等地。越南、印度、泰国、马来西亚以及美国的佛罗里达州等有零星栽种。黄皮属于芸香科黄皮属植物，与柑橘同科，过去一直认为黄皮不会感染黄龙病病原。2006年8月，作者在广东罗定索龙镇柑橘园附近发现有些黄皮的叶片变黄，而且黄化的叶片一般从植株的顶端开始，逐渐向下扩展直至中部，这与柑橘黄龙病的黄化症状及发病规律很相似，那么黄皮的黄化症状是不是由黄龙病病原（Candidatus Liberobacter spp.）所引致的呢？黄皮是芸香科植物，同时也是柑橘木虱的寄主植物，究竟黄皮是否会发生黄龙病？其病原与柑橘黄龙病病原有何异同？值得进一步的探讨和研究。本研究从田间采集叶脉表现黄化症状的黄皮叶片，用CTAB法提取叶脉组织DNA。以α亚纲细菌的通用引物27F/1500R为外套引物，取2μl待测黄皮样品进行第一轮的PCR扩增，用已感染了柑橘黄龙病的病叶材料提取的DNA为阳性对照，健康黄皮材料提取的DNA模板为阴性对照，第一轮的PCR先进行10个循环；再以OI1/OI2c为内嵌引物，取第一轮扩增的2μl PCR为模板，在内嵌引物的引导下进行第二轮Nested-PCR扩增。通过Nested-PCR的扩增，在表现黄化症状的2个黄皮样品中则有1160bp的特异条带扩增，初步证明在表现黄化症状的黄皮样品中含有黄龙病病原。XbalⅠ酶切显示，该片段可被切成大小分别约为640bp和520bp的两个片段，初步证明黄龙病病原为亚洲种（Candidatus Liberobacter asiaticus）。扩增产物经纯化，与pMD18-TVector连接，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH 5α，筛选克隆重组子。对PCR产物进行测序及序列分析，结果表明黄皮黄龙病病原16SrDNA片段序列与柑橘黄龙病亚洲种16SrDNA片段序列的同源率为：98.3%～99.6%；与非洲种16SrDNA片段序列的同源率为96.8%；与美洲种16SrDNA片段序列的同源率为94.1%～94.6%；与非洲种亚种的16SrDNA片段序列的同源率94.5%。而与其他的根瘤菌、难培养菌和另外的α亚纲细菌的同源率都在87%～89%之间。因此，认为黄皮叶脉黄化的症状是由黄龙病病原引致的，称之为黄皮黄龙病，而且该黄皮黄龙病病原属于柑橘黄龙病病原亚洲种中的一个成员。系统进化树分析显示，黄皮黄龙病病原与中国柑橘黄龙病病原亲缘关系最近，推测是直可能来自柑橘黄龙病病原。过去人们对黄皮黄龙病关注较少，本研究从分子水平上证实了黄皮确实会感染黄龙病，建议今后在黄皮生产上应重视黄龙病的问题。但由于黄皮植株内的黄龙病病原含菌量却要比柑橘植株体内的要低得多，而且黄皮也较少表现柑橘黄龙病的典型的斑驳症状，这是否和黄皮的生理特性或者是其体内的某种物质有关，值得深入研究和探讨。

1.利用柑橘溃疡病菌细胞悬浮液免疫BALB/c小鼠，免疫后小鼠抗血清效价为2500倍左右。提取小鼠脾细胞mRNA，构建的单链抗体文库重链DNA大小为350bp左右，轻链为650bp左右，经linker（Gly3Ser）4连接后单链抗体DNA大小为1.2kb左右。将单链抗体文库DNA克隆到大肠杆菌JM109中，随机挑选了9个克隆子测序表明，9条单链抗体序列都是开放阅读框，其重链分别属于VH1、VH2、VH3基因家簇，轻链属于VKⅠ、VKⅢ、VKⅣ亚基因家簇。每个单链抗体的互补决定区（CDRs）都为不同的CDR，其中氨基酸序列变化多样，说明构建的单链抗体文库多样性好，适合于进一步进行单链抗体的筛选。2.采用核糖体展示技术对构建单链抗体文库进行了进化和富集。结果显示第一轮核糖体展示后回收的mRNA量非常少，分光光度计已测不出其浓度，反转录RCR后，扩增得到的条带非常弱，说明在原始未筛选的抗体文库中，能与柑橘溃疡病菌O-特异性脂多糖作用的单链抗体数量较少。经过三轮筛选后，得到的mRNA量逐渐增多，经RT-PCR后，产生了比较亮的扩增条带。说明在核糖体展示过程中，抗原阳性的单链抗体得到了富集。3.将未经过核糖体展示的原始单链抗体文库DNA和经过三轮展示的单链抗体文库DNA与噬菌体表达载体pCANTAB5E相连接后，转入大肠杆菌TG1中小量表达，表达后用间接ELISA测定单链抗体与抗原的结合活性。结果表明：从未经过筛选的原始单链抗体文库中随机挑取的60个克隆子表达产物与柑橘溃疡病菌O-特异性脂多糖几乎没有结合能力；而从经过三轮展示后的单链抗体文库中挑取的60个克隆子中有30%与柑橘溃疡病菌O-特异性脂多糖有较好的结合能力。从三轮展示后的单链抗体文库中共挑取了180个克隆子，用间接ELISA法初筛到60株抗原阳性的单链抗体；然后用生物分子相互作用技术（biosensor，biacore）对筛选的抗原阳性的单链抗体进行了复筛，筛选了3株高亲和力的单链抗体（GX13、GX44和GX95）以用于下一步的表达鉴定。4.将筛选的高亲和力抗原阳性的克隆子从大肠杆菌TG1中转入高表达菌株HB2151中进行可溶性表达。单链抗体表达后，其表达产物主要集中于细胞周质提取物中，具有抗体活性。将浓缩的周质提取物进行SDS-PAGE电泳，显示在32 kDa处有一蛋白条带产生。将表达产物纯化后进行SDS-PAGE电泳显示，在32 kDa处有单一蛋白条带产生。为了进一步验证表达的蛋白即目的蛋白，将表达产物进行了Western blot 杂交，结果显示，与纯化后的电泳结果一致，在32 kDa处有单一的条带产生，说明表达纯化的蛋白即目的蛋白。5.将筛选的抗原阳性单链抗体进行了特性研究。单链抗体（GX95、GX44、GX13）特异性强、亲和力高。其与柑橘溃疡病菌近源种Xanthomonas oryzae pv.oryzae（Xooc）；Xanthomonas campestris pv.campestri（Xcc）；Xanthomonas oryzae pv.oryzicola（Xoc）；及从柑橘叶片上分离的10种腐生黄单孢菌及Bacillus subtilis；E.coli 都没有交叉反应。Biacore 分析其亲和力表明，单链抗体GX95、GX44和GX13的亲和常数分别为1.98×1010 M-1、1.89×1010 M-1、3.43×1010 M-1。6.对筛选的单链抗体进行了测序。用DNAplot 软件分析单链抗体序列。结果表明：单链抗体 GX44 和GX13重链分别属于VH1基因家簇，GX95 重链属于VH3基因家簇；GX44和GX13轻链属于Vk IV亚基因家簇，GX95轻链属于Vk III亚基因家簇。用Vector NTI软件对筛选的单链抗体的序列同源性进行了分析，表明GX44 和GX13重链有89.67%的同源性，GX95和GX13具有92.53%的同源性。

桑叶是家蚕的唯一饲料，桑树是蚕丝产业的物质基础。桑树生长在各种不同气候和地貌的生态环境，桑树萎缩病是蚕桑生产最严重的病害之一，主要有黄化型、萎缩型和花叶型3种类型，分布于中国、日本、韩国、格鲁吉亚、越南等蚕桑生产国，特别是中国和日本受害最为严重。桑树萎缩病在我国主要蚕桑区江浙、湖广及北方的山东、陕西等省均有分布，对蚕桑生产造成严重甚至毁灭性的危害，且防治比较困难。本研究对山东省发生的症状为萎缩型的桑萎缩病，采用PCR技术对其16S rDNA、延伸因子和核糖体蛋白基因片段进行扩增和直接测序，并且与已知的植原体各组中代表的植原体序列进行同源性比较，确定了该分离物的亚组分类地位。现将研究结果报道如下。表现萎缩型症状的发病桑树材料采自山东省宁阳市。克隆载体pMD18-T、PCR产物回收试剂盒、限制性内切酶及其他酶类等分子生物学试剂产品均购自TaKaRa公司。提取方法参照漆艳香等[1]的方法进行，总DNA于-20℃保存备用。植原体16S rDNA基因扩增采用Lee等[2]报道的通用引物R16mF2/R16mR1，植原体延伸因子基因的引物对fTufu/rTufu序列及核糖体蛋白（rp）基因的引物对rpF1/rpR1序列分别根据Schneider等[3]和Lim等[4]文献设计合成（Table 1）。以提取得病组织总DNA为模板进行PCR扩增。NamePrImersequenceTm(℃)ReferencesR16mF25′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′60[3]R16mR15′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′60[3]fTufu5′-CCTGAAGAAAGAGAACGTGG-3′50[4]rTufu5′-CGCAAATAGAATTGAGGACG-3′50[4]rpF15′-GGACATAAGTTAGGTGAATTT-3′55[5]rpR15′-ACGATATTTAGTTCTTTTTGG-3′55[5]Table 1 Primers used in this research to amplify three genePCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用PCR纯化试剂盒进行纯化回收。PCR产物回收后与pMD18-T连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取筛选平板上的白色菌落培养，提取质粒，经PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒送上海英骏生物技术有限公司测序。将所得DNA 序列输入GenBank进行Blast检索，采用DNAMAN和MEGA3.1软件对所得到的核苷酸序列与GenBank中收录的相应基因的核苷酸序列进行比对分析，并构建系统进化树。以带有桑萎缩病原（Mulberry dwarf-Ningyang，MDNY）的发病桑树病组织总DNA为模板，16S rDNA引物经直接PCR扩增，得到长度为1.5kb的片段，延伸因子基因引物经PCR扩增，得到长度为0.8kb的片段，PCR扩增核糖体蛋白基因，得到长度为1.2kb的片段，与预期的结果一致，表明该病组织中存在植原体。对含有目标外源片断的重组质粒进行序列测定，扩增得到16S rDNA基因片断为1431bp；延伸因子基因片断为842bp，共编码280个氨基酸；核糖体蛋白基因片断为1249bp，DNAMAN软件分析表明该序列包括部分rps19和全部rp122和rps3基因。将MDNY的16S rDNA序列与GenBank中22个植原体分离物16S rDNA的核苷酸序列进行比对和构建系统进化树，该分离物与植原体的16S rI组处于同一个分支，与16S rI-B和16S rI-D亚组同源性最高。该分离物MDNY的延伸因子基因序列与GenBank中植原体16S rI组的7个亚组分离物延伸因子基因的核苷酸序列进行比对和构建系统进化树（Figure 1）。从系统进化树中可以看出，该分离物MDNY与16S rI-B和16S rI-D亚组处于同一分支，同源性最高，与16S rDNA的结果一致。Figure 1 Phylogenetic tree of MDNY based on the elongation factor gene sequences using neighbor-joining in MEGA3.1该分离物MDNY的核糖体蛋白基因（rp）序列与GenBank中植原体16S rI组的6个亚组分离物核糖体蛋白基因的核苷酸序列进行比对并构建系统发育树（Figure 2），从系统进化树中可以看出，该分离物与16S rI-D 的Paulownia witches-broom处于同一分支，同源性最高，确定了该分离物的亚组分类地位。Figure 2 Phylogenetic tree of MDNY based on the rIbosomal protein gene sequences using neighbor-joining in MEGA3.1夏志松等对桑黄化性萎缩病病原体16S rRNA基因序列进行了分析[5]，而刘清神等对广州桑萎缩病植原体进行检测时确定所检测的桑树植原体属于16S rI组[6]，没有确定桑萎缩植原体的亚组分类地位。本研究对分离物MDNY的16S rDNA和延伸因子基因构建系统发育树，确定该分离物与16S rI-B和16S rI-D的同源性最高。通过核糖体蛋白基因构建系统发育树表明该分离物MDNY属于16S rI-D亚组，进一步明确了其亚组分类地位。20世纪80年代至今，由于分子生物学技术，特别是分子克隆和PCR技术的应用大大加快了包括植原体在内的细菌系统学研究进展。目前植原体的分类16S rDNA是一种非常有效的手段，但对于16S rDNA类群内的进一步划分，用16S rDNA类群作为分类标准显得过于保守，延伸因子和核蛋白基因序列可以作为系统学研究的依据。Schneider等[7]对STOL类群和AY类群的16S rRNA和延伸因子基因进行序列分析，利用延伸因子基因比16SrRNA序列建立的遗传距离要远。Lee等[8]对植原体各亚组的16S rRNA和核糖体蛋白基因进行了分析，证明16S rRNA和核糖体蛋白基因序列分析可以作为植原体鉴定和分类的依据。本试验以16S rDNA基因，延伸因子基因及核糖体蛋白基因作为分类依据，在亚组水平明确了桑树萎缩病的分类地位，为今后研究桑树萎缩病植原体的来源、进化关系及其致病的分子机理提供了理论依据。

稻曲病Usitilaginoidea vriens是影响水稻产量及品质的重要穗部病害。稻曲病厚垣孢子可以侵染水稻，引起稻粒发病[1，2]。陈永坚[2]用室内越冬的厚垣抱子接种水稻种子、芽鞘、苗期叶片、秧苗根系，穗苞均可引起稻曲病的发生，说明稻曲病很有可能在种子萌发或插秧时已侵染水稻，水稻生长后期穗部发病，是一种系统性侵染病害。也有研究认为稻曲病不是系统侵染的病害[3，4]。为进一步明确稻曲病的侵染方式问题，有必要用更严谨的试验加以研究，为稻曲病的防治及抗源筛选提供的理论指导。于2007年8月1日在湖北省宜昌市远安县莲花镇进行套袋试验。莲花镇海拔510m，峡谷地貌，7、8月份日平均温度低于30℃，8月份降雨量超过212mm，是稻曲病的重要疫区，田间累积了大量的厚垣孢子。供试水稻品种为“粤优938”，在水稻圆杆拔节期，用40cm×10cm的纸袋套住单株水稻，以避免田间厚垣孢子的自然侵染，套袋共计68穗，于水稻乳熟期回收套袋稻穗并逐一检查稻曲病的发病情况。1.2.1 供试菌源 将4℃保存的2006年中稻“粤优938”上采集的稻曲球粉碎后，用2%的蔗糖溶液配置为厚垣孢子悬浮液A，置于28℃的培养箱（LRH-250型，广东省医疗器械厂）中保存24h备用；将2007年采集的早稻“金优402”上的稻曲球，粉碎后用2%的蔗糖溶液配置为厚垣孢子的悬浮液B，过滤后加入少量土温-20，在涡漩振荡器上振荡5分钟，在28℃条件下保存24h。以上厚垣孢子悬浮液在100×显微镜下一个视野内有约1000个厚垣孢子。1.2.2 供试水稻 2007年5月9日将水稻种子“粤优938”在自然日光下暴晒8h后用杀菌剂浸泡72h，然后置于培养皿（φ=9cm）内在28℃培养箱（LRH-250型，广东省医疗器械厂）中催芽，72h后播种育苗，2007年6月8号移栽插秧。1.2.3 方法 试验地点位于湖北省农科院网室内，网室周边农田环境中没有稻曲病疫情发生。试验用土壤经200℃电热鼓风干燥箱（HN101-1型，南通沪南科学仪器有限公司）灭菌1h后，分装入瓷盆（φ=25cm，h=32cm）中备用，瓷盆置于聚乙烯薄膜棚（长×宽×高=4×3×1.5m）内，棚顶敞开，用遮阳黑网覆盖。供试水稻做作以下处理：1）种子带菌：经消毒后的种子催芽时用少量厚垣孢子液A浸泡，2007年6月8日移栽入装有无菌土的瓷盆中。2）根部带菌：年6月8日插秧时，用清水洗净秧苗根部，在厚垣孢子液A中浸泡8h后移栽入装有无菌土的瓷盆中。3）穗期接种：2007年9月4日下午6时，将处于破口或杨花初期的水稻用手提猴头喷雾器在穗部喷雾接种厚垣孢子液B，喷雾后用聚乙烯薄膜将稻穗封闭保湿48h。4）不做任何接种处理。以上每处理2个瓷盆，每瓷盆内3兜水稻，分蘖后期每瓷盆内水稻有30～40株。水稻生长期正常管理，同时在水稻孕穗期以后，每天喷水两次，保持环境的湿度，同时观察记录稻曲病的发病情况。田间套袋试验结果：在水稻乳熟期回收的68个套袋稻穗中发病稻穗有38个，病穗率为55.9%，按照唐春生[5]的病情分级标准，病情指数为24.58。网室盆栽试验结果：在水稻灌浆初期，浸根处理的水稻首先发病，稻粒内外颖壳接缝处出现白色的菌丝团，逐渐长成白色球状物，形成稻曲球，4d后露出黄色的厚垣孢子，厚垣孢子颜色由鲜黄色逐渐转暗。浸根处理发病一个星期后种子带菌及喷雾接种处理都开始出现稻曲球。种子带菌、根部带菌及破口期喷雾接种带菌的病穗率分别为：25.0%、1.6%、5.8%。王国良[1]认为稻曲病厚垣孢子主要在水稻破口前1～4天至破口时从水稻柱头侵入引起发病。本次田间套袋试验中，在水稻圆秆拔节期用纸袋隔离了田间厚垣孢子的自然侵染，但后期调查病穗率仍高达55.88%，说明稻曲病厚垣孢子在水稻生长早期可能已被上年累积在田间的厚垣孢子侵染。在网室试验中对土壤及种子都进行了严格消毒，土壤中无自然存在的稻曲病厚垣孢子；试验中对照没有发病排除了种子自身带菌的情况。在水稻育秧及移栽以后的生长阶段都实施了隔离措施，避免了未知自然侵染对结果的干扰。试验中无论是水稻营养生长期还是生殖生长期接种，在水稻生长后期都出现了稻曲病粒，而且试验结果以厚垣孢子接种水稻种子的发病率最高，进一步说明了厚垣孢子在水稻生长早期侵染的可能性。试验中接种水稻种子所用的厚垣孢子源于2006年的中稻稻曲病粒，穗部接种菌源是2007年早稻病粒，说明上茬水稻上的稻曲病厚垣孢子可能是田间的重要侵染源。以上两试验结果表明稻曲病厚垣孢子侵染水稻的方式至少包括两种：1）系统侵染：土壤中或依附于种子表面的厚垣孢子，在水稻种子萌发初期侵入水稻胚内或在插秧时侵染水稻根部，灌浆期出现穗部病症；2）局部侵染：在水稻孕穗期，直接侵染穗部，灌浆期发病，而且以系统侵染为主要侵染方式。因此郭荣华等根据水稻穗部接种的结果及王国良的试验结论认为稻曲病不是系统侵染病害值得商榷。王疏等[6]用Nested PCR方法成功检测出水稻生殖生长期稻曲病在植株茎秆、穗部的分布特征，为研究稻曲病的侵染提供了分子生物学方法。故对于本次试验中水稻材料，可以用分子生物学手段检测水稻不同生长期稻曲病菌在水稻根部、茎秆、叶片及穗部的分布情况从而进一步明确稻曲病的侵染方式。

Keywords:Magnaporthe grisea;pathogenicity;T-DNA insertional mutants;gene function稻瘟病菌[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr.，无性世代为Pyricularia grisea（Cooke）Sacc.]侵染水稻引起的稻瘟病是水稻“三大病害”之一[1，2]，严重限制世界水稻产量，但迄今为止对其致病性及其变异的机制了解得仍然不够透彻。已知水稻与稻瘟病菌之间的特异性互作，符合Flor提出的“基因对基因”关系假说[3]。对稻瘟病菌无毒基因的研究，将有助于进一步了解稻瘟病菌致病性变异的机制以及水稻与稻瘟病菌之间分子水平特异性互作的机制。目前，通过遗传分析或分子标记技术，已鉴定了至少30个稻瘟病菌无毒基因[4～7]，其中仅有5个无毒基因（PWL1、PWL2、AVR1-CO39、AVR-Pita、ACE1）被克隆[8～12]。此外，稻瘟病菌的侵染过程是一个错综复杂的循环过程，涉及一系列形态结构与生理生化的变化，故而除了无毒基因之外，与稻瘟病菌致病过程有关的基因的研究也是研究者关注的焦点，目前已经克隆和分析了包括MPG1，CPKA1，PTH11，PMK1，MPS1，MAGB，MAC1，PDE1，PSL1，TPS1等40余个参与稻瘟病菌生活史各个阶段的功能基因[13，14]。稻瘟病菌基因组全序列测定已经完成[15]，伴随着生物信息学的飞速发展，进一步以功能基因组学的研究方法从全基因组水平研究水稻与稻瘟病菌之间特异性互作的分子机制、诠释关键基因的功能已经成为解决持久抗瘟问题的关键所在。本研究正是通过接种筛选本实验室已建成的稻瘟病菌菌株FJ95054 B T-DNA插入突变体库，获得致病性变异稳定的突变体，运用TAIL-PCR方法获得了突变体被T-DNA标记的侧翼序列，并通过一系列表型分析、分子生物学实验及生物信息学分析初步分析了T-DNA插入区域的基因功能，为进一步获得相关病菌小种的无毒基因或与致病性相关的基因奠定良好的基础。稻瘟病菌菌株FJ95054B，是本研究的野生型对照菌株，由本实验室从福建田间单孢分离得到的菌株；供筛选的突变体菌株，是随机从本实验室已建成的稻瘟病菌菌株FJ95054B T-DNA插入突变体库中抽取的。供接种筛选的水稻品种CO39近等基因系：C101LAC Pi-1（t）、C101A51 Pi-2（t）、C104PKT Pi-3（t）、C101PKT Pi-4a、C105TTP-4L-23 Pi-4b及感病对照CO39，由国际水稻研究所提供。稻瘟病菌菌株的活化、扩大培养及产孢方法参照王宝华等[16]，育苗及接种方法参照张学博等[17]。接种后8～10 天，采用目测法调查并记载各品种水稻叶片上的病斑反应型。病斑反应型的记载标准参照Valent等[18]的方法，具体分级标准如下：0级：无病斑；1级：只有针尖大小的褐色斑点（病斑直径可达0.5cm）；2级：直径约0.5～1mm褐色病斑，病斑有明显黄褐色中心；3级：直径约为2mm的褐色眼状病斑，中央灰色，边缘褐色；4级：长约3～4mm中等大小的灰色梭形病斑，边缘褐色；5级：病斑达到最大（CO39的眼状病斑最长约为5mm），甚至多个病斑连片，叶枯死，如出现暗绿色急性病斑或叶节瘟也属于这一类型。其中，0～2级记为抗病反应，3～5级记为感病反应。参考李宏宇方法[19]，观察所获得突变体的形态特征及其生长发育过程，记录菌落直径、产孢量、孢子萌发率、附着胞形态和形成率以及洋葱表皮侵入情况。稻瘟病菌基因组DNA的提取参照何月秋方法[20]。TAIL-PCR反应使用的T-DNA左、右边界嵌套引物为：LB1：5'-GGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCATG-3'；LB2：5'-CATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCT-3'；LB3：5'-GAATTAATTCGGCGTTAATTCAGT-3'；RB1：5'-GGCACTGGCCGTCGTTTTACAAC-3'；RB2：5'-AACGTCGTGACTGGGAAAACCCT-3'；RB3：5'-CCCTTCCCAACAGTTGCGCA-3'。使用的随机引物为AD7：5'-TG（A/T）GNAG（A/T）ANCA（G/C）AGA-3'；AD9：5'-TCGTTCCGCA-3'；AD12：5'-（A/T）AGTGNAG（A/T）ANCANAGA-3'。以上引物由上海生工生物工程服务有限公司合成。10×PCR Bufer、dNTP、rTaq酶均购自宝生物公司（TAKARA）。TAIL-PCR反应程序参考文献[21]。将TAIL-PCR第2、3步扩增产物用0.5×TBE制备1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳电压为5 V/CM。电泳结束后，将凝胶放入含EB的0.5×TBE 中染色20～30min，用紫外透射反射仪观察并照相记录。TAIL-PCR扩增产物通过电泳分离后，回收目的片段，纯化后与pGEM-T Easy Vector（购自Promega公司）连接；连接产物通过热激转化到DH5α感受态细胞中，通过蓝白斑反应初筛转化子；采用碱裂解法少量提取转化子中的质粒DNA，通过PCR及酶切鉴定，挑选。将含正确插入的转化子的克隆，送由上海鼎安生物科技有限公司测序。测序获得的序列去除T-DNA载体序列后，将剩余的序列与GenBank数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）、稻瘟菌基因组数据库（http：//www.broad.mit.edu/annotation/fungi/magnaporthe/index.html）进行Blast比较分析及相关生物信息学分析，以推断T-DNA所插入的基因及其可能的功能。此外，应用SignalP 3.0 server（Http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）推断所获得的基因序列中是否含有信号肽（signal peptide，SNP）；应用Pfam（http：//www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/）推测基因编码的蛋白可能的结构域；应用TMHMM-v 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测基因编码的蛋白可能的跨膜结构域；应用Protcomp-v 6.0（http：//sun1.softberry.com/berry.phtml）对基因编码的蛋白质进行亚细胞定位，该软件可将蛋白质按细胞核、质膜、胞外分泌、细胞质、线粒体、内质网等归属进行划分；应用TargetP-v 1.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）进一步确定预测蛋白的亚细胞定位，其可将蛋白质的定位归属于线粒体、叶绿体、胞外分泌以及其他亚细胞定位。将随机选取的60个突变体与野生型菌株FJ95054B分别接种在国际水稻研究所提供的CO39近等基因系的6个水稻品种上，即C101LAC Pi-1（t）、C101A51 Pi-2（t）、C104PKT Pi-3（t）、C101PKT Pi-4a、C105TTP-4L-23 Pi-4b、CO39，每个突变体都进行3个平行以上的接种试验。接种后发病情况显示：野生型菌株FJ95054B对Pi-1（t）、Pi-2（t）、Pi-4a均无致病性，对Pi-3（t）、Pi-4b、CO39致病，而在随机选取的突变体中有3个突变体的致病性发生了稳定的变异，如表1、图1所示。其中，突变体2t-2 T940024501对水稻品种Pi-2（t）从无毒转变为有毒，突变体T940084501和T940086501在水稻品种CO39上的致病性减弱。菌株号IsolatesC101LACPi-1（t）C101A51Pi-2（t）C104PKTPi-3（t）C101PKTPi-4aC101TTP-4L-23Pi-4bCO39FJ95054B（WT）RRSRRS2t-2T940024501/++////T940084501/////—T940086501/////—表1 稻瘟病菌T-DNA插入致病性突变体接种CO39近等基因系的发病情况*Table 1 Virulence of T-DNA insertional pathogenicity mutants on CO39 NILs稻瘟病菌侵染过程中的任何一个环节被破坏均会导致致病性减弱或丧失，因此，对致病性减弱的突变体进行相关表型分析，有助于了解其致病性减弱的原因。筛选出的两个致病性减弱突变体的生长发育变化情况如表2所示。与野生型FJ95054 B相比，两个突变体均表现出生长速度减缓、单位面积产孢量显著减少、孢子萌发率和附着胞形成率降低的性状（在α=0.05水平上差异显著）， 这些都可能是造成突变体致病性减弱的原因。图1 稻瘟病菌致病性突变体的变化情况Figure 1 Pathogenicity of mutants of M.grisea compared with wildtype FJ95054B菌株Isolate菌落直径Colonydiameter（cm）产孢量Sporulation（105spores/cm2）8h孢子萌发率Percentageofsporegermination8hpi（%）16h附着孢形成率Percentageofappressoriumformation16hpi（%）95054B（WT）5.20±0.100.7499.0693.68T-9400845014.17±0.030.001287.9073.17T-9400865014.22±0.070.003383.8963.69表2 稻瘟病菌致病性减弱突变体的生长发育变化Table 2 Morphology and development of pathogenicity-decreased mutants of M.grisea此外，在洋葱表皮侵入实验中，野生型FJ95054B侵入正常，能形成正常的附着胞以及侵染栓，并能观察到菌丝在洋葱细胞内广泛蔓延。相比之下，突变体T940084501的孢子能够形成附着胞，但随后并未形成侵染栓侵入，未发现菌丝在洋葱细胞内蔓延；而突变体T940086501的部分孢子能够形成附着胞，但同样未能形成侵染栓侵入，也未发现菌丝在洋葱细胞内蔓延，还有部分孢子甚至不会形成附着胞。这些都可能是其致病性减弱的原因。实验结果如图2所示。图2 稻瘟病菌致病性减弱突变体的洋葱表皮侵入实验结果Figure 2 The results of onion penetration assays of pathogenicity-decreased mutants of M.grisea使用右边界嵌套特异引物RB与随机简并引物AD7组合，扩增出了突变体2t-2 T940024501的T-DNA侧翼序列（如图3A所示）；使用左边界嵌套特异引物LB与随机简并引物AD9组合，扩增出了突变体T940084501的T-DNA侧翼序列（如图3B所示）。突变体T940086501的T-DNA侧翼序列通过TAIL-PCR反应尚未获得。通过在稻瘟菌基因组数据库进行的比对分析，结果显示突变体2t-2 T940024501 T-DNA侧翼序列中的117～591 bp区段与稻瘟病菌基因组supercontig5.183的776534～777008 bp同源（同源率98%）， T-DNA 插入位点位于基因 MGG_07927.5 的外显子区，该基因位于Chromosome/Linkage GroupⅢ，编码一个假定蛋白（ hypothetical protein）， 该蛋白属于Glyco-syl hydrolases family 18（糖基水解酶家族18）。图3 TAIL-PCR第二步和第三步产物的电泳图谱Figure 3 Electrophoresis patterns of secondary and tertiary TAIL-PCR products（secondary and tertiary products of the same isolate are loaded side by side）分别利用SignalP 3.0、Protcomp-v 6.0、TMHMM-v 2.0、TargetP-v 1.1以及Pfam对该基因编码的蛋白进行分析。首先通过Signal IP 3.0预测，并不包含信号肽结构；继而经TMHMM-v 2.0预测，不含跨膜结构；通过Protcomp-v 6.0和TargetP-v 1.1分析表明，含有胞外分泌信号，是一种胞外分泌蛋白，在胞内无定位。另外，Pfam分析结果表明，该基因可能具有某种糖基水解酶活性。目前仅知该基因被T-DNA阻断后，突变体菌株对水稻品种Pi-2（t）从无毒转变为有毒，至于其在病原菌致病过程中的具体功能尚需通过进一步的基因敲除和功能互补实验加以确定。至于突变体T940084501的T-DNA侧翼序列，在稻瘟病菌基因组数据库中未比对到其同源序列，而在GenBank数据库中同样未比对到与稻瘟病菌相关的同源序列。由于该序列可能是FJ95054B菌株的特异序列，拟根据该序列扣除与载体有关序列及引物序列后的剩余序列设计引物，筛选FJ95054B BAC文库。对稻瘟病菌无毒基因以及致病过程有关基因的研究一直是了解稻瘟病菌致病性及其变异机制乃至水稻与稻瘟病菌特异性互作机制的关键所在，而研究某一个具体基因的功能最便捷的方法就是对该基因的突变体进行分析，这也正是本研究筛选T-DNA插入所致致病性突变体的初衷所在。获得致病性变异稳定的突变体是本研究的关键之一。本研究通过大量平行、重复实验初步筛选出致病性表型稳定的突变体，随后为避免由于菌株污染而造成的致病性变异的假象，还进一步将所获得的致病性突变体进行单孢分离，将分离的单孢与原菌株一同进行接种实验，结果显示单孢与原菌株的发病情况基本保持一致。这为进一步的分子水平的研究奠定了良好的基础。本研究对所获得的基因的功能还只是做了初步的预测，为了明确其功能尚需要借助进一步的基因敲除和功能互补实验。另外，为了明确致病性变异是否为单基因作用所致，尚且需要对致病性突变体的后代群体进行接种实验和潮霉素抗性分析，通过检测其后代的表型分离比率加以验证。

利用4个抗感杂交组合 （‘富士’ב金冠’ ‘金冠’ב富士’‘嘎拉’ב富士’ ‘富士’בQF-2’） 进行了苹果炭疽菌叶枯病抗性鉴定和遗传分析。结果表明，4 个群体中抗、感植株的分离比分别符合1∶1、1∶1、0∶1和1∶0的理论比值，初步推测苹果抗炭疽菌叶枯病性状受隐性单基因控制，抗病基因型为 rr，感病基因型为 RR和Rr。由此推测供试杂交群体的亲本品种 （系） ‘富士’ ‘金冠’‘嘎拉’ ‘QF-2’ 的基因型分别为rr、Rr、RR和rr。利用207株 ‘金冠’ב富士’ 的杂交后代为试材，构建了抗感基因池用于BSA分析。从HiDRAS和GenBank网站上下载了300 对均匀覆盖苹果染色体组的 SSR 引物，通过在亲本及抗感池中的初步筛选，将产生多态性条带的引物进行群体验证，获得了两个位于苹果15号连锁群上与抗病性状相关的分子标记 CH01d08 和 CH05g05。通过MapMarker 4.0 软件分析，将这两个标记定位于Rgls基因两侧，重组率分别为7.3%和 23.2%。依据苹果基因组 CH01d08 和 CH05g05 标记之间的序列，自行设计了276对SSR引物。经过亲本及抗感池的初步筛选及群体验证，最终筛选出 9 对与 R gls基因位点连锁的分子标记。将表型抗性鉴定结果与标记基因型数据相结合采用 JoinMap ver.4.0软件，完成了SSR标记与Rgls基因位点的连锁图谱。这11个标记覆盖了49.2 cM的遗传距离，最近的标记为 S0405127 遗传距离为 0.5 cM。Rgls基因位点两侧最近的两个标记 S0304673 和 S0405127 之间的物理距离为500kb。以‘金冠’和‘富士’及‘金冠’ב富士’的F1代群体中20株极端抗和20株极端感炭疽菌叶枯病的单株为材料，利用全基因组重测序（whole genome re-sequencing，WGR）技术，结合混合分组分析法（bulked szegregate analysis，BSA）共开发SNP位点3399950个，InDel位点573040个，SNP位点位于内含子上的465317个，位于外显子上的13029个，其中同义变异7330个，InDel位点位于内含子上的108996个，位于外显子上的19957个，其中插入或缺失3或3的整数倍的碱基，不改变蛋白质的编码框的有6928个。在全基因组范围内共得到33个候选的SNP位点及所对应的29个候选基因。通过对△（SNP-index）的筛选，将抗性基因位点快速定位于苹果第15条染色体的2～5Mb的区域内，结合SSR标记定位结果，最终锁定18个SNP位点、30个InDel位点，以及5个候选基因。通过对5个候选基因在接种病原菌后不同时间点的表达量差异及生物信息学分析，结果显示，基因MDP0000686092、MDP0000205432、MDP0000120033为功能未知蛋白，基因MDP0000945764具有CCHC型锌指结构，是丝氨酸/精氨酸富集剪接因子，具有核酸绑定、锌离子结合分子功能，参与RNA剪切生物过程，调节基因产物的表达。基因MDP0000864010具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸盐）NAD（P）绑定区域，属于NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族，具有辅酶绑定功能，可能与鼠李糖生物合成酶1有关。通过qRT-PCR验证，5个候选基因均不同程度的响应炭疽叶枯病病原菌的诱导，是苹果炭疽叶枯病抗病相关基因。通过高分辨熔解曲线 （HRM） 分析技术对SNP 及InDel标记进行验证。对SNP 及InDel引物在亲本和抗感基因池中进行初步筛选，将出现不同分型的引物在分离群体上进行验证，获得了6个SNP 及5 个InDel标记与Rgls基因位点紧密连锁。从中挑选了10 个标记对所检验出的重组个体进行了分析，将 Rgls基因位点定位于标记 InDel4199 和SNP4257之间，范围缩小为58 kb以内。以青岛农业大学苹果试验基地 （山东省胶州市） 栽培的50 个田间栽培品种和品系为试材，利用四个紧密连锁的分子标记 S0405127、S0304673、SNP4236和InDel4254验证了分子标记的可靠性。结果表明，SSR标记 S0405127，S0304673，SNP 标记 SNP4236，InDel标记InDel4254鉴定的准确率分别为 90.0%，94.0%，98.0%，96.0%，其鉴定结果的准确率均达到90%以上，可以应用于田间栽培品种、品系、种质资源以及杂种后代幼苗对炭疽菌叶枯病抗性的鉴定。一是通过对4个杂交组合的F1 群体及4个亲本进行苹果炭疽菌叶枯病抗性鉴定和遗传分析，推断出苹果抗炭疽菌叶枯病性状受隐性单基因控制，抗病基因型为rr，感病基因型为RR和Rr。二是通过300对均匀覆盖苹果染色体组的SSR引物和自行设计的276对SSR引物在亲本及抗感池中进行筛选，得到的多态性标记经作图群体验证，共获得了11个与Rgls基因位点连锁的分子标记，将抗病基因定位于苹果第15条染色体上，并完成了SSR标记与Rgls基因位点连锁图谱的构建。将 Rgls基因位点定位在 SSR 标记 S0304673 和S0405127之间，物理距离为500 kb，与最近的标记 S0405127 的遗传距离仅为0.5 cM。三是开发了与抗炭疽菌基因相关的 SNP 标记和 Indel标记，并对部分SNP 及 InDel 标记进行了验证，将 R gls基因位点进行精细定位，将抗病基因的范围进一步缩小至58 kb，并获得了14 个与抗病相关的候选基因。

柿是我国主要果树树种之一，柿树具有寿命长、产量高、收益大、易管理的优点，发展柿树生产对增加农民收入、调整农业产业结构方面具有重要的意义。柿树嫁接后5～6年开始结果，15年后进入盛果期，经济寿命在100年以上。丰产园3～4年开始结果，5～6年进入盛果期。柿根系分布取决于砧木。君迁子作砧木，根系发达，分枝力强，细根多。根系大多分布在10～40cm深土层中；垂直根深达3m以上，水平分布为冠径的2～3倍。柿根系单宁含量多，受伤后难愈合，发根困难，应注意保护根系。根系春季开始生长晚于地上部，一般地上部展叶时开始生长。柿枝条分为营养枝、结果枝和结果母枝。结果母枝是指着生混合花芽的枝条；结果枝是指由混合花芽抽生的枝条，大多由结果母枝的顶芽及其以下1～3个侧芽发出，再往下的侧芽的抽生为营养枝。营养枝是不能开花结果的枝，其上着生叶片进行光合作用制造有机营养物质，其一般短而弱。柿结果枝第3～7节叶腋间着生花蕾，开花结果，着生花的各节没有叶芽，开花结果后成为盲节。柿在平均温度12℃以上时萌芽。新梢生长以春季为主，成年树一般只抽生春梢，生长量较小，幼龄树和生长势旺的树可生长2～3次梢。柿树顶端优势和层性都比较明显，但新梢生长初期先端有下垂性，枯顶后不再下垂。柿树芽分叶芽和花芽两种。花芽为混合花芽。叶芽较瘦小，着生于1年生枝的中下部，萌发后抽生营养枝。花芽较肥大，位于1年生枝的顶部1～3节，萌发后抽生结果枝。柿树枝条顶芽为伪顶芽。枝条基部有两个鳞片覆盖的副芽，常不萌发而成为潜伏芽，其寿命较长。柿树的花芽分化在新梢停止生长后1个月，大约在6月中旬，当新梢侧芽内雏梢具有8～9片叶原始体时，自基部第3节开始向上，在雏梢叶腋间连续分化花的原始体。每个混合花芽一般分化3～5朵花。柿树的花有雌花、雄花、两性花三种类型。一般栽培品种仅生雌花，单生于结果枝第3～7节叶腋间，雄蕊退化，可单性结实。雄花1～3朵聚生于弱枝或结果枝下部，呈吊钟状。柿树在展叶后30～40d,日均温达17℃以上时开花，花期3～12d,大多数品种为6d。柿果实是由子房发育而成的浆果。果实发育过程分为3个明显的阶段:第一阶段为开花后60d以内，幼果迅速膨大，最后基本定形；第二阶段自花后60d至着色，果实停长后或间歇性膨大；第三阶段从果实着色至采收，果实又明显增大。柿的落花落果包括落蕾、落花和落果。开花前落蕾，落花在5月上中旬，部分花脱落。幼果形成后有落果现象，以后2～3周较重，6月中旬以后落果减轻，8月上中旬至成熟落果很少。柿树喜温耐寒。在年平均温度10.0～21.5℃,绝对最低温度不低于-20℃的地区均可栽培，但以年平均气温13～19℃最为适宜。并且甜柿耐寒力比涩柿弱，要求生长期(4—11月)平均气温在17℃以上。冬季低于-15℃时易发生冻害。柿树耐湿抗旱。在年降水量500～700mm、光照充足地方，生长发育良好，丰产优质。由于柿树根系分布深广，故较耐旱，一般在年降水量450mm以上地方，不需灌溉，但在开花坐果期，发生干旱，易造成大量落花落果。柿树喜光，但也较耐阴。一般在光照充足地方，柿树生长发育好，果实品质优良。对于甜柿要求4—10月日照时数在1400h以上。柿树对土壤要求不严，山区、丘陵、平地、河滩均能生长。但以土层深1m、土壤pH值6.0～7.5、含盐量0.3%以下、地下水位在1.5m以下，保水排水良好的壤土和黏壤土为宜。柿树开花前疏花蕾。保留结果枝发育最大，开放最早的花蕾，其余疏除。始果期幼树主侧枝上花蕾全部疏除。甜柿品种果园放蜂或人工辅助授粉；花期喷0.1%硼砂+300mg/kg赤霉素；或用0.3%尿素+0.1%硼砂+0.5%磷酸二氢钾，以提高坐果率。花后35～40d早期生理落果后疏果。首先疏除病虫果、伤果、畸形果、迟花果及易日灼果，保留不受日光直射的侧生果或下垂果，保留个大、整齐、深绿色，萼片大而完整的果实。保留1枝1～2个果，或15～18片叶留1个果。叶片在5片以下的小枝和主侧枝延长枝上不留果。根据柿果用途适期采收。榨取柿漆用果实在单宁含量最高的8月下旬采收；涩柿鲜食品种在果实由绿变黄尚未变红色时采收；制柿饼用果实在果皮黄色减褪呈橘红色时采收；软柿(烘柿)鲜食，在充分成熟、呈现固有色泽而未软化时采收；甜柿品种在充分成熟、完全脱涩、果皮由黄变红色、果肉尚未软化时采收。采收采用折枝法或摘果法。折枝法是用手、夹杆或挠钩将果实连同果枝上中部一同折下。摘果法是用手或采果器将柿果逐个摘下。二者交替使用。采收时轻拿轻放，采后及时剪去果柄，并在分级时将萼片摘去。

苹果 （ Malus pumila Mill.） 是世界上栽培最为普遍的落叶果树之一，有着很强的生态适应性，地域分布极为广泛。中国不仅是苹果属植物的发源地之一，拥有悠久栽培历史和极为丰富的苹果种质资源，也是世界上最大的苹果生产国和消费国，在世界苹果产业中占有重要的地位。近年来，我国苹果栽培面积快速增长，苹果产量和质量得到了稳步提髙。据统计数据显示，2015年我国苹果栽培面积和产量分别达到232 万 hm2和 4300万 t，居世界首位。苹果在调整农业产业结构、增加农民收入、促进地方经济快速发展等方面发挥着越来越重要的作用。病害是制约着苹果产业发展的重要影响因素。其中苹果炭疽病是苹果生产中普遍发生的一种重要病害，包括发生在果实上的苦腐病（Bitter rot of apple） 和主要发生在叶片上的炭疽菌叶枯病 （ Glomerella leaf spot，GLS）。苦腐病又被称作晚腐病，是苹果果实的三大病害之一，多在果实成熟期或半成熟期发病，主要是引起大量落果、果实腐烂，降低了果实的产量和商品价值。而苹果炭疽菌叶枯病是一种流行性很强的病害，由于该病潜育期短、发病快，在外界环境条件适宜的情况下从侵染到发病落叶仅需要3d或者更短的时间，造成树叶大量干枯、脱落，严重时形成二次开花，也侵染果实引起坏死性斑点，不仅导致当季果实产量和品质的下降，而且大大削弱了翌年的树势，严重地威胁着苹果产业的发展。特别是广泛种植于我国各大苹果产区的重要栽培品种 ‘金冠’ ‘嘎拉’ 品种极易感病，尤其是 ‘金冠’ 在世界苹果生产国中 （中国除外） 品种比例最高，这也是选择 ‘金冠’作为苹果基因组测序材料的重要原因。它不仅是生产上的优良品种，同时也是苹果育种的核心亲本 （陈学森，2015），所以炭疽菌叶枯病的侵染不仅仅是对 ‘金冠’ ‘嘎拉’ 等品种的侵害，而可能是对 ‘金冠’ 系、‘嘎拉’ 系苹果的为害。化学药物防治是目前采用的主要防治方法，但成效甚微。所以急需培育出抗病品种从根本上解决该问题，同时也减少了果园化学试剂的使用，降低农药残留，保证果品的安全。但育种实践表明，要实现育种目标，在亲本选择与选配恰当的前提条件下，必须保证每个杂交组合有足够数量的后代群体，至少 3000株 （陈学森，2010），加上果树具有童期长 （6～12 年），基因组高度杂合，杂种后代广泛分离，自交不亲和，许多重要的经济性状是多基因控制的数量性状等特点，使得常规育种工作难度大、周期长。因此利用杂交后代早期选择技术，及早地剔除非目标基因的单株，减少杂种后代的数目，提高筛选效率，减少盲目性是提高育种效率的最实用有效的方法。随着分子生物学技术的快速发展，特别是以DNA多态性为基础的分子标记技术在苹果育种中的应用，大大提高了目标性状早期选择的效率，缩短了育种周期，加快了新品种选育的速率。同时，通过构建高密度分子标记遗传图谱对重要农艺性状基因进行标记定位，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并验证其功能，阐明其作用机制，通过基因工程实现对果树性状的改良。因此，揭示苹果炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，发掘与抗性基因紧密连锁的分子标记，构建精细的抗病遗传图谱对于定位抗病基因，研究基因功能，探索、掌握抗病机制，培育抗病品种有着重要的意义。苹果炭疽菌叶枯病 （ Glomerella Leaf Spot，GLS） 是近几年在中国大部分苹果主产区新出现的一种流行性很强的真菌病害。主要为害苹果叶片，造成病叶早期的干枯、脱落，也侵染果实引起坏死性斑点，导致苹果失去商品价值 （刘源霞等，2015）。该病于1988年首次报道于巴西，导致感病的 ‘嘎拉’ 苹果70%以上的叶片脱落，经鉴定其病原为围小丛壳Glomerella cingulate （Leite et al.，1988；Camilo＆Denar-di，2002；González et al.，1999，2003），为盘长孢状刺盘孢 Colleto-trichum gloeosporioides 的有性态，定名为围小丛壳叶斑病 （ Glomerella leaf spot，GLS），在中国被称为炭疽菌叶枯病。1997—1999年在巴西6个苹果产区均发现了炭疽菌叶枯病，由于‘嘎拉’ 品种是巴西的主栽品种，所以该病严重威胁着巴西苹果产业，成为巴西苹果的主要病害 （Katsurayama et al.，2000；Crusius et al.，2002；Velho et al.，2014）。1998 年在美国田纳西州的两个 ‘嘎拉’果园中暴发了苹果炭疽菌叶枯病，引起大量落叶，这也是美国首次报道苹果炭疽菌叶枯病的发生，随后在佐治亚州和北卡罗来纳州也发现了这种病害 （González，1999，2003）。我国最早于2008 年发现了炭疽菌叶枯病 （王素芳，2009），2010年相继报道了在黄河故道苹果主产区发现了炭疽叶枯病，该病引起 ‘嘎拉’ ‘金冠’ 等苹果的大量落叶。尤为严重的是在 2011 年，据报道江苏丰县、安徽砀山、淮北等地栽培的 ‘嘎拉’ ‘金冠’ 等苹果品种大面积发生叶斑病，导致叶片干枯脱落，严重的造成果树二次开花 （宋清等，2012） （附图1-1）。经鉴定该病为苹果炭疽菌叶枯病，病原为围小丛壳 G. cingulata （宋清等，2012；Wang et al.，2012）。González 等 （2006）通过利用mtDNA-RFLP 对病原菌的甘油酸脱氢酶核苷酸序列进行分析，认为引起 GLS 的病原分别属于尖孢炭疽菌 C. acutatum 和围小丛壳G. cingulata。这两种菌分别归属于尖胞刺盘孢复合群和盘长孢状刺盘孢复合群 （王嶶等，2015）。王薇等 （2015） 的研究明确了在我国引起该病害的病原为果生刺盘孢 （ Colletotrichum fructicola） 和隐秘刺盘孢 （ C. aenigma），均归属于盘长孢状刺盘孢复合群。中国是否存在尖孢刺盘孢复合群的病原，还没有明确的结论。由苹果叶枯炭疽菌引起的苹果炭疽菌叶枯病症状为 （附图1-2）：在幼叶上发病时，初期表现为红至黄褐色或红褐色小点，针尖大小，边缘不规则，病健交界不清晰。在老叶上发病时，初期表现为黑色坏死性病斑，病斑边缘模糊。在7—8月高温高湿或连续阴雨的条件下，病斑迅速扩展，2～3d便可使整个叶片失水、焦枯、变黑、坏死，很快脱落。感病叶片在环境条件不适宜时，病斑停止扩展，在叶片上形成大小不等的枯死斑，病斑周围的健康组织逐渐变黄，叶片呈现花叶状，病重叶片逐渐脱落。病斑的形状多为圆形或椭圆形，也可能形成不规则的形状。病原菌侵染果实时，前期为红褐色小点，然后变为圆形或近圆形红褐色斑点，病斑周围有红褐色晕圈，中间变为灰白色，微凹。在自然环境条件下果实病斑上很少产生分生孢子，与常见的苹果炭疽病的症状明显不同。叶片上的病斑多为直径在 1～2 mm的小斑点，也有少数病斑直径超过1 cm。后期病斑中央产生黑色小点 （分生孢子盘），呈轮纹状排列，病斑上形成大量淡黄色分生孢子堆，当孢子萌发时会在病斑上产生白色丝状物 （宋清等，2012；符丹丹，2014）。苹果炭疽菌叶枯病的病原菌有性世代为 Glomerella cingulata （Stonem） Spauld＆Schrenk，属真菌子囊菌 （亚） 门，球壳目，小丛壳属，围小丛壳菌；无性世代为胶孢炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides （Penz.） Penz.＆Sacc.和尖孢炭疽菌C. acutatum J.H.Simmonds （González，2003）。在PDA 平板上培养的菌落特征为（附图1-2e）：菌落边缘完整，呈规则圆形，气生菌丝呈絮状，比较稀疏，边缘颜色为白色中间为淡灰色。分生孢子堆呈柠檬色或橙色（符丹丹，2014）。在一般情况下，苹果炭疽叶枯病病原菌主要在苹果的休眠芽和枝条上越冬，也可以以菌丝体的形态在病僵果、干枝、果台和有虫害的树枝上越冬。5月在条件适宜的情况下产生分生孢子，成为初侵染源，越冬的子囊壳也是初侵染源之一 （宋清等，2012）。病原孢子可以随着雨水或气流传播，经皮孔或伤口侵染后，进入苹果叶片或果实内。病害发生时，首先形成中心病株，随后迅速的向四周蔓延侵染，可多次侵染，最终造成病害大面积的发生。Wang等 （2015） 的试验结果表明，温度和湿度是炭疽菌叶枯病发生的必要条件。苹果炭疽菌叶枯病病原菌分生孢子萌发的温度范围在15～35℃，最适宜温度为30℃。菌丝生长的温度范围在15～35℃，最适宜温度为25℃。炭疽菌叶枯病病原菌主要依靠雨水传播，病原菌分生孢子的萌发和侵染也需要自由水或高湿环境，而我国北方苹果主产区6—8月气温多在30℃左右，雨水充沛，满足了苹果炭疽菌叶枯病病原菌的传播、侵染和发病条件，是苹果炭疽菌叶枯病病害发生的高峰期。植物虽然在充满多种潜在病原微生物的环境中生长，但是在多数情况下植物并不表现出感病，这表明，植物在与病原微生物共同进化过程中，为了防御病原微生物的入侵，逐渐形成一套天然的免疫系统（Takken et al.，2009；Boller et al.，2009）。研究表明，病原微生物表面存在着一些保守分子，而且很少发生变异，对维持微生物的基本生物学特征非常重要。这些保守的分子特征被称为病原相关分子模式 （Pathogen Associated Molecular Patterns，PAMPs） （Jones and Dangl，2006），例如细菌的鞭毛蛋白 （flagellin）。这些保守的分子并非病原微生物所特有，而是广泛的存在于微生物中（Zipfel et al.，2008），所以它们也被称之为微生物相关分子模式（Microbe-associated Molecular Pattern，MAMPs）。真菌的病原相关分子模式主要包括多聚半乳糖醛酸内切酶、麦角甾醇、木聚糖酶以及细胞壁衍生物葡聚糖和几丁质等；细菌的病原相关分子模式主要包括冷激蛋白、脂多糖、延伸因子 （EF-Tu） 及鞭毛蛋白等，卵菌的病原相关分子模式主要包括 β-葡聚糖及转谷氨酰胺酶等 （Van et al.，2008；Naito et al.，2008）。与之相对应，植物的细胞表面存在着识别病原相关分子模式的模式识别受体 （Pattern Recognition Receptors，PRRs）。P RRs是一类跨膜蛋白，具有高度的灵敏性和专化性，大都是存在于细胞表面的受体激酶或者具有亮氨酸重复序列的受体样蛋白 （LRR-RLP） （Fritz-Laylin et al.，2005）。例如，鞭毛蛋白的识别受体 FLS2 （Gomez-Gomez，et al.，2000；Chinchilla，et al.，2006）、水稻几丁质酶的识别受体CEBiP （Kaku et al.，2006）、延伸因子的识别受体EFR （EF-Tu receptor） （Zipfel et al.，2006）、水稻 Ax21 的识别受体 XA21 （Park et al.，2010）、拟南芥几丁质酶的识别受体CERKl （Miya et al.，2007；Wan et al.，2008）、水稻几丁质酶的识别受体OsCERK1 （Chen et al.，2010）等。在病原微生物与植物表面接触的瞬间，植物通过其细胞表面的PRRs感知病原微生物的 PAMPs，从而识别各类微生物，激活一系列的信号元件，启动植物的先天免疫反应 （Zhang，2010）。这种通过植物的PRRs感知 PAMPs并启动的主动防卫反应被定义为植物的基础抗性 （Basal Disease Resistance），也称为基础免疫 （Basal Immunity） （Boller et al.，2009）。该免疫过程被称为病原物相关分子模式触发免疫 （PAMP-triggered Immunity，PTI），可以激活植物体内的一系列抗病反应，包括激酶的活化、胼胝质沉积、PR-蛋白的表达以及miRNA 的合成等 （Navarro et al.，2008），从而帮助植物阻止了环境中绝大多数病原微生物的入侵 （赵开军等，2011；柏素花，2012；程曦等，2012）。在PTI中，研究最为清楚的 PAMPs 及其相应 PRR 是细菌的鞭毛蛋白以及拟南芥中鞭毛蛋白的识别受体 FLS2 （Flagellin-sensing 2）。鞭毛蛋白是一种构成细菌鞭毛的粒状蛋白。在对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa） 的序列分析中发现，其鞭毛蛋白 N 端存在着一个肽段 （flg22），含有22个氨基酸，具有激发子活性。该区域在革兰氏阴性菌中高度保守 （Felix et al.，1999）。Chinchilla等 （2006）发现在模式植物拟南芥中，鞭毛蛋白的识别受体是富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶 （Leucine-rich repeat receptor-like kinase，LRR-RLK） FLS2。LRR-RLK是一类单跨膜蛋白，通常由富含亮氨酸重复序列的膜外功能区，跨膜区以及胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶区组成。FLS2能特异性识别并结合 flg22。现已证明番茄、烟草以及水稻中的FLS2 同源蛋白均对鞭毛蛋白具有识别功能 （程曦等，2012）。水稻白叶枯病菌 （ Xanthomonas oryzae pv.Oryzae） 的病原相关分子模式（PAMP） 是N末端具有一个硫酸化肽段 （axYS22） 的蛋白 Ax21，由17个氨基酸组成。 axYS22 结构在所有黄单胞菌属细菌中高度保守。而在水稻中能够结合并识别 axYS22的模式识别受体是LRRXII 亚家族的类受体激酶XA21 蛋白 （Lee et al.，2009）。几丁质是大多数高等真菌细胞壁的主要组成成份。源于几丁质的 N-乙酰几丁寡糖是许多植物的PAMP。水稻几丁质结合蛋白 （Chitin elicitor binding protein，CE-BiP） 和拟南芥的受体激酶 （LysM-containing chitin elicitor receptor ki-nase，CERKl） 是典型的真菌病原识别受体。水稻的几丁质结合蛋白是一类跨膜蛋白，带有两个胞外 LysM 基序，能够与几丁质结合，但缺少胞内蛋白激酶区域。这很可能暗示着CEBiP 介导的免疫反应需要其他受体的参与 （Kaku et al.，2006）。拟南芥的受体激酶含有三个胞外LysM基序和一个胞内丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，它能够在体外直接结合几丁质 （Lizasa et al.，2010）。植物通过PRRs识别外来病原微生物的 PAMPs触发 PTI，成功抵挡了大部分病原微生物的侵入，保护宿主免受侵染。然而有少数病原微生物依然能够通过效应子抑制 PTI，从而成功避开宿主的防御，进而展开进一步入侵。效应子对P TI的抑制方式是多样的，一部分效应子可能促进病原物扩散或植物细胞养分渗漏 （Badel et al.，2002），一部分效应子有可能在卵菌及真菌侵染植物细胞并形成吸器外基质的过程中起到了框架结构作用 （Schulze-Lefert et al.，2003），一部分效应子则有可能对P TI过程中的一个或多个成分起到了抑制作用。在植物的许多致病细菌中都具有III型分泌系统 （Type III secretion system，TTSS）。该系统能够使致病细菌直接将效应子送入宿主植物细胞中。细菌效应子常常通过模仿或抑制真核生物的细胞功能来实现病原菌对宿主的侵染。在拟南芥及烟草中，丁香假单胞菌株 DC3000 所分泌的效应子AvrPto以及 AvrPtoB 能够成功的抑制 PTI的防卫反应并促进细菌繁殖。对这两种蛋白结构的分析表明， AvrPto可能作为一种蛋白激酶抑制剂，与FLS2、 BAK1及EFR的激酶区域相互作用，抑制了 PRRs的激酶活性 （Xiang et al.，2008），并干扰了 FLS2-BAK1 复合体的形成 （Shan et al.，2008）。 AvrPtoB是一种类泛素连接酶蛋白，其酶活性与 FLS2 的泛素化及降解有关 （Gohre et al.，2008）。丁香假单胞菌的另一个效应子 HopAI1 是一个磷酸苏氨酸裂解酶，能够使丝裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activatedprotein kinases，MAPKs） MPK3和MPK6去磷酸化，从而实现了对PRR信号的传导终止，抑制了宿主PTI的功能 （Zhang et al.，2007）。病原微生物能够通过效应子的作用抑制宿主的 P TI防卫反应，从而成功的进入宿主体内。病原微生物的效应子是菌种甚至小种所特有的。然而在自然选择压力下，植物也相应的进化出能够特异性的识别这些效应子的受体，在植物细胞内部开启了由效应子触发的免疫反应（Effector-triggered immunity，ETI） （Takken and Tameling，2009）。该免疫主要依靠抗病基因 （Resistance gene，R gene） 所编码的NB-LRR （Nucleotide binding-leucine rich repeat） 蛋白产物起作用，它们能够识别病原菌效应子，激活并介导小种专化抗性。这种抗性通常伴随有局部细胞死亡即超敏反应 （hypersensitive response，HR）。植物 NB-LRR 蛋白是植物细胞内的一类能与核苷酸结合并具有亮氨酸重复序列的蛋白质，是由一个多变的N 末端，C末端的LRR区域及一个NB-ARC结构域构成 （Elmore et al.，2011）。植物识别效应子并导致NB-LRR蛋白构象发生改变，从而将 NB-LRR 蛋白由抑制状态转变为激活状态，进一步诱导下游信号的转导 （Collier et al.，2009），从而实现对病原菌的防御反应。NB-LRR 蛋白对效应子的识别一般采用两种方式：间接识别和直接识别。间接识别大都是由病原效应子诱导特定的宿主蛋白发生修饰，修饰的宿主蛋白再激活 NB-LRR蛋白，完成抗病反应。拟南芥中的 RIN4 蛋白就是一种能够被病原效应子特定诱导的宿主蛋白。该蛋白是多种病原效应子 （ AvrRpt2、AvrRpm1、 AvrB 及 HopF2） 的靶标，在病原效应子的诱导作用下，RIN4蛋白被修饰，从而激活NB-LRR 蛋白，触发下游免疫应答。 Avr-Rpt2对RIN4的修饰作用是通过对RIN4蛋白的直接裂解完成的，从而激活NB-LRR蛋白RPS2介导的 ETI （Axtell et al.，2003）。直接识别是NB-LRR 蛋白与病原菌的效应子直接结合。例如，拟南芥中的RRS1-R 蛋白能够与茄科雷尔氏菌 （ Ralstoniasolanacearum） 的效应子Pop2 直接结合，从而启动了ETI应答 （Deslandes et al.，2003）。通过酵母双杂交实验也证明了亚麻的 TIR-NB-LRR 蛋白能够与亚麻锈病病菌的效应子Avr567相互作用，开启ETI应答 （Dodds et al.，2006）。植物与病原微生物之间相互作用并协同进化的过程被 Jones 等（2006） 总结为 “之” 字形模型 （附图1-3）：这个过程可以分为四个阶段，第一阶段：触发 P TI。植物通过 P RRs识别绝大多数病原微生物的 PAMPs，从而引发基础抗性。第二阶段：抑制 PTI。病原微生物相应的进化出效应子来抑制 PTI，避开宿主的防御，对植物展开再次侵染，此时植物对病原微生物是感病的。第三阶段：触发 ETI。在自然选择压力下，植物进化出能够特异性识别相应效应子的 NB-LRR蛋白，激发防御反应，阻止病原微生物的进一步侵染。第四阶段：避开 ETI。病原微生物通过不同的进化策略，产生新的效应子，展开新一轮的入侵。长期以来，作物的抗病育种主要使用了小种专化性抗病性 （即过敏性坏死反应类型），由于病原微生物生理小种的变异，导致作物抗病性的 “丧失”，缩短了抗病品种的使用年限。而且随着作物产量水平的不断提高，农田生态条件的变化和作物抗性资源的消耗，许多新的病害逐渐显现。再加上抗病性多与不良农艺性状相连锁，所以要培育出优良的抗病品种越来越难。抗病分子机理的研究为作物抗病育种提供了新的发展思路。一是重视 P TI的利用。植物细胞表面的模式识别受体对病原微生物相关分子模式的识别，诱导 P TI，是植物免受病害侵染的第一道防线。因此将 P TI 有效应用于作物抗病品种的选育，有望获得广谱性抗病品种。拟南芥中的受体基因 EFR 能够识别细菌延伸因子EF-Tu。Lacombe等 （2010） 利用农杆菌介导法将拟南芥中的受体基因 EFR 转入到烟草和番茄的基因组中，成功获得了转基因植株。经验证，转入 EFR 基因的植株可以抗假单胞菌属 （ Pseudomonas）、黄单胞菌属 （ Xanthomonas）、拉尔氏菌属 （ Ralstonia） 和农杆菌属（ Agrobacterium） 等不同属的病原细菌。这说明在育种中可以充分利用不同植物的模式识别受体基因来培育出具有广谱性、持久性抗性的作物新品种。二是将 ETI 与 PTI 相结合。植物大多数 R-基因是专门为识别病原微生物效应子而进化的，而病原微生物的效应子是菌种甚至小种所特有的，所以尽管植物ETI 能很强的特异性抵抗某种病害，但是也容易激发病原微生物产生新的效应子而避开原有的 ETI，使抗性消失。如果在利用 ETI 时，结合利用 PTI，便可以达到两道防线共同作用的效果，可以有效地避免大面积推广的抗病品种因 ETI的丧失而造成重大的产量损失。在育种实践中，利用P TI 抗性较好的栽培品种作为育种材料，利用多基因聚合或多基因转化将多个优良抗病基因导入其中，有利于扩大作物的抗病广谱性，改良作物的 ETI 抗性。近等基因系法 （Near-isogenic Lines，NIL） 和分离群体分析法（Bulked Segregant Analysis，BSA） 是获取与抗病基因紧密连锁的分子标记的两种最经典的方法。近等基因系是指仅在目标性状存在差异的两种基因型个体，通过杂交及多代自交或回交分离而获得的群体 （Young，1998）。近等基因系法的基本原理是比较轮回亲本与近等基因系及供体亲本三者的标记基因型。当近等基因系与供体亲本具有相同的标记基因型，但与轮回亲本的不同时，则该标记就有可能与目标基因连锁 （Muehlbauer，1988）。近等基因系的建立一般需要连续自交或回交6～8 代，耗时较长，而且常会导致一些重要基因的丢失或形成连锁累赘，因而限制了它的应用。分离群体分组分析法又称近等基因池法，是从近等基因系法演化而来的，属于双尾分析中的选择 DNA 基因池法 （selective DNA pooling，SDP）。Michelmore等 （1991） 首先利用 BSA 法在没有近等基因系的条件下通过对F2分离群体进行RAPD分析，成功的从100 个引物中筛选出3 个与莴苣霜霉病抗性基因 Dm5/8紧密连锁的 RAPD 标记。该实验的基本原理是：具有相对性状 （如抗病、感病） 的一对亲本杂交，在其后代分离群体中，根据个体表型或基因型分为两组 （如抗病组、感病组），选取两组中相同数量的极端差异个体，提取DNA，并进行等量混合，构建两个相当于近等基因系的基因池 （如抗病基因池、感病基因池），并对两个基因池进行标记的多态性筛选。由于两个基因池在遗传背景上是相似的，表型上的差异就有可能是由于某一目的基因的改变而造成的。因此两池间筛选出的多态性 DNA 标记就有可能是与目的基因连锁的分子标记。将多态性分子标记在后代分离群体上进行进一步验证，就可以分析出多态性标记与目的基因是否连锁以及连锁程度 （廖毅等，2009）。分离群体分组分析法包括基于标记基因型的 BSA 法 （Giovannoni et al.，1991） 和基于性状表现型的 BSA 法 （Michelmore et al.，1991）。前者是根据已有图谱或标记信息对基因进行精细定位，后者是通过对分离群体中就某一性状表现极端差异的个体进行分组，构建两个相对性状的 DNA 池，并筛选与目的基因连锁的多态性标记，实现对基因的初步定位。BSA 法具有许多优点：如原理简单、操作方便、实用经济等，重要一点是克服了许多作物没有或者难以创建近等基因系的限制，所以被广泛应用于质量性状单基因的定位以及数量性状主效基因的定位。2007 年，Korol等对 BSA法进行了优化，在精密仪器的辅助作用下实现了对定位效应较大QTL的定位。许多学者从理论上和实践上都证明了 BSA 法对数量性状基因定位的合理性 （Wang and Paterson，1994；William et al.，1997；Chagué et al.，1997；Hill，1998；Mackay and Caligari，2000；Chantret et al.，2000）。分子标记 （Molecular markers） 是 20 世纪 80 年代以来，继形态标记 （Morphological marker）、细胞标记 （Cytological marker）、生化标记 （Biochemical marker） 三大遗传标记之后，又诞生的一种以 DNA一级序列的多态性为基础的新的遗传标记。分子标记与其他遗传标记的不同之处在于，分子标记能够直接从 DNA 序列上找出差异。因此其具有如下的优点：一是准确性高，不受组织器官、个体发育时期状况、环境条件等因素的干扰；二是检测定位多，几乎遍及整个基因组；三是共显性好，有些共显性分子标记可有效的鉴别出二倍体中纯合和杂合基因型；四是多态性高，无需专门去创造特殊的遗传材料，自然就存在着许多等位变异；五是表现为 “中性” （即无基因多效性），与不良性状没有必然的连锁遗传，也不影响目标性状的正常表达；六是遗传稳定，可靠性强，检测速度快，操作简单。根据分子标记的发展进程，可以将其归类划分为三代分子标记：第一代分子标记以扩增片段长度多态性分子标记 AFLP （Amplified fragment length polymorphism）、限制性片段长度多态性分子标记 RFLP （Restriction fragment length polymorphisms）、随机扩增多态性DNA分子标记 RAPD （Random amplified polymorphism DNA） 为代表。第二代分子标记以重复序列的重复次数作为标记，操作较为简单，易于分型，且为共显性标记，更便于进行遗传分析。其代表性标记为简单重复序列标记 SSR （Simple sequence repeat） 和简单重复序列间扩增标记ISSR （Inter-simple sequence repeat）。第三代分子标记以核苷酸多态性标记SNP （Single nucleotide polymorphism）、插入缺失标记 InDel （In-sertion-deletion）、拷贝数变异标记 CNV （Copy Number Variation） 为代表，在后基因组时代已被大量开发，并被广泛使用。这类标记的最大特点是数量多、范围广、为显性标记、易于高通量分型。SSR （Simple sequence repeat），即简单重复序列，又称微卫星（Microsatellite），是Litt等1989 年提出，Moore等1991 年创立的。由1～6 个核苷酸为单位组成的串联重复序列 （Wang，1994），是 DNA复制和修复过程中，微卫星序列内发生滑链错配或不均等重组时，导致增加或缺失一个或更多的重复单元 （Levinson and Gutman，1987；Richards，1992），广泛分布于植物和动物的基因组中 （Tautz and Renz，1984）。每个SSR两侧具有相对保守的单拷贝序列，这为设计特异引物扩增SSR序列提供了模板。由于扩增产物中基本单元重复次数的不同，就形成了SSR座位的多态性。通常经过SSR引物扩增出来的PCR产物，可以经过聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳进行检测其多态性。SSR分子标记的优点在于信息量大、多态性高、重复性好、操作简单、呈共显性 （Kalia et al.，2011），因此被广泛应用于作物及果树等目标基因的遗传定位、遗传连锁图谱的构建、遗传多样性的检测以及分子标记辅助育种等方面。SSR标记的开发：目前常见的 SSR标记开发的方法包括数据库检索法、构建与筛选基因组文库法、微卫星富集法以及省略筛库法等。其中数据库检索法是开发SSR标记既经济又有效的方法。充分利用现有的DNA序列数据库中的信息，搜索 SSR 序列，可以轻松的获得全基因组的所有SSR引物，省去构建基因文库、杂交、测序等烦琐的工作，节省了大量的时间和财力。随着高通量测序技术的快速发展，使得如GenBank、EMBL/EBI （European Bioinformatics Institute，http：//www.embl-heidelberg.de/）、NCBI （National Center for Biotechnology Information， http：//www.ncbi.rdm.nih.gov/） 以及 DDBJ （DNA Data Bank of Japan，http：//www.Ddbj.nig.ac.jp） 等公共数据库中各物种的基因组序列、转录组序列及EST序列等不断增多。结合在线软件SSRIT （ http：//archive.gramene.org/db/markers/ssrtool） 以及 SSRHunter 等来搜索SSR位点，利用 Primer Premier 5.0 或者利用在线引物设计软件Primer 3.0 （http：//primer3.ut.ee/） 根据位点两侧保守核苷酸序列设计特异性引物。SNP 即单核苷酸多态性，是两个DNA序列中的某个位点由于单个核苷酸的变化而引起的多态性。SNP 标记的优点在于数量多，分布广，相对稳定，易于快速筛查和基因分型。SNP 标记的开发：可以通过多种方式和方法实现对SNP 标记的检测和分析。一是质谱分析法。通过 PCR 扩增后，用质谱进行分析检测。二是HRM分析法。利用高分辨率熔解曲线 （High resolution melt-ing，HRM） 分析方法进行分型检测。三是芯片法。利用 SNP 标记芯片进行分型检测。四是测序法。通过高通量测序手段进行检测 （孙瑞，2015）。SNP 标记的开发主要依赖于含有大量测序序列的数据库，具有速度快、高通量的特点。随着测序技术的发展，特别是全基因组测序，不仅可以从全基因组中获得大量的SNP 位点，而且还可以了解到SNP 位点在基因组中的分布状况，对于我们进一步分析基因的功能及表达提供了更多的可能。基于参考基因组序列的分析方法包括：全基因组重测序 （Whole-genome re-sequencing，WGR）、转录组测序（RNA-seq） 和简化基因组测序 （Reduced-Representation Genome Se-quencing，RRGS）。全基因组重测序是对已知物种基因组序列的前提下所进行的全基因组范围内的测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。优点：快速进行资源普查筛选，寻找到大量遗传变异，实现遗传分析及重要性状候选基因的预测。转录组测序的研究对象为某个体在某一特定的功能状态下所能转录出来的所有 RNA 的总和，检测的是某个体位于编码区的碱基差异。优点是能够降低成本，能够直接检测功能区碱基的序列变化，能够有效的检测分析基因的表达水平，更有可能找到直接与表型相关的 SNP 差异 （Geraldes et al.，2011；Li et al.，2012a）。简化基因组测序是对与限制性核酸内切酶识别位点相关的DNA进行高通量测序。RAD-seq （Restriction-site Associated DNA Se-quence） 和 GBS （Genotyping-by Sequencing） 技术是目前应用最为广泛的简化基因组技术，优点是可以大幅度地降低基因组的复杂程度，简化操作，同时不受有无参考基因组的限制，可快速有效地鉴定出高密度的SNP 位点，从而实现遗传分析及重要性状候选基因的预测。InDel是指父母本之间在全基因组序列范围内存在的差异。一个亲本相对于另一个亲本而言，在基因组中存在着一定数量的核苷酸插入或缺失 （Jander et al.，2002）。InDel标记就是根据基因组中的这些插入或缺失位点，依据一定原则，在其上下游设计一些PCR引物能扩增出包含这些插入缺失位点的碱基片段，成为 InDel标记。基于全基因组重测序的 InDel 标记是遗传标记的一个重要来源，因其具有分布广、密度高、变异稳定、多态性强、基因型判别简单、检测容易等优点，受到越来越多的关注。InDel标记已广泛应用于目标基因的遗传定位、高密度遗传图谱的构建、目的基因的精细定位、生物遗传多样性的分析、种子纯度鉴定及分子标记辅助育种等多方面。Yu等 （2003） 利用InDel标记、RFLP 标记、SSR标记构建了一张向日葵的高饱和度分子标记遗传连锁图谱。Feng等 （2005） 利用日本晴和9311 序列筛选得到的分布于每条染色体的20 对 InDel标记和53 对 SSR 标记，分析鉴定了46份粳稻和47份籼稻的遗传多样性。葛敏等 （2013） 利用生物信息学对玉米全基因组进行扫描，发现可用于开发 Indel分子标记的插入缺失位点，同时成功地运用 Indel分子标记鉴定了玉米杂交种的纯度。Hayashi等将开发的9对InDel标记成功的应用于水稻抗性基因的筛选。分子遗传图谱 （Genetic linkage map） 是不同分子标记在染色体上的位置和相对距离的排列图，遗传图谱上的每个分子标记反映的都是与遗传特征有关的相应染色体座位上的遗传变异和多态性。分子遗传图谱的构建是基于染色体交换与重组的理论，它是分子遗传学研究中的重要领域，是对基因进行定位及克隆的基础，也是遗传育种的重要依据。随着分子标记技术的发展，图谱上标记的种类越来越多，标记的密度也越来越高。起源于 “欧洲苹果基因组作图计划” 的第一张遗传连锁图谱于1994年由 Hemmat等人完成发表。该图谱以56 株 ‘Rome Beauty’בWhite Angel’ 的杂交后代为作图群体，构建了包含 360 个标记的父本和母本两个苹果品种的遗传连锁图 （Hemmat et al.，1994），实现了苹果遗传图谱构建的突破。2003 年，Liebhard 等以 ‘Fiesta’בDiscovery’ 的 267 株 F1 代杂交群体为试材，利用 SCAR、AFLP、SSR、RAPD标记等840个不同类型的分子标记构建了高密度的遗传连锁图谱 （Liebhard et al.，2003）。2009 年，Celton 等利用 93 个‘M.9’בR.5’ 的F1 杂交群体构建了17 个连锁群，包含了224 个SSR标记，42 个 RAPD 标记、18 个 SCAR 标记和 14 个 SNP 标记（Celton et al.，2009）。随着苹果基因组全序列的公布 （Velasco et al.，2010），利用全基因组重测序技术大规模开发 SNP 标记构建高密度遗传连锁图谱成为现实。2012 年，Antanaviciute等完成了以 ‘M.27’בM.116’ F1 代杂交后代为群体，构建了由306个SSR标记和2272个SNP 标记组成的高密度遗传连锁图谱，平均每一个标记间的遗传距离为0.5 cM （Antanaviciute et al.，2012）。同年 Khan 等构建了包含2033个SNP 和843 个SSR共2875个分子标记的苹果整合遗传图谱，总长为1991.38 cM。DNA指纹图谱因具有高度的特异性、稳定的遗传性和体细胞稳定性的特点，因此不受植物组织和器官的种类、生长发育阶段、环境条件等因素的影响，所以在苗期即可对品种进行快速、有效的鉴定，提高了鉴定的准确性和效率。高质量的指纹图谱不仅可以应用于种质资源亲缘关系的分析，遗传多样性的研究，还可以通过对苹果 DNA 指纹图谱的比较分析，从本质上找出生物个体间的差异，实现对苹果栽培品种的鉴别、新品种登记、注册和产权保护。Koller等 （1993） 利用RAPD标记对11 个苹果栽培品种进行了鉴别。Gianfranceschi等 （1998） 利用两对SSR 引物对19 个苹果栽培品种的DNA进行扩增，成功的将 17 个苹果品种区分开来。祝军等（2000a） 应用 AFLP 技术，用筛选出的引物P32M46 绘制了我国苹果生产中常见的 25 个重要品种的 DNA 指纹图谱，通过对该指纹图谱的分析表明，苹果栽培品种在 DNA结构组成上具有较高的遗传多样性。祝军等 （2000b） 还利用AFLP 引物 P44M64 构建了5 个苹果矮化砧木基因型的DNA 指纹图谱，区分了供试的5 个矮化砧木的基因型并确定了他们之间的遗传关系。Liu等 （2014） 利用8 对SSR引物和60个苹果样品 （包括几个栽培品种和 ‘富士’בTelamon’ F1 实生苗）运用品种鉴定图 （Cultivar identification diagram，CID） 策略完成了第一张苹果品种鉴定图谱的构建，并证明了该方法能高效地应用于品种鉴别。分子标记辅助选择育种和基因定位克隆的前提是筛选与目的基因紧密连锁的分子标记。控制苹果重要农艺性状的基因大多属于数量性状由多基因或主效基因控制，受环境因素影响大，并且由于果树的基因高度杂和，更增加了筛选分子遗传标记的难度。目前，研究进展较快，所获得的遗传距离较近的分子标记多来自于单基因控制的质量性状。在苹果抗病性育种工作方面，研究最为广泛和深入的是对抗黑星病基因的研究。Yang 和 Krüger （1994） 首次报道了利用改进的分离分析法发现了一个与苹果抗黑星病基因Vf连锁的分子标记。随后，经过不懈的研究，不同类型的分子标记如 RAP D 标记、RFLP 标记、AFLP 标记、SSR标记等众多与苹果抗黑星病 V 基因连锁的标记被挖掘，与抗病位点连锁最紧密的分子标记的遗传距离仅为 0.5cM （Koller et al.，1994；Durham and Korban，1994；Tartarini，1996；Yang and Korban，1996；Yang et al.，1997；Tartarin et al.，1998；Xu and Korban，2000；Benaouf and Parisi.，2000；Gygax et al.，2004；Dunemann and Egerer，2010；Galli et al.，2010）。在果实品质育种方面，筛选出与控制果皮颜色主基因Rf连锁的分子标记，并将其定位在第九连锁群上 （Cheng et al.，1996；何晓薇等，2009）。与控制果实酸度、果形指数、果肉褐变等性状基因连锁的分子标记都有报道 （王雷存等，2012；Sun et al.，2012）。在矮化密植育种方面，田义柯等（2003） 筛选出一个与柱形基因Co基因位点的连锁距离为8.66 cM的RAPD标记。Moriya等 （2012） 在苹果第十条染色体上筛选出3 个与Co基因位点共分离的分子标记 （Mdo.ch10.12、Mdo.ch10.13 和Mdo.ch10.14），将Co基因定位在196 kb 个碱基区间内。分子标记辅助选择 （Molecular marker-assisted selection，MAS） 是利用与目标性状紧密连锁的分子标记作为辅助手段进行选择育种。MAS可以不用测交或后裔测定，加速遗传改良的速度；独立于环境，增加可靠性；进行育种早期选择，提高育种效率；实验室操作，降低成本；对多基因、多个性状甚至全基因组选择，增加选择效率 （徐云碧，2014）。主要应用于：种质资源的有效鉴定、量化和表征遗传变异 （Tanksley et al.，1989；Gur and Zamir，2004）；对改良目标性状的基因或数量性状基因座 （Quantitative trait loci，QTL） 的定位、克隆和导入 （Peters et al.，2003；Gur and Zamir，2004；Holland，2004；Salvi and Tuberosa，2005）；对遗传变异的操作 （包括鉴定、选择、聚合及整合） （Collard et al.，2005；Francia et al.，2005；Varshney et al.，2005；Wang et al.，2007）；植物品种保护和特殊性、均匀性及稳定性测试过程 （CFIA/NFS，2005；Heckenberger et al.，2006；IBRD/World Bank，2006） 等。MAS在苹果育种中主要应用于重要性状的筛选，杂种实生苗的早期选择，杂交亲本的选配，遗传转化中目的基因的检测等。Tartarini等（2000）报道了利用获得的与抗苹果黑星病的显性单基因Vf紧密连锁的RAPD标记测验了携带该基因个体，淘汰错误率为3%，保留错选率仅为0.02%。Cheng等（1996）利用与控制果色的Thd01基因紧密连锁的RAPD标记，在苹果实生苗发育早期进行了标记筛选，实现了对果色这一特定性状的早期选择，大大减少了人力物力的浪费。由苹果单基因Co控制的柱型性状有利于形成集约高效的现代苹果栽培模式，能够降低生产成本，提高产量。Moriya等（2012）所得到的3个与Co基因共分离的标记Mdo.chlO.12、Mdo.chlO.13和Mdo.chlO.14，对于柱型苹果杂交育种中对群体材料的早期选择、基因的克隆及转化有着重要意义。Nybom等（1990）利用M13作为探针，对64株枫树实生苗进行了DNA指纹验证，通过亲缘关系和系统分类分析，成功的实现了对其中56株枫树实生苗的身份认证。苹果炭疽菌叶枯病是近年来高发且蔓延速度极快的一种真菌病害，目前尚没有有效的药物进行预防和治疗，对于感病的品种，特别是在高温高湿的季节，一旦发病将会带来毁灭性的为害。培育和种植抗病品种是防控植物病害的重要途径之一。随着分子生物学的快速发展，分子标记辅助选择技术逐渐成为植物抗病育种的有效手段。研究苹果对炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，筛选与苹果抗炭疽菌叶枯病基因连锁的分子标记对于抗病基因的定位、构建精细遗传图谱、进行图位克隆、基因功能验证及苹果抗病分子育种有着极其重要的意义。本书采用两个高抗苹果炭疽菌叶枯病品种 （系） ‘富士’ ‘QF-2’ （‘秦冠’ב富士’ 杂交后代中的高抗品系） 和两个高感病品种‘金冠’ ‘嘎拉’ 做亲本配制了4个杂交群体 （‘金冠’ב富士’ F1代 207 株，‘富士’ב金冠’ F1代 95 株，‘嘎拉’ב富士’ F1代262 株，‘富士’בQF-2’ F1代 198 株），采用室内人工离体接种的方法对 F1单株进行了苹果炭疽菌叶枯病的抗性鉴定。首先采用 BSA （bulked segregation analysis，分离群体分组分析） 法和 SSR （simple se-quence repeats，简单重复序列） 分子标记相结合的手段筛选抗性标记，然后通过全基因重测序与BSA相结合的方法筛选与目标基因相关的SNP 标记和Indel标记，并运用高分辨率熔解曲线 （High Resolution Melting，HRM） 分析技术验证 SNP 及 Indel标记，进一步将目标基因进行精细定位，筛选与抗炭疽菌叶枯病相关的候选基因，以期揭示苹果炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，获得与目标基因紧密连锁的分子标记，实现抗性基因定位，为挖掘抗病的关键基因，探索病原菌与抗病基因的互作机制，实现分子标记辅助育种，提高苹果抗病育种效率打下基础。