采果时，准备工作是否周全，采果是否适期，方法是否得当，都直接关系到采果质量，影响果品的贮藏保鲜。严格把好采果质量关，减轻果实贮藏期的病害，对搞好果品贮藏保鲜，至关重要。采收前应准备好采果工具。主要工具如下。(1)采果剪。采果时，为了防止刺伤果实，减少柑橘果皮的机械损伤，应使用采果剪。作业时，齐果蒂剪取。采果剪采用剪口部分弯曲的对口式果剪。果剪刀口要锋利、合缝且不错口，以保证剪口平整光滑。(2)采果篓或袋。采果篓一般用竹蔑或荆条编制，也有用布制成的袋子，通常有圆形和长方形等形状。采果篓不宜过大，为了便于采果人员随身携带，容量以装5kg果实左右为好。采果篓里面应光滑，不至于伤害果皮，必要时篓内应衬垫棕片或厚塑料薄膜。采果篓为随身携带的容器，要求做到轻便坚固。(3)装果箱。有用木条制成的木箱，也有用竹编的箩或筐，还有用塑料制成的筐。这些容器，要求光滑和干净，里面最好有衬垫，如用纸做衬垫，可避免果箱伤害果皮。(4)采果梯。采用双面采果梯，使用起来较方便，既可调节高度，又不会因紧靠树干损伤枝叶和果实。采收时期的早晚，对柑橘的产量、品质、树势及翌年的产量均有影响。适时采收，应按照柑橘果鲜销售或贮藏所要求的成熟度进行。若过早采收，果实的内部营养成分尚未完全转化形成，影响果品的产量和品质；采收过晚，也会降低品质，增加落果，容易腐烂，不耐贮藏。适时采收的关键是掌握采收期。柑橘通常在11月中旬至翌年1月上旬成熟时采收。采果时，应遵循由下而上、由外到内的原则。先从树的最低和最外围的果实开始，逐渐向上和向内采摘。作业时，一手托果，一手持剪采果，为保证采收质量，通常采用“一果两剪”法。即第一剪带果梗剪下果实，第一剪齐果蒂剪平。采时不可拉枝和拉果。尤其是远离身边的果实不可强行拉至身边，以免折断枝条或者拉松果蒂。为了保证采收质量，要严格执行操作规程，认真做到轻采、轻放、轻装和轻卸。对于采下的果实，应轻轻倒入有衬垫的篓(筐)内，不要乱摔乱丢。果篓和果筐不要盛得太满，以免果实滚落和被压伤。果实倒篓和转筐时都要轻拿轻放，田间尽量减少倒动，以防止造成碰伤和摔伤。对伤果、落地果、病虫果及等外果，应分别放置，不要与好果混放。提示：不要在降雨、有雾或露水未干时采摘，以免果实附有水珠引起腐烂。采下的果实，及时地进行防腐保鲜处理、果品分级和包装，对搞好果品贮藏保鲜，提高果品商品价值，是相当重要的。对采下的果实，应及时地进行防腐处理，可防止病菌传染，减少在包装和运输过程中的腐烂损失；同时可去除果面尘埃、煤烟等，使果品色泽更鲜艳、商品价值更高。对柑橘进行防腐处理用水按GB 5749—2006《生活饮用水卫生标准》规定执行，使用的清洗液，允许加入清洁剂、保鲜剂、防腐剂和植物生长调节剂等。通常赤霉素一般为20mg/L，甲基托布津、多菌灵、抑霉唑、噻菌灵和双胍盐为500～1000mg/L。处理时，柑橘常用多菌灵500mg/L (即将药对水成2000倍液)或甲基托布津500～1000mg/L (即将药对水成1000～2000倍液)溶液洗果。如果加用赤霉素20mg/L混合洗果，效果更好，既可防腐，又能保持青蒂。药物处理后30天内不得上市。而“叶橘”上市因时间短，一般不用药物处理，采摘后，可用清洁剂清洗，经药物处理，要符合国家最新的无公害食品柑橘类水果农业标准的规定，方可上市。采摘后的柑橘果实，经预冷和挑选后，即可用保鲜剂进行处理。保鲜剂种类很多，常见的有以下两种。打蜡可提高柑橘果实的耐藏性及外观，可提高售价和延长果品供应期，是果实商品化处理的重要环节。经涂果打蜡的柑橘果实，能抑制水分的蒸发、保持新鲜，减少腐烂，改善外观，增强商品竞争力。剥皮食用柑橘所用蜡液和卫生指标按农业标准(NY/T 869—2004)的规定执行。目前，使用的有虫胶涂料。它由漂白虫胶加丙二醇、氨水和防腐剂制成。虫胶涂料可与水任意混合。柑橘果实保鲜使用2号或3号涂料。2号虫胶涂料还加了甲基托布津，3号涂料加了多菌灵。贮藏柑橘果实用1：(1～1.5)的比例。使用虫胶涂料处理柑橘果实时，应现配现用。一般1kg原液可涂果1500kg左右。柑橘果打蜡前果面应清洁、干燥。打蜡后一个半月内销售完毕，以免因无氧呼吸而产生酒味，最好在销售前进行打蜡。采用手工打蜡操作时，适用于量少或带叶果实，用海绵或软布等蘸上加入防腐剂的蜡液均匀涂于果面。采用机械操作打蜡时，适用于数量较大和不带枝叶的果实。机械操作时，高效、省工、省保鲜剂。重庆师范学院研制出液态膜保鲜剂，有SM-2、SM-3、SM-6、SM-7和SM-8。其中SM-6用于柑橘果实保鲜，防衰老；液态膜的乳白色溶液，对人体无害。使用时，将SM保鲜剂倒入盆(桶)内，先加少量热水充分搅拌，使之完全溶化，再加冷水稀释至规定倍数，冷却至室温，将无病伤的柑橘果实放入浸泡，并翻动几十秒钟，然后捞出沥干水，晾干后入库贮藏。刚采下的柑橘果实，果皮鲜脆，容易受伤，水分含量高，并带有大量的田间热，未经过预贮，易造成贮藏库内或箱内温度过高，包果纸异常潮湿，有可能在短短几天内发生严重的腐烂，造成重大损失。因此，通常应将采下的果实，放在通风处，经2～4天的预贮，以便散失其带有的田间热，起到降温、催汗和预冷的作用。同时，经预贮的果实，让果皮的水分蒸发一部分，可使果皮软化，并具有弹性，能减少在包装贮运过程中的碰、压伤，并可降温降湿和减缓果皮呼吸强度，后期的果实枯水率可大大减少。另外，经预贮的果实，使果实的轻微伤口得到愈合。这样，果实进入贮藏库内以后，就不至于使贮藏库的温度骤增，影响果实的贮藏性。理想的预贮温度为7℃，相对湿度为75%，经2～4天以后，用手轻捏果实，有弹性感觉，即可出库，进行包装和运输。果品经营要实现商品化和标准化，就必须实行分级。果实分级执行农业部柑橘分级标准(NY/T 869—2004)。分级方法:对无带叶的柑橘果实，可用打蜡分级机进行，整个过程都由机器完成，生产工艺流程:原料→漂洗→清洁剂洗刷→冷风干→涂蜡(或喷涂允许加入杀菌剂的醋液)→擦亮→热风干→选果→分级生产“叶橘”时，根据客户或市场需求，采用手工操作。柑橘手工分级操作时，果实大小的横径可用分级板或分级圈进行。果重用称重法计量。将分出的各级果实，按果实大小进行包纸。目前，柑橘的包装应推广纸箱包装，每箱装果10～15kg。经包装的果实，规格一致，方便贮藏、运输和销售。但内销的果实，大多采用竹篓和塑料篓等容器包装，竹篓每篓5～10kg，塑料篓每篓1.5～2.5kg。这些容器材料来源充足，成本低廉。不管采用何种容器包装，对于产自同一产区、同一品种和级别的果实，应力求包装型号和规格一致，以利于商品标准化的实施。应注意箱(篓)底、箱(篓)内应有衬垫物，防止擦伤果实。运输要求便捷，轻拿轻放，空气流通，严禁日晒雨淋、受潮、虫蛀和鼠咬。运输工具要清洁、干燥、无异味。远途运输需要具备防寒保暖设备，防冻伤。果品贮藏保鲜方法多种多样，既有传统的农家简易库贮藏，又有采用现代技术的贮藏方法，如气调贮藏和冷藏等。采用何种贮藏方法，既要从经济技术条件出发，因地制宜，因陋就简，又要有长远打算，规模效益。通风贮藏库，主要利用室内外存在的温差和库底温度的差异，通过开关通风窗，来调节库内温度和湿度，并排除不良气体，保持稳定而较低的库温。通风库贮藏，库容量大，结构坚固，产区和销售区均可采用。农家简易库多是砖墙瓦面平房或者砖柱瓦房，依靠自然通风换气来调节库内温度和湿度，进行贮藏。因此，要求仓库门窗关启灵活，门窗厚度要超过普通平房。仓库四周和屋顶应加设通风窗，安装排风扇。入库前，仓库及用具可用500～1000mg/L多菌灵消毒。果实入库前，需要经过防腐保鲜剂处理，并预贮2～3天，挑选无病虫、无损伤的果实，用箱或篓装好，按“品”字形进行堆垛，并套上或罩上塑料薄膜，保持湿度，垛与垛之间、垛与墙之间要保持一定的距离，以利于通风和入库检査。库房的管理与通风贮藏库相似。

美国白蛾周氏啮小蜂Chouioia cunea，属膜翅目Hymenoptera小蜂总科Chalcidoidea姬小蜂科Eulophidae啮小蜂亚科Tetrastichinae周氏啮小蜂属Chouioia，是杨忠歧等在1985年调查美国白蛾天敌昆虫时发现，并于1989年记述发表的一个新属新种。成虫 雌成虫体长1.1～1.5mm。红褐色稍带光泽，但头部、前胸及腹部色深；触角各节褐黄色；上额、单眼褐红色；3对足及下额、下唇复合体均为污黄色。头部正面观宽大于高（24：19），触角窝中部位于复眼下缘的连线上。前胸背板后缘有1排鬃毛，其他部分也生有较密的黑色短毛。中胸背片中叶及侧叶上的刚毛较密，但三角片上无毛。中胸小盾片略呈八边形，有比较明显的网状刻纹，在中部处刻纹明显较密且小，似乎形成1纵线。前翅长为宽的2倍，翅面被毛。3对足的腿节外方、胫节及跗节上生有密的刚毛，这些刚毛比雄性的短。雄成虫体长1.4mm左右，近黑色略带光泽，胸腹节色较淡，腹柄节、腹部第1节基部为淡黄褐色，触角及2分裂的唇基片黄褐色，足除基节色同触角外，其余各节均为污黄色。头部正面观宽显著大于高（22：14），在两触角窝之间的脸部的倒“V”字形缺口两侧各着生相向生长的刚毛5根；2唇基裂片外侧、颜面端部与上颚前端部形成的半圆形凹入部处的缘部生有很密的刷状毛。腹部背观卵圆形，背面及腹面均生有密毛，宽度与长度都比胸部显著为小。卵 初产时白色，半透明，牡蛎形，长0.054～0.065mm，大的一端宽0.021～0.033mm。幼虫 蛆形，无头无足，自由生活于寄主蛹内。蛹 蛹长1.2～1.7mm，体白色，腹部收缩，体色逐渐由白色变为浅黄色，腹部微呈黑色。周氏啮小蜂一年可发生4～7代。以老熟幼虫在美国白蛾蛹中越冬，翌年4月下旬5月初成蜂羽化。周氏啮小蜂发育起点温度为6.14℃，有效积温为（365.12±15.56）日·度。在温度为30℃，相对湿度为85%时，一世代发育时间为15.7天。周氏啮小蜂雌成虫在羽化后的当天即可产卵。既可咬破美国白蛾蛹体外的薄茧将卵产于蛹体上，也可找到美国白蛾的老熟幼虫，爬附于幼虫体上，用产卵器刺蜇寄主，注入毒液，促使其提前化蛹。化蛹时将雌蜂也包在茧内，一旦寄主化蛹完成，雌蜂即开始产卵，产卵时间可长达6～10小时。卵产于寄主体内的组织中，一头雌蜂最多能产卵680粒。产卵后2～3天，孵化为幼虫。幼虫以寄主的血淋巴器官组织为食。经7～8天后，幼虫开始化蛹。周氏啮小蜂的蛹为裸蛹，蛹期约5～6天。雌蜂在羽化后12～24小时即可交配，1头雄蜂可和多头雌蜂交配，雌蜂一生只交配1次，无重复交配现象。待一个寄主蛹内所有的雌蜂均与雄蜂交配后，咬开一不规则的圆孔爬出寄主体外。雌成虫在饥饿条件下可存活8天以上。人工繁育周氏啮小蜂的主要设施有：寄主冷藏库、成品蜂冷藏库、接种室、寄生暗室、培养室、暖蜂室、选蜂室、贮物室，此外，还应有办公室、实验室等。主要设备有：空调、冰箱、冰柜、加湿器、操作台、恒温恒湿箱、消毒设备、解剖镜、显微镜、电脑、打印机等。常用工具有：接种箱、玻璃试管、削茧刀、镊子、剪刀、软毛刷、棉花、胶带、消毒药液等。周氏啮小蜂虽然在自然界中寄主的种类很多，不仅可寄生美国白蛾，还可寄生油松毛虫、赤松毛虫、天幕毛虫、榆毒蛾、舞毒蛾、侧柏毒蛾、杨雪毒蛾、银杏大蚕蛾、野蚕、柞蚕、亚洲玉米螟、菜粉蝶、卫茅巢蛾、国槐尺蛾、卫茅尺蛾、大袋蛾、杨扇舟蛾及桃剑纹夜蛾等多种昆虫的蛹，也可重寄生于寄生蝇的幼虫或蛹，但在大规模人工繁育生产中，以柞蚕蛹为寄主为好。主要是因为柞蚕蛹容易被周氏啮小蜂寄生、个体大、繁殖系数高，且资源丰富，成本低，易于获得，能终年大量供应。柞蚕蛹宜在入冬前大量准备，收购回的柞蚕蛹应进行低温贮藏，温度控制在-2～2℃。贮藏时，将茧装入竹筐或塑料筐中，交错摆放，不宜过密，保持通风，防止受热。寄主的健康状况是繁蜂成败的关键，接蜂时必须剔除死亡、感病及不健康的蛹，只选用健康的柞蚕蛹作为繁育寄主。接蜂前，将柞蚕茧外面的浮丝剥去，首先在带有茧蒂的一侧削开一口，观察蛹的颅顶板。若颅顶板发白、且色泽新鲜则为健康蛹，如果颅顶板发黄或色泽发污，则为死蛹或不健康蛹。然后，再于茧的另一端削开一口，并用刀尖挑出柞蚕化蛹时的蜕皮。削茧时应掌握好下刀的深度，避免削到蛹体，两端的开口为直径约1.5～1.8cm的圆形或椭圆形。削好的茧既可直接用于接蜂，也可放回冷藏室贮藏备用。人工繁育周氏啮小蜂所用的种蜂，主要采用人工野外采集获得。在冬季，到美国白蛾的老发生区，人工野外采集美国白蛾蛹，以获得自然寄生于美国白蛾蛹中的周氏啮小蜂。将采回的美国白蛾蛹放入指形管或矿泉水瓶中，视指形管及矿泉水瓶的大小，装入约1/3的美国白蛾蛹，用棉花或黑布将口封好，放在22～26℃的暗室内或培养箱中培养，约10～15天，便可从白蛾蛹中羽化出周氏啮小蜂。从野外采集的种蜂数量是有限的，大规模人工繁育时，可根据防治需要再进行1～2次扩繁，从扩繁的种蜂中淘汰弱蜂，选择体壮、个体大、活动能力强的蜂作为种蜂进行成品蜂繁育生产。将削好的茧蛹放入繁蜂箱中，摆放最多不超过2层，按1头柞蚕蛹接65～75头雌蜂的比例将周氏啮小蜂接入繁蜂箱中，及时用胶带将箱缝密封。接蜂后的繁蜂箱，放入恒温箱或暗室中，在暗光条件下，周氏啮小蜂在柞蚕蛹上产卵寄生。暗室的温度控制在23～25℃，相对湿度保持在50%～70%。36小时后，打开繁蜂箱，将繁蜂箱转入培养室中培养，培养室的温度控制在23～28℃，相对湿度保持在40%～60%。7～10天后，蛹体内的啮小蜂进入老龄幼虫期，这时便可进行被寄生柞蚕蛹的挑选。被寄生柞蚕蛹可通过颅顶板或蛹体腹部的节间处看到蛹体内寄生的小蜂幼虫。健康的柞蚕蛹，周氏啮小蜂寄生率可达90%以上，单蛹出蜂量在4000～8000头，平均5000头，最多的可达10000头以上。将被寄生的柞蚕蛹挑选出后，装入筐中，放入15℃左右的过渡室中2～3天后便可转放6～10℃的冰箱或冷藏室中贮藏，贮藏时间以不超过30天为宜。出蜂时间应与美国白蛾老熟幼虫期和化蛹初期吻合，放蜂防治时间确定后，应将冷藏的成品蜂提前10～15天取出，放在暖蜂室进行升温。暖蜂温度应逐渐升高，每2～3小时升高5℃，1天后温度控制在24～26℃，相对湿度保持在60%～70%，并应注意通风。出蜂前1～2天即可进行林间释放。在恒温条件下人工繁育周氏啮小蜂多代后，产生蜂种会产生退化，影响繁蜂质量和防治效果。蜂种退化现象表现为同一批蜂出现羽化不整齐、羽化率低、体型变小、飞翔能力弱、寿命短、群体雄蜂数显著增多。为了防止蜂种退化，应在人工繁殖5～6代后进行蜂种复壮。利用自然界的蜂种进行复壮是一个有效措施，由于其已有相当长一段时间的自然锻练，故生命力旺盛。每年繁育周氏啮小蜂的种蜂应来自于野外采集的美国白蛾越冬蛹。冬季在上年放蜂地点或美国白蛾老发生区大量采集美国白蛾蛹，将采集回的美国白蛾蛹放入培养室中培养出蜂，然后，收集培养出的周氏啮小蜂进行种蜂扩繁，根据当年的繁蜂计划数量，将种蜂扩繁2～3代。繁育用于防治的成品蜂时，应采用扩繁的种蜂进行接蜂，不得用繁育的成品蜂作种蜂，尽量减少蜂的代数，控制退化现象的发生。周氏啮小蜂可以爬附在美国白蛾的老熟幼虫体上刺蛰，促其提前化蛹，然后产卵于美国白蛾蛹中，也可在美国白蛾蛹期直接在蛹体上产卵寄生。因此，放蜂防治的最佳时期是美国白蛾化蛹初期。由于美国白蛾的发育常常很不整齐，化蛹期持续时间较长，因此，1个世代应放蜂2次，才能达到较好的防治效果。一次在首批美国白蛾老熟幼虫期或化蛹初期，第二次放蜂应在第一次放蜂7～10天进行。也可将不同发育期的周氏啮小蜂（相差3～7天）混合，一次性放蜂。在自然环境中，周氏啮小蜂一年可繁殖4～7代，因此，为提高放蜂效果，放蜂应尽量在美国白蛾的第1代和第2代进行，第3代美国白蛾蛹期，很快就进入冬季休眠期，放蜂的利用率较低。释放周氏啮小蜂应选择风和日丽的晴天进行，阴雨和大风天气放蜂效果差。放蜂时最好选择下午日落之前和日出之前，这一段时间气象因子较为稳定，无风，空气湿度较为适宜。如果放蜂量较大时，放蜂时间可选择在5：00～9：00时和17：00～20：00进行。炎热的中午时段，不适合放蜂作业。在美国白蛾发生的林中，如果树冠较低或树干上有细枝条，可将小细枝折断，将寄生有周氏啮小蜂的柞蚕茧蛹从削口处挂在树枝上即可。如果树冠较高或树干上没有细枝条，则可用大头针将茧蛹固定在树干上。根据美国白蛾的发生情况，可采用逐株放蜂，也可只在有美国白蛾发生的树上放蜂。一般情况下，1头周氏啮小蜂雌蜂可以寄生1头美国白蛾。如果将自然界中的多种不利因素考虑在内，放蜂量应适当加大。放蜂量可根据美国白蛾虫口密度的调查结果，按蜂虫比（3～5）：1的比例计算。每个网幕美国白蛾按300头幼虫计算，每个柞蚕蛹出蜂量按5000头计算。天敌防治不同于一般药物防治，周氏啮小蜂放蜂后，具有在自然环境中多次繁殖、多次寄生的作用，所以防治效果调查应在放蜂后的各代美国白蛾蛹期进行调查，并以一年内总的寄生率来评价放蜂防治效果。寄生率调查，在放蜂后10～12天便可进行。分别在放蜂区和未放蜂区采集美国白蛾蛹，调查寄生情况，并计算出寄生率和防治效果。放蜂寄生率（%）=被寄生蛹数/调查总蛹数×100放蜂防治效果（%）=（放蜂区寄生率-对照区寄生率）/（1-对照区寄生率）×100%周氏啮小蜂在自然界中可以寄生多种鳞翅目害虫的蛹，这些害虫的蛹期相互衔接，为周氏啮小蜂在自然界中的生存提供了非常有利的条件。我们释放周氏啮小蜂防治美国白蛾时，周氏啮小蜂不仅可以寄生美国白蛾的蛹，而且，在两代美国白蛾蛹期之间，小蜂可以在其他害虫的蛹上寄生，等到下一代美国白蛾蛹期时，又可转到美国白蛾的蛹上寄生，从而达到持续控制美国白蛾的效果。利用周氏啮小蜂进行生物防治，不仅能有效地控制美国白蛾的危害，而且对其他害虫也有很好的控制作用，收到“一虫多治”的效果。

市场经济最突出的特点之一就是竞争。而人才是竞争的核心，培养一支稳定的、有强烈进取心和创造性的员工队伍是一个企业发展的基石。要想在现代社会竞争中取得优势，企业就必需要储备大量人才，而且要对人才进行有效的管理和开发。因此，人力资源的开发管理在现代社会中具有十分重要的意义。然而，由于传统计划经济形成的旧的管理模式的影响和轻程序、轻理性的中国文化的积淀，国有企业在人力资源管理理念和操作方式上，均处于初级的层次。因此，对目前大多数国有企业而言，更重要的就是要进行规范化的人力资源管理体系建设。人力资源管理是现代管理的重要内容。所谓人力资源管理是指将组织内的所有人力资源作适当的获取、维护、激励以及活用于发展的全部管理过程与活动，亦即以科学的方法使企业的人与事作适当的配合，发挥最有效的人力运用，促进企业的发展。简单地说，人力资源管理就是企业对人的管理，也就是企业通过工作分析、人力资源规划、员工招聘选拔、绩效考评、薪酬管理、员工激励、人才培训和开发等一系列的手段来提高劳动生产率，最终达到人与事配合，事得其人，人尽其才的一种管理行为。由于人在整个社会经济活动中的支柱作用，决定了人力资源管理在社会经济管理体系中的关键地位。管理学中的激励理论往往以人的需要为基础，对激励的过程进行深入细致的研究，确定影响因素，寻找科学的激励方法，旨在提高激励结果的有效性，充分调动员工的工作积极性。激励就是指挥棒，激励什么，员工就重视什么。没有激励，没有优胜劣汰，没有奖惩，人力资源就无法发展，无法创造生机与活力。有效的激励竞争可满足人才的各方面需要，尤其是高层次的精神需要，使得个人的要求、发展与企业的发展战略紧密相连，极大地调动人才的积极性与创造性，实现个人与企业目标共赢。管理者应结合企业的不同情况采用不同的激励机制，做到物质激励与精神激励、短期激励与长期激励、管理激励与自我激励有机结合，积极营造一种良好的激励环境，激发、鼓励人才充分发挥自己的积极性、主动性和创造性，展示自己的潜能。报酬就是企业对员工为企业所做的贡献（包括他们实现的绩效、付出的努力、时间、学识、技能、经验与创造）所付给相应的回报或答谢。报酬在人力资源管理中对吸引、留住和激励人才起到重要的作用，会大大提升企业的竞争实力，具有增值功能、激励功能、导向功能、帮助员工实现自我价值的功能。报酬主要包括经济性报酬和非经济性报酬。经济性报酬是与经济有关的各类报酬，包括工资、薪水、佣金、奖金等直接经济报酬及各种福利、保险等间接经济报酬。非经济性报酬是指个人对工作或工作环境在心理上或物质环境上的满足感，诸如社会地位、成就感、发展机会、弹性工作制之类，包括工作本身和工作环境两个方面。人力资源管理与企业效益之间的关系不是来自抽象的理论概括，而是来自企业里每个人实实在在活动的结果，即来自企业员工个人的具体工作以及他们之间相互结成的关系。人力资源管理活动本身所产生的效益和费用支出，对企业效益产生了直接的贡献或者损害，这是人力资源管理对企业效益直接的作用结果：有效的人力资源管理政策和活动，促使员工工作效率的提高、生产或服务的质量提高和改善以及跳槽率的降低等所导致的企业收益提高或成本降低，是人力资源管理对企业效益的间接作用过程。人力资源管理目标是根据企业总体目标来确定的，人力资源管理部门再根据目标确定企业人力资源管理的政策和活动，通过人力资源管理效益实现企业效益。我国国有企业由于先天不足，对如何引人、育人、用人、留人，如何全面提高员工的积极性和工作效益，尚缺乏足够的认识和有效的措施。主要体现在以下几个方面。改革开放以后，虽然许多国有企业已经逐步认识到人力资源管理在企业经营活动中所创造的价值，但是相当一部分企业只是形式上的改动，换汤不换药，与原来无实质性的差异，从用工制度、人事制度、分配制度到企业经营者的任用制度基本沿用传统的方法。大多数企业的人力资源管理还处于以事为中心，把人视为一种成本，只注重使用和控制，不注重投入。在选人、用人的观念上，计划经济的用人模式和思维习惯依然存在。在大多数企业，根本没有设立专门的人力资源管理机构，而是把人力资源管理任务委托于企业长期以来设立的人事管理部门，即使设立人力资源管理机构，也没有赋予其相应的职责：绝大多数企业人力资源部门的绝大部分日常工作仍然在围绕诸如人事考勤、档案管理、薪酬福利管理、人员配置、绩效考评等事务性工作来开展，对人力资源发展规划、员工发展、政策制定完善、促进组织变革等方面的战略性工作很少顾及。我国大部分国有企业不重视员工的培训和继续教育工作，还没有把人才培养看成是知识经济时代最主要的基本建设，企业的人才培训还没有和员工的敬业爱岗、管理能力、创新精神以及自身价值等综合为一个整体去统筹考虑，还没有树立“日常管理是培训”、“终身接受培训”的观念。有的企业即使有一些培训，但培训内容的科技含量不高，也缺乏具体的要求，缺少具体的激励机制，使得教学形式单一，缺乏多样性，培训往往走过场，并不注重实效，随之而来的是员工创新动力不足，造成人才大量流失。国企人力资源管理水平明显偏低，主要表现在：管理观念陈旧，缺乏科学的人力资源管理；吸引人才机制严重滞后，企业因害怕人才流动，并设置种种障碍以尽可能减少人才流失；企业过分依赖人才管理，忽视制度管理，甚至连人事部门也缺乏制度化的规范管理；人才激励机制不健全，管理人员在实施激励机制的过程中不能有效地调动员工的积极性，对员工长期激励的措施不够，忽视了约束与激励相结合，造成人才大量流失。“人是管理工作的核心和动力，是企业在日趋激烈的竞争中立于不败之地的重要保证。”人才是企业经营的重点，唯有企业或组织拥有优秀人才，企业才有可能生机不断。国企要生存要发展，就必须树立人力资源是第一资源的思想。人本管理思想正是以人为中心的管理思想。主要体现为充分尊重知识，尊重人才；把人作为企业最重要的资源，在工作中充分考虑到员工的成长和价值。使员工的利益得以最充分的体现。企业有了这种方针，才能谈得上运用科学的管理方法，进行全面的人力资源管理与开发。随着社会的进步和人们受教育程度的不断提高，人和企业之间的关系变得越来越紧密，并且不断地向更为合理的方向演变。人力资源管理策略中的一个重要体系就是激励体系。第一，加强物质激励。物质激励体现企业对人的创造性劳动、对社会所作贡献的一种酬劳和补偿。第二，加强精神激励。精神激励是企业对人才所作贡献的一种表彰和宣扬。企业通过各种形式的认定、宣传和褒奖，使人才获得荣誉感、成就感和责任感，并用尊重和企业精神来激励员工，发挥榜样的激励作用。第三，加强情感激励。情感激励就是以个人与个人或组织与个人之间的感情联系作为激励的手段，通过调节人的情绪系统，实现激励的目的。第四，企业根据其特点而采用不同的激励机制。激励是一种催化剂，但用得过多，就成了滥奖，其负效应会妨碍员工的竞争活力，达不到预期得目的。第五，建立良好的激励机制的同时形成有效的约束机制，使企业对员工的激励是约束中的激励，是基于责任的激励。绩效管理是实现人力资源管理的前提之一，也是一个企业管理的缩影，从一个侧面反映了企业的经营哲学和价值观。绩效评估可以为企业的各项人事决策提供客观依据，同时能加强组织的团队建设，提高管理效率。一个完善的绩效管理体系有如下五个构件：第一，设定绩效管理的目标；第二，持续不断的沟通过程；第三，记录员工的绩效表现，形成管理文档；第四，绩效考评；第五，绩效管理体系的诊断和提高。这五个构件既是绩效管理体系的组成部分，又是绩效管理体系的流程。一个完整的绩效管理体系必须同时具备上述五个构件，缺一不可。第一，建立以市场为导向的薪酬管理机制。引入市场价位机制，调整分配关系。新的分配制度参照劳动力市场价位，重点向关键管理、科研技术岗位以及企业主体生产岗位倾斜。第二，建立以岗位工资为主要形式的工资制度，明确岗位职责和技能要求，实行以岗定薪，岗变薪变。第三，在坚持效率优先分配原则的同时，兼顾职工的历史贡献。对于老职工将体现职工历史贡献的技能工资和工龄工资合并为保障工资，充分兼顾了职工的历史贡献。对于新职工，可直接将当地最低生活水平线作为保障工资。第四，加大绩效考核力度，将员工的工资分配直接和个人工作绩效挂钩，除保障工资和部分岗位工资外，将其他工资全部列入考核范围，加大考核发放工资的比重。这样就将单位的实际经营状况传递给员工，并以员工胜任工作岗位的能力和在工作中的表现为价值导向，将月度考核结果和员工收入挂钩。职工的培训和发展是企业人力资源管理与开发的一个重要内容。员工的教育培训能够实现其自身价值，也是有效提高劳动生产率的途径。加大员工培训力度，企业首先要对人力资源工作者进行培训。由于人力资源工作者的自身素质和专业知识及技能决定着他对人力资源管理的认识，企业要树立提高本企业的人力资源素质的前提首先要提高人力资源工作者的自身素质。其次，培训应有全面的计划和系统的安排，将教育培训与员工的考核、提升、晋级有机地结合起来，以提高员工参与培训的积极性。对那些有发展潜力的员工，培训的目的就使为了让他们担负起更重要的工作。再次，要把培训与业务考核结合起来。业务考核和培训的目的都是为了让员工更好地工作，所以，二者的目的是一致的，把二者有机地结合起来，有利于增强培训的效果，有利于人才的成长。最后，要把培训与工作需要结合起来。对员工培训必须结合每个员工的工作需要、每个员工的能力，采取因人而异、因材施教的原则进行。同时，要加强一线员工的培训，提高一线员工的知识技能，而不能只培训高层管理人员。要培养企业良好的人际关系和亲和的文化氛围。良好的人际关系，有利于沟通，使人心情愉快；亲和的文化氛围，有助于凝聚人心，培养团队精神和力量。企业文化的核心内容，主要是指企业内部具有明确统一的思想、意识、精神、信仰和价值观。企业文化所蕴含的管理哲学和企业核心价值形成的企业人格，对于企业的经营行为起着至关重要的作用。企业文化建设和管理的实质是贯彻“以人为本”的人本思想，良好的人际关系和亲和的文化氛围仅仅是企业文化重要内涵的体现。始终爱护人，尊重人，承认人的劳动和做出的成绩，构建企业上下左右良好的沟通系统，让人才了解和参与企业的决策与管理，并切实为他们提供各种必要的保障，增强他们的认同感、归属感和忠诚心，让他们毫无怨言地努力与奉献，才是抓住了企业文化建设的“本”，才能从根本上稳定人心，留住人才。职业生涯是指一个人一生中的所有与工作相联系的行为或活动，以及相关的态度、价值观、愿望等连续性的经历的过程。职业生涯规划是指组织建立职业通道，针对组织成员各自的才能与个性制定定向培养计划，以适应各工作岗位的需要，帮助人才充分发挥自己的潜能，达到应有的职业生涯高峰。有效的职业生涯规划要求人才的个人需要与组织需要之间相互结合。在人才的整个职业生涯中，个人与组织双方均处于一个不断变化的环境中，二者需要相互匹配是个动态的过程。如果匹配过程能够有效地进行，人才就会很好地融入组织，组织得到人才的忠诚、合理利用与开发人才资源与潜能，组织绩效提高，人际关系改善，人才个人将能较好地管理自己的职业生涯，实现个人与组织的最佳配合，个人才能充分发挥，态度与价值观较好地实现，个人在管理阶梯上步步高升。通过职业生涯规划，让人才走上发展之路，是企业送给人才最好的礼物，因而也是留住人才非常有效的方式。国有企业应从根本战略上重视人力资源管理，从长远发展着眼于管理体制的变革和人力资源工作的推行。国有企业只有开放思维，采取先进的人力资源开发与管理方法，从大处着眼，建立科学、理性的制度系统，再逐步根据企业具体环境加以变通和灵活应用，同时改革落后的机制，建立规范的价值评价和分配系统，设计合理的薪资结构、报酬体系，明确员工发展路径，国有企业就一定可以从根本上形成吸引人才、凝聚人才、培养人才的企业氛围，从而增强企业的竞争力。

灰霉病（gray mold）是番茄生产中一种重要的气传病害，其病原为灰葡萄孢属（Botrytis cinerea）真菌，寄主范围广，再侵染频繁，为害严重。化学防治仍是目前生产中防控该病害的主要手段，其中以甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂为代表的呼吸作用抑制剂近年来在灰霉病防治实践中显现出了良好的防效，而线粒体作为真核细胞呼吸作用的主要场所，在线粒体上合成的ATP提供了细胞生命活动所需的大部分能量。为此，进行高纯度线粒体的分离对于开展呼吸抑制剂类杀菌剂的作用机制研究[1～5]具有十分重要的意义。至今，从病原真菌中分离获得高纯度线粒体的方法尚不成熟，国内外一般采用从动物或高等植物中分离得到的线粒体作为替代品来进行研究。本研究拟借鉴相关研究[6～7]方法，采用机械破壁及差速离心的方法从番茄灰霉病菌中分离获得线粒体，并对其进行呼吸测定，以确证获得的线粒体是否具备完整的结构和功能。现将研究结果报道如下。1.1.1 番茄灰霉病菌（B.cinerea）菌株NJ-9，由中国农业大学植物病理学系种子病理学和杀菌剂药理学实验室提供。1.1.2 供试药剂 α-酮戊二酸，NADHNa2（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐）为Roche公司产品，ADPNa2（5′-腺苷二磷酸二钠盐）为Sigma公司产品。线粒体分离液的配制[9]：0.5mol/L 蔗糖，5mmol/L半胱氨酸，1mmol/L 乙二胺四乙酸二钠盐，0.3%（w/v）牛血清白蛋白Ⅴ组分，0.1mol/L（pH值7.4）磷酸盐缓冲液；线粒体保持液（洗液）的配制[9]：0.5mol/L 蔗糖，1mmol/L 乙二胺四乙酸二钠盐，0.3%（w/v）牛血清白蛋白Ⅴ组分，0.1mol/L（pH 7.4）的磷酸盐缓冲液；线粒体呼吸测定的反应液[9]：0.5mol/L 蔗糖，10mmol/L KCl，5mmol/L MgCl2，1mmol/L 乙二胺四乙酸二钠盐，0.1%（w/v）牛血清白蛋白Ⅴ组分，0.01mol/L（pH 7.2）的磷酸盐缓冲液。1.1.3 菌体的培养 将浓度为8×106个/ml的孢子悬浮液接种到1L的复合盐液体培养基（SSY）[9]（10g可溶性淀粉，2g KH2PO4，1.5g K2HPO4，0.5g MgSO·7H2O4，1g（NH4）2SO4，2g 酵母粉，1L去离子水，pH 6.2）中，置于23℃，150rpm条件下摇培24h。1.1.4 供试仪器 Oxytherm氧电极（Hansatech Instruments Ltd.），DHZ-D冷冻恒温振荡器（江苏太仓实验设备厂），高速低温离心机（Beckman Coulter AvantiR J-E）。1.2.1 灰霉病菌孢子的获得 将菌株NJ-9接种至MEA（麦芽糖20g，酵母粉5g，琼脂粉14g，1L去离子水）培养基上，25℃下黑暗培养5～7 天后，放置于日光灯和长波长紫外灯（黑光灯）下，12h轮流交替照射7～14天，产生大量的分生孢子，备用[8]。1.2.2 线粒体的分离 通过真空抽滤的方法收集幼嫩菌丝，依次用4℃的去离子水冲洗两次，再用线粒体分离液冲洗。随后各操作中所用的器材必须在4℃下经过预冷处理，操作过程均需在0～4℃下进行。将用线粒体分离液预洗得到的菌丝悬浮在3倍体积的分离液中，分别采用以下两种方式进行破碎细胞壁：（1）杵状玻璃匀浆器法：每30～40g菌丝用100ml的分离液悬浮，用杵摩擦20次左右，混合到匀浆物均一、平滑即可。每次时间不要超过2～3min，整个样品处理的时间不要超过30min。立即将得到的匀浆物倒入50ml的离心管中，于2000g离心25min，取上清液于7000g转速下离心20min后取上清液于12000g再次离心15min，最后小心弃去上清，沉淀即为分离到的线粒体，外观为浅黄色胶状物。将线粒体悬浮在200μl的线粒体保持液中，置于冰上备用，放置时间不能超过3～4h，避免线粒体的降解。（2）高速组织匀浆器法：采用高速组织匀浆机（恒定功率220W），破碎菌丝，每次破碎时间15s，破碎3次，中间的隔1min（防止匀将机刀口发热影响线粒体的分离，将匀浆物用双层预冷的湿纱布快速过滤，过滤的时间不要超过30s，立即将匀浆物倒入50ml的离心管中，于1200g下离心20min；取上清于6000g离心20min后再取上清于12000g离心15min，小心弃去上清，沉淀即为分离到的线粒体。1.2.3 氧消耗量的测定 采用极谱法在25℃条件下使用Oxytherm氧电极进行测定，标准反应液2ml，加入线粒体50μl（蛋白质的含量大约为0.3mg），反应液中氧饱和的最大浓度是226μmol/L，所有的底物都溶解到反应液中，依据Estabrook[10]的方法计算RCR和P/O值。提取过程保持0～4℃低温条件下，杵状玻璃匀浆、高速组织匀浆两种破壁方法均可从番茄灰霉病菌幼嫩的菌丝中分离得到紧密偶联的线粒体。全玻璃杵状匀浆器手工破壁操作耗费人力，需要的菌丝量较少，从10g到几十克湿重菌丝都能分离到完整的线粒体。通常60～80g湿重菌丝即可以分离得到满足试验需要的线粒体。高速匀浆器省力快速，但是在匀浆器高速转动时易产热可导致分离物的降解，操作过程中持续时间不能过长，必要时应使用循环冷却水降温或置于低温环境下操作；同时该法需要的菌丝量也较多，以50g 以上的湿重菌丝为宜，菌丝量少时容易在破碎过程中使线粒体结构受到破坏，从而影响提取效果。番茄灰霉病菌线粒体的底物利用，呼吸控制率和磷氧值测定结果见表1。当以外源的NADH和α-酮戊二酸作底物被氧化时，状态3（在线粒体中加入底物及ADP后测定的线粒体呼吸速率）的呼吸数率明显增加，反映了在ADP刺激下线粒体功能增强的程度；两种底物的呼吸控制率（RCR）值都在3.1～3.3之间，高的呼吸控制率值表明线粒体中电子传递与氧化磷酸化紧密偶联；加入NADH做外源的呼吸底物时，磷氧比值（P/O）是1.3～1.7，表明有2个氧化磷酸化位点，即ATP生成有两个部位；α-酮戊二酸的磷氧比值（P/O）是2.2～2.5，表明有3个氧化磷酸化位点，即ATP生成有3个部位。图1表示两种破壁方法获得线粒体在外援NADH电子供体下呼吸特征图。以上研究结果表明分离的高纯度线粒体具有在活细胞中对等的生物功能，可作为线粒体生物学研究的适宜材料。MethodsofdisruptionSubstratesState3respirationrates(nmolO2/min)(mgprotein)Respiratorycontrolrations(RCR)ADP/OrationsAll-glassNADH90.16±203.8±0.11.7±0.2Potter-Elvehjemhomogenizerα-ketoglutarate175.43±453.3±0.62.2±0.1AwaringNADH118.96±303.5±0.71.3±0.1blendorα-ketoglutarate198.17±653.1±0.52.5±0.2Table 1 Respiration properties of mitochondrial isolated from mycelia of Botrytis cinereaaFigure 1 oxidation of NADH and α-ketoglutarate by mitochondrial isolated from mycelial of B.cinerea, Concentration of substrates were 10mmol/L α-ketoglutarate,2mmol/L NADHNa2, the ADP concentration was 200μmol/L and reaction were carried with 0.2~0.4mg mitochondrial protein本研究获得以下结论：（1）采用杵状玻璃匀浆器和高速组织匀浆机两种机械力可以有效破碎番茄灰霉病菌的细胞壁，借助梯度离心可以实现番茄灰霉病菌线粒体的有效分离；（2）使用本方法获得的番茄灰霉病菌线粒体结构完整、功能齐备，具有在活细胞中对等的生物功能，可作为线粒体生物学研究的适宜材料。（3）B.cinerea在培养液中生长很缓慢，选取生长代谢最旺盛的菌丝，有利于线粒体的分离。目前常用的破碎细胞方法包括传统的机械法（如匀浆、研磨、压榨、研磨、超声等）和非机械法（包括酶溶、冻融、化学等），都有其适用范围和优缺点，选择的原则是该方法不影响目标蛋白和产物的结构和功能。本文除采用上述两种机械破壁方法外，也曾尝试过超声波破壁方法以及采用蜗牛酶和纤维素酶进行酶解处理以获得原生质体的方法，但均没有获得理想的结果，推测可能与真菌细胞壁较厚，或使用的降解酶的降解特点有关。有关线粒体生物学和呼吸动力学的研究报道[9]表明，RCR 比ADP/O比值更能反映线粒体功能的完整性和氧化磷酸化的效率，ADP/O值是指线粒体每吸收一克原子氧的同时，生成ATP 的克分子数的比值，它反映线粒体的能量转化效率。RCR是表征线粒体结构、功能完整性及氧化磷酸化效率的指标。本文研究表明外源的NADH仅有2个氧化磷酸化位点，即只能生成2个ATP，然而，有文献报道[11]灰霉病菌的线粒体在氧化NADH的电子传递链中有3个磷酸化位点。因此，需要进一步研究不同的呼吸抑制剂和氧化磷酸化抑制剂在灰霉菌线粒体的电子传递链的各种抑制效果。

白粉病是我国小麦、蔬菜及花卉等作物上的一种常见重要病害。气候适宜时，该病在湖北麦区以及大棚瓜类蔬菜上分别造成小麦白粉病和瓜类白粉病流行，损失严重[1～2]。三唑酮、烯唑醇、福美双、氟化硅等是我国防治白粉病的常用药剂，而一些研究表明，在某地区已发现白粉病对这些药剂防效有所降低，已产生一定程度的抗药性[3～5]。随着人们对可持续发展和环境污染的高度重视，开发对环境友好且又能延缓抗药性产生的杀菌剂成为农药研究的一个新方向。为寻找和开发替代三唑酮的高效、无公害的杀菌剂，由本课题组和内蒙古清源保科技有限公司联合研制了用于防治植物白粉病的植物源提取物Vegard（0.5%大黄素水剂），该制剂对黄瓜白粉病和小麦白粉病室内活性明显，为明确该药剂的田间效果，对该制剂进行了防治小麦和甜瓜白粉病的试验，现将结果报道如下。0.5%Vegard水剂，内蒙古清源保科技有限公司生产；15%三唑酮可湿性粉剂，江苏利民化工有限公司生产；共设6个处理：①Vegard 500倍液；②Vegard 200倍液；③Vegard 100倍液；④Vegard 50倍液；⑤15%三唑酮可湿性粉剂1000倍液；⑥ 清水对照。小麦白粉病防治试验设在湖北省农业科学院南湖试验农场进行。小麦品种为“郑98”，高感白粉病，条播，试验每个处理3次重复，小区面积30m2，小区随机区组排列，亩施5kg尿素作拔节肥。甜瓜白粉病试验在湖北省农业科学院新科源温室内进行，供试甜瓜为感白粉病品种“金红”，营养钵育苗后移植至温室，行距1m，株距0.5m，小区面积15m2，每个处理3次重复，随机排列。分别在小麦始见零星白粉病斑期和甜瓜白粉病发病初期分别进行施药，施药量为小麦每亩对水50kg，甜瓜每亩对水60kg喷雾，喷药时尽量做到叶面均匀喷透。喷雾器械为426-8型压缩式喷雾器。对于小麦白粉病，药前调查病情基数，药后14天作最终病情结果调查，各小区对角线五点法取样，每点定15株，采用0～9级分级标准，每株调查上3叶。对于甜瓜白粉病，每小区对角线五点法取样，每点取2株，采用0～9级分级标准，调查每株上所有叶片的病情（每小区约调查80～100片叶），调查时期分别为药前，药后7天、10天和14天。病情分级标准、病指、药效的计算方法参照《农药试验田间药效准则》进行，并对防效进行平均值的多重比较（SSR法）。从表1可以看出，Vegard对小麦白粉病具有明显的保护效果，采用该药剂50～500倍液，于始见病期施药1次即可达到76.2%～94.2%的效果，其中该制剂200倍液、100倍液和50倍液药液的防效间差异不显著，该制剂100倍液和50倍液处理的防效与对照药剂15%三唑酮可湿性粉剂1000倍液的防效相当。结果表明，Vegard 50倍液和100倍液两个浓度处理的防效在用药后7天、10天、14天均在90%以上；200倍液处理在用药后7天和10天调查的防效分别为89.9%和89.1%，14天后的防效也达80%以上；500倍浓度在施药后7天和10天的防效分别为84.0%和83.6%，14天的防效下降为77.8%（表2）。三唑酮对甜瓜白粉病防效不理想，该药剂在药后7天、10天、14天的防效为79%、66%和30%，明显低于Vegard的防效。Vegard对瓜类白粉病具有良好的防治效果且残效期较长。500倍浓度的残效期为10天，比常规药剂三唑酮的残效长3～4天。100倍液和50倍液处理药后14天绝对病情指数未有发展，表明在这两个浓度下其残效长于14天。处理Treatment稀释倍数Dilution药前病指Diseaseindexbeforeapplication药后14天病指Diseaseindexafterapplication14days防效（%）Effect显著性Significant0.5%Vegard水剂0.5%vegard500倍500×0.221.6476.2c200倍200×0.241.3383.6bc100倍100×0.220.5592.2a50倍500×0.160.3194.2a15%三唑酮可湿粉15%triadimefon1000倍1000×0.160.2495.8a空白对照Watercontrol—0.248.32——表1 Vegard防治小麦白粉病试验结果Table 1 Effect of Vegard on wheat powdery mildew处理Treatment稀释倍数Dilution药前病指Diseaseindexbeforeapplication药后7天病指Diseaseindexafterapplication7days防效（%）Effect药后10天病指Diseaseindexafterapplication10days防效（%）Effect药后14天病指Diseaseindexafterapplication14days防效（%）Effect0.5%Vegard水剂0.5%vegard500倍500×7.7011.5584.0c13.2383.6c20.4377.8c200倍200×8.037.5589.9b9.2589.1b16.1383.2bc100倍100×7.053.5594.6a6.5091.5b8.5390.0ab50倍50×7.983.3595.5a3.0096.5a4.9894.7a15%三唑酮可湿粉剂15%triadimefon1000倍1000×7.6014.5379.1d27.3366.0d63.1830.1d空白对照Watercontrol—7.6071.63—81.20—91.63—表2 Vegard防治甜瓜白粉病试验结果Table 2 Effect of Vegard on melons powdery mildew随着人们对环保意识的高度关注，无公害农药的研制成为农药开发领域的一个新方向。本课题组和内蒙古清源保科技有限公司联合开发的无公害植物源提取物Vegard田间防治小麦和甜瓜白粉病效果明显。在发病初期喷施，Vegard 200倍液对小麦白粉病可达83.6%的效果，100倍液和50倍液防效可达90%以上的效果，其防效与15%三唑酮1000倍液的防效相当。该制剂对瓜类白粉病防效亦突出，且防效明显超过三唑酮常规用量的防效，持效期长。从防治成本考虑，在防治小麦白粉病和瓜类白粉病上可选用Vegard 100～200倍液在发病初期喷施，10～12天用药1次，则可取得理想的效果。

植物寄生线虫是重要的植物病原物，全世界已报道的植物寄生线虫达200多属5000余种[1]，我国粗略统计到2005年底报道的植物线虫约有40属，400种[2]。植物寄生线虫不但为害植物根部，而且还为害茎、叶、花和果实。据估计全球每年因植物寄生线虫造成的经济损失达1000亿美元[3]。植物寄生线虫的生防因子包含天敌（真菌、细菌、病毒、立克氏体、捕食性线虫、涡虫、螨类、昆虫和原生动物等）、动植物、微生物等[4]。1917年美国的Cobb最早提出植物寄生线虫的生物防治，1924年Thorne在美国犹他州将捕食性线虫Iotonchus amphiogonicusy引入甜菜地中并获得成功。其后，各国学者做了大量工作，到20世纪70年代，又开始研究利用捕食线虫防治植物寄生线虫，在法国Cayrol及其合作者利用Arthrobotrys robusta和A.irregularis首先研制成功防治蘑菇栽培中的有害线虫和蔬菜根结线虫的商品制剂Royal 300[5]和Royal 350[6]。从20世纪80年代开始，国内外开始大量调查定殖于固着性线虫卵、雌虫、胞囊上的真菌，国际马铃薯中心组织了40多个国家和地区的专家对Paecilomyces lilacinus进行了防治根结线虫的试验并取得一定结果[7]，Paecilomyces lilacinus被研制成商品制剂应用于根结线虫的防治[8]。90年代之后，植物寄生线虫的生防资源挖掘工作大量增加，新的生防因子不断被发现。据统计，关于线虫生物防治的文献中，以真菌为材料的占76%，捕食性线虫占7%，细菌和放线菌占5%左右，其余在3%以下[9]。目前，国内外发现的线虫生防因子主要包括以下几种类型：植物寄生线虫生防真菌包括捕食性真菌、线虫内寄生真菌、卵寄生真菌、产毒真菌、菌根真菌、机会真菌。研究较多的有寡孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora）、指状节丛孢（A.dactyloides）、淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、木霉属（Trichoderma spp.）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）以及担子菌中的粗皮侧耳（Pleurotus ostreatus）等[10]。应用于植物寄生线虫的生防真菌有：节丛孢属（Arthrobotrys）的A.irregularis，A.robusta，A.conoides，A.oligospora，A.dactyloides[11]等；单顶孢霉属（Monacrosporium oudemans）的椭圆单顶孢M.ellipsosporium[12]；指状节丛孢A.dactyloides[13]。其中不规则节丛孢（A.irregularis）已经制成了商品制剂Royal 300和Royal 350。目前报道的线虫内寄生真菌主要有被毛孢菌（Hirsutella rhossiliensis=Hirsutella heteroderea）[14]和Hirsutella minnesotensis[15]。轮枝霉属（Verticillium）的8种：V.catenulatum，V.chlamydosporium（厚垣轮枝孢），V.sinensis（中国轮枝孢），V.lamellicola（菌褶轮枝霉），V.leptobactum，V.lecanii（蜡蚧轮枝霉），V.psalliotae（蘑菇轮枝霉），V.inseatorum。还有Drechmeria coniospora等[11]。我国已用厚垣孢普可尼亚菌（Pochonia chlamydospora）ZK7菌株制成了“线虫必克”商品制剂。目前研究最多的是淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus。该菌是一类广泛存在的线虫卵寄生土壤真菌。不少研究表明，淡紫拟青霉可以寄生根结线虫Meloidogyne spp.[16]、胞囊线虫Heterodera spp.等植物病原线虫的卵[17]，对南方根结线虫卵的寄生率高达60%～70%[7]。刘畅在18℃和25℃条件下，室内测定厚垣轮枝菌V10菌株对南方根结线虫卵的寄生效果，结果表明，在18℃和25℃条件下，V10菌株对南方根结线虫卵的相对寄生率分别为77.22%、73.00%[18]。除寄生作用外，Cayrol等还报道了淡紫拟青霉的培养滤液中含有杀线虫物质。目前，该菌株已被各国学者广泛应用于线虫的生防并成为商品制剂[19]。目前发现的有90多个杀线虫菌物毒素，其中包括担子菌、子囊菌、半知菌中的部分菌物产生杀线虫的毒素。1984年Thorn&Barron报道了侧耳属真菌的5个种具有侵染和消解线虫的活性，1987年他们证明了侧耳属侵染线虫的机制是通过产生毒素作用于线虫，向红琼等的研究也认为糙皮侧耳对腐生线虫的作用机制是杀虫寄生。到目前为止，已经证明侧耳属的P.ostreatus，P.pulmonarius，P.tuberregium，P.strigosus，P.subareo latus，P.cornucopiae，P.cystidiosus，P.citrinopileatus，P.colombinus，P.shodophyllus，P.salmon seostramineus，P.sapidus，P.sajorcaju，P.florrida，P.flabellatus，P.dryinus，P.euosmus，P.eryngii，P.levis，.ferulae，P.spodoleucus，P.memberan cens，P.certicautus等23个种对线虫有活性。汪来发等对草皮侧耳属真菌对松材线虫的作用也进行了初步研究。在对线虫抑制活性的测定中，经过测定的该属的不同种都对线虫有活性，但还没有活性显著强于其他种的优势种，毒力高、活性强的菌株都分属于不同的种[20]。在菌根真菌的研究中，最为关注并被研究最多的是丛枝菌根Arbusculare Mycorrhiza 简称为AM。据报道AM真菌对Globodela rostochiensis，Meloidognearenaria，M.incognita，M.javanica，Heterodera cajani，H.glycines，Helicolylenchus dihstera，Pratylenchus subrachyurus，P.pene-trans，P.zeae，Potylenchulus reniformis，Radopholus citrophilus，R.semilis，Tylenchulus semipenetrans等引起的花生、大豆、蚕豆、鹰嘴豆、棉花、燕麦、番茄、黄瓜、马铃薯、桃、葡萄、柑橘等各种线虫病害，都能不同程度地降低其为害[21]。机会真菌是可以寄生线虫的卵、胞囊或雌虫的一类真菌，有的学者把这种菌物称为机会真菌。对此类真菌的侵染机制已进行了超微结构观察和分子机制研究[22]。Chen和Dickson对12种真菌对大豆胞囊线虫卵的侵染做了扫描电镜和透射电镜观察，其中10种能够侵染[23]。Galper等报道，Cuninghamella elegans可以产生胶原蛋白酶，其菌物在胶原蛋白培养基上的培养滤液可以抑制爪哇根结线虫卵的孵化，影响幼虫的活动和侵入[24]。1982年Zavaleta-Mejia和Van Gundy首次报道了根际细菌对番茄和黄瓜根结线虫侵染的抑制作用，随后Becker在1988年报道了根际细菌对南方根结线虫的防治作用，Jaworski等于1986年将2株对根结线虫具有防治作用的荧光假单胞Pseudomons fluorescens申请了专利。2001年据Copping报道，美国CCT Corp.公司用洋葱假单胞菌Pseudomonas cepacia制成了杀线剂“Deny”。到目前为止，发现有效的根际拮抗细菌有Pseudomons spp.，Bacillus spp.，Agrobacterium radiobacter，Gluconobacter spp.，Sporolactobacillus spp.，Serratia spp.，Acinebacter spp.等，这些根际细菌的作用机理和应用技术都在进一步的研究中 [25]。1906年美国线虫学家Cobb首次报道了巴氏杆菌Pasteuria penetrans对线虫的寄生作用。1996年，Ebert等从水蚤上重又分离到细菌寄生物P.ramosa，并以此作为巴氏杆菌的模式种。现今报道巴氏杆菌可根据其寄主类型及内生孢子分为4个种，即水虱寄生菌P.ramos、根结线虫Meloidogne spp.成虫上的寄生物P.penetrans、仅寄生短体线虫Pratylenchusbrachyurus的P.thornei及可以寄生胞囊线虫Heterodera spp.、球形胞囊线虫Globodera spp.成虫的P.nishizawae。另外有两个未鉴定的种：从德国豌豆胞囊线虫上分离的菌株和从佛罗里达长尾刺线虫上分离的菌株[26]。鉴于巴氏杆菌具备生防菌的诸多优良性状，许多国家和地区都十分重视对该菌的研究。我国在这方面起步较晚，相关研究虽然取得了很大进展，但距离开发成商品制剂还有许多工作要做。苏云金杆菌是一种广谱微生物杀虫剂，它的最大的优点就是能够形成芽孢的同时，也能够形成不同形态且具蛋白性质的伴孢晶体。苏云金杆菌（BT）目前已广泛应用于鳞翅目害虫的防治。1990年Davidas报道，苏云金杆菌β-外毒素对南方根结线虫、大豆胞囊线虫有毒杀作用[27]。放线菌和真菌、细菌一样，是植物寄生线虫的重要天敌类群之一。尽管对放线菌研究很少，但阿维菌素及其衍生物的研究和开发利用是少数成功例子中典型的一个。我国于20世纪80年代末引进和分离到阿维菌素产生菌。1994年由中国农业大学和上海农药研究所等单位开发成功首个AVM产品—北农爱福丁，到2003年6月登记的AVM产品品种达到658个。近30年来国内外陆续发现了莫比霉素（Milbemycin）、戒台霉素（Jietaicin）、阿维菌素（Avermectin）、南昌霉素（Nanchangmycin）等高活性杀虫杀线虫抗生素[28～29]。病毒作为植物寄生线虫的天敌因子研究甚少。迄今为止发现的受病毒感染的线虫只有6种：南方根结线虫Meloidogyne incognita、鼠膀胱线虫Trichosomoides crassicauda、异头锥线虫Dolichodorus heterocephalus、食蚊罗索线虫Romanomermis culicivorax、马氏矮化线虫Tylenchorhynchus martini、Thaumamermis cosgrovei等 [30]。1973年Shepherd等首次报道豌豆胞囊线虫Heterodera goettingiana和马铃薯金线虫Globodera rostochiensis体内存在有立克次氏体，从而证实立克次氏体是线虫的致病因子。1979年Endo也报道大豆胞囊线虫Heyerodera glycines细胞受到立克次氏体的感染。尽管30多年前就证实立克次氏体能够感染胞囊线虫，但利用立克次氏体进行植物寄生线虫的生物防治至今未见报道。研究发现，一些植物能产生对线虫的行为和发育有较强影响的物质，最终可引起线虫死亡，或干扰卵孵化、蜕皮和激素调控，作用方式也多种多样。目前已知约有75科植物含有杀线虫物质，其中菊科和豆科植物是研究最多的杀线虫植物。非洲万寿菊（Tagetes erecta）的根部、叶部提取物都表现明显的杀线虫活性或抑制卵孵化。日本杉（Cryptomeria japonica）的叶片对南方根结线虫有显著防效[31]；毛鱼藤（Derrielliptica）根有极强杀线活性，三尖杉（Cephalotaxus fortunei）茎叶、粗榧（Cephalotaxus sinensis）树叶、狼牙刺（Sophora viciifolia）种子、紫斑牡丹（Paeonia suffruticosa var.papaveracea）茎的抽提物对南方根结线虫和水稻潜根线虫具极强的杀线虫活性[32]。众多研究表明，万寿菊是应用植物防治线虫的生防研究中使用最多的一种植物[33]。有机改良剂种类繁多，主要有壳质粗粉、植物残体及加工废料、绿肥、饼肥、堆肥和粪肥等。在有机改良剂防治根结线虫病方面国内外也有不少的报道，例如 Singh 等报道了不同植物饼肥提取物对根结线虫卵孵化的影响，发现菜子饼和棉子饼的水煮提取物可降低孵化率 90%以上[34]。本课题组研究了不同植物有机质对黄瓜根结线虫病的防治效果。盆栽试验结果表明：蓖麻叶、麦糠、楝叶和花生饼粕对黄瓜根结线虫病防治效果分别达到70.44%、68.17%、56.09%和54.92%；田间小区的试验结果与盆栽试验结果基本一致，防效较好的有麦糠、楝叶、蓖麻叶和菜籽饼粕4个处理，防效分别达到71.55%、69.99%，63.14%和62.19%[35]。刘辉志研究发现将不同有机改良剂及其生防菌混用，可以提高防治效果[36]。捕食性线虫一直是国内外线虫学家关注的重点之一，其中最重要的属有Odontopharynx，Butlerius，Onchulus，Mononchuus，Ironus，Labronema，Aporcelaimus，Sectonema，Actinoloaimus，Carcharolaimus和Nygolaimus。此外Discolaimium，Discolaimus，Eudorylaimus，Tripyla中的一些种也捕食线虫。捕食性线虫在土壤中分布广、数量大，Rahaman 和Ahmad从90个土壤样品中分离的64个种中，捕食线虫占第二位，并且Aporcelaimellus密度大，数量多[37]。捕食性节肢动物的研究也很广泛，可取食植物线虫的节肢动物主要有4种功能类型：①普通捕食者：主要有吸食猎物的螨、捕食猎物的蜈蚣、Symphylan也在此列；②线虫捕食者：主要有螨类如犹伊螨属（Eviphis）、异伊螨属（Alliphis）、Crasscheles三类吸食体液的螨类以及Alycus和无爪螨属Alicorhagia；③吸食真菌或线虫体液者：如Tydeus，Eupodes，Tarsonemus，Bakerdania，Pediculaster，Scutacarus，Speleorchestes等；④摄取线虫某一部分：如Oribatula，Zygoribatula，Pilogalumna，Tyrophagus，Folsomia，Isotoma，Oppiella，Joshuella，Ceratocepheus，Anotylus，Tullbergia，Hypogastura 等 [38～39]。经过国内外植物寄生线虫研究工作者的共同努力，植物寄生线虫的生物防治研究取得了很大成就，大量的生防资源被挖掘出来并进行了深入研究，一些生防因子也已被开发利用，除广泛使用的阿维菌素（AVM）和线虫必克外，还有防治蔬菜根结线虫的Pasteuria penenteans；防治植物根结线虫和胞囊线虫的Paecilomyces lilacinu，Pochonia chlamydosporia；防治大豆胞囊线虫的不产孢真菌（ARF18）；防治植物寄生线虫的Myrothecium verrucaria和H.rhossilienesis，防治松材线虫的植物杀线剂杀线一号等。线虫分子生物学技术近年来也取得长足发展，尤其是在线虫生防资源调查、高效生防菌株的选育、基因改良、菌剂研制、抗病育种及线虫与植物的互作等研究领域得到广泛应用[11]。此外，其他一些相关的研究方法和评价办法也日臻成熟，这些都为我们进一步开展更深入和更广泛的研究奠定了良好的基础。在植物寄生线虫的生物防治研究中，存在的突出问题主要是：（1）在生防因子方面，筛选出的生防因子主要是真菌，而细菌和放线菌很少，并且在植物寄生线虫的生防因子的作用机制研究方面还较匮乏。（2）所开发出的生防制剂仍然存在稳定性差、自然条件下存贮时间短的问题，并且剂型单一，推广应用难度大。（3）优良菌株筛选模型和评价体系不完备。优良菌株筛选模型和评价标准是植物寄生线虫生物防治及生防制剂开发的基础，但至今国内外仍然没有统一的、科学的筛选模型和评价标准，尤其是生防制剂的安全评价标准。（4）在杀线植物、杀线植物产品和有机改良剂利用研究方面仍较少，一些植物病原线虫如禾谷胞囊线虫的生防研究仍较滞后。（5）在植物寄生线虫的生防微生物代谢产物的生防作用研究方面，国内外报道较少，如何利用微生物高活性代谢产物为模板，开发出更多的生物源杀线剂，仍是需要进一步深入研究解决的问题。运用有益生物防治植物病害，包括植物寄生线虫在内，是今后植物病害防治的重要手段。在自然界，线虫的天敌数量大、种类多、分布广，有着极大的生防潜力；杀线虫植物在自然界也广泛存在。国内外学者虽然对植物寄生线虫的生物学、生态学、生防因子等方面进行了深入研究，并开发出一些生防制剂，但在植物寄生线虫的生防因子的作用机制研究方面还较匮乏，对筛选出来的生防因子进行产品开发和利用技术研究还相对滞后，致使能够在生产中应用的生防产品还相对较少，而且效果不够稳定。今后需要重点研究解决的问题包括土壤的抑菌作用问题、生防菌的风险评估、生防制剂的质量评价标准和体系问题等。在生防制剂的开发和应用技术研究方面，应投入更多人力物力进行攻关，有关研究单位应加强合作和交流。此外，在利用微生物高活性代谢产物为模板，开发生物源杀线剂，对杀线植物的调查和挖掘工作也需进一步深入开展。

利用植物有益内生细菌进行植物病害生物防治和提高作物产量是当前农用微生物研究的一个热点。在我国，以植物有益内生细菌为主体的植物微生态制剂已经进入田间的农业生产应用，取得了良好的经济和生态效益。细菌在植物上发挥其功能的关键是细菌可以在作用部位很好的定殖。研究发现，在细菌与植物相互作用时，会引起该区域的氧自由基浓度的急剧升高；同时植物也会代谢分泌出一些酚类物质，这些物质都会产生氧自由基[1，2]。在该环境中定殖的细菌必须克服这种氧自由基对细胞的毒性。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是细胞抗氧自由基毒性的一种关键酶。SOD广泛存在于生物体内，催化O·2歧化为H2O2 和O2。按照结合的不同金属离子，SOD主要分为Mn-SOD、Fe-SOD和CuZn-SOD[3]。其中，Mn-SOD和Fe-SOD在细胞体内发挥功能，而CuZn-SOD定位在胞壁空间或者胞外以清除细胞膜外的氧自由基[4]。Bacillus cereus 905是本研究室从小麦体内分离获得的一株具有很好的促生和防病效果的细菌，在小麦体内及根围定殖能力强。为分析其定殖的分子机制，根据已公布的蜡样芽孢杆菌的全基因组序列及本实验室已获得的B.cereus M22的CuZn-SOD基因[5]，推测在B.cereus 905中也存在CuZn-SOD基因。本研究试图从氧自由基毒性角度探讨CuZn-SOD在细菌与宿主相互作用时发挥的重要功能。比对Genbank发表的几个B.cereus菌株的CuZn-SOD基因序列，根据两端高度保守的序列设计引物，利用PCR方法扩增B.cereus 905的CuZn-SOD基因全长（sodC）。构建表达载体pET-22b-sodC，转化Escherichia coli BL21（DE3），IPTG诱导表达，化学抑制法验证蛋白种类。以B.cereus 905的基因组DNA为模板进行PCR，得到了B.cereus 905的CuZn-SOD基因全长（sodC）。该基因由537 bp组成，编码179个氨基酸残基。根据该蛋白的分子量大小和pET-22b载体中的多克隆位点上游pelB前导序列和下游His-tag序列，预测表达出的蛋白大小约为23kD。序列比对发现其与B.cereus M22同源性高至96%[5]，BLAST结果也显示其与其他的几株蜡样芽孢杆菌的CuZn-SOD基因的同源性在90%以上。在sodC推定的179个氨基酸残基中，甘氨酸（G）含量最高，达到12.29%（22/179，mol/mol），且在序列中均匀分布。在推定氨基酸序列中，不含酪氨酸（Y）和色氨酸（W），这与其他CuZn-SOD序列特征一致。构建表达载体pET-22b-sodC，转化Escherichia coli BL21（DE3），IPTG诱导表达，NBT反相染色后，较未诱导样品相比，诱导后的细胞裂解液出现一条明显的亮带，表明该基因表达出的蛋白表现出SOD活性（图1）。SOD酶活测定也发现诱导后细胞裂解液的SOD酶活有了显著的提高，化学抑制法得出诱导出的SOD蛋白经KCN和H2O2处理后，其活性受到很大程度上的抑制，而氯仿/乙醇对其活性没有影响，确定了诱导表达出的蛋白为CuZn-SOD（图2）。Figure 1 Enzymatic activity tests of E.coli BL21(pET-22b-sodC) by Native-PAGEFigure 2 Identification of CuZn-SOD with chemical inhibitant methods超氧化物歧化酶普遍存在于所有的需氧生物中，从最低等的原核生物到高度复杂的人脑，都存在SOD的防御反应。B.cereus 905是一种植物内生细菌。有数据发现在细菌与植物互作及植物体内都可能有超氧阴离子的存在。B.cereus 905很可能依靠其CuZn-SOD的活性清除胞外的氧自由基以保证该细菌可以在植物体内很好的定殖。作为非病原菌的植物内生细菌，CuZn-SOD可能在其侵入及定殖过程中扮演着重要角色，更明确的结论需要下一步基因缺失后的定殖能力的比较分析。

The term"programmed cell death"(PCD)is used to describe cell death that results from the activation of a cell suicide pathway that is encoded by the genome of the dying cell[1].So PCD is an important physiological mechanism for selective cell elimination during development or following damage in multicellular organisms[2].Characteristic morphological changes associated with PCD include cytoplasmic shrinking,chromatin condensation and nuclear DNA fragmentation[3].In plants,PCD is also an indispensable facet of development,defence response and architecture,which shares some characteristic features with animal apoptosis[4].Plant PCD is involved in anther,megagametophyte and vascular tissue development as well as in senescene,pollination,and sex determination[5].It is also employed as a controlled response to different biotic and abiotic stimuli[6,7].The hypersensitive response(HR)during the incompatible plant-pathogen interaction may be the most typical defence-related PCD process in plants[8].The PCD can be induced at the site of pathogen invasion as an attempt to isolate the pathogen and prevent it spreading to non-infected parts of the plant.Besides HR,plant also respond to a variety of externally added inducer by initiating PCD.These include elicitors(N-acetylchitooligosaccharides,chitosan)[9,10],signaling moleculars(hydrogen oxide, nitric oxide)[11,12] and environmental extremes(temperature stress,UV radition)[13,14].Chitosan and its fragments,the natural component of the fungi cell wall,have been shown to act as potent elicitor signals in several plant system.These include the induction of jasmonate synthesis[15],enhancement of cell wall lignification and phytoalexin production as well as to induce salicylic acid and PR proteins[16,17].In the present study,the events leading to the death of cultured tobacco cells treated with various doses of oligochitosan have been investigated.It is thus shown that oligochitosan can induce programmed cell death features in cultured tobacco cells including cell shrinkage,chromatin condensation,suggest the death process may be programmed.Oligochitosan with 85%N-deacetylation and polymerization degree from 2 to 10 was self-prepared by enzymatic hydrolysis method,solubilized(50mg/ml)in deionized water.Suspension cultures of tobacco(Samsun NN)were grown in Murashige and Skoog(MS)medium supplemented with 3%sucrose,0.5μg/ml 2,4-D.The culture were incubated with rotation(120rpm)at 25℃ with 16-hour photoperiod,on a 14 day growth cycle(10%v/v inoculum).After 12 days in culture,the cells were harvested,resuspended in fresh culture medium.All procedures were done under aseptic conditions.Oligochitosan used were sterilized by filtration through a millpore filter(0.22μm).Intracellular H2O2production was measured using 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate( DCFH-DA) as a probe.The cells were stained for 5 min with 2.5uM and then viewed under a fluorescence microscope with an excitation wavelength of 480nm.Cell viability was evaluated as described elsewhere[18],Briefly,cells in suspension culture were deprived of culture medium and incubated for 15min with 0.05%trypan blue.After several washings with deionized water to remove the excess of the dye,dye bound to dead cells was solubilized in 50%methanol/ 1%SDS and quantified spectrophotometrically by measuring the absorbance at 595nm.Hoechst 33342(HO)and Propidium Iodide(PI)was used to detect cellular change.After different times of treatment,the cells were incubated in the dark with 5μg/ml HO and 5μg/ml PI at room temperature for 30min and 15min respectively,then observed under fluorescent microscopy by using an excitation wavelength of 350nm and 570nm.Oligochitosan dose-dependently inhibited the growth of suspension-cultured cells of tobacco(Figure 1).Growth inhibition was estimated by determining the fresh weight of the cultures after 7 days of exposured to increasing concentrations of oligochitosan.In order to determine whether the antiproliferation effect of oligochitosan in tobacco suspension cultures was due to growth arrest or cell death,we analysed cell viability.Administration of 5～200μg/ml oligochitosan to tobacco cells for 6h and 24h caused cell death,as measured by trypan blue staining.The degree of cell death rose with the increase in elicitor concentration and length of treatment.The highest value was observed with 200μg/ml oligochitosan for 24h(about 55.6%),where as 50μg/ml caused about 30.6%cell death after the same time of elicitor incubation.5μg/ml is similar to control tobacco cell cultures exhibited about 5.3%of trypan blue stained cells(Fig-ure 2).Figure 1 Oligochitosan inhibits tobacco cells proliferation.Tobacco suspension(1g/100ml liquid medium),were treated with the indicated concentrations of oligochitosan, after 7 days of treatment, cell proliferation was determined by measuring the fresh weight.Figure 2 Effect of oligochitosan on viability of tobacco cells. Exponential growing cells(1g/100ml liquid medium),were treated with the indicated concentrations of oligochitosan, after 6h (closed bar) and 24h (open bar) treatment.The 100% value corresponds to heat treatment (30min 100℃).Data are means ±SD of three independent experiments.To further determine the nature of the cell death induced by oligochitosan,we analyzed the occurrence of the main PCD hallmarks recognized for plant cells such as morphological changes,nuclear morphology,and DNA fragmentation,focusing our attention on the concentration of 50μg/ml.Under light microscopy control cells showed a well defined structure with round nuclei, while oligochitosan-treated cells were found to undergo various progressive morphological changes.Cells treated for 24h with 50μg/ml,oligochitosan showed a cell disorganization with a gradual condensation of the cytoplasm and a consequent detaching of the plasma membrane from the cell wall(Figure 3 E).Different degrees of cell disorganization were found coexist,indicating a different sensitivityto the elicitor molecule in an asynchronized cell population.Treatment with 200μg/ml led to highly collapsed cells after 24h.Figure 3 Chromatin condensation and cytoplasm shrinkage induced by oligochitosan for 24h in tobacco cells. Aliquiots of both control (A,C) and oligochitosan-induced(B,D,E) cells were collected ,stained with Hoechst 33342(A,B) and Propidium Iodide(B,D),analyzed by fluorescence microscopy, or stained with trypan blue(E), and visualized under light microscopy. Pictures represent typical examples.To further investigate the cellular changes induced by oligochitosan a double staining of cells with HO/PI dyes were carried out.This staining allows the simultaneous detection of the early stages of apoptotic cells(HO+ and PI- nuclei)and of late apoptotic(HO+ and PI+ nuclei)or necrotic cells(mainly HO- and PI+ nuclei).As showen in Figure 3, Nuclei of tobacco control cells exhibited a large central nucleolus surrounded by uniformly stained chromatin,whereas the chromatin had a granular appearance with lobated nuclei in cells after oligochitosan treatment,resembling those observed during apoptosis in animals cells.Taken together the present data are suggestive of the induction by 50μg/ml oligochitosan of a cell death pathway showing some PCD-like features recognized for animal apoptosis.In the light of the crucial role played by ROS in PCD,we investigated production of ROS in oligochitosan-induced suspension-cultured tobacco cells by monitoring H2O2 production.Generation of H2O2,measured by following the fluorescence of the dye 2′,7′-dichlorofluorescin produced from the cell-permeable non-fluorescent probe 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate( DCFH-DA)in the presence of H2O2.Fluorescence occurred in the majority of cells immediately after oligochitosan treatment,as shown in Figure 4,whereas production of ROS in control cells was negligible.Figure 4 Production of H2O2 in tobacco cells induced by oligochitosan. The cells were stained with DCFH-DA.and H2O2 production was visualized by fluorescent microscopy as described in "Materials and Methods." Pictures represent typical examples.Plant cells can activate their intrinsically programmed cell death when respond to a variety of extracellular stimulus.This process may be related with plant resistance[1].Oligochitosan has been shown to be a potent elicitor,in this paper tobacco suspension cell cultures treated with exogenous oligochitosan showed some programmed cell death features including cell shrinkage,chromatin condensation,suggest the death process may be programmed.By contrast to the degradation of DNA to nucleosomal fragments observed in several plant PCD process,no detectable DNA ladder was observed in tobacco cells undergoing cell death in the considered time interval.Anna and his coworkers found that chitosan can induce programmed cell death in soybeans,and they do not observe DNA ladder either[10].Nevertheless,the lack of apoptotic bodies in plants is not surprising,if their fuction is to facilitate phagocytosis of their contents by neighboring cells.There is no way for typical apoptotic bodies to pass through the cell wall[19].Plants have an arsenal against the invasion of a broad array of environmental microorganisms.These include preexisting structure and chemical barriers as well as induced-defenses.Plants can combined different kinds of weapons to deal with enemies.Although PCD is a kind of death,it is still an active defense-related process which under plants control.Tobacco cells treated by oligochitosan produce ROS.This phenomenon has been reported already for cells subject both to pathogen attack or to abiotic stress[21,22].Oligochitosan may trigger the death program,which involve the alter of cellular redox homeostasis.It should be noted that in the cascade of events leading to cell death,the cellular level of ROS is critical.A threshold level of ROS is required to activate the signal transduction pathway that result in PCD,but at high doses,the process is subverted and death occurs rapidly by necrosis[23].These data are suggestive of the induction of PCD pathway depending on the amounts of ROS accumulated in given cells.On the whole our data suggest that tobacco cell suspension can trigger cell death program shared features with animal apoptosis when responded to oligochitosan,and it may be a kind of plant defense mechanism.