稻曲病Usitilaginoidea vriens是影响水稻产量及品质的重要穗部病害。稻曲病厚垣孢子可以侵染水稻，引起稻粒发病[1，2]。陈永坚[2]用室内越冬的厚垣抱子接种水稻种子、芽鞘、苗期叶片、秧苗根系，穗苞均可引起稻曲病的发生，说明稻曲病很有可能在种子萌发或插秧时已侵染水稻，水稻生长后期穗部发病，是一种系统性侵染病害。也有研究认为稻曲病不是系统侵染的病害[3，4]。为进一步明确稻曲病的侵染方式问题，有必要用更严谨的试验加以研究，为稻曲病的防治及抗源筛选提供的理论指导。于2007年8月1日在湖北省宜昌市远安县莲花镇进行套袋试验。莲花镇海拔510m，峡谷地貌，7、8月份日平均温度低于30℃，8月份降雨量超过212mm，是稻曲病的重要疫区，田间累积了大量的厚垣孢子。供试水稻品种为“粤优938”，在水稻圆杆拔节期，用40cm×10cm的纸袋套住单株水稻，以避免田间厚垣孢子的自然侵染，套袋共计68穗，于水稻乳熟期回收套袋稻穗并逐一检查稻曲病的发病情况。1.2.1 供试菌源 将4℃保存的2006年中稻“粤优938”上采集的稻曲球粉碎后，用2%的蔗糖溶液配置为厚垣孢子悬浮液A，置于28℃的培养箱（LRH-250型，广东省医疗器械厂）中保存24h备用；将2007年采集的早稻“金优402”上的稻曲球，粉碎后用2%的蔗糖溶液配置为厚垣孢子的悬浮液B，过滤后加入少量土温-20，在涡漩振荡器上振荡5分钟，在28℃条件下保存24h。以上厚垣孢子悬浮液在100×显微镜下一个视野内有约1000个厚垣孢子。1.2.2 供试水稻 2007年5月9日将水稻种子“粤优938”在自然日光下暴晒8h后用杀菌剂浸泡72h，然后置于培养皿（φ=9cm）内在28℃培养箱（LRH-250型，广东省医疗器械厂）中催芽，72h后播种育苗，2007年6月8号移栽插秧。1.2.3 方法 试验地点位于湖北省农科院网室内，网室周边农田环境中没有稻曲病疫情发生。试验用土壤经200℃电热鼓风干燥箱（HN101-1型，南通沪南科学仪器有限公司）灭菌1h后，分装入瓷盆（φ=25cm，h=32cm）中备用，瓷盆置于聚乙烯薄膜棚（长×宽×高=4×3×1.5m）内，棚顶敞开，用遮阳黑网覆盖。供试水稻做作以下处理：1）种子带菌：经消毒后的种子催芽时用少量厚垣孢子液A浸泡，2007年6月8日移栽入装有无菌土的瓷盆中。2）根部带菌：年6月8日插秧时，用清水洗净秧苗根部，在厚垣孢子液A中浸泡8h后移栽入装有无菌土的瓷盆中。3）穗期接种：2007年9月4日下午6时，将处于破口或杨花初期的水稻用手提猴头喷雾器在穗部喷雾接种厚垣孢子液B，喷雾后用聚乙烯薄膜将稻穗封闭保湿48h。4）不做任何接种处理。以上每处理2个瓷盆，每瓷盆内3兜水稻，分蘖后期每瓷盆内水稻有30～40株。水稻生长期正常管理，同时在水稻孕穗期以后，每天喷水两次，保持环境的湿度，同时观察记录稻曲病的发病情况。田间套袋试验结果：在水稻乳熟期回收的68个套袋稻穗中发病稻穗有38个，病穗率为55.9%，按照唐春生[5]的病情分级标准，病情指数为24.58。网室盆栽试验结果：在水稻灌浆初期，浸根处理的水稻首先发病，稻粒内外颖壳接缝处出现白色的菌丝团，逐渐长成白色球状物，形成稻曲球，4d后露出黄色的厚垣孢子，厚垣孢子颜色由鲜黄色逐渐转暗。浸根处理发病一个星期后种子带菌及喷雾接种处理都开始出现稻曲球。种子带菌、根部带菌及破口期喷雾接种带菌的病穗率分别为：25.0%、1.6%、5.8%。王国良[1]认为稻曲病厚垣孢子主要在水稻破口前1～4天至破口时从水稻柱头侵入引起发病。本次田间套袋试验中，在水稻圆秆拔节期用纸袋隔离了田间厚垣孢子的自然侵染，但后期调查病穗率仍高达55.88%，说明稻曲病厚垣孢子在水稻生长早期可能已被上年累积在田间的厚垣孢子侵染。在网室试验中对土壤及种子都进行了严格消毒，土壤中无自然存在的稻曲病厚垣孢子；试验中对照没有发病排除了种子自身带菌的情况。在水稻育秧及移栽以后的生长阶段都实施了隔离措施，避免了未知自然侵染对结果的干扰。试验中无论是水稻营养生长期还是生殖生长期接种，在水稻生长后期都出现了稻曲病粒，而且试验结果以厚垣孢子接种水稻种子的发病率最高，进一步说明了厚垣孢子在水稻生长早期侵染的可能性。试验中接种水稻种子所用的厚垣孢子源于2006年的中稻稻曲病粒，穗部接种菌源是2007年早稻病粒，说明上茬水稻上的稻曲病厚垣孢子可能是田间的重要侵染源。以上两试验结果表明稻曲病厚垣孢子侵染水稻的方式至少包括两种：1）系统侵染：土壤中或依附于种子表面的厚垣孢子，在水稻种子萌发初期侵入水稻胚内或在插秧时侵染水稻根部，灌浆期出现穗部病症；2）局部侵染：在水稻孕穗期，直接侵染穗部，灌浆期发病，而且以系统侵染为主要侵染方式。因此郭荣华等根据水稻穗部接种的结果及王国良的试验结论认为稻曲病不是系统侵染病害值得商榷。王疏等[6]用Nested PCR方法成功检测出水稻生殖生长期稻曲病在植株茎秆、穗部的分布特征，为研究稻曲病的侵染提供了分子生物学方法。故对于本次试验中水稻材料，可以用分子生物学手段检测水稻不同生长期稻曲病菌在水稻根部、茎秆、叶片及穗部的分布情况从而进一步明确稻曲病的侵染方式。

菌核病为我国油菜三大病害之首，严重影响油菜的产量和品质，目前通过使用化学农药等措施对其进行防治，但是效果不很明显，且长期使用化学农药会造成对环境的严重污染。所以利用植物自身诱导抗病性对菌核病进行防治是现在农业生产中的新趋势。植物诱导抗病性是植物抵御病害侵袭的重要机制之一，具有作用效果明显，广谱性及环境友好等优点，作为一种经济有效的抗病策略，在农业可持续病害防治中具有广阔的应用前景，日益受到人们的关注。我们实验室开发研制的生物农药中科六号（壳寡糖）在田间及温室实验中被证实可诱导烟草等作物对相应的病害产生防治作用[1]；田间使用中科六号可减轻油菜菌核病对油菜的影响，故本文中利用植物生理生化方法进行温室实验及生化实验，初步探讨壳寡糖诱导油菜抗菌核病的作用机制。1.1.1 供试药剂 壳寡糖（oligochitosan、COS），脱乙酰度>95%，聚合度为3-10，由中国科学院大连化学物理研究所研制；配制成50μg/ml使用。1.1.2 供试植物 甘蓝型油菜沪油15（Brassica napus L.）温室中培养至4～6片叶期。1.1.3 供试病原菌 油菜菌核病病原菌 核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）本实验室保存。1.2.1 实验设计 为考察接菌前不同时间壳寡糖预处理对诱抗作用的影响，分别在接菌前0～4天处理油菜植株。新鲜配置的50μg/ml壳寡糖溶液喷雾油菜植株，每株取两片叶子，确保其正反面均润湿，确保其他叶片未被喷上壳寡糖溶液。1.2.2 油菜菌核病接种方法 保存的菌核用70%乙醇浸泡30s，1%的升汞消毒10min，无菌水冲洗3次后，接种于PDA（potato dextrose agar）培养基中。在25℃下暗培养3～5天，待菌丝长满培养皿后即可进行接种。接种试验之前，先将4～6片叶期油菜植株喷上雾状水珠，用打孔器将菌丝截成直径为0.15cm大小的菌丝琼脂块，将有菌丝的一面与壳寡糖预处理的油菜叶片接触，每株取一片叶子，每片叶子上放一块菌丝琼脂块，然后用保鲜膜盖上，再喷一次雾状水珠，保持温度20℃左右，接种后每天喷一次水。1.2.3 病情指数调查方法 在接菌后第五天根据病斑占叶片面积比例调查病情指数，分级标准为：0=没有病斑；1=病斑面积占叶面积11%以下；2=病斑面积占叶面积11%～30%；3=病斑面积占叶面积31%～50%；4=病斑面积占叶面积51%以上。1.3.1 粗酶提取 取提前三天壳寡糖预处理植株进行试验，以正常、壳寡糖处理不接核盘菌和未经壳寡糖预处理接核盘菌的植株为对照。每个试验点选取4株植株，每株取系统叶和处理叶各一片，迅速放入液氮中保存。取样叶1.4g，10.0ml含5mmol/L巯基乙醇的硼酸缓冲液（0.05M，pH 8.8），加入0.5g PVP和石英砂在研钵中研磨，在冰水中研磨成浆。10000r/min 4℃离心10min，上清液即为酶液。考马斯亮蓝法测定总蛋白含量。1.3.2 脂氧合酶（LOX）活性测定 0.1ml粗酶液与3ml 0.20mM亚麻酸溶液混匀后放入30℃水浴中反应，监测5min后OD234变化值，酶活由以下公式计算：（A234末-A234初）/0.001/总蛋白含量（mg）。用滤纸片法在PDA培养基平板上进行抑菌试验，在培养基平板正中央接0.15cm大小的核盘菌菌丝琼脂块，打孔器取直径5～6mm的滤纸片，在无菌条件下浸泡壳寡糖溶液均匀后放置平板上，每皿放置5点，其中一点为对照即浸无菌水，另设不放滤纸片的培养皿平板为阴性对照，观察不同浓度处理滤纸片后其周围病菌生长状况，与对照相比，经72h恒温培养后，根据抑菌圈大小判断抑菌效果。壳寡糖溶液浓度50mg/kg，200mg/kg，500mg/kg，1000mg/kg。依据田间试验诱抗效果取最佳浓度50μg/ml进行温室试验，试图寻找防效最好的预处理时间点。对照植株在12h时就发病明显，96h后叶片枯萎。而经壳寡糖预处理者接核盘菌后12h内症状不明显，24h时产生病症，120h后叶片出现枯萎现象（图1），说明壳寡糖处理能延缓菌核病发病，壳寡糖预处理的植株都表现出一定的抗菌核病的能力接菌（表1），提前三天（72h）预处理有最佳效果，在120h时防效为54.60%，试验结果显示防效可达120h以上。图1 壳寡糖提前三天预处理后油菜接菌核病后表型变化（0h，12h，24h，48h，120h）Figure 1 Appearance of 72h before COS pretreated B.napus leaves challenged with S.sclerotiorum.（0h，12h，24h，48h，120h）预处理时间病情指数（%）防效（%）022.91—提前24h15.6231.8提前48h14.5836.35提前72h10.4154.60提前96h12.5045.44表1 不同时间壳寡糖预处理对油菜菌核病的影响Table 1 The resistance of COS pretreated B.napus to S.sclerotiorum不同处理后油菜植株LOX的活性变化如图2所示。处理叶在只接菌和COS预处理后接菌情况下，72h小后活力提高，而COS处理的植株96h后活力才提高，且COS处理后的植株LOX活力高于只接菌者。在系统叶中获利变化更明显，在48时有一个峰值，96h水平又明显提高一个途径使SOD酶活升高。这些复杂现象说明在油菜中COS可通过多种途径诱导LOX活力升高。图2 壳寡糖和核盘菌引起的LOX酶活力变化 （A）处理叶 （B）系统叶Figure 2 Effects of oligochitosan and S.sclerotiorum on activities of LOX enzymes in B.napus leafs.（A）Treat leafs （B） System leafs如表2所示，低浓度壳寡糖对核盘菌的直接抑制作用不明显。壳寡糖浓度（mg/kg）抑菌圈直径（cm）壳寡糖浓度（mg/kg）抑菌圈直径（cm）0—5000.34±0.0550无抑制10000.75±0.11100无抑制表2 不同浓度壳寡糖对核盘菌的抑菌圈直径Table 2 The inhibitory diameter of S.sclerotiorum by different concentration COS壳寡糖作为近几年研究较多的一种植物诱抗剂，已经被广泛应用于烟草、棉花、油菜等作物生产中。然而其作用机制尚不明了，本文首次进行了壳寡糖对油菜抗菌核病的研究。发现使用50μg/ml的壳寡糖溶液预处理油菜植株，可以提高其抗菌核病能力，其抗性可持续96h以上，防效可达到54.60%。防治效果虽然没有化学药剂作用明显[2]，但与其他诱抗剂效果相当[3，4]，在环境友好前提下具有良好的防治效果。壳寡糖对核盘菌的生长没有显著抑制作用，于汉寿等人也发现壳聚糖对核盘菌的直接抑制作用也不明显[3，5]，说明喷施壳寡糖使油菜对菌核病产生抗性主要是因为壳寡糖诱导油菜产生了系统抗性，而不是来源于壳寡糖对菌核病的直接作用。提前三天预处理的植株有最高防效，说明壳寡糖诱导对菌核病的抗性可能有一个响应和滞后期，Molloy等人[6]报道壳寡糖诱导胡萝卜防治菌核病的最佳处理期也是接菌前三天，说明这种现象是广泛存在的。脂氧合酶（LOX）在植物抗胁迫响应时扮演重要角色[7]，脂氧合酶可催化多不饱和脂肪酸转化为氢过氧化物，并最终生成重要的植物抗性反应信号分子茉莉酸（JA）。Kim等人[8]报道LOX酶水平可以被JA诱导升高，我们的实验结果说明壳寡糖可同时诱导油菜处理叶和系统叶中LOX酶活性升高，揭示壳寡糖可能是通过JA酸途径诱导植物产生抗病性的，这与我们之前利用基因芯片得出的结论相吻合[9]，但具体的信号转导网络仍有待进一步研究。

Keywords:Magnaporthe grisea;pathogenicity;T-DNA insertional mutants;gene function稻瘟病菌[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr.，无性世代为Pyricularia grisea（Cooke）Sacc.]侵染水稻引起的稻瘟病是水稻“三大病害”之一[1，2]，严重限制世界水稻产量，但迄今为止对其致病性及其变异的机制了解得仍然不够透彻。已知水稻与稻瘟病菌之间的特异性互作，符合Flor提出的“基因对基因”关系假说[3]。对稻瘟病菌无毒基因的研究，将有助于进一步了解稻瘟病菌致病性变异的机制以及水稻与稻瘟病菌之间分子水平特异性互作的机制。目前，通过遗传分析或分子标记技术，已鉴定了至少30个稻瘟病菌无毒基因[4～7]，其中仅有5个无毒基因（PWL1、PWL2、AVR1-CO39、AVR-Pita、ACE1）被克隆[8～12]。此外，稻瘟病菌的侵染过程是一个错综复杂的循环过程，涉及一系列形态结构与生理生化的变化，故而除了无毒基因之外，与稻瘟病菌致病过程有关的基因的研究也是研究者关注的焦点，目前已经克隆和分析了包括MPG1，CPKA1，PTH11，PMK1，MPS1，MAGB，MAC1，PDE1，PSL1，TPS1等40余个参与稻瘟病菌生活史各个阶段的功能基因[13，14]。稻瘟病菌基因组全序列测定已经完成[15]，伴随着生物信息学的飞速发展，进一步以功能基因组学的研究方法从全基因组水平研究水稻与稻瘟病菌之间特异性互作的分子机制、诠释关键基因的功能已经成为解决持久抗瘟问题的关键所在。本研究正是通过接种筛选本实验室已建成的稻瘟病菌菌株FJ95054 B T-DNA插入突变体库，获得致病性变异稳定的突变体，运用TAIL-PCR方法获得了突变体被T-DNA标记的侧翼序列，并通过一系列表型分析、分子生物学实验及生物信息学分析初步分析了T-DNA插入区域的基因功能，为进一步获得相关病菌小种的无毒基因或与致病性相关的基因奠定良好的基础。稻瘟病菌菌株FJ95054B，是本研究的野生型对照菌株，由本实验室从福建田间单孢分离得到的菌株；供筛选的突变体菌株，是随机从本实验室已建成的稻瘟病菌菌株FJ95054B T-DNA插入突变体库中抽取的。供接种筛选的水稻品种CO39近等基因系：C101LAC Pi-1（t）、C101A51 Pi-2（t）、C104PKT Pi-3（t）、C101PKT Pi-4a、C105TTP-4L-23 Pi-4b及感病对照CO39，由国际水稻研究所提供。稻瘟病菌菌株的活化、扩大培养及产孢方法参照王宝华等[16]，育苗及接种方法参照张学博等[17]。接种后8～10 天，采用目测法调查并记载各品种水稻叶片上的病斑反应型。病斑反应型的记载标准参照Valent等[18]的方法，具体分级标准如下：0级：无病斑；1级：只有针尖大小的褐色斑点（病斑直径可达0.5cm）；2级：直径约0.5～1mm褐色病斑，病斑有明显黄褐色中心；3级：直径约为2mm的褐色眼状病斑，中央灰色，边缘褐色；4级：长约3～4mm中等大小的灰色梭形病斑，边缘褐色；5级：病斑达到最大（CO39的眼状病斑最长约为5mm），甚至多个病斑连片，叶枯死，如出现暗绿色急性病斑或叶节瘟也属于这一类型。其中，0～2级记为抗病反应，3～5级记为感病反应。参考李宏宇方法[19]，观察所获得突变体的形态特征及其生长发育过程，记录菌落直径、产孢量、孢子萌发率、附着胞形态和形成率以及洋葱表皮侵入情况。稻瘟病菌基因组DNA的提取参照何月秋方法[20]。TAIL-PCR反应使用的T-DNA左、右边界嵌套引物为：LB1：5'-GGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCATG-3'；LB2：5'-CATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCT-3'；LB3：5'-GAATTAATTCGGCGTTAATTCAGT-3'；RB1：5'-GGCACTGGCCGTCGTTTTACAAC-3'；RB2：5'-AACGTCGTGACTGGGAAAACCCT-3'；RB3：5'-CCCTTCCCAACAGTTGCGCA-3'。使用的随机引物为AD7：5'-TG（A/T）GNAG（A/T）ANCA（G/C）AGA-3'；AD9：5'-TCGTTCCGCA-3'；AD12：5'-（A/T）AGTGNAG（A/T）ANCANAGA-3'。以上引物由上海生工生物工程服务有限公司合成。10×PCR Bufer、dNTP、rTaq酶均购自宝生物公司（TAKARA）。TAIL-PCR反应程序参考文献[21]。将TAIL-PCR第2、3步扩增产物用0.5×TBE制备1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳电压为5 V/CM。电泳结束后，将凝胶放入含EB的0.5×TBE 中染色20～30min，用紫外透射反射仪观察并照相记录。TAIL-PCR扩增产物通过电泳分离后，回收目的片段，纯化后与pGEM-T Easy Vector（购自Promega公司）连接；连接产物通过热激转化到DH5α感受态细胞中，通过蓝白斑反应初筛转化子；采用碱裂解法少量提取转化子中的质粒DNA，通过PCR及酶切鉴定，挑选。将含正确插入的转化子的克隆，送由上海鼎安生物科技有限公司测序。测序获得的序列去除T-DNA载体序列后，将剩余的序列与GenBank数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）、稻瘟菌基因组数据库（http：//www.broad.mit.edu/annotation/fungi/magnaporthe/index.html）进行Blast比较分析及相关生物信息学分析，以推断T-DNA所插入的基因及其可能的功能。此外，应用SignalP 3.0 server（Http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）推断所获得的基因序列中是否含有信号肽（signal peptide，SNP）；应用Pfam（http：//www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/）推测基因编码的蛋白可能的结构域；应用TMHMM-v 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测基因编码的蛋白可能的跨膜结构域；应用Protcomp-v 6.0（http：//sun1.softberry.com/berry.phtml）对基因编码的蛋白质进行亚细胞定位，该软件可将蛋白质按细胞核、质膜、胞外分泌、细胞质、线粒体、内质网等归属进行划分；应用TargetP-v 1.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）进一步确定预测蛋白的亚细胞定位，其可将蛋白质的定位归属于线粒体、叶绿体、胞外分泌以及其他亚细胞定位。将随机选取的60个突变体与野生型菌株FJ95054B分别接种在国际水稻研究所提供的CO39近等基因系的6个水稻品种上，即C101LAC Pi-1（t）、C101A51 Pi-2（t）、C104PKT Pi-3（t）、C101PKT Pi-4a、C105TTP-4L-23 Pi-4b、CO39，每个突变体都进行3个平行以上的接种试验。接种后发病情况显示：野生型菌株FJ95054B对Pi-1（t）、Pi-2（t）、Pi-4a均无致病性，对Pi-3（t）、Pi-4b、CO39致病，而在随机选取的突变体中有3个突变体的致病性发生了稳定的变异，如表1、图1所示。其中，突变体2t-2 T940024501对水稻品种Pi-2（t）从无毒转变为有毒，突变体T940084501和T940086501在水稻品种CO39上的致病性减弱。菌株号IsolatesC101LACPi-1（t）C101A51Pi-2（t）C104PKTPi-3（t）C101PKTPi-4aC101TTP-4L-23Pi-4bCO39FJ95054B（WT）RRSRRS2t-2T940024501/++////T940084501/////—T940086501/////—表1 稻瘟病菌T-DNA插入致病性突变体接种CO39近等基因系的发病情况*Table 1 Virulence of T-DNA insertional pathogenicity mutants on CO39 NILs稻瘟病菌侵染过程中的任何一个环节被破坏均会导致致病性减弱或丧失，因此，对致病性减弱的突变体进行相关表型分析，有助于了解其致病性减弱的原因。筛选出的两个致病性减弱突变体的生长发育变化情况如表2所示。与野生型FJ95054 B相比，两个突变体均表现出生长速度减缓、单位面积产孢量显著减少、孢子萌发率和附着胞形成率降低的性状（在α=0.05水平上差异显著）， 这些都可能是造成突变体致病性减弱的原因。图1 稻瘟病菌致病性突变体的变化情况Figure 1 Pathogenicity of mutants of M.grisea compared with wildtype FJ95054B菌株Isolate菌落直径Colonydiameter（cm）产孢量Sporulation（105spores/cm2）8h孢子萌发率Percentageofsporegermination8hpi（%）16h附着孢形成率Percentageofappressoriumformation16hpi（%）95054B（WT）5.20±0.100.7499.0693.68T-9400845014.17±0.030.001287.9073.17T-9400865014.22±0.070.003383.8963.69表2 稻瘟病菌致病性减弱突变体的生长发育变化Table 2 Morphology and development of pathogenicity-decreased mutants of M.grisea此外，在洋葱表皮侵入实验中，野生型FJ95054B侵入正常，能形成正常的附着胞以及侵染栓，并能观察到菌丝在洋葱细胞内广泛蔓延。相比之下，突变体T940084501的孢子能够形成附着胞，但随后并未形成侵染栓侵入，未发现菌丝在洋葱细胞内蔓延；而突变体T940086501的部分孢子能够形成附着胞，但同样未能形成侵染栓侵入，也未发现菌丝在洋葱细胞内蔓延，还有部分孢子甚至不会形成附着胞。这些都可能是其致病性减弱的原因。实验结果如图2所示。图2 稻瘟病菌致病性减弱突变体的洋葱表皮侵入实验结果Figure 2 The results of onion penetration assays of pathogenicity-decreased mutants of M.grisea使用右边界嵌套特异引物RB与随机简并引物AD7组合，扩增出了突变体2t-2 T940024501的T-DNA侧翼序列（如图3A所示）；使用左边界嵌套特异引物LB与随机简并引物AD9组合，扩增出了突变体T940084501的T-DNA侧翼序列（如图3B所示）。突变体T940086501的T-DNA侧翼序列通过TAIL-PCR反应尚未获得。通过在稻瘟菌基因组数据库进行的比对分析，结果显示突变体2t-2 T940024501 T-DNA侧翼序列中的117～591 bp区段与稻瘟病菌基因组supercontig5.183的776534～777008 bp同源（同源率98%）， T-DNA 插入位点位于基因 MGG_07927.5 的外显子区，该基因位于Chromosome/Linkage GroupⅢ，编码一个假定蛋白（ hypothetical protein）， 该蛋白属于Glyco-syl hydrolases family 18（糖基水解酶家族18）。图3 TAIL-PCR第二步和第三步产物的电泳图谱Figure 3 Electrophoresis patterns of secondary and tertiary TAIL-PCR products（secondary and tertiary products of the same isolate are loaded side by side）分别利用SignalP 3.0、Protcomp-v 6.0、TMHMM-v 2.0、TargetP-v 1.1以及Pfam对该基因编码的蛋白进行分析。首先通过Signal IP 3.0预测，并不包含信号肽结构；继而经TMHMM-v 2.0预测，不含跨膜结构；通过Protcomp-v 6.0和TargetP-v 1.1分析表明，含有胞外分泌信号，是一种胞外分泌蛋白，在胞内无定位。另外，Pfam分析结果表明，该基因可能具有某种糖基水解酶活性。目前仅知该基因被T-DNA阻断后，突变体菌株对水稻品种Pi-2（t）从无毒转变为有毒，至于其在病原菌致病过程中的具体功能尚需通过进一步的基因敲除和功能互补实验加以确定。至于突变体T940084501的T-DNA侧翼序列，在稻瘟病菌基因组数据库中未比对到其同源序列，而在GenBank数据库中同样未比对到与稻瘟病菌相关的同源序列。由于该序列可能是FJ95054B菌株的特异序列，拟根据该序列扣除与载体有关序列及引物序列后的剩余序列设计引物，筛选FJ95054B BAC文库。对稻瘟病菌无毒基因以及致病过程有关基因的研究一直是了解稻瘟病菌致病性及其变异机制乃至水稻与稻瘟病菌特异性互作机制的关键所在，而研究某一个具体基因的功能最便捷的方法就是对该基因的突变体进行分析，这也正是本研究筛选T-DNA插入所致致病性突变体的初衷所在。获得致病性变异稳定的突变体是本研究的关键之一。本研究通过大量平行、重复实验初步筛选出致病性表型稳定的突变体，随后为避免由于菌株污染而造成的致病性变异的假象，还进一步将所获得的致病性突变体进行单孢分离，将分离的单孢与原菌株一同进行接种实验，结果显示单孢与原菌株的发病情况基本保持一致。这为进一步的分子水平的研究奠定了良好的基础。本研究对所获得的基因的功能还只是做了初步的预测，为了明确其功能尚需要借助进一步的基因敲除和功能互补实验。另外，为了明确致病性变异是否为单基因作用所致，尚且需要对致病性突变体的后代群体进行接种实验和潮霉素抗性分析，通过检测其后代的表型分离比率加以验证。

利用4个抗感杂交组合 （‘富士’ב金冠’ ‘金冠’ב富士’‘嘎拉’ב富士’ ‘富士’בQF-2’） 进行了苹果炭疽菌叶枯病抗性鉴定和遗传分析。结果表明，4 个群体中抗、感植株的分离比分别符合1∶1、1∶1、0∶1和1∶0的理论比值，初步推测苹果抗炭疽菌叶枯病性状受隐性单基因控制，抗病基因型为 rr，感病基因型为 RR和Rr。由此推测供试杂交群体的亲本品种 （系） ‘富士’ ‘金冠’‘嘎拉’ ‘QF-2’ 的基因型分别为rr、Rr、RR和rr。利用207株 ‘金冠’ב富士’ 的杂交后代为试材，构建了抗感基因池用于BSA分析。从HiDRAS和GenBank网站上下载了300 对均匀覆盖苹果染色体组的 SSR 引物，通过在亲本及抗感池中的初步筛选，将产生多态性条带的引物进行群体验证，获得了两个位于苹果15号连锁群上与抗病性状相关的分子标记 CH01d08 和 CH05g05。通过MapMarker 4.0 软件分析，将这两个标记定位于Rgls基因两侧，重组率分别为7.3%和 23.2%。依据苹果基因组 CH01d08 和 CH05g05 标记之间的序列，自行设计了276对SSR引物。经过亲本及抗感池的初步筛选及群体验证，最终筛选出 9 对与 R gls基因位点连锁的分子标记。将表型抗性鉴定结果与标记基因型数据相结合采用 JoinMap ver.4.0软件，完成了SSR标记与Rgls基因位点的连锁图谱。这11个标记覆盖了49.2 cM的遗传距离，最近的标记为 S0405127 遗传距离为 0.5 cM。Rgls基因位点两侧最近的两个标记 S0304673 和 S0405127 之间的物理距离为500kb。以‘金冠’和‘富士’及‘金冠’ב富士’的F1代群体中20株极端抗和20株极端感炭疽菌叶枯病的单株为材料，利用全基因组重测序（whole genome re-sequencing，WGR）技术，结合混合分组分析法（bulked szegregate analysis，BSA）共开发SNP位点3399950个，InDel位点573040个，SNP位点位于内含子上的465317个，位于外显子上的13029个，其中同义变异7330个，InDel位点位于内含子上的108996个，位于外显子上的19957个，其中插入或缺失3或3的整数倍的碱基，不改变蛋白质的编码框的有6928个。在全基因组范围内共得到33个候选的SNP位点及所对应的29个候选基因。通过对△（SNP-index）的筛选，将抗性基因位点快速定位于苹果第15条染色体的2～5Mb的区域内，结合SSR标记定位结果，最终锁定18个SNP位点、30个InDel位点，以及5个候选基因。通过对5个候选基因在接种病原菌后不同时间点的表达量差异及生物信息学分析，结果显示，基因MDP0000686092、MDP0000205432、MDP0000120033为功能未知蛋白，基因MDP0000945764具有CCHC型锌指结构，是丝氨酸/精氨酸富集剪接因子，具有核酸绑定、锌离子结合分子功能，参与RNA剪切生物过程，调节基因产物的表达。基因MDP0000864010具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸盐）NAD（P）绑定区域，属于NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族，具有辅酶绑定功能，可能与鼠李糖生物合成酶1有关。通过qRT-PCR验证，5个候选基因均不同程度的响应炭疽叶枯病病原菌的诱导，是苹果炭疽叶枯病抗病相关基因。通过高分辨熔解曲线 （HRM） 分析技术对SNP 及InDel标记进行验证。对SNP 及InDel引物在亲本和抗感基因池中进行初步筛选，将出现不同分型的引物在分离群体上进行验证，获得了6个SNP 及5 个InDel标记与Rgls基因位点紧密连锁。从中挑选了10 个标记对所检验出的重组个体进行了分析，将 Rgls基因位点定位于标记 InDel4199 和SNP4257之间，范围缩小为58 kb以内。以青岛农业大学苹果试验基地 （山东省胶州市） 栽培的50 个田间栽培品种和品系为试材，利用四个紧密连锁的分子标记 S0405127、S0304673、SNP4236和InDel4254验证了分子标记的可靠性。结果表明，SSR标记 S0405127，S0304673，SNP 标记 SNP4236，InDel标记InDel4254鉴定的准确率分别为 90.0%，94.0%，98.0%，96.0%，其鉴定结果的准确率均达到90%以上，可以应用于田间栽培品种、品系、种质资源以及杂种后代幼苗对炭疽菌叶枯病抗性的鉴定。一是通过对4个杂交组合的F1 群体及4个亲本进行苹果炭疽菌叶枯病抗性鉴定和遗传分析，推断出苹果抗炭疽菌叶枯病性状受隐性单基因控制，抗病基因型为rr，感病基因型为RR和Rr。二是通过300对均匀覆盖苹果染色体组的SSR引物和自行设计的276对SSR引物在亲本及抗感池中进行筛选，得到的多态性标记经作图群体验证，共获得了11个与Rgls基因位点连锁的分子标记，将抗病基因定位于苹果第15条染色体上，并完成了SSR标记与Rgls基因位点连锁图谱的构建。将 Rgls基因位点定位在 SSR 标记 S0304673 和S0405127之间，物理距离为500 kb，与最近的标记 S0405127 的遗传距离仅为0.5 cM。三是开发了与抗炭疽菌基因相关的 SNP 标记和 Indel标记，并对部分SNP 及 InDel 标记进行了验证，将 R gls基因位点进行精细定位，将抗病基因的范围进一步缩小至58 kb，并获得了14 个与抗病相关的候选基因。

苹果 （ Malus pumila Mill.） 是世界上栽培最为普遍的落叶果树之一，有着很强的生态适应性，地域分布极为广泛。中国不仅是苹果属植物的发源地之一，拥有悠久栽培历史和极为丰富的苹果种质资源，也是世界上最大的苹果生产国和消费国，在世界苹果产业中占有重要的地位。近年来，我国苹果栽培面积快速增长，苹果产量和质量得到了稳步提髙。据统计数据显示，2015年我国苹果栽培面积和产量分别达到232 万 hm2和 4300万 t，居世界首位。苹果在调整农业产业结构、增加农民收入、促进地方经济快速发展等方面发挥着越来越重要的作用。病害是制约着苹果产业发展的重要影响因素。其中苹果炭疽病是苹果生产中普遍发生的一种重要病害，包括发生在果实上的苦腐病（Bitter rot of apple） 和主要发生在叶片上的炭疽菌叶枯病 （ Glomerella leaf spot，GLS）。苦腐病又被称作晚腐病，是苹果果实的三大病害之一，多在果实成熟期或半成熟期发病，主要是引起大量落果、果实腐烂，降低了果实的产量和商品价值。而苹果炭疽菌叶枯病是一种流行性很强的病害，由于该病潜育期短、发病快，在外界环境条件适宜的情况下从侵染到发病落叶仅需要3d或者更短的时间，造成树叶大量干枯、脱落，严重时形成二次开花，也侵染果实引起坏死性斑点，不仅导致当季果实产量和品质的下降，而且大大削弱了翌年的树势，严重地威胁着苹果产业的发展。特别是广泛种植于我国各大苹果产区的重要栽培品种 ‘金冠’ ‘嘎拉’ 品种极易感病，尤其是 ‘金冠’ 在世界苹果生产国中 （中国除外） 品种比例最高，这也是选择 ‘金冠’作为苹果基因组测序材料的重要原因。它不仅是生产上的优良品种，同时也是苹果育种的核心亲本 （陈学森，2015），所以炭疽菌叶枯病的侵染不仅仅是对 ‘金冠’ ‘嘎拉’ 等品种的侵害，而可能是对 ‘金冠’ 系、‘嘎拉’ 系苹果的为害。化学药物防治是目前采用的主要防治方法，但成效甚微。所以急需培育出抗病品种从根本上解决该问题，同时也减少了果园化学试剂的使用，降低农药残留，保证果品的安全。但育种实践表明，要实现育种目标，在亲本选择与选配恰当的前提条件下，必须保证每个杂交组合有足够数量的后代群体，至少 3000株 （陈学森，2010），加上果树具有童期长 （6～12 年），基因组高度杂合，杂种后代广泛分离，自交不亲和，许多重要的经济性状是多基因控制的数量性状等特点，使得常规育种工作难度大、周期长。因此利用杂交后代早期选择技术，及早地剔除非目标基因的单株，减少杂种后代的数目，提高筛选效率，减少盲目性是提高育种效率的最实用有效的方法。随着分子生物学技术的快速发展，特别是以DNA多态性为基础的分子标记技术在苹果育种中的应用，大大提高了目标性状早期选择的效率，缩短了育种周期，加快了新品种选育的速率。同时，通过构建高密度分子标记遗传图谱对重要农艺性状基因进行标记定位，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并验证其功能，阐明其作用机制，通过基因工程实现对果树性状的改良。因此，揭示苹果炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，发掘与抗性基因紧密连锁的分子标记，构建精细的抗病遗传图谱对于定位抗病基因，研究基因功能，探索、掌握抗病机制，培育抗病品种有着重要的意义。苹果炭疽菌叶枯病 （ Glomerella Leaf Spot，GLS） 是近几年在中国大部分苹果主产区新出现的一种流行性很强的真菌病害。主要为害苹果叶片，造成病叶早期的干枯、脱落，也侵染果实引起坏死性斑点，导致苹果失去商品价值 （刘源霞等，2015）。该病于1988年首次报道于巴西，导致感病的 ‘嘎拉’ 苹果70%以上的叶片脱落，经鉴定其病原为围小丛壳Glomerella cingulate （Leite et al.，1988；Camilo＆Denar-di，2002；González et al.，1999，2003），为盘长孢状刺盘孢 Colleto-trichum gloeosporioides 的有性态，定名为围小丛壳叶斑病 （ Glomerella leaf spot，GLS），在中国被称为炭疽菌叶枯病。1997—1999年在巴西6个苹果产区均发现了炭疽菌叶枯病，由于‘嘎拉’ 品种是巴西的主栽品种，所以该病严重威胁着巴西苹果产业，成为巴西苹果的主要病害 （Katsurayama et al.，2000；Crusius et al.，2002；Velho et al.，2014）。1998 年在美国田纳西州的两个 ‘嘎拉’果园中暴发了苹果炭疽菌叶枯病，引起大量落叶，这也是美国首次报道苹果炭疽菌叶枯病的发生，随后在佐治亚州和北卡罗来纳州也发现了这种病害 （González，1999，2003）。我国最早于2008 年发现了炭疽菌叶枯病 （王素芳，2009），2010年相继报道了在黄河故道苹果主产区发现了炭疽叶枯病，该病引起 ‘嘎拉’ ‘金冠’ 等苹果的大量落叶。尤为严重的是在 2011 年，据报道江苏丰县、安徽砀山、淮北等地栽培的 ‘嘎拉’ ‘金冠’ 等苹果品种大面积发生叶斑病，导致叶片干枯脱落，严重的造成果树二次开花 （宋清等，2012） （附图1-1）。经鉴定该病为苹果炭疽菌叶枯病，病原为围小丛壳 G. cingulata （宋清等，2012；Wang et al.，2012）。González 等 （2006）通过利用mtDNA-RFLP 对病原菌的甘油酸脱氢酶核苷酸序列进行分析，认为引起 GLS 的病原分别属于尖孢炭疽菌 C. acutatum 和围小丛壳G. cingulata。这两种菌分别归属于尖胞刺盘孢复合群和盘长孢状刺盘孢复合群 （王嶶等，2015）。王薇等 （2015） 的研究明确了在我国引起该病害的病原为果生刺盘孢 （ Colletotrichum fructicola） 和隐秘刺盘孢 （ C. aenigma），均归属于盘长孢状刺盘孢复合群。中国是否存在尖孢刺盘孢复合群的病原，还没有明确的结论。由苹果叶枯炭疽菌引起的苹果炭疽菌叶枯病症状为 （附图1-2）：在幼叶上发病时，初期表现为红至黄褐色或红褐色小点，针尖大小，边缘不规则，病健交界不清晰。在老叶上发病时，初期表现为黑色坏死性病斑，病斑边缘模糊。在7—8月高温高湿或连续阴雨的条件下，病斑迅速扩展，2～3d便可使整个叶片失水、焦枯、变黑、坏死，很快脱落。感病叶片在环境条件不适宜时，病斑停止扩展，在叶片上形成大小不等的枯死斑，病斑周围的健康组织逐渐变黄，叶片呈现花叶状，病重叶片逐渐脱落。病斑的形状多为圆形或椭圆形，也可能形成不规则的形状。病原菌侵染果实时，前期为红褐色小点，然后变为圆形或近圆形红褐色斑点，病斑周围有红褐色晕圈，中间变为灰白色，微凹。在自然环境条件下果实病斑上很少产生分生孢子，与常见的苹果炭疽病的症状明显不同。叶片上的病斑多为直径在 1～2 mm的小斑点，也有少数病斑直径超过1 cm。后期病斑中央产生黑色小点 （分生孢子盘），呈轮纹状排列，病斑上形成大量淡黄色分生孢子堆，当孢子萌发时会在病斑上产生白色丝状物 （宋清等，2012；符丹丹，2014）。苹果炭疽菌叶枯病的病原菌有性世代为 Glomerella cingulata （Stonem） Spauld＆Schrenk，属真菌子囊菌 （亚） 门，球壳目，小丛壳属，围小丛壳菌；无性世代为胶孢炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides （Penz.） Penz.＆Sacc.和尖孢炭疽菌C. acutatum J.H.Simmonds （González，2003）。在PDA 平板上培养的菌落特征为（附图1-2e）：菌落边缘完整，呈规则圆形，气生菌丝呈絮状，比较稀疏，边缘颜色为白色中间为淡灰色。分生孢子堆呈柠檬色或橙色（符丹丹，2014）。在一般情况下，苹果炭疽叶枯病病原菌主要在苹果的休眠芽和枝条上越冬，也可以以菌丝体的形态在病僵果、干枝、果台和有虫害的树枝上越冬。5月在条件适宜的情况下产生分生孢子，成为初侵染源，越冬的子囊壳也是初侵染源之一 （宋清等，2012）。病原孢子可以随着雨水或气流传播，经皮孔或伤口侵染后，进入苹果叶片或果实内。病害发生时，首先形成中心病株，随后迅速的向四周蔓延侵染，可多次侵染，最终造成病害大面积的发生。Wang等 （2015） 的试验结果表明，温度和湿度是炭疽菌叶枯病发生的必要条件。苹果炭疽菌叶枯病病原菌分生孢子萌发的温度范围在15～35℃，最适宜温度为30℃。菌丝生长的温度范围在15～35℃，最适宜温度为25℃。炭疽菌叶枯病病原菌主要依靠雨水传播，病原菌分生孢子的萌发和侵染也需要自由水或高湿环境，而我国北方苹果主产区6—8月气温多在30℃左右，雨水充沛，满足了苹果炭疽菌叶枯病病原菌的传播、侵染和发病条件，是苹果炭疽菌叶枯病病害发生的高峰期。植物虽然在充满多种潜在病原微生物的环境中生长，但是在多数情况下植物并不表现出感病，这表明，植物在与病原微生物共同进化过程中，为了防御病原微生物的入侵，逐渐形成一套天然的免疫系统（Takken et al.，2009；Boller et al.，2009）。研究表明，病原微生物表面存在着一些保守分子，而且很少发生变异，对维持微生物的基本生物学特征非常重要。这些保守的分子特征被称为病原相关分子模式 （Pathogen Associated Molecular Patterns，PAMPs） （Jones and Dangl，2006），例如细菌的鞭毛蛋白 （flagellin）。这些保守的分子并非病原微生物所特有，而是广泛的存在于微生物中（Zipfel et al.，2008），所以它们也被称之为微生物相关分子模式（Microbe-associated Molecular Pattern，MAMPs）。真菌的病原相关分子模式主要包括多聚半乳糖醛酸内切酶、麦角甾醇、木聚糖酶以及细胞壁衍生物葡聚糖和几丁质等；细菌的病原相关分子模式主要包括冷激蛋白、脂多糖、延伸因子 （EF-Tu） 及鞭毛蛋白等，卵菌的病原相关分子模式主要包括 β-葡聚糖及转谷氨酰胺酶等 （Van et al.，2008；Naito et al.，2008）。与之相对应，植物的细胞表面存在着识别病原相关分子模式的模式识别受体 （Pattern Recognition Receptors，PRRs）。P RRs是一类跨膜蛋白，具有高度的灵敏性和专化性，大都是存在于细胞表面的受体激酶或者具有亮氨酸重复序列的受体样蛋白 （LRR-RLP） （Fritz-Laylin et al.，2005）。例如，鞭毛蛋白的识别受体 FLS2 （Gomez-Gomez，et al.，2000；Chinchilla，et al.，2006）、水稻几丁质酶的识别受体CEBiP （Kaku et al.，2006）、延伸因子的识别受体EFR （EF-Tu receptor） （Zipfel et al.，2006）、水稻 Ax21 的识别受体 XA21 （Park et al.，2010）、拟南芥几丁质酶的识别受体CERKl （Miya et al.，2007；Wan et al.，2008）、水稻几丁质酶的识别受体OsCERK1 （Chen et al.，2010）等。在病原微生物与植物表面接触的瞬间，植物通过其细胞表面的PRRs感知病原微生物的 PAMPs，从而识别各类微生物，激活一系列的信号元件，启动植物的先天免疫反应 （Zhang，2010）。这种通过植物的PRRs感知 PAMPs并启动的主动防卫反应被定义为植物的基础抗性 （Basal Disease Resistance），也称为基础免疫 （Basal Immunity） （Boller et al.，2009）。该免疫过程被称为病原物相关分子模式触发免疫 （PAMP-triggered Immunity，PTI），可以激活植物体内的一系列抗病反应，包括激酶的活化、胼胝质沉积、PR-蛋白的表达以及miRNA 的合成等 （Navarro et al.，2008），从而帮助植物阻止了环境中绝大多数病原微生物的入侵 （赵开军等，2011；柏素花，2012；程曦等，2012）。在PTI中，研究最为清楚的 PAMPs 及其相应 PRR 是细菌的鞭毛蛋白以及拟南芥中鞭毛蛋白的识别受体 FLS2 （Flagellin-sensing 2）。鞭毛蛋白是一种构成细菌鞭毛的粒状蛋白。在对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa） 的序列分析中发现，其鞭毛蛋白 N 端存在着一个肽段 （flg22），含有22个氨基酸，具有激发子活性。该区域在革兰氏阴性菌中高度保守 （Felix et al.，1999）。Chinchilla等 （2006）发现在模式植物拟南芥中，鞭毛蛋白的识别受体是富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶 （Leucine-rich repeat receptor-like kinase，LRR-RLK） FLS2。LRR-RLK是一类单跨膜蛋白，通常由富含亮氨酸重复序列的膜外功能区，跨膜区以及胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶区组成。FLS2能特异性识别并结合 flg22。现已证明番茄、烟草以及水稻中的FLS2 同源蛋白均对鞭毛蛋白具有识别功能 （程曦等，2012）。水稻白叶枯病菌 （ Xanthomonas oryzae pv.Oryzae） 的病原相关分子模式（PAMP） 是N末端具有一个硫酸化肽段 （axYS22） 的蛋白 Ax21，由17个氨基酸组成。 axYS22 结构在所有黄单胞菌属细菌中高度保守。而在水稻中能够结合并识别 axYS22的模式识别受体是LRRXII 亚家族的类受体激酶XA21 蛋白 （Lee et al.，2009）。几丁质是大多数高等真菌细胞壁的主要组成成份。源于几丁质的 N-乙酰几丁寡糖是许多植物的PAMP。水稻几丁质结合蛋白 （Chitin elicitor binding protein，CE-BiP） 和拟南芥的受体激酶 （LysM-containing chitin elicitor receptor ki-nase，CERKl） 是典型的真菌病原识别受体。水稻的几丁质结合蛋白是一类跨膜蛋白，带有两个胞外 LysM 基序，能够与几丁质结合，但缺少胞内蛋白激酶区域。这很可能暗示着CEBiP 介导的免疫反应需要其他受体的参与 （Kaku et al.，2006）。拟南芥的受体激酶含有三个胞外LysM基序和一个胞内丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，它能够在体外直接结合几丁质 （Lizasa et al.，2010）。植物通过PRRs识别外来病原微生物的 PAMPs触发 PTI，成功抵挡了大部分病原微生物的侵入，保护宿主免受侵染。然而有少数病原微生物依然能够通过效应子抑制 PTI，从而成功避开宿主的防御，进而展开进一步入侵。效应子对P TI的抑制方式是多样的，一部分效应子可能促进病原物扩散或植物细胞养分渗漏 （Badel et al.，2002），一部分效应子有可能在卵菌及真菌侵染植物细胞并形成吸器外基质的过程中起到了框架结构作用 （Schulze-Lefert et al.，2003），一部分效应子则有可能对P TI过程中的一个或多个成分起到了抑制作用。在植物的许多致病细菌中都具有III型分泌系统 （Type III secretion system，TTSS）。该系统能够使致病细菌直接将效应子送入宿主植物细胞中。细菌效应子常常通过模仿或抑制真核生物的细胞功能来实现病原菌对宿主的侵染。在拟南芥及烟草中，丁香假单胞菌株 DC3000 所分泌的效应子AvrPto以及 AvrPtoB 能够成功的抑制 PTI的防卫反应并促进细菌繁殖。对这两种蛋白结构的分析表明， AvrPto可能作为一种蛋白激酶抑制剂，与FLS2、 BAK1及EFR的激酶区域相互作用，抑制了 PRRs的激酶活性 （Xiang et al.，2008），并干扰了 FLS2-BAK1 复合体的形成 （Shan et al.，2008）。 AvrPtoB是一种类泛素连接酶蛋白，其酶活性与 FLS2 的泛素化及降解有关 （Gohre et al.，2008）。丁香假单胞菌的另一个效应子 HopAI1 是一个磷酸苏氨酸裂解酶，能够使丝裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activatedprotein kinases，MAPKs） MPK3和MPK6去磷酸化，从而实现了对PRR信号的传导终止，抑制了宿主PTI的功能 （Zhang et al.，2007）。病原微生物能够通过效应子的作用抑制宿主的 P TI防卫反应，从而成功的进入宿主体内。病原微生物的效应子是菌种甚至小种所特有的。然而在自然选择压力下，植物也相应的进化出能够特异性的识别这些效应子的受体，在植物细胞内部开启了由效应子触发的免疫反应（Effector-triggered immunity，ETI） （Takken and Tameling，2009）。该免疫主要依靠抗病基因 （Resistance gene，R gene） 所编码的NB-LRR （Nucleotide binding-leucine rich repeat） 蛋白产物起作用，它们能够识别病原菌效应子，激活并介导小种专化抗性。这种抗性通常伴随有局部细胞死亡即超敏反应 （hypersensitive response，HR）。植物 NB-LRR 蛋白是植物细胞内的一类能与核苷酸结合并具有亮氨酸重复序列的蛋白质，是由一个多变的N 末端，C末端的LRR区域及一个NB-ARC结构域构成 （Elmore et al.，2011）。植物识别效应子并导致NB-LRR蛋白构象发生改变，从而将 NB-LRR 蛋白由抑制状态转变为激活状态，进一步诱导下游信号的转导 （Collier et al.，2009），从而实现对病原菌的防御反应。NB-LRR 蛋白对效应子的识别一般采用两种方式：间接识别和直接识别。间接识别大都是由病原效应子诱导特定的宿主蛋白发生修饰，修饰的宿主蛋白再激活 NB-LRR蛋白，完成抗病反应。拟南芥中的 RIN4 蛋白就是一种能够被病原效应子特定诱导的宿主蛋白。该蛋白是多种病原效应子 （ AvrRpt2、AvrRpm1、 AvrB 及 HopF2） 的靶标，在病原效应子的诱导作用下，RIN4蛋白被修饰，从而激活NB-LRR 蛋白，触发下游免疫应答。 Avr-Rpt2对RIN4的修饰作用是通过对RIN4蛋白的直接裂解完成的，从而激活NB-LRR蛋白RPS2介导的 ETI （Axtell et al.，2003）。直接识别是NB-LRR 蛋白与病原菌的效应子直接结合。例如，拟南芥中的RRS1-R 蛋白能够与茄科雷尔氏菌 （ Ralstoniasolanacearum） 的效应子Pop2 直接结合，从而启动了ETI应答 （Deslandes et al.，2003）。通过酵母双杂交实验也证明了亚麻的 TIR-NB-LRR 蛋白能够与亚麻锈病病菌的效应子Avr567相互作用，开启ETI应答 （Dodds et al.，2006）。植物与病原微生物之间相互作用并协同进化的过程被 Jones 等（2006） 总结为 “之” 字形模型 （附图1-3）：这个过程可以分为四个阶段，第一阶段：触发 P TI。植物通过 P RRs识别绝大多数病原微生物的 PAMPs，从而引发基础抗性。第二阶段：抑制 PTI。病原微生物相应的进化出效应子来抑制 PTI，避开宿主的防御，对植物展开再次侵染，此时植物对病原微生物是感病的。第三阶段：触发 ETI。在自然选择压力下，植物进化出能够特异性识别相应效应子的 NB-LRR蛋白，激发防御反应，阻止病原微生物的进一步侵染。第四阶段：避开 ETI。病原微生物通过不同的进化策略，产生新的效应子，展开新一轮的入侵。长期以来，作物的抗病育种主要使用了小种专化性抗病性 （即过敏性坏死反应类型），由于病原微生物生理小种的变异，导致作物抗病性的 “丧失”，缩短了抗病品种的使用年限。而且随着作物产量水平的不断提高，农田生态条件的变化和作物抗性资源的消耗，许多新的病害逐渐显现。再加上抗病性多与不良农艺性状相连锁，所以要培育出优良的抗病品种越来越难。抗病分子机理的研究为作物抗病育种提供了新的发展思路。一是重视 P TI的利用。植物细胞表面的模式识别受体对病原微生物相关分子模式的识别，诱导 P TI，是植物免受病害侵染的第一道防线。因此将 P TI 有效应用于作物抗病品种的选育，有望获得广谱性抗病品种。拟南芥中的受体基因 EFR 能够识别细菌延伸因子EF-Tu。Lacombe等 （2010） 利用农杆菌介导法将拟南芥中的受体基因 EFR 转入到烟草和番茄的基因组中，成功获得了转基因植株。经验证，转入 EFR 基因的植株可以抗假单胞菌属 （ Pseudomonas）、黄单胞菌属 （ Xanthomonas）、拉尔氏菌属 （ Ralstonia） 和农杆菌属（ Agrobacterium） 等不同属的病原细菌。这说明在育种中可以充分利用不同植物的模式识别受体基因来培育出具有广谱性、持久性抗性的作物新品种。二是将 ETI 与 PTI 相结合。植物大多数 R-基因是专门为识别病原微生物效应子而进化的，而病原微生物的效应子是菌种甚至小种所特有的，所以尽管植物ETI 能很强的特异性抵抗某种病害，但是也容易激发病原微生物产生新的效应子而避开原有的 ETI，使抗性消失。如果在利用 ETI 时，结合利用 PTI，便可以达到两道防线共同作用的效果，可以有效地避免大面积推广的抗病品种因 ETI的丧失而造成重大的产量损失。在育种实践中，利用P TI 抗性较好的栽培品种作为育种材料，利用多基因聚合或多基因转化将多个优良抗病基因导入其中，有利于扩大作物的抗病广谱性，改良作物的 ETI 抗性。近等基因系法 （Near-isogenic Lines，NIL） 和分离群体分析法（Bulked Segregant Analysis，BSA） 是获取与抗病基因紧密连锁的分子标记的两种最经典的方法。近等基因系是指仅在目标性状存在差异的两种基因型个体，通过杂交及多代自交或回交分离而获得的群体 （Young，1998）。近等基因系法的基本原理是比较轮回亲本与近等基因系及供体亲本三者的标记基因型。当近等基因系与供体亲本具有相同的标记基因型，但与轮回亲本的不同时，则该标记就有可能与目标基因连锁 （Muehlbauer，1988）。近等基因系的建立一般需要连续自交或回交6～8 代，耗时较长，而且常会导致一些重要基因的丢失或形成连锁累赘，因而限制了它的应用。分离群体分组分析法又称近等基因池法，是从近等基因系法演化而来的，属于双尾分析中的选择 DNA 基因池法 （selective DNA pooling，SDP）。Michelmore等 （1991） 首先利用 BSA 法在没有近等基因系的条件下通过对F2分离群体进行RAPD分析，成功的从100 个引物中筛选出3 个与莴苣霜霉病抗性基因 Dm5/8紧密连锁的 RAPD 标记。该实验的基本原理是：具有相对性状 （如抗病、感病） 的一对亲本杂交，在其后代分离群体中，根据个体表型或基因型分为两组 （如抗病组、感病组），选取两组中相同数量的极端差异个体，提取DNA，并进行等量混合，构建两个相当于近等基因系的基因池 （如抗病基因池、感病基因池），并对两个基因池进行标记的多态性筛选。由于两个基因池在遗传背景上是相似的，表型上的差异就有可能是由于某一目的基因的改变而造成的。因此两池间筛选出的多态性 DNA 标记就有可能是与目的基因连锁的分子标记。将多态性分子标记在后代分离群体上进行进一步验证，就可以分析出多态性标记与目的基因是否连锁以及连锁程度 （廖毅等，2009）。分离群体分组分析法包括基于标记基因型的 BSA 法 （Giovannoni et al.，1991） 和基于性状表现型的 BSA 法 （Michelmore et al.，1991）。前者是根据已有图谱或标记信息对基因进行精细定位，后者是通过对分离群体中就某一性状表现极端差异的个体进行分组，构建两个相对性状的 DNA 池，并筛选与目的基因连锁的多态性标记，实现对基因的初步定位。BSA 法具有许多优点：如原理简单、操作方便、实用经济等，重要一点是克服了许多作物没有或者难以创建近等基因系的限制，所以被广泛应用于质量性状单基因的定位以及数量性状主效基因的定位。2007 年，Korol等对 BSA法进行了优化，在精密仪器的辅助作用下实现了对定位效应较大QTL的定位。许多学者从理论上和实践上都证明了 BSA 法对数量性状基因定位的合理性 （Wang and Paterson，1994；William et al.，1997；Chagué et al.，1997；Hill，1998；Mackay and Caligari，2000；Chantret et al.，2000）。分子标记 （Molecular markers） 是 20 世纪 80 年代以来，继形态标记 （Morphological marker）、细胞标记 （Cytological marker）、生化标记 （Biochemical marker） 三大遗传标记之后，又诞生的一种以 DNA一级序列的多态性为基础的新的遗传标记。分子标记与其他遗传标记的不同之处在于，分子标记能够直接从 DNA 序列上找出差异。因此其具有如下的优点：一是准确性高，不受组织器官、个体发育时期状况、环境条件等因素的干扰；二是检测定位多，几乎遍及整个基因组；三是共显性好，有些共显性分子标记可有效的鉴别出二倍体中纯合和杂合基因型；四是多态性高，无需专门去创造特殊的遗传材料，自然就存在着许多等位变异；五是表现为 “中性” （即无基因多效性），与不良性状没有必然的连锁遗传，也不影响目标性状的正常表达；六是遗传稳定，可靠性强，检测速度快，操作简单。根据分子标记的发展进程，可以将其归类划分为三代分子标记：第一代分子标记以扩增片段长度多态性分子标记 AFLP （Amplified fragment length polymorphism）、限制性片段长度多态性分子标记 RFLP （Restriction fragment length polymorphisms）、随机扩增多态性DNA分子标记 RAPD （Random amplified polymorphism DNA） 为代表。第二代分子标记以重复序列的重复次数作为标记，操作较为简单，易于分型，且为共显性标记，更便于进行遗传分析。其代表性标记为简单重复序列标记 SSR （Simple sequence repeat） 和简单重复序列间扩增标记ISSR （Inter-simple sequence repeat）。第三代分子标记以核苷酸多态性标记SNP （Single nucleotide polymorphism）、插入缺失标记 InDel （In-sertion-deletion）、拷贝数变异标记 CNV （Copy Number Variation） 为代表，在后基因组时代已被大量开发，并被广泛使用。这类标记的最大特点是数量多、范围广、为显性标记、易于高通量分型。SSR （Simple sequence repeat），即简单重复序列，又称微卫星（Microsatellite），是Litt等1989 年提出，Moore等1991 年创立的。由1～6 个核苷酸为单位组成的串联重复序列 （Wang，1994），是 DNA复制和修复过程中，微卫星序列内发生滑链错配或不均等重组时，导致增加或缺失一个或更多的重复单元 （Levinson and Gutman，1987；Richards，1992），广泛分布于植物和动物的基因组中 （Tautz and Renz，1984）。每个SSR两侧具有相对保守的单拷贝序列，这为设计特异引物扩增SSR序列提供了模板。由于扩增产物中基本单元重复次数的不同，就形成了SSR座位的多态性。通常经过SSR引物扩增出来的PCR产物，可以经过聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳进行检测其多态性。SSR分子标记的优点在于信息量大、多态性高、重复性好、操作简单、呈共显性 （Kalia et al.，2011），因此被广泛应用于作物及果树等目标基因的遗传定位、遗传连锁图谱的构建、遗传多样性的检测以及分子标记辅助育种等方面。SSR标记的开发：目前常见的 SSR标记开发的方法包括数据库检索法、构建与筛选基因组文库法、微卫星富集法以及省略筛库法等。其中数据库检索法是开发SSR标记既经济又有效的方法。充分利用现有的DNA序列数据库中的信息，搜索 SSR 序列，可以轻松的获得全基因组的所有SSR引物，省去构建基因文库、杂交、测序等烦琐的工作，节省了大量的时间和财力。随着高通量测序技术的快速发展，使得如GenBank、EMBL/EBI （European Bioinformatics Institute，http：//www.embl-heidelberg.de/）、NCBI （National Center for Biotechnology Information， http：//www.ncbi.rdm.nih.gov/） 以及 DDBJ （DNA Data Bank of Japan，http：//www.Ddbj.nig.ac.jp） 等公共数据库中各物种的基因组序列、转录组序列及EST序列等不断增多。结合在线软件SSRIT （ http：//archive.gramene.org/db/markers/ssrtool） 以及 SSRHunter 等来搜索SSR位点，利用 Primer Premier 5.0 或者利用在线引物设计软件Primer 3.0 （http：//primer3.ut.ee/） 根据位点两侧保守核苷酸序列设计特异性引物。SNP 即单核苷酸多态性，是两个DNA序列中的某个位点由于单个核苷酸的变化而引起的多态性。SNP 标记的优点在于数量多，分布广，相对稳定，易于快速筛查和基因分型。SNP 标记的开发：可以通过多种方式和方法实现对SNP 标记的检测和分析。一是质谱分析法。通过 PCR 扩增后，用质谱进行分析检测。二是HRM分析法。利用高分辨率熔解曲线 （High resolution melt-ing，HRM） 分析方法进行分型检测。三是芯片法。利用 SNP 标记芯片进行分型检测。四是测序法。通过高通量测序手段进行检测 （孙瑞，2015）。SNP 标记的开发主要依赖于含有大量测序序列的数据库，具有速度快、高通量的特点。随着测序技术的发展，特别是全基因组测序，不仅可以从全基因组中获得大量的SNP 位点，而且还可以了解到SNP 位点在基因组中的分布状况，对于我们进一步分析基因的功能及表达提供了更多的可能。基于参考基因组序列的分析方法包括：全基因组重测序 （Whole-genome re-sequencing，WGR）、转录组测序（RNA-seq） 和简化基因组测序 （Reduced-Representation Genome Se-quencing，RRGS）。全基因组重测序是对已知物种基因组序列的前提下所进行的全基因组范围内的测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。优点：快速进行资源普查筛选，寻找到大量遗传变异，实现遗传分析及重要性状候选基因的预测。转录组测序的研究对象为某个体在某一特定的功能状态下所能转录出来的所有 RNA 的总和，检测的是某个体位于编码区的碱基差异。优点是能够降低成本，能够直接检测功能区碱基的序列变化，能够有效的检测分析基因的表达水平，更有可能找到直接与表型相关的 SNP 差异 （Geraldes et al.，2011；Li et al.，2012a）。简化基因组测序是对与限制性核酸内切酶识别位点相关的DNA进行高通量测序。RAD-seq （Restriction-site Associated DNA Se-quence） 和 GBS （Genotyping-by Sequencing） 技术是目前应用最为广泛的简化基因组技术，优点是可以大幅度地降低基因组的复杂程度，简化操作，同时不受有无参考基因组的限制，可快速有效地鉴定出高密度的SNP 位点，从而实现遗传分析及重要性状候选基因的预测。InDel是指父母本之间在全基因组序列范围内存在的差异。一个亲本相对于另一个亲本而言，在基因组中存在着一定数量的核苷酸插入或缺失 （Jander et al.，2002）。InDel标记就是根据基因组中的这些插入或缺失位点，依据一定原则，在其上下游设计一些PCR引物能扩增出包含这些插入缺失位点的碱基片段，成为 InDel标记。基于全基因组重测序的 InDel 标记是遗传标记的一个重要来源，因其具有分布广、密度高、变异稳定、多态性强、基因型判别简单、检测容易等优点，受到越来越多的关注。InDel标记已广泛应用于目标基因的遗传定位、高密度遗传图谱的构建、目的基因的精细定位、生物遗传多样性的分析、种子纯度鉴定及分子标记辅助育种等多方面。Yu等 （2003） 利用InDel标记、RFLP 标记、SSR标记构建了一张向日葵的高饱和度分子标记遗传连锁图谱。Feng等 （2005） 利用日本晴和9311 序列筛选得到的分布于每条染色体的20 对 InDel标记和53 对 SSR 标记，分析鉴定了46份粳稻和47份籼稻的遗传多样性。葛敏等 （2013） 利用生物信息学对玉米全基因组进行扫描，发现可用于开发 Indel分子标记的插入缺失位点，同时成功地运用 Indel分子标记鉴定了玉米杂交种的纯度。Hayashi等将开发的9对InDel标记成功的应用于水稻抗性基因的筛选。分子遗传图谱 （Genetic linkage map） 是不同分子标记在染色体上的位置和相对距离的排列图，遗传图谱上的每个分子标记反映的都是与遗传特征有关的相应染色体座位上的遗传变异和多态性。分子遗传图谱的构建是基于染色体交换与重组的理论，它是分子遗传学研究中的重要领域，是对基因进行定位及克隆的基础，也是遗传育种的重要依据。随着分子标记技术的发展，图谱上标记的种类越来越多，标记的密度也越来越高。起源于 “欧洲苹果基因组作图计划” 的第一张遗传连锁图谱于1994年由 Hemmat等人完成发表。该图谱以56 株 ‘Rome Beauty’בWhite Angel’ 的杂交后代为作图群体，构建了包含 360 个标记的父本和母本两个苹果品种的遗传连锁图 （Hemmat et al.，1994），实现了苹果遗传图谱构建的突破。2003 年，Liebhard 等以 ‘Fiesta’בDiscovery’ 的 267 株 F1 代杂交群体为试材，利用 SCAR、AFLP、SSR、RAPD标记等840个不同类型的分子标记构建了高密度的遗传连锁图谱 （Liebhard et al.，2003）。2009 年，Celton 等利用 93 个‘M.9’בR.5’ 的F1 杂交群体构建了17 个连锁群，包含了224 个SSR标记，42 个 RAPD 标记、18 个 SCAR 标记和 14 个 SNP 标记（Celton et al.，2009）。随着苹果基因组全序列的公布 （Velasco et al.，2010），利用全基因组重测序技术大规模开发 SNP 标记构建高密度遗传连锁图谱成为现实。2012 年，Antanaviciute等完成了以 ‘M.27’בM.116’ F1 代杂交后代为群体，构建了由306个SSR标记和2272个SNP 标记组成的高密度遗传连锁图谱，平均每一个标记间的遗传距离为0.5 cM （Antanaviciute et al.，2012）。同年 Khan 等构建了包含2033个SNP 和843 个SSR共2875个分子标记的苹果整合遗传图谱，总长为1991.38 cM。DNA指纹图谱因具有高度的特异性、稳定的遗传性和体细胞稳定性的特点，因此不受植物组织和器官的种类、生长发育阶段、环境条件等因素的影响，所以在苗期即可对品种进行快速、有效的鉴定，提高了鉴定的准确性和效率。高质量的指纹图谱不仅可以应用于种质资源亲缘关系的分析，遗传多样性的研究，还可以通过对苹果 DNA 指纹图谱的比较分析，从本质上找出生物个体间的差异，实现对苹果栽培品种的鉴别、新品种登记、注册和产权保护。Koller等 （1993） 利用RAPD标记对11 个苹果栽培品种进行了鉴别。Gianfranceschi等 （1998） 利用两对SSR 引物对19 个苹果栽培品种的DNA进行扩增，成功的将 17 个苹果品种区分开来。祝军等（2000a） 应用 AFLP 技术，用筛选出的引物P32M46 绘制了我国苹果生产中常见的 25 个重要品种的 DNA 指纹图谱，通过对该指纹图谱的分析表明，苹果栽培品种在 DNA结构组成上具有较高的遗传多样性。祝军等 （2000b） 还利用AFLP 引物 P44M64 构建了5 个苹果矮化砧木基因型的DNA 指纹图谱，区分了供试的5 个矮化砧木的基因型并确定了他们之间的遗传关系。Liu等 （2014） 利用8 对SSR引物和60个苹果样品 （包括几个栽培品种和 ‘富士’בTelamon’ F1 实生苗）运用品种鉴定图 （Cultivar identification diagram，CID） 策略完成了第一张苹果品种鉴定图谱的构建，并证明了该方法能高效地应用于品种鉴别。分子标记辅助选择育种和基因定位克隆的前提是筛选与目的基因紧密连锁的分子标记。控制苹果重要农艺性状的基因大多属于数量性状由多基因或主效基因控制，受环境因素影响大，并且由于果树的基因高度杂和，更增加了筛选分子遗传标记的难度。目前，研究进展较快，所获得的遗传距离较近的分子标记多来自于单基因控制的质量性状。在苹果抗病性育种工作方面，研究最为广泛和深入的是对抗黑星病基因的研究。Yang 和 Krüger （1994） 首次报道了利用改进的分离分析法发现了一个与苹果抗黑星病基因Vf连锁的分子标记。随后，经过不懈的研究，不同类型的分子标记如 RAP D 标记、RFLP 标记、AFLP 标记、SSR标记等众多与苹果抗黑星病 V 基因连锁的标记被挖掘，与抗病位点连锁最紧密的分子标记的遗传距离仅为 0.5cM （Koller et al.，1994；Durham and Korban，1994；Tartarini，1996；Yang and Korban，1996；Yang et al.，1997；Tartarin et al.，1998；Xu and Korban，2000；Benaouf and Parisi.，2000；Gygax et al.，2004；Dunemann and Egerer，2010；Galli et al.，2010）。在果实品质育种方面，筛选出与控制果皮颜色主基因Rf连锁的分子标记，并将其定位在第九连锁群上 （Cheng et al.，1996；何晓薇等，2009）。与控制果实酸度、果形指数、果肉褐变等性状基因连锁的分子标记都有报道 （王雷存等，2012；Sun et al.，2012）。在矮化密植育种方面，田义柯等（2003） 筛选出一个与柱形基因Co基因位点的连锁距离为8.66 cM的RAPD标记。Moriya等 （2012） 在苹果第十条染色体上筛选出3 个与Co基因位点共分离的分子标记 （Mdo.ch10.12、Mdo.ch10.13 和Mdo.ch10.14），将Co基因定位在196 kb 个碱基区间内。分子标记辅助选择 （Molecular marker-assisted selection，MAS） 是利用与目标性状紧密连锁的分子标记作为辅助手段进行选择育种。MAS可以不用测交或后裔测定，加速遗传改良的速度；独立于环境，增加可靠性；进行育种早期选择，提高育种效率；实验室操作，降低成本；对多基因、多个性状甚至全基因组选择，增加选择效率 （徐云碧，2014）。主要应用于：种质资源的有效鉴定、量化和表征遗传变异 （Tanksley et al.，1989；Gur and Zamir，2004）；对改良目标性状的基因或数量性状基因座 （Quantitative trait loci，QTL） 的定位、克隆和导入 （Peters et al.，2003；Gur and Zamir，2004；Holland，2004；Salvi and Tuberosa，2005）；对遗传变异的操作 （包括鉴定、选择、聚合及整合） （Collard et al.，2005；Francia et al.，2005；Varshney et al.，2005；Wang et al.，2007）；植物品种保护和特殊性、均匀性及稳定性测试过程 （CFIA/NFS，2005；Heckenberger et al.，2006；IBRD/World Bank，2006） 等。MAS在苹果育种中主要应用于重要性状的筛选，杂种实生苗的早期选择，杂交亲本的选配，遗传转化中目的基因的检测等。Tartarini等（2000）报道了利用获得的与抗苹果黑星病的显性单基因Vf紧密连锁的RAPD标记测验了携带该基因个体，淘汰错误率为3%，保留错选率仅为0.02%。Cheng等（1996）利用与控制果色的Thd01基因紧密连锁的RAPD标记，在苹果实生苗发育早期进行了标记筛选，实现了对果色这一特定性状的早期选择，大大减少了人力物力的浪费。由苹果单基因Co控制的柱型性状有利于形成集约高效的现代苹果栽培模式，能够降低生产成本，提高产量。Moriya等（2012）所得到的3个与Co基因共分离的标记Mdo.chlO.12、Mdo.chlO.13和Mdo.chlO.14，对于柱型苹果杂交育种中对群体材料的早期选择、基因的克隆及转化有着重要意义。Nybom等（1990）利用M13作为探针，对64株枫树实生苗进行了DNA指纹验证，通过亲缘关系和系统分类分析，成功的实现了对其中56株枫树实生苗的身份认证。苹果炭疽菌叶枯病是近年来高发且蔓延速度极快的一种真菌病害，目前尚没有有效的药物进行预防和治疗，对于感病的品种，特别是在高温高湿的季节，一旦发病将会带来毁灭性的为害。培育和种植抗病品种是防控植物病害的重要途径之一。随着分子生物学的快速发展，分子标记辅助选择技术逐渐成为植物抗病育种的有效手段。研究苹果对炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，筛选与苹果抗炭疽菌叶枯病基因连锁的分子标记对于抗病基因的定位、构建精细遗传图谱、进行图位克隆、基因功能验证及苹果抗病分子育种有着极其重要的意义。本书采用两个高抗苹果炭疽菌叶枯病品种 （系） ‘富士’ ‘QF-2’ （‘秦冠’ב富士’ 杂交后代中的高抗品系） 和两个高感病品种‘金冠’ ‘嘎拉’ 做亲本配制了4个杂交群体 （‘金冠’ב富士’ F1代 207 株，‘富士’ב金冠’ F1代 95 株，‘嘎拉’ב富士’ F1代262 株，‘富士’בQF-2’ F1代 198 株），采用室内人工离体接种的方法对 F1单株进行了苹果炭疽菌叶枯病的抗性鉴定。首先采用 BSA （bulked segregation analysis，分离群体分组分析） 法和 SSR （simple se-quence repeats，简单重复序列） 分子标记相结合的手段筛选抗性标记，然后通过全基因重测序与BSA相结合的方法筛选与目标基因相关的SNP 标记和Indel标记，并运用高分辨率熔解曲线 （High Resolution Melting，HRM） 分析技术验证 SNP 及 Indel标记，进一步将目标基因进行精细定位，筛选与抗炭疽菌叶枯病相关的候选基因，以期揭示苹果炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，获得与目标基因紧密连锁的分子标记，实现抗性基因定位，为挖掘抗病的关键基因，探索病原菌与抗病基因的互作机制，实现分子标记辅助育种，提高苹果抗病育种效率打下基础。

柿是我国主要果树树种之一，柿树具有寿命长、产量高、收益大、易管理的优点，发展柿树生产对增加农民收入、调整农业产业结构方面具有重要的意义。柿树嫁接后5～6年开始结果，15年后进入盛果期，经济寿命在100年以上。丰产园3～4年开始结果，5～6年进入盛果期。柿根系分布取决于砧木。君迁子作砧木，根系发达，分枝力强，细根多。根系大多分布在10～40cm深土层中；垂直根深达3m以上，水平分布为冠径的2～3倍。柿根系单宁含量多，受伤后难愈合，发根困难，应注意保护根系。根系春季开始生长晚于地上部，一般地上部展叶时开始生长。柿枝条分为营养枝、结果枝和结果母枝。结果母枝是指着生混合花芽的枝条；结果枝是指由混合花芽抽生的枝条，大多由结果母枝的顶芽及其以下1～3个侧芽发出，再往下的侧芽的抽生为营养枝。营养枝是不能开花结果的枝，其上着生叶片进行光合作用制造有机营养物质，其一般短而弱。柿结果枝第3～7节叶腋间着生花蕾，开花结果，着生花的各节没有叶芽，开花结果后成为盲节。柿在平均温度12℃以上时萌芽。新梢生长以春季为主，成年树一般只抽生春梢，生长量较小，幼龄树和生长势旺的树可生长2～3次梢。柿树顶端优势和层性都比较明显，但新梢生长初期先端有下垂性，枯顶后不再下垂。柿树芽分叶芽和花芽两种。花芽为混合花芽。叶芽较瘦小，着生于1年生枝的中下部，萌发后抽生营养枝。花芽较肥大，位于1年生枝的顶部1～3节，萌发后抽生结果枝。柿树枝条顶芽为伪顶芽。枝条基部有两个鳞片覆盖的副芽，常不萌发而成为潜伏芽，其寿命较长。柿树的花芽分化在新梢停止生长后1个月，大约在6月中旬，当新梢侧芽内雏梢具有8～9片叶原始体时，自基部第3节开始向上，在雏梢叶腋间连续分化花的原始体。每个混合花芽一般分化3～5朵花。柿树的花有雌花、雄花、两性花三种类型。一般栽培品种仅生雌花，单生于结果枝第3～7节叶腋间，雄蕊退化，可单性结实。雄花1～3朵聚生于弱枝或结果枝下部，呈吊钟状。柿树在展叶后30～40d,日均温达17℃以上时开花，花期3～12d,大多数品种为6d。柿果实是由子房发育而成的浆果。果实发育过程分为3个明显的阶段:第一阶段为开花后60d以内，幼果迅速膨大，最后基本定形；第二阶段自花后60d至着色，果实停长后或间歇性膨大；第三阶段从果实着色至采收，果实又明显增大。柿的落花落果包括落蕾、落花和落果。开花前落蕾，落花在5月上中旬，部分花脱落。幼果形成后有落果现象，以后2～3周较重，6月中旬以后落果减轻，8月上中旬至成熟落果很少。柿树喜温耐寒。在年平均温度10.0～21.5℃,绝对最低温度不低于-20℃的地区均可栽培，但以年平均气温13～19℃最为适宜。并且甜柿耐寒力比涩柿弱，要求生长期(4—11月)平均气温在17℃以上。冬季低于-15℃时易发生冻害。柿树耐湿抗旱。在年降水量500～700mm、光照充足地方，生长发育良好，丰产优质。由于柿树根系分布深广，故较耐旱，一般在年降水量450mm以上地方，不需灌溉，但在开花坐果期，发生干旱，易造成大量落花落果。柿树喜光，但也较耐阴。一般在光照充足地方，柿树生长发育好，果实品质优良。对于甜柿要求4—10月日照时数在1400h以上。柿树对土壤要求不严，山区、丘陵、平地、河滩均能生长。但以土层深1m、土壤pH值6.0～7.5、含盐量0.3%以下、地下水位在1.5m以下，保水排水良好的壤土和黏壤土为宜。柿树开花前疏花蕾。保留结果枝发育最大，开放最早的花蕾，其余疏除。始果期幼树主侧枝上花蕾全部疏除。甜柿品种果园放蜂或人工辅助授粉；花期喷0.1%硼砂+300mg/kg赤霉素；或用0.3%尿素+0.1%硼砂+0.5%磷酸二氢钾，以提高坐果率。花后35～40d早期生理落果后疏果。首先疏除病虫果、伤果、畸形果、迟花果及易日灼果，保留不受日光直射的侧生果或下垂果，保留个大、整齐、深绿色，萼片大而完整的果实。保留1枝1～2个果，或15～18片叶留1个果。叶片在5片以下的小枝和主侧枝延长枝上不留果。根据柿果用途适期采收。榨取柿漆用果实在单宁含量最高的8月下旬采收；涩柿鲜食品种在果实由绿变黄尚未变红色时采收；制柿饼用果实在果皮黄色减褪呈橘红色时采收；软柿(烘柿)鲜食，在充分成熟、呈现固有色泽而未软化时采收；甜柿品种在充分成熟、完全脱涩、果皮由黄变红色、果肉尚未软化时采收。采收采用折枝法或摘果法。折枝法是用手、夹杆或挠钩将果实连同果枝上中部一同折下。摘果法是用手或采果器将柿果逐个摘下。二者交替使用。采收时轻拿轻放，采后及时剪去果柄，并在分级时将萼片摘去。

菠萝在植物分类学上是凤梨科凤梨属，属于多年生草本植物，菠萝品种分为3类：皇后类、卡因类、西班牙类。目前，我国栽培的主要品种就属于这三大类。栽培品种有皇后、金皇后、菲律宾(巴厘)、纳塔尔、神湾、鲁比等；菲律宾(巴厘)是华南地区主栽品种。栽培品种有无刺卡因(又名“夏威夷”“沙捞越”)、台凤、希路等。栽培品种主要有西班牙、土种、新加坡罐用种、卡比宗那等。菠萝对环境条件的适应性比较强，但更适应于温暖湿润的气候，菠萝栽培区要求年平均气温20～27℃,冬季平均气温高于10℃;菠萝耐旱性较强，雨水过于集中对根系生长不利；光照不足，植株生长势弱，果小品质差，阳光过强时叶片变成红黄色，果实易受日灼；疏松、透气性好、pH值为4.5～6.0的土壤种植菠萝最适宜。利用老熟菠萝粗壮的顶芽、托芽和吸芽，通过假植培育后作种苗。菠萝组织培养苗一般由专业机构进行培育。组织培养苗适应性强，生长快速、成熟整齐、品质较好。园地应选择缓坡丘陵山地，排水良好，pH值为4.5～5.5疏松的酸性土，坡向以西南向为佳，东向次之。华南全年均可定植，5—8月是定植的主要季节，充分利用采果后摘下的各种芽体作种苗，且此时各种芽体老熟，高温多湿的气候也适宜定植后的幼苗生根和新叶生长。(1)耕翻。全园深翻20～30cm，多犁少耙，保持泥团直径5～8cm大小的块状，有利好气性的菠萝根系生长良好；土壤过碎，泥土易板结，大雨时泥土溅积到植株心部，妨碍植株新叶的生长发育。(2)整畦。方式有平畦、垒畦和浅沟畦三种：畦面宽度1.0～1.5m；畦沟宽0.3～0.4m、深0.2～0.25m。不易保水的沙地可开宽度1.0m、深0.30～0.35m的浅沟畦。要求选留一定面积土地作育苗地。(3)施基肥。整畦时施基肥，施入猪牛粪等优质有机肥20000～25000kg/hm2，过磷酸钙750kg/hm2，麸肥750kg/hm2，石灰1000kg/hm2，肥土混匀。(1)定植方式。可选用双行、3行和宽窄畦4行3种方式。(2)定植密度。卡因品种植45000～60000株/hm2；菲律宾种植60000～75000株/hm2；肥水充足时，密度大，单位面积产量高。但单果重则下降，抽蕾期、成熟期也晚半个月左右；小行距30～35cm，株距20～30cm。(3)种植方法。种苗要分级分地段种植，中等大小的种苗要健壮，叶肥厚浓绿，叶数8～12张。深耕浅种，以生长点不入土为原则，以免泥土溅入株心。生产上一般按顶芽入土3～4cm，吸芽入土4～5cm，大吸芽入土6～8cm进行浅种：入土后小苗要扶正压实。种后0～40d要查苗补苗。种苗要分级分地段种植，中等大小的种苗要健壮，叶肥厚浓绿，叶数8～12张。生长结果需钾量最多，氮居中，磷较少，氮、磷、钾三要素适宜比例为(3～4)∶1∶(3～4)。一般采果后施。施猪牛粪等优质有机肥20000～25000kg/hm2、过磷酸钙750kg/hm2、饼肥750kg/hm2。也可用三元复合肥1500kg/hm2代替上述肥料。(1)壮苗肥。密植园根际施肥不方便时，在施足基肥基础上，每月叶面追肥2次，肥料溶液参考配方为每3000kg水加尿素25kg、硫酸钾25～30kg、硫酸镁2kg、硫酸亚铁2kg、硫酸锌2kg溶解。如果追肥为根际施肥，壮苗肥在定植后20d左右施尿素或碳铵750kg/hm2。(2)促蕾肥。在定植后5～6个月施复合肥900kg/hm2，促进花芽分化。(3)壮果催芽肥。在定植后9～10个月施复合肥300kg/hm2；壮芽肥在采果后施尿素250～300kg/hm2、复合肥250kg/hm2。投产菠萝园一年至少施促蕾肥和壮芽肥。新开垦的菠萝园，杂草还比较少，一般一年除草4次左右，第一次在3—4月进行，浅锄轻铲；第二次除草在5—6月进行；第三次除草在正造果采收后即7—8月结合施重肥进行;第四次除草在秋冬季进行。已投产一年的菠萝地除草可减少至每年2次，一次在5—6月，另一次在秋冬季。但行间和畦面上的零星杂草每月至少拔除1次，以免杂草结籽散落在畦面和行间，造成危害。生长期间的培土，一般在雨后和采果后进行。采果后培土高度要盖过吸芽的基部。防止因雨水冲刷，导致一些根系裸露，使植株早衰和结果后倒伏。在雨后进行轻培土，即将被雨水冲到畦沟的表土培的畦面，盖住裸露的根系。被冲塌的叠畦壁，也应立即修复，等高畦内沟在雨季必须挖通，避免渍水造成菠萝烂根，导致凋萎或心腐。(1)封顶。新种植株营养生长达到催花标准时(“菲律宾”40cm长的叶片25张、卡因种34张时)即进行催花。当果实谢花后7d左右，顶芽长到5～7cm高时即进行封顶，具体做法是：一手扶果，另一手四指掌握幼果，扶稳，用大拇指将小顶芽推断。(2)托芽。果实发育的同时果柄上的托芽也大量萌生，常常影响果实正常发育，严重影响产量。因此，在托芽萌发到3～4cm长时则分期分批摘除，每次摘除1～2个，摘2～3次；用托芽作繁殖材料，卡因种可采取留近果柄基部2个芽，其余分批摘除。(3)激素催花。菠萝植株的催花标准是：“菲律宾”品种有长35cm以上、宽4.5cm的叶片30张以上，植株重为1.5kg以上；卡因种有长40cm以上、宽5.5cm的叶片35张以上，植株重为3.0kg以上。采用乙烯利进行催花：乙烯利的浓度和用量要根据季节气温变化和品种来决定：一般高温季节宜在阴天或傍晚进行，使用浓度稍低些，如在5—7月“菲律宾”品种一般用乙烯利1500倍液，即1ml乙烯利对水1.5kg，附加尿素15g，每株灌心20ml；卡因种则要用1000倍液，即1ml乙烯利对水1kg，附加尿素10g，每株灌心30ml。而开春和入秋气温偏低，浓度要高些，如2—4月或8月以后，“菲律宾”品种要用乙烯利1000倍液，每株灌心25ml；卡因种则需用乙烯利500倍液，每株灌心30ml。5d后花芽就开始分化，25～28d抽蕾，抽蕾率通常达90%以上，抽蕾和成熟期也比较一致。应用激素喷果，对菠萝果实的发育有明显的促进作用。另外，菠萝果实经激素处理后，还可以延长其成熟期。常用来喷果的激素有赤霉素、萘乙酸和萘乙酸钠。(1)赤霉素喷果。在菠萝上使用浓度为50mg/kg和70mg/kg，即1g赤霉素用5ml酒精溶解后,对水20kg或14.5kg，再加入0.1kg尿素混合拌匀喷果至湿润即可。喷后用草盖果则效果更好。大田生产通常喷2次，第一次在花蕾小花全部谢花时，可用50mg/kg浓度喷；喷后20d左右再以70mg/kg浓度喷第二次，可有效促进果实发育。(2)萘乙酸和萘乙酸钠喷果。通常在开花末期用万分之一喷第一次；隔15～20d再用万分之二喷第二次。每次都应加0.5%的尿素一起喷果，以提高激素的增产效果。应注意，萘乙酸及其钠盐，在浓度超过50mg/kg时，对吸芽有明显的抑制作用，使用时不能将药液喷到或流到叶腋和茎部，更不能喷到中小吸芽上，以免引起早抽蕾，果小，经济效益低。(3)乙烯利催熟。菠萝生产上常用乙烯利催熟，效果较好，特别是秋、冬果采用乙烯利催熟，不仅使果肉色泽良好，而且还能提早果实成熟，提前加工。同时，果实成熟一致，便于采收，降低生产成本。用乙烯利催熟时的果实成熟度，一般掌握在七成熟时进行。若按抽蕾至催熟时的天数计算，夏果约在100d，秋果110d左右，冬果则需120～130d。催熟过早，品质差，产量下降。

果树病虫害防治技术是果树生产中非常关键和综合性极强的一项技术，也是果园管理中一个重要的环节。苹果腐烂病是我国北方苹果树的主要病害，除为害苹果及其苹果属植物外，也为害梨、桃、樱桃和梅等多种落叶果树。图22-1 苹果腐烂病为害枝及果实(1)田间诊断。苹果腐烂病俗称烂皮病，主要为害果树枝干，病部树皮腐烂，表现为溃疡型和枝枯型。溃疡型病斑主要发生在冬春和极度衰弱的树体上。发病初期为红褐色，略隆起，呈水渍状，组织松软，病皮易于剥离，内部组织成暗红褐色，有酒糟气味。溃疡型病斑在早春扩展迅速，在短时间内发展成为大型病斑，围绕枝干造成环切，使上部枝干枯死。枝枯型多发生在2～3年生或4～5年生的枝条或果苔上，在衰弱树上发生更明显。病部为红褐色，呈水渍状，不规则，迅速延及整个枝条，使其枯死。病枝上的叶片变黄，后期病部产生小粒点。果实上的病斑为红褐色，圆形或不规则形，有轮纹，边缘清晰。病组织腐烂，略带酒糟气味。(2)防治方法。①加强栽培管理。通过合理调整结果量、改善立地条件、实行科学施肥、合理灌水、防治病虫害等方法调整。②铲除树体所带病菌。通过采用重刮皮、药剂铲除、枝干喷药等方法铲除果树落皮层、皮下干斑、皮下湿润坏死点、树杈夹角皮下的褐色坏死点来清除潜伏病菌。③治疗病斑。采用刮治和包泥方法及时治疗病斑。④桥接复壮。治疗后及时做好桥接工作，其具有恢复树势的作用。苹果轮纹病也称粗皮病、轮纹褐腐病，除为害苹果外，还为害梨、山楂、桃、栗和枣等果树。(1)田间诊断。苹果轮纹病为害树干和果实，树干以皮孔为中心产生红褐色圆形病斑，中心隆起瘤状，后凹陷为眼状，又称为粗皮病，一般在病健交界处开裂，病斑翘起或剥落。图22-2 苹果轮纹病为害果实和树干(2)防治方法。①药剂防治。轻微发病时，按靓果安800倍液稀释喷洒，10～15d用药一次。病情严重时，靓果安按500倍液稀释，7～10d喷施一次。②清除侵染源。晚秋、早春刮除粗皮，集中销毁，并喷45%代森铵水溶液1000倍液或75%五氯酚钠粉100～200倍液，3月下旬至4月初喷3°Bé石硫合剂为宜。③果实套袋。落花后一个月内套完，每果一袋，红色品种采收前一个星期拆除即可。④生长期涂树干。8月用1.8%辛菌胺醋酸盐水剂50倍液涂刷粗皮病部，可加药液1%的腐植酸钠，促进健皮生长。⑤储藏期管理。严格剔除病果，注意控制温、湿度。苹果白粉病在我国苹果产区发生普遍，除了为害苹果外，还为害沙果、海棠、槟子和山定子等。图22-3 苹果白粉病为害叶片、嫩梢及果实(1)田间诊断。苹果白粉病为害苹果树的幼苗、嫩梢、叶片、芽、花及幼果。嫩梢染病，生长受抑，节间缩短，其上着生的叶片变得狭长或不开张，变硬变脆，叶缘上卷，初期表面被覆白色粉状物，后期逐渐变为褐色，严重的整个枝梢枯死；叶片染病，叶背初现稀疏白粉，新叶略呈紫色，皱缩畸形，后期白色粉层逐渐蔓延到叶正反两面，叶正面色泽浓淡不均，叶背产生白粉状病斑，病叶变得狭长，边缘呈波状皱缩或叶片凹凸不平；严重时，病叶自叶尖或叶缘逐渐变褐色，最后全叶干枯脱落。幼果受害多发生在萼的附近，萼洼处产生白色粉斑，病部变硬，果实长大后白粉脱落，形成网状锈斑，变硬的组织后期形成裂口或裂纹。(2)防治方法。①加强栽培管理。采用配方施肥，避免偏施氮肥，控制灌水，使果树生长健壮；增施有机肥和磷、钾，提高抗病力；合理密植抗病品种，逐步淘汰高感抗品种。②清洁田园。结合冬季修剪，剪除病梢、病芽；早春复剪，剪掉新发病的枝梢，集中烧毁或深埋，防止分生孢子传播。③药剂防治。发芽前喷洒70%硫黄可湿性粉剂150倍稀释液；春季在发病初期，喷施70%甲基硫菌灵(甲基托布津)1000倍液、12.5%特谱唑2000倍液、6%乐必耕可湿性粉剂1000～1500倍液，10～20d喷一次，共喷3～4次。在苗圃中幼苗发病初期，可连续喷2～3次0.2°～0.3°Bé石硫合剂、70%甲基托布津可湿性粉剂1000～1200倍液、45%晶体石硫合剂300倍液。苹果炭疽菌叶枯病简称炭疽叶枯病，是近年来发生在嘎拉、花冠、秦冠、晨阳、新红星、早熟红富士等众多早、中熟品种上的一种新的病害，主要为害叶片及果实，高温季节雨后，病菌繁殖迅速，短短3～5d便可导致大量枯叶及果实布满病斑而失去商品价值。图22-4 苹果炭疽菌叶枯病(1)田间诊断。初发病时，叶片上分布多个干枯病斑，病斑初为棕褐色，在高温及高湿条件下，病斑扩展迅速，1～3d内可蔓延至整张叶片，3～5d即可致全树叶片干枯脱落。枯叶颜色发暗，呈黑褐色。环境条件不适宜时，叶片上会形成大小不等的枯死斑，病斑周围的健康组织随后变黄，病重叶片很快脱落。病斑较小、较多时，病叶的病状与褐斑病的症状非常相似。受害果实果面出现多个直径2～3mm的圆形褐色凹陷病斑，病斑周围果面呈红色，病斑下果肉呈褐色海绵状，深约2mm。自然条件下果实病斑上很少产生孢子梗，与常见苹果炭疽病的症状明显不同。(2)防治方法。①栽植抗病品种和提高叶片生理功能。建立新园时，尽量选择不易感病的苹果品种，如美国8号、藤牧1号、晚熟红富士系列品种等，并实行起垄栽培。此外，在苹果树进入生长季后，结合喷药加入功能性液肥强壮树势，提高叶片抗病能力。②铲除越冬病菌。例如，早春彻底清理果园，清扫枯枝落叶，并及时喷施清园药剂；苹果萌芽后，继续选用杀灭性较强的铲除剂和叶面肥，目的是铲除在枝条及休眠芽和健壮叶片上越冬的病菌。③高温季节防治。自6月中旬后，可交替喷施石灰倍量式波尔多液或80%全络合态代森锰锌500～800倍液+叶面肥800～1000倍液或60%百泰(5%吡唑醚菌酯+55%代森联)1500倍液+叶面肥800～1000倍液或80%丙森锌600倍液+叶面肥800～1000倍液与其他防治该类病菌的药剂(如45%咪鲜胺水乳剂2000倍液、15%多抗霉素可湿性粉剂1500倍液、50%异菌脲悬浮剂1500倍液等交替混合喷雾)。每10～15d施用一次，保证每次出现超过两天的连续阴雨前，叶面和枝条都处于药剂的保护之中。④雨后补药。如果降雨前没有及时喷药，可在连续阴雨间歇期或雨后及时补喷80%全络合态代森锰锌500～800倍液+60%百泰(5%吡唑醚菌酯+55%代森联)1500倍液+叶面肥800～1000倍液，对发病严重的苹果园，可间隔7d左右，连喷两次，以后按照高温季节防治方法进行用药。苹果褐斑病为常发性病害，是造成苹果早期落叶的重要病害之一，主要为害叶片，也侵染果实和叶柄。若防治不当，可引起苹果树早期大量落叶，导致果实品质低劣，严重影响到当年经济效益及来年树体的正常生长发育。(1)田间诊断。叶片上病斑的形状可分为轮纹型、针芒型及不规则混合型病斑三种类型。轮纹型病斑发病初期，叶片的正面出现黄褐色小点，后逐渐扩大至直径10～15mm的圆形病斑，病斑中心暗褐色，边缘不明显，病斑上产生黑色小粒点，形成同心状轮纹，叶的背面暗褐色；针芒型病斑斑点较小，呈放射状向外扩展，这是由于黑色菌索穿行于表皮组织之下而形成的，病斑背面为绿色；混合型病斑兼有轮纹型和针芒型两者的特点。三种病斑都使叶片变黄，但病斑边缘仍旧保持绿色形成晕圈，这是此病的重要特征。老病斑中央多呈灰白色，病叶稍触即落。叶柄受害后有长圆形黑色斑，使输导组织受阻致病叶枯死。果实染病时，表皮上初生浅褐色小点，逐渐扩大成圆形或不规则形，边缘清晰，稍凹陷的病斑直径为6～12mm,病部果肉疏松干腐，褐色，中间产生黑色小点，有光泽，一般不深入果肉内部。图22-5 苹果褐斑病(2)防治方法。①合理修剪，控制树冠大小及骨干枝数量，改善园内通风透光条件。②秋季、冬季剪除树上残留的病枝和摘除病叶并清扫地面落叶，深埋或烧毁。③喷药保护。一般从发病前15d左右开始喷药，隔15d左右一次，连喷4～6次。常用石灰倍量式波尔多液［1∶2∶(180～200)］、43%戊唑醇2000～2500倍液+80%代森锰锌可湿性粉剂800～1000倍液、60%百泰(5%吡唑醚菌酯+55%代森联)1500倍液+15%多抗霉素可湿性粉剂1500倍液等药剂交替使用。注意在幼果期慎用波尔多液以防果锈产生。苹果害虫的种类约有350种，根据发生轻重的不同划分为三类：第一类为主要害虫，包括食心虫类、卷叶蛾类、红蜘蛛类，统称为苹果的三大害虫；第二类为较主要害虫，包括毛虫类、蚜虫类、蛀虫害虫类；第三类为一般害虫，包括刺蛾类、吸果夜蛾类、金龟子类、潜夜蛾类、蚧壳虫类。桃小食心虫又称桃蛀果蛾，简称桃小，国内各果区都有发生，还为害桃、梨、山楂和酸枣等树种。(1)田间诊断。幼虫多从果实萼洼蛀入，蛀孔流出泪珠状的果胶，干涸呈白色蜡质粉末。幼虫入果直达果心，在果肉中乱窜，排粪便于隧道中，没有充分膨大的幼果受害多呈畸形，俗称“猴头果”。被害果实渐变黄色，果肉僵硬，俗称黄病。图22-6 桃小食心虫(2)防治方法。①农业防治。通过更换无冬茧的新土，减少越冬虫源基数；清除树盘内的杂草及其他覆盖物，随时捕捉；在越冬幼虫出土前，用宽幅地膜覆盖。②生物防治。在越冬代成虫发生盛期，释放桃小寄生蜂；在幼虫初孵期，喷施细菌性农药(Bt乳剂)，也可使用桃小性诱剂在越冬代成虫发生期进行诱杀。③化学防治。地面防治采用撒毒土或地面喷施40%辛硫磷乳油8倍液，在越冬幼虫出土前喷湿地面，耙松地表；树上防治在幼虫初孵期，喷施或2.5%高效氯氟氰菊酯微乳剂1500倍液或2.5%敌杀死(溴氰菊酯)乳油2000～3000倍液。苹果红蜘蛛又名苹果全爪螨，分布全国，尤以北方发生普遍，为害苹果、月季、海棠、榆、梨、樱花等。(1)田间诊断。苹果红蜘蛛主要为害叶片。叶片受害初期出现白色小斑点，后期叶片苍白，光合作用减弱。虫口密度大时，叶片布满螨蜕，但很少落叶。图22-7 苹果红蜘蛛(2)防治方法。①在早春树木发芽前，用20号石油乳剂20～40倍液喷树干，或者用石硫合剂300～500倍液喷树干，以消灭越冬雌成虫及卵。②及时消除花圃、果园的杂草。③为害期喷施扫螨净1000倍液或螺螨酯、哒螨灵等药剂防治，均可收到较好的防治效果。但要注意炔螨特和三唑锡可能会产生药害，慎用。螨类易产生抗药性，要注意杀螨剂的交替使用。④保护和引进天敌。苹果小卷叶蛾又名小黄卷叶蛾、棉褐带卷叶蛾、苹小卷叶蛾，属鳞翅目，卷叶蛾科，主要为害苹果、梨、桃、山楂等果树。图22-8 苹果小卷叶蛾(1)田间诊断。幼虫主要为害苹果、梨、桃等的嫩叶、新芽、花蕾和果实。幼虫吐丝卷叶，食害叶肉或缠绕新芽和花蕾，使芽、蕾不能展开。大龄幼虫啃食叶片覆盖下的果皮组织，形成深浅不一的条、点状斑痕，影响果品的质量。(2)防治方法。①冬春刮除老鞘皮，清除部分越冬幼虫。春季结合疏花疏果，摘除虫包，集中处理。生长季节及时摘除虫叶、虫梢。②花芽分离期至盛花期及幼虫发生期是全年喷药防治的重点时期，可用25%灭幼脲悬浮剂1500倍液或4.5%氟铃脲悬浮剂1500～2000倍液+甲维盐2000～2500倍液及时进行喷雾防治，成虫期用黑光灯或杀虫剂消灭成虫。③在各代成虫发生期，采用“迷向法”在果园内各个方向的果树上挂性诱芯，使雄性成虫不能和雌蛾进行交配，阻止其繁育后代为害。④在各代卷叶虫卵发生期，根据性外激素诱蛾情况释放赤眼蜂。绵蚜群落寄生在苹果树上，吸取树液，消耗树体营养。果树受害后，树势衰弱，寿命缩短，世界各国都把苹果绵蚜列为进出口检疫对象。(1)田间诊断。成虫、若虫群集于背光的树干伤疤、剪锯口、裂缝、新梢的叶腋、短果枝端的叶群、果柄、梗洼和萼洼等处，为害枝干和根部，吸取汁液。被害部膨大成瘤，常因该处破裂，阻碍水分、养分的输导，严重时树体逐渐枯死。幼苗受害，可使全枝死亡。图22-9 苹果绵蚜(2)防治方法。①冬季修剪。彻底刮除老树皮，修剪虫害枝条、树干，及时清除杂草和干枯树枝，破坏和消灭苹果绵蚜栖居、繁衍的场所。②人工繁殖释放或吸引苹果蚜小蜂、瓢虫、草蛉等天敌。③苗木、接穗及包装材料要用10%吡虫啉1000倍液浸泡2～3min。④加强检疫。禁止从苹果绵蚜发生疫区调进苗木、接穗。⑤生长季树上喷药，可选用1500～2000倍液10%吡虫啉可湿性粉剂等药剂，要喷透剪锯口、伤疤、缝隙等处。所用药剂要注意交替使用，以免发生抗性。苹果山楂叶螨又名山楂红蜘蛛、樱桃红蜘蛛，主要为害梨、苹果、桃、樱桃、山楂、李等多种果树。(1)田间诊断。苹果山楂叶螨吸食叶片及幼嫩芽的汁液。叶片严重受害后，先是出现很多失绿小斑点，随后扩大连成片，严重时全叶变为焦黄而脱落，严重抑制了果树生长，甚至造成二次开花，影响当年花芽的形成和次年的产量。图22-10 苹果山楂叶螨(2)防治方法。①释放、吸引和保护天敌，尽量减少杀虫剂的使用次数或使用不杀伤天敌的药剂，在树木休眠期刮除老皮，主要刮除主枝分杈以上老皮，主干可不刮皮以保护主干上越冬的天敌。②在树干基部培土拍实，防止越冬螨出蛰上树。③发芽前，刮皮后喷洒石硫合剂或45%晶体石硫合剂20倍液、含油量3%～5%的柴油乳剂；在花前繁殖前，施用45%晶体石硫合剂300倍液或20%灭扫利乳油3000倍液或15%扫螨净乳油3000倍液或21%灭杀毙乳油2500～3000倍液或20%螨卵酯可湿性粉剂800～1000倍液或25%除螨酯(酚螨酯)乳油1000～2000倍液等多种杀螨剂。注意药剂的轮换使用，可延缓叶螨抗药性的产生。我国已知的梨树病害约有80种。梨树主要病害包括梨黑星病、腐烂病、干腐病、轮纹病、锈病、黑斑病和褐斑病。梨黑星病又称疮痂病，是梨树的一种主要病害。我国梨产区均有发生。(1)田间诊断。梨黑星病为害所有幼嫩的绿色组织，以果实和叶片为主。果实发病初期产生浅黄色圆形斑点并逐渐扩大，以后病部稍凹陷，长出黑霉，最后病斑木栓化，凹陷并龟裂。叶片和新梢受害后可长出黑色霉斑。图22-11 梨黑星病(2)防治方法。①农业防治。加强栽培管理，增施有机肥，提高抗病力；晚秋清除落叶、病果、病枯枝等，减少越冬病原；生长期及早摘除病花丛和病梢。②化学防治。花蕾膨大期及落花后期各喷一次药，后隔2～3周喷一次，共3～4次。要特别注意喷叶背。可用0.5∶1∶100的波尔多液或30%氧氯化铜600倍液或50%多菌灵500～800倍液或70%甲基托布津500～800倍液。梨锈病又称赤星病、羊胡子，我国南北果区均有发生，但一般不造成严重为害，仅在果园附近种植桧柏类树木较多的风景区和城市郊区造成较重为害。梨锈病除为害梨树外，还能为害山楂、棠梨和贴梗海棠等。(1)田间诊断。梨锈病为害叶片、新梢和幼果。叶片受害时，在叶面上出现橙黄色有光泽的小斑，逐渐扩大为近圆形的病斑，直径4～5mm，中部为橙黄色，边缘为浅黄色，外圈的黄绿色的晕环与健部分开，病斑性孢子器由黄色变为黑色后向叶背面隆起，叶面微凹，以后病斑变黑。发病严重时引致早期落叶。新梢、幼果及果柄病斑与叶相似。幼果受害畸形、早落；新梢受害易被风折断。转主寄主为柏科植物桧柏(圆柏)等。图22-12 梨锈病（叶部）(2)防治方法。①梨园5km内不种植桧柏，中断转主寄主。②梨园附近有桧柏，2月下旬至3月上旬在桧柏上喷1°～2°Bé石硫合剂，杀灭越冬后的冬孢子和担子孢子。③从梨展叶开始至5月下旬为止，可喷1∶3∶(200～240)倍波尔多液或65%代森锌500倍液。也可选用氟硅唑(或氟环唑)+醚菌酯、特富灵等药剂进行防治。开花期不能喷药，以免产生药害。梨黑斑病是梨树主要的病害之一,在中国主要梨区普遍发生。西洋梨、日本梨、酥梨、雪花梨最易感病。图22-13 梨黑斑病(1)田间诊断。梨黑斑病主要为害果实、叶和新梢。叶部受害，幼叶先发病并形成黑褐色圆形斑点，后逐渐扩大，形成近圆形或不规则形病斑，中心为灰白色至灰褐色，边缘为黑褐色。病叶焦枯、畸形，早期脱落。果实受害，果面出现一个至数个黑色斑点，逐渐扩大，颜色变浅，形成浅褐色至灰褐色圆形病斑，略凹陷。发病后期病果畸形、龟裂，裂缝可深达果心，果面和裂缝内产生黑霉，引起落果。果实近成熟期染病，前期表现与幼果相似，但病斑较大，黑褐色，后期果肉软腐而脱落。新梢发病，病斑呈圆形或椭圆形、纺锤形，浅褐色或黑褐色，略凹陷，易折断。(2)防治方法。①农业防治。发芽前剪除病梢，清除落叶落果，认真清园。改善栽培管理，增强树势。低洼果园雨季及时排水。重病树要重剪，以通风透光，清除病原。②药剂防治。发芽前喷药铲除树上越冬病菌，生长期及时喷药预防侵染以保护叶和果实。南方一般在4月下旬至7月上旬，每间隔10d左右喷洒一次。华北从初见病叶到雨季喷药4～6次，可基本控制此病害。50%异菌脲(扑海因)可湿性粉剂或10%多抗霉素1000～1500倍液对黑斑病效果最好，75%百菌清可湿性粉剂800倍液、90%三乙膦酸铝500倍液、65%代森锌可湿性粉剂600～800倍液、1∶2∶240波尔多液等也有一定效果。为延缓抗药性的产生，异菌脲和多抗霉素应与其他药剂交替使用。③果实套袋。④在病害流行地区选栽抗病品种。我国梨树害虫记载有697种，目前为害严重的害虫有梨二叉蚜、梨小食心虫、梨木虱、梨黄粉蚜、山楂叶螨、梨大食心虫。梨二叉蚜是梨树的主要害虫。全国各梨区都有分布，以辽宁、河北、山东和山西等梨区发生普遍。图22-14 梨二叉蚜(1)田间诊断。梨二叉蚜以成虫、若虫群集于芽、嫩叶、嫩梢上吸取梨汁液。早春若虫集中在嫩芽上为害。随着梨芽开绽而侵入芽内。梨芽展叶后，则转至嫩梢和嫩叶上为害。被害叶从主脉两侧向内纵卷成松筒状。(2)防治方法。①早期摘除被害叶，集中处理，消灭蚜虫。②抓好开花前喷药防治工作，在越冬卵全部孵化未造成卷叶时应喷药。用10%吡虫啉(一遍净)2000倍液等。③保护并利用天敌。梨小食心虫简称梨小(又名梨小蛀果蛾、东方果蠹蛾、梨姬食心虫、桃折梢虫、小食心虫、桃折心虫)小卷叶蛾科。梨小食心虫在各地果园均有发生，是梨树的主要害虫，在梨树、桃树混栽的果园为害尤为严重。图22-15 梨小食心虫(1)田间诊断。梨小食心虫为害果实和新梢。幼虫蛀果多从萼洼处蛀入，直接蛀到果心，在蛀孔处有虫粪排出，被害果上有幼虫脱出的脱果孔。幼虫蛀害嫩梢时，多从嫩梢顶端第三叶叶柄基部蛀入，直至髓部，向下蛀食。蛀孔处有少量虫粪排出，蛀孔以上部分易萎蔫干枯。(2)防治方法。①人工防治。早春刮树皮，消灭翘皮下和裂缝内越冬的幼虫；秋季幼虫越冬前，在树干上绑草把，诱集越冬幼虫，入冬后或翌年早春解下烧掉，消灭其中越冬的幼虫；春季发现部分新梢受害时，及时剪除被害梢，深埋或烧掉，消灭其中的幼虫。②药剂防治。在各代成虫产卵盛期和幼虫孵化期，为防止果实受害，重点防治第二、第三代幼虫。用梨小食心虫性外激素诱捕器监测成虫发生期，指导准确的喷药时间。一般情况下，在成虫出现高峰后即可喷药。在发生严重的年份，可在成虫发生盛期前、后各喷一次药，控制其为害。在没有梨小食心虫性诱剂的情况下，可在田间调查卵果率，当卵果率达到1%时就可喷药。常用药剂有50%杀螟松乳油1000倍液、80%敌百虫晶体1000倍液、2.5%功夫菊酯乳油3000倍液。③生物防治。在虫口密度较低的果园，可用松毛虫赤眼蜂治虫。成虫产卵初期和盛期分别释放松毛虫赤眼蜂一次，每100m2果园放蜂4500头左右，能明显减轻为害。④果实套袋是防止梨小食心虫为害的较好方法。⑤刮皮消灭越冬幼虫。梨木虱又叫梨虱，主要寄主是梨树。梨木虱是梨园常见且为害十分严重的一种害虫，套袋果园常受害较重。图22-16 梨木虱(1)田间诊断。若虫常聚集于叶背主脉两侧为害，使叶片沿主脉向背面弯曲，呈匙状，叶片皱缩，甚至枯黄、变黑、脱落。幼龄若虫将叶片沿叶缘卷曲成筒状，受害部位虫体分泌的黏液在秋季湿度大时会引起煤污病，污染叶和果面，造成落叶及枝条和果实发育不良。(2)防治方法。①清除虫叶。早期摘除被害卷叶，集中处理。②药剂防治。蚜卵孵化，梨芽尚未开放至发芽展叶期是防治最适期。在梨木虱严重发生时，可选用螺虫乙酯、虫螨腈、阿维菌素防治梨木虱。若要求速效，可添加菊酯类药剂。因梨木虱对吡虫啉等药剂抗性的加大，使用时应缩小倍数并轮换用药。③保护天敌。梨蚜天敌有瓢虫、草蛉、食蚜蝇、蚜茧蜂等，应注意加以保护。我国已知的桃树病害有50余种，其中桃褐腐病、桃疮痂病、桃细菌性穿孔病、桃炭疽病和桃缩叶病是主要的桃树病害。桃褐腐病又名菌核病、灰腐病、灰霉病，是桃树的主要病害之一，可为害桃、李、杏、梅及樱桃等核果类果树，主要发生在浙江、山东沿海地区和长江流域。(1)田间诊断。桃褐腐病主要为害花、叶、枝梢和果实。果实染病后，果面开始出现小的褐色斑点，后急速扩大为圆形褐色大斑，果肉为浅褐色，并很快全果烂透。同时，病部表面长出质地密结的串珠状灰褐色或灰白色霉丛，初为同心环纹状，并很快遍及全果。烂病果除少数脱落外，大部分干缩呈褐色至黑色僵果，经久不落；病花瓣、柱头初生褐色斑点，渐蔓延至花萼与花柄，天气潮湿时病花迅速腐烂，长出灰色霉层。气候干燥时则萎缩干枯，长留树上不脱落。嫩叶发病自叶缘开始，初为暗褐色水渍状病斑，并很快扩展至叶柄，叶片萎垂如霜害，病叶上常具灰色霉层，也不易脱落；枝梢发病多为病花梗、病叶柄及病果中的菌丝向下蔓延所致，渐形成长圆形溃疡斑，边缘为紫褐色，中央微凹陷，灰褐色，病斑周缘微凸，被覆灰色霉层，初期溃疡斑常有流胶现象。病斑扩展环绕枝条一周时，枝条即萎蔫枯死。图22-17 桃褐腐病为害果实(2)防治方法。①清除病原。休眠期结合冬剪彻底清除树上和树下的病枝、病叶、僵果，集中烧毁。秋冬深翻树盘，将病菌埋于地下。②药剂防治。芽膨大期喷布石硫合剂+80%五氯酚钠200～300倍液。花后10d至采收前20d喷布65%代森锌400～500倍液，或用70%甲基托布津800倍液或50%多菌灵可湿性粉剂800～1000倍液，或用50%硫悬浮剂500～800倍液，或用30%碱式硫酸铜悬浮剂400～500倍液，或用20%三唑酮乳油3000～4000倍液等药剂。药剂应交替使用。③生长期及时防治蝽象、象鼻虫、食心虫、桃蛀螟等害虫，减少伤口。桃疮痂病又名黑星病，在我国各地普遍发生，尤以高温多湿的江浙一带发病最重，主要为害果实，油桃更容易感染。此病除为害桃外，还能侵害李、梅、杏、樱桃等核果类果树。(1)田间诊断。桃疮痂病主要为害桃树果实、枝梢和叶片。果实发病先发生暗绿色圆形斑点，逐渐扩大，严重时病斑融合连片，随果实增大，果面往往龟裂。当果柄被害时，病果常脱落。枝梢染病后，起初发生浅褐色椭圆形斑点，边缘带紫褐色。秋季病斑表面呈紫色或黑褐色，微隆起，常流胶。翌年春季，病斑变灰色，产生暗色绒点状分生孢子丛。叶片初发病时，叶背出现不规则形或多角形灰绿色病斑，渐变为褐色或紫红色，后期形成穿孔，严重时落叶。图22-18 桃疮痂病(2)防治方法。①加强栽培管理，提高树体抗病力，增施有机肥，控制速效氮肥的用量，适量补充微量元素肥料，以提高树体抵抗力。合理修剪，注意桃园通风透光和排水。②清除病原。秋末冬初结合修剪，彻底清除园内树上的病枝、枯死枝、僵果、地面落果，集中处理，以减少初侵染源。③药剂防治。芽膨大前期喷布石硫合剂+80%五氯酚钠200～300倍液，铲除越冬病原；花露红期及落花后间隔10～15d喷布一次10%苯醚甲环唑2000～2500倍液或50%多菌灵可湿性粉剂800倍液或50%甲基托布津可湿性粉剂500倍液或40%氟硅唑1000～1500倍液或50%克菌丹可湿性粉剂400～500倍液，注意药剂交替使用。桃细菌性穿孔病是桃树上最常见的叶部病害，在世界各桃产区都有发生，广泛分布于我国各地桃产区。(1)田间诊断。桃细菌性穿孔病主要为害叶片，在桃树新梢和果实上均能发病。叶片发病初期为水渍状小圆斑，后逐渐扩大成圆形或不规整形病斑，边缘有黄绿色晕环，以后病斑干枯、脱落、穿孔，严重时病斑相连，造成叶片脱落。新枝染病，以皮孔为中心树皮隆起，出现直径1～4mm的疣，其上散生针头状小黑点，即病菌分生孢子器。在大枝及树干上，树皮表面龟裂、粗糙。之后瘤皮开裂，陆续溢出树脂，透明、柔软状，树脂与空气接触后，由黄白色变成褐色、红褐色至茶褐色硬胶块。病部易被腐生菌侵染，叶片变黄，严重时全株枯死。果实发病，由果核内分泌黄色胶质，溢出果面，病部硬化，初为浅褐色水渍状小圆斑，稍凹陷，以后病斑稍扩大，天气干燥时病斑开裂，严重影响桃果品质和产量。图22-19 桃细菌性穿孔病(2)防治方法。①加强桃园综合管理、增强树势、提高树体抗病力是防治穿孔病最重要的措施。②新建桃园注意选栽抗病品种，选好土壤、地势条件。③药剂防治。可参考桃炭疽病、褐腐病、疮痂病的药剂防治方法，综合进行喷药。桃炭疽病是桃树的主要病害之一，分布于全国各桃产区，尤以长江流域、东部沿海地区发病较重。(1)田间诊断。桃炭疽病主要为害果实，也为害枝叶。果实被害处先产生水渍状褐色斑，后逐渐扩大呈暗褐色圆形斑,斑稍凹陷，病斑上产生黑褐色颗粒状点(分生孢子盘)，组成同心轮纹状。后期病斑扩大成圆形或椭圆形，具有同心轮纹状的分生孢子盘，雨季孢子盘变成红色或粉红色黏质颗粒状，病害严重时常造成大量落果。新梢受害出现暗褐色病斑，略凹陷。病斑蔓延后可导致枝条死亡。天气潮湿时，病斑表面可出现橘红色小点，叶片发病后呈纵筒状卷曲。图22-20 桃炭疽病(2)防治方法。①加强栽培管理。合理施肥，及时排除果园积水。夏季及时去除直立徒长枝，改善树体通风透光条件；冬季修剪时，彻底剪除干枯枝和残留在树上的病僵果，集中烧毁。②药剂防治。在花芽膨大期，喷洒1∶1∶160波尔多液，或用5°Bé石硫合剂。落花后，及时喷洒杀菌剂，可用70%甲基托布津可湿性粉剂1000倍液、50%多菌灵可湿性粉剂800倍液、10%苯醚甲环唑水分散粒剂2000～2500倍液，或用75%百菌清可湿性粉剂1000倍液。根据天气情况，可间隔10～15d喷一次药，注意不同药剂的轮换使用。桃树蚜虫分为桃蚜、桃粉蚜、桃瘤蚜(图22-21)三种，分布范围广，在国内大部分桃产区都有发生。以成蚜、若蚜密集在叶背面吸食汁液，导致桃树生长缓慢或叶片卷缩，其排泄物可诱发煤污病。图22-21 桃蚜、桃粉蚜、桃瘤蚜(1)田间诊断。春季桃树萌芽长叶时，桃蚜群集在嫩梢、嫩芽及幼叶背面，使被害部位叶片扭曲，卷成螺旋状，严重时造成落叶，新梢不能生长，影响产量及花芽形成。桃蚜还为害花蕾，影响坐果，降低产量。其桃蚜排泄的蜜露，污染叶面及枝梢，易造成煤污病，桃蚜还能传播桃树病毒。(2)防治方法。①清除虫源。桃树落叶后，如清理枯枝落叶、树干涂药等。②药剂防治。桃花期前后及幼果期是药剂防治的关键时期，(日平均气温小于30℃)。可选用10%的吡虫啉1000～1500倍液+40%吡蚜酮1500～2000倍液或25%丁硫克百威1500～2000倍液进行防治，中后期(日平均气温大于30℃),可选用5%啶虫脒1000～1500倍液+4%吡蚜酮1500～2000倍液或22.4%螺虫己酯4000倍液或40%噻嗪酮3000～4000倍液混合喷雾，注意药剂要交替使用。桃红颈天牛俗称水牛、铁炮虫、木花，全国各桃产区均有分布，主要为害桃、杏、李、梅、樱桃、苹果、梨、柳等，对核果类果树为害尤为严重，是桃树主要害虫之一。图22-22 桃红颈天牛(1)田间诊断。以幼虫蛀食干和主枝，小幼虫先在皮层下串蛀，然后蛀入木质部，深达干心，受害枝干被蛀中空阻碍树液流通，引起流胶，使枝干未老先衰，严重时可使全株枯萎。蛀孔外堆满红褐色木屑状虫粪。(2)防治方法。①清除虫源。幼虫孵化期，人工刮除老树皮，集中烧毁。成虫羽化期，人工捕捉，主要利用成虫中午至下午两三点钟静栖在枝条上，特别是下到树干基部的习性，进行捕捉。成虫产卵期，经常检查树干，发现有方形产卵伤痕，及时刮除或以木槌击死卵粒。②药剂防治。对有新鲜虫粪排出的蛀孔，可用小棉球蘸敌敌畏煤油合剂(煤油1000g加入80%敌敌畏乳油50 g)塞入虫孔内，然后再用泥土封闭虫孔，或者注射80%敌敌畏原液少许，洞口敷以泥土，可熏杀幼虫。③保护和利用天敌昆虫，如管氏肿腿蜂。桑白蚧又称桑盾蚧、桃白蚧，分布遍及全国，是为害最普遍的一种介壳虫。桑白蚧除为害桃外，还有樱桃、山毛桃、李、杏、梨、核桃、桑、国槐等。(1)田间诊断。以若虫和成虫群集于主干、枝条上，以口针刺入皮层吸食汁液，也有在叶脉或叶柄、芽的两侧寄生，造成叶片提早硬化。图22-23 桑白蚧(2)防治方法。①清除虫源。果树休眠期用硬毛刷或钢丝刷刷掉枝条上的越冬雌虫，剪除受害严重的枝条。②药剂防治。可喷洒石硫合剂，或者用95%机油乳剂50倍液喷布；在各代若虫孵化高峰期尚未分泌蜡粉介壳前，全树喷布40%氧化乐果1500倍液，或用5%高效氯氰菊酯乳油2000倍液。在药剂中加入0.2%的中性洗衣粉，可提高防治效果。桃球坚介壳虫又叫朝鲜球坚介壳虫、球形介壳虫、树虱子，我国南方、北方均有分布，主要为害桃、杏、李、梅等，是桃、杏树上普遍发生的害虫。(1)田间诊断。主要以若虫和雌成虫集聚在枝干上吸食汁液，被害枝条发育不良，出现流胶现象，树势严重衰弱，树体不能正常生长和花芽分化，严重时枝条干枯，一经发生，常在一、二年内蔓延全园，如防治不利，会使整株植株死亡。图22-24 桃球坚介壳虫(2)防治方法。①清除虫源，铲除越冬若虫，在春季雌成虫产卵以前，采用人工刮除的方法防治。②药剂防治。早春芽萌动期，用石硫合剂均匀喷布枝干，也可用95%机油乳剂50倍液混加5%高效氯氰菊酯乳油1500倍液喷布枝干。6月上旬卵进入孵化盛期时，全树喷布5%高效氯氰菊酯乳油2000倍液等。③保护天敌。注意保护黑缘红瓢虫等天敌。桃蛀螟又叫桃蠹螟、桃实螟、桃蛀虫等，我国各地均有分布，长江以南为害桃果特别严重，主要为害桃、梨、李、苹果等多种果树及向日葵、玉米等农作物，为杂草性害虫。(1)田间诊断。桃蛀螟主要为害果实，幼虫孵化后多从果蒂部或果与叶及果与果相接处蛀入，蛀入后直达果心。被害果内和果外都有大量虫粪和黄褐色胶液。幼虫老熟后多在果柄处或两果相接处化蛹。图22-25 桃蛀螟(2)防治方法。①清除虫源。冬季或早春及时处理向日葵、玉米等秸秆，并刮除桃树老皮，清除越冬茧。生长季及时摘除被害果，集中处理。②诱杀处理。秋季采果前在树干上绑草把诱集越冬幼虫集中杀灭或利用黑光灯、糖醋液诱杀成虫。③药剂处理。在第一、第二代卵高峰期树上喷布5%高效氯氰菊酯乳油2000倍液、2.5%敌杀死乳油3000～4000倍液以保护桃果。每个产卵高峰期喷两次药，间隔期7～10d。葡萄黑痘病又名疮痂病，俗称“鸟眼病”，是葡萄的主要病害之一。(1)田间诊断。黑痘病主要为害葡萄的绿色幼嫩部分，如果实、果梗、叶片、叶柄、新梢和卷须等。感病部位产生褐色斑点，叶片、嫩梢、卷须等扭曲、皱缩，幼果畸形。图22-26 葡萄黑痘病（病穗）图22-27 葡萄黑痘病（病果）(2)防治方法。①苗木消毒。由于黑痘病的无距离传播主要通过带病菌的苗木或插条，因此，葡萄园定植时应选择无病的苗木，或者先进行苗木消毒处理。常用的苗木消毒剂有10%～15%的硫酸铵溶液或3%～5%的硫酸铜溶液或硫酸亚铁硫酸液(10%硫酸亚铁+1%的粗硫酸)或3°～5°Bé石硫合剂等。方法是将苗木或插条在上述任一种药液中浸泡3～5min取出即可定植或育苗。②选育抗病品种。③清除病原。晚秋将葡萄园落叶枯枝、病枝、病果等彻底清除烧毁。剪枝时将病枝彻底剪除，剪枝后喷5°Bé石硫合剂或硫酸铜200倍液。④喷药防治。喷药应抓早期防治，开花前、落花后、幼果期连喷三次可以控制病害，可喷石灰半量式波尔多液［1∶0.5∶(180～200)］或50%多菌灵500～600倍液或70%甲基硫菌灵800～1000倍液。也可选用吡唑醚菌酯2000倍液或百泰(5%吡唑醚菌酯+55%代森联)1500倍液进行防治。葡萄白腐病俗称“水烂”或“穗烂”，是华北黄河流域及陕西关中等地经常发生的一种主要病害，在多雨年份常和炭疽病并发流行，造成很大损失。图22-28 葡萄白腐病（病穗）图22-29 葡萄白腐病（病枝）(1)田间诊断。葡萄白腐病主要为害果穗，病果呈褐色，水渍状，后期变软腐，容易脱落。葡萄叶片感病产生近圆形浅褐色病斑，呈不明显的同心轮纹状，后期叶片干枯脱落。枝蔓易在损伤处发病，皮层与木质部分离、纵裂，纤维乱如麻，枝体生理受阻，枝叶渐枯死。(2)防治方法。①因地制宜选用抗病品种。②做好清园工作，冬季结合修剪彻底剪除病枝蔓和挂在枝蔓上的干病穗，扫净地面的枯枝落叶，集中烧毁或深埋，减少第二年的侵染源。③生长季节摘除病果、病蔓、病叶，冬剪时把病组织剪除干净。搞好排水工作以降低园内湿度，适当提高果穗离地表距离，可减少病菌侵染，减轻发病。④加强栽培管理。改善通风透光条件，降低小气候湿度，及时除草、及时摘心，剪副梢，提高结果部位，减少离地面很近的果穗。⑤药剂防治。在发病严重地区的多雨年份，在6—8月每隔10～15d喷一次700～800倍液50%多菌灵或50%托布津或75%百菌清，也可喷200倍半量式波尔多液(1∶0.5∶200)。还可选用氟硅唑2000倍液、吡唑醚菌酯2000倍液和拜耳拿敌稳75%水分散粒剂(25%肟菌酯+50%戊唑醇)3000倍液中的任意一种进行防治。⑥地面撒药。在发病前地面可喷施50%多菌灵500倍液，每667m2施药0.5kg;也可用福美双1份、硫黄粉1份、碳酸钙1份，三者混合均匀，于葡萄架下撒施，每667m2施药1.5～2kg,施药后用耙荡平。葡萄炭疽病又名晚腐病，在我国各葡萄产区发生较为普遍，为害果实较严重；在南方高温多雨的地区，早春也可引起葡萄花穗腐烂。图22-30 葡萄炭疽病（果穗）图22-31 葡萄炭疽病（果实）(1)田间诊断。葡萄炭疽病主要为害着色或接近成熟的果实。果实受害表面产生豆粒大的褐色圆形斑点，后凹陷产生轮纹状排列的小黑点，严重时果粒软腐，逐渐失水干缩或成僵果。(2)防治方法。①选用抗病品种。②清除病原。结合葡萄冬剪彻底清园，将植株上剪下的枝蔓、穗柄、僵果、卷须及地上落叶、铁丝与绑绳等全部清除出园，并焚烧或深埋以清除病原。③加强栽培管理。在葡萄生长期内要及时摘心、合理夏剪、适度负载，随时清除剪下的副梢、卷须，提高园中通透性；注意排水、中耕，尽可能降低园中湿度；科学施肥，特别注意氮、磷、钾肥的比例，切忌氮肥过多，还要注意增施微肥，以提高植株的抗逆能力。④药剂防治。初见发病开始(6月中旬)每10～15d喷药一次直至采收。可用50%多菌灵500～600倍液或70%甲基硫菌灵800～1000倍液或百菌清800～1000倍液交替使用，连喷4～6次即可控制其为害。也可选用巴斯夫百泰、巴斯夫健达(21.2%吡唑醚菌酯+21.2%氟唑菌酰胺)和拜耳露娜森(21.4%氟吡菌酰胺+21.4%肟菌脂)的任意一种进行防治。(1)田间诊断。葡萄霜霉病是葡萄的重大病害之一，葡萄霜霉病主要为害叶片，也能侵染嫩梢、花序、幼果等幼嫩组织。葡萄叶片正面产生浅黄色水浸状病斑，背面生有灰白色霜样霉状物，果粒、果梗发病均布满白霜，果梗褐变坏死，果粒肩部变褐凹陷甚至脱落。(2)防治方法。①选用抗病品种。②清除越冬病原。晚秋剪除病枝，清除落叶落果和其他病组织，集中深埋或烧毁。图22-32 葡萄霜霉病（病叶）图22-33 葡萄霜霉病（发病植株）③喷药防治。可根据不同年份降雨和发病早晚来决定喷药时期和次数，一般在开花前后即需要进行喷药防治，尤其对多雨年份和多雨季节，更应及早进行防治。药剂以选用50%烯酰吗啉可湿性粉剂或40%悬浮剂为主，使用倍数为1000倍液，再加上其他辅助药剂，如94%霜脲氰800～1000倍液或30%醚菌酯悬浮剂3000～4000倍液或50%异菌脲悬浮剂1000～2000倍液或50%嘧菌酯水分散粒剂2500倍液或25%甲霜灵可湿性粉剂1000～1500倍液或40%乙膦铝可湿性粉剂200～300倍液等。(1)田间诊断。白粉病能为害所有绿色组织。该病主要为害叶片、枝梢及果实等部位，以幼嫩组织最敏感。葡萄展叶期叶片正面产生大小不等的不规则形黄色或褪绿色小斑块，病斑正反面均可见一层白色粉状物，粉斑下叶表面有褐色花斑，严重时全叶枯焦。新梢、果梗和穗轴初期表面产生不规则灰白色粉斑，后期粉斑下面形成雪花状或不规则的褐斑，可使穗轴、果梗变脆，枝梢生长受阻。幼果先出现褐绿色斑块，果面出现星芒状花纹，其上覆盖一层白粉状物，病果停止生长，有时变成畸形，果肉味酸；开始着色后果实在多雨时感病，病处裂开，之后腐烂。图22-34 葡萄白粉病（病果）图22-35 葡萄白粉病（病叶）(2)防治方法。①加强栽培管理，注意开沟排水，增施磷、钾肥，增强树势；冬季修剪时合理留枝，生长期间及时摘心、除副梢，保持良好的通风透光性，杜绝发病。②秋季清除病原，剪除病组织，清除枯枝落叶和落果。在发病初期摘除病组织。③发芽前喷5°Bé石硫合剂。发芽后喷1～2次0.3°～0.5°Bé石硫合剂或硫悬乳剂400倍液，也可喷托布津700～800倍液或醚菌酯1000～1500倍液。葡萄二星叶蝉又叫葡萄小叶蝉、葡萄斑叶蝉、葡萄二星浮尘子，属同翅目，叶蝉科。它分布于辽宁、河南、河北、山东、山西、陕西、安徽、江苏、浙江、湖南、湖北、广西、台湾、天津、北京等地。受害叶片失绿变色，影响光合产物生成，降低果实品质和枝条发育，造成叶片早期脱落。图22-36 葡萄二星叶蝉(1)田间诊断。以成虫、若虫为害叶片，虫体在叶背面为害，失绿斑在叶面表现突出，被害处产生灰白色失绿斑；很多斑相连则叶面变灰白色，叶背面被害处为浅黄褐色枯斑。(2)防治方法。①清除落叶及杂草，消灭越冬成虫。②夏季加强栽培管理，及时摘心、整枝、中耕、锄草、管理好副梢，保持良好的通风透光条件。③喷药防治。第一代若虫期喷敌杀死2000～3000倍液，防治效果95%以上，连喷两次，消灭第一代若虫可以控制全年虫害。也可喷敌敌畏1000倍液或功夫菊酯2000～3000倍液或90%敌百虫800倍液等。葡萄根瘤蚜属同翅目，瘤蚜科。它在辽宁、山东、陕西、台湾等地的局部葡萄园发生，其他地区尚未发现。葡萄园一旦发生，为害严重，所以已被列为主要检疫对象。(1)田间诊断。葡萄根瘤蚜对美洲品种为害严重，既能为害根部又能为害叶片；对欧亚品种和欧美杂种，主要为害根部。根部受害，须根端部膨大，出现小米粒大的、略呈菱形的瘤状结，在粗根上形成较大的瘤状突起。叶上受害，叶背形成许多粒状虫瘿。因此，葡萄根瘤蚜有“根瘤型”和“叶瘿型”之分。受害植株树势衰弱，提前黄叶、落叶，产量大幅度降低，严重时全株枯死。图22-37 葡萄根瘤蚜(2)防治方法。①严格检疫防治传播。严禁已发生区的苗木、枝条外运或引种。②苗木消毒。对苗木和枝条进行药剂处理时，可选用2.5%溴氰菊酯乳油3000倍液等菊酯类农药浸泡1min,以杀死苗木上的虫体。③土壤处理。对有根瘤蚜的葡萄园或苗圃，可用二硫化碳灌注。方法：在葡萄茎周围距茎25cm 处，每平方米打孔8～9 个，深10～15cm，春季每孔注入药液6～8g，夏季每孔注入4～6g，效果较好。但在花期和采收期不能使用，以免产生药害。还可以用50%辛硫磷 500g 拌入 50kg 细土，每 667m2 用药土 25kg，于15∶00—16∶00施药，随即翻入土内。葡萄透翅蛾又称葡萄透羽蛾，属鳞翅目，透翅蛾科。它在山东、河南、河北、陕西、吉林、内蒙古、江苏和浙江等地普遍发生，是葡萄产区主要害虫之一。(1)田间诊断。葡萄透翅蛾主要为害葡萄枝蔓。幼虫蛀食新梢和老蔓，被害处逐渐膨大，蛀入孔有褐色虫粪，是该虫为害标志。幼虫蛀入枝蔓后，向嫩蔓方向进食，严重时，被害植株上部枝叶枯死。图22-38 葡萄透翅蛾幼虫图22-39 葡萄透翅蛾(2)防治方法。①剪除虫枝。因被害处常有黄叶出现或枝蔓膨大增粗，冬、夏季经常检查，发现被蛀蔓要及时剪除、烧毁或深埋。②挖幼虫或虫孔灌药。当发现大蔓被害又不能去掉时，可用刀将蛀孔剥开，找到虫道，将幼虫挖出并向虫道内注入敌敌畏100倍液或塞入浸敌敌畏原液的棉球，而后用塑料薄膜将孔包扎封死，以熏杀幼虫。此外，虫口密度大的果园在成虫发生期可选2.5%溴氰菊酯乳油3000倍液等药交替使用，连喷2～3次。葡萄短须螨又称葡萄红蜘蛛属蜱螨目，细须螨科。此虫是我国葡萄产区主要的害虫之一，山东、河南、河北、辽宁、江苏、浙江等地发生较普遍。(1)田间诊断。以幼虫、若虫、成虫为害新梢、叶柄、叶片、果梗、穗梗及果实。新梢基部受害时，表皮产生褐色颗粒状突起。叶柄被害状与新梢相同。叶片被害，叶脉两侧呈褐锈斑，严重时叶片失绿变黄，枯焦脱落。果梗、穗梗被害后由褐色变成黑色，脆而易落。果粒被害前期有浅褐色锈斑，果面粗糙硬化，有时从果蒂向下纵裂。后期受害时，成熟果实色泽和含糖量降低，对葡萄产量和质量有很大影响。图22-40 葡萄短须螨(2)防治方法。①剪除被害严重的枝条。②晚秋剪枝后喷3°～5°Bé石硫合剂，喷药前去掉粗裂翘起的老皮。春季芽萌发前喷3°Bé石硫合剂。③生长季节喷药防治。展叶后，一般在5—6月造成严重为害前喷灭扫利、功夫菊酯2000～3000倍液及0.3°Bé石硫合剂等均有良好的防治效果，7—8月可再喷一次。一般每年喷两次杀螨剂即可控制虫害。引起枣锈病的病菌属担子菌纲，锈菌目。枣锈病别名串叶、雾烟病，在河北、河南、山东、山西、陕西、四川、云南、广西、湖北、江苏、浙江、台湾、福建等地的枣产区均有发生，常造成严重灾害，影响枣果产量和品质。(1)田间诊断。枣锈病主要为害树叶。发病初期，叶片背面多在中脉两侧及叶片尖端和基部散生浅绿色小点，逐渐形成暗黄褐色突起，即锈病菌的夏孢子堆。夏孢子堆埋生在表皮下，后期破裂，产生黄色粉状物，即夏孢子。发展到后期，在叶正面与夏孢子堆相对的位置出现绿色小点，使叶面呈现花叶状。病叶逐渐变为灰黄色，失去光泽，干枯脱落。树冠下部先落叶，逐渐向树冠上部发展。在落叶上有时形成冬孢子堆，黑褐色，稍凸起，但不突破表皮。图22-41 枣锈病(2)防治方法。①栽培不易过密，疏去过密枝保持树冠通风透光。②及时排除枣园积水。③7月中旬和8月中旬各喷一次200倍石灰倍量式波尔多液。枣疯病是枣树的毁灭性病害，在河北、辽宁、河南、山东、陕西、山西、江苏、浙江、福建、台湾、四川、广西、云南、湖北等地的枣产区都有发生，有些地区发病株率高达20%～30%，病株大多3～5年后死亡。(1)田间诊断。田间诊断如下。①花变叶或枝。花器退化，花柄延长，萼片、花瓣、雄蕊均变成小叶，雌蕊转化为小枝。②丛枝状。芽不正常萌发，病株一年生发育枝的主芽和多年生发育枝上的隐芽均萌发成发育枝，其上的芽又大部分萌发成小枝，如此逐级生枝。病枝纤细，节间缩短，呈丛状，叶片小而萎黄。图22-42 枣疯病③花叶。叶片病变，先是叶肉变黄，叶脉仍绿，以后整个叶片黄化，叶的边缘向上反卷，暗淡无光，叶片变硬、变脆，有的叶尖边缘焦枯，严重时病叶脱落。花后长出的叶片比较狭小，具明脉，翠绿色，易焦枯。有时在叶背面主脉上再长出一片小的明脉叶片，呈鼠耳状。④病果。病花一般不能结果。病株上的健枝仍可结果，果实大小不一，果面着色不匀，凸凹不平，凸起处为红色，凹处为绿色，果肉组织松软，不堪食用。⑤病根。疯树主根由于不定芽的大量萌发，往往长出一丛丛的短疯根，同一条根上可出现多丛疯根。后期病根皮层腐烂，严重者全株死亡。(2)防治方法。①及时刨除病株，清除病原。②育无毒苗，繁殖发展新果园。③消灭传播昆虫。枣炭疽病又称焦叶病。北方各枣区均有发生，以山西梨枣和新郑灰枣最易感病。该病多在果实近成熟期发生，导致产品品质降低，病果常提前脱落，严重者造成枣园绝产，失去经济价值。(1)田间诊断。枣炭疽病主要侵害果实，也可侵染各种营养器官，如枣吊、叶片、枣股等。受害叶片多为黄绿色，也有的呈黑褐色焦枯状悬挂在枣吊上；果实受害初期在果肩或果腰处会出现浅黄色水渍状斑点，并进一步扩大为不规则的黄褐色斑块，病斑中间呈圆形凹陷状，连片病斑呈红褐色。病果着色稍早，在空气相对湿度较高时，病斑上常产生许多黄褐色小突起，并分泌粉红色黏液。图22-43 枣炭疽病(2)防治方法。①早春清除枣园树体及地面上的枯枝、落叶和病果，园外烧毁或深埋。②枣树发芽前喷5°Bé的石硫合剂进行清园。③当果实进入白熟期前15d左右开始喷药防治，药剂可选用25%嘧菌酯悬浮剂1500～2000倍液或60%百泰(5%吡唑醚菌酯+55%代森联)1500倍液或30%醚菌酯悬浮剂2000～3000倍液等交替使用。枣褐斑病也称黑斑病、斑点病，是枣果实的主要病害之一，在北方枣区均有发生。(1)田间诊断。当枣果豆粒大便可受到侵染。初期幼果表面会出现针尖状大小的浅白色至白色突起，并迅速扩大，挤压破裂后会流出带菌的脓汁，病斑发展后期在果面上会产生形状不一的褐色病斑，导致果面溃烂，果实提早脱落。图22-44 枣褐斑病（叶片）图22-45 枣褐斑病（果实）(2)防治方法。①搞好早春清园。清扫枯枝、落叶、病果，园外烧毁。②萌芽前树体喷施3°～5°Bé的石硫合剂一次。③6—8月进行药剂防治，参考枣炭疽病。枣黏虫属鳞翅目，卷蛾科，又叫镰翅小卷蛾，在河北、河南、陕西、山西、山东、湖南、江苏等枣产区普遍发生，有的地区为害成灾，主要为害枣和酸枣。图22-46 枣黏虫(1)田间诊断。以幼虫为害叶片，常将枣吊或叶片吐丝缠卷成团或小包，将叶吃成缺刻和孔洞，串食花蕾并啃食幼果，幼果被啃食成坑坑洼洼的。(2)防治方法。①刮树皮消灭越冬蛹。②诱杀成虫。利用灯光或性诱剂诱杀成虫。9月树干绑草，诱集准备越冬的幼虫去化蛹，早春解除烧毁。③抓第一代幼虫发生期喷药防治，可喷二溴磷800倍液，也可喷敌敌畏800倍液或敌杀死2000倍液或喷功夫菊酯2000倍液及天王星等。集中发生期的前期和盛期各喷一次可控制此虫全年为害。密度大时第二代幼虫期再喷一次。成虫集中发生期可用20%甲氰菊酯乳油4000～6000倍液或2.5%溴氰菊酯乳油3000倍液等菊酯类农药交替使用，间隔10～15d，连喷2～4次以杀死幼虫。枣粉蚧属同翅目，粉蚧科，在河北、河南、山西、山东等枣产区普遍发生，在河北保定、石家庄大枣产区及沧州小枣产区常造成严重为害。此虫可造成叶片枯黄、枣果萎蔫、树势衰弱。(1)田间诊断。枣粉蚧的成虫、若虫和幼虫均可爬行为害，受害叶片枯黄，受害果实萎蔫，枝条衰弱，被害枝上常可看到披有白粉的虫体活动。此虫分泌白色透明的蜡质胶黏物招致黑霉，污染叶面和果面变黑。(2)防治方法。①发芽前刮树皮消灭越冬幼虫。②第一代幼虫期喷药防治，可参照枣黏虫的防治用药。枣步曲又叫枣尺蠖，俗名“顶门吃”，属鳞翅目，尺蛾科，以幼虫为害枣芽、叶片、枣吊、花蕾和新梢等绿色组织部分。幼虫在爬行时身体一曲一伸，故名“步曲”。此虫在北方各枣产区均有发生，在河北、河南、山东、山西等枣产区常造成严重为害。枣树刚发芽时，幼虫啃吃幼芽；密度大时可将全部幼芽吃光，也可将叶片吃光造成绝产或严重减产，而且影响下年产量，是枣树大害虫之一。(1)田间诊断。虫口密度小时将叶片吃成缺刻，芽被咬成孔洞。虫口密度大时，嫩芽被吃光，甚至将芽基部啃成小坑。后期幼虫将叶片吃光并啃食花蕾，只留下没叶片的枣吊。图22-47 枣步曲（幼虫行走状）(2)防治方法。①早春或晚秋挖越冬蛹，将树干周围1m范围内的土壤、深10cm的土层内的蛹挖出杀死。②树干距地15cm处，缠塑料裙阻止雌蛾上树，每天捕捉雌蛾杀死。树干基部10～15cm处涂粘虫环杀死上树雌蛾。可用蓖麻油1 kg、松香1 kg、石蜡10 g,将蓖麻油熬开加入石蜡，停火后放入松香，溶化即可。杀虫环宽10cm。③幼虫发生期，即枣萌芽期喷药防治。可喷敌杀死5000倍液等即可控制此虫为害。枣瘿蚊俗名“卷叶蛆”，属双翅目，瘿蚊科，在河北、河南、山东、山西等枣产区均有发生，有的年份可造成严重为害，引起落叶而减产。此虫主要为害各种枣和酸枣。(1)田间诊断。以幼虫为害叶片，主要为害嫩叶，叶受害后红肿，从叶面两侧向叶正面纵卷呈筒状，并变为紫红色，而后逐渐变黑枯萎脱落。图22-48 枣瘿蚊为害状(2)防治方法。①地面喷药消灭越冬幼虫。在发生严重的枣园，于5—6月树下喷洒1000倍液辛硫磷、敌杀死等。②枣树萌芽期展叶前喷药防治，可参照枣黏虫的防治用药。图22-49 枣瘿蚊（成虫）果树生长发育既需要氮(N)、磷(P)、钾(K)、钙(Ca)等大量元素，又需要镁(Mg)、铁(Fe)、硼(B)、锌(Zn)等微量元素。果树生长需要均衡营养，平衡施肥，所有元素不缺乏，这样才能达到果树生长健壮、果实品质最好和产量最高的目的。果树在生长过程中缺少哪种营养元素都会表现出相应的症状。例如，缺铁出现黄叶；缺锌出现小叶；缺钙发生流胶、黑点、枯梢、裂果；缺硼出现畸形果、粗皮枝、果肉褐化等。所以说，果树营养元素的平衡是果树正常发育和结果的重要条件，任何一种元素的缺乏都会对果树造成不同程度的生理病害。因此，生产上可以根据果树表现，判断缺乏的营养元素，及时补充，就能取得好的增产、增质效果。氮肥可以促进果树的营养生长，提高光合效能，减少落花落果，加速果实膨大，并能促进花芽分化，增进果实的品质和产量。磷能促进花芽分化，提早开花结果，促进果实、种子成熟，改进果实品质，促进根系生长，提高果树抗寒、抗旱、抗盐碱等方面的能力。钾充足时，能促进枝条加粗生长，提高抗旱、抗寒、耐高温和抗病虫的能力，特别能使果实肥大和成熟、着色良好、品质佳、裂果少、耐储藏，所以，有人把钾肥称作“果实肥”。钙有利于植物抗旱、抗热，在果树内起着平衡生理活性的作用。钙对土壤微生物的活动和杀虫灭菌也有较好的效果。(1)缺氮。若氮素不足，则树体营养不良，叶片黄化，新梢细弱，落花落果严重，缩短寿命。长期缺氮，则导致树体衰弱，抗逆性降低。防治方法：及时追施尿素、硝酸铵等氮素化肥。(2)缺磷。磷素不足表现为果树萌芽、开花延迟，新梢和细根生长减弱，并影响果实的品质，抗寒和抗旱力降低。防治方法：展叶后，叶面喷布0.5%～1%过磷酸钙；在根系分布层施磷肥颗粒。(3)缺钾。缺钾果树叶小、果小，裂果严重，着色不良，含糖量低，味酸，落果早。防治方法：6—7月追施草木灰、磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸钾、硝酸钾等钾肥，叶面追施浓度为3%～10%的草木灰浸出液，以上其他钾肥浓度为0.5%～1%。并增施有机肥料，注意合理搭配氮、磷、钾比例。(4)缺钙。缺钙果树的根系生长不良，枝条枯死，花朵萎缩，核果类果树易得流胶病和根癌病。果实腐烂和缺钙密切相关，含钙多的果实的耐储性明显提高。防治方法：在生长季节叶面喷施氯化钙200倍液，连喷3～4遍，最后一次宜在采收前三周进行；干旱季节适时灌水，雨季及时排水；增施有机肥料，适期、适量使用氮肥，以增加钙的有效度。果树在生长发育过程中，除需要氮、磷、钾、钙等大量元素外，还需要镁、铁、锌、锰、硼等微量元素。在果树生产中，若果树缺少某种微量元素，则会出现小叶病、黄叶病、缩果皮硬病等生理病害，这就是缺少微量元素症。(1)缺镁。镁是叶绿素的组成部分，缺镁时果树不能形成叶绿素，叶变黄而早落，首先在老叶中表现。(2)缺铁。铁对叶绿素的形成起重要作用，缺铁的典型症状就是幼叶首先失绿，叶肉呈浅绿色或黄绿色，随病情加重，除中脉及少数叶脉外，全叶变黄甚至为白色，发生我们平时常说的黄化现象，即黄叶病。(3)缺锌。锌是许多酶类的组成成分，在缺锌的情况下，生长素少，植物细胞只分裂而不能伸长，又缺乏蛋白质，所以苹果、桃等果树常发生小叶病。典型症状是幼叶小，簇生，有杂色斑和失绿现象，枝条生长受阻。严重缺锌时，果树生长不均匀，缺锌的枝条上芽不萌发或早落，形成光秃的枝条，只在顶端有一丛簇叶。葡萄缺锌时，叶片靠近叶柄的裂片变宽，果穗疏松，颗粒大小不齐，但果形正常。核果类缺锌时，沿叶缘有不规则的失绿区，然后从叶脉到叶缘出现一条连续的黄色带，花芽少，果实也少，果实小且常成畸形果，其中桃和李的果实变得扁平。(4)缺硼。硼能促进开花结果，促进花粉管萌发，对子房发育也有一定作用，缺硼常引起输导组织的坏死，使苹果、梨、桃等果树发生缩果病，同时还发生枯梢及簇叶现象。果实发生症状往往在枝叶之前，不同树种或不同缺硼程度的表现有一定差异。苹果与梨的表现症状基本一致。早期缺硼果实不发育、畸形、果面凹凸不平似猴头，果皮上有水渍状坏死区，以后变硬呈褐色，果皮发生裂缝、皱缩，果肉内形成木栓；如果果实生长后期缺硼，则果实大小不变，但果肉内呈分散的木栓组织，有时则是大片溃疡。梨缺硼时，果实萼凹末端常有石细胞。李子缺硼时，果肉有褐色下陷区，或呈斑点状或布满整个果实，下陷部的果肉变硬，有时硬肉可达果心，受害果着色早、易早落、果肉内形成胶状物空穴。葡萄则因缺硼影响浆果的生长，以致果实呈扁球形。桃树缺硼后在果实近核处发生褐色木栓区，常会沿缝线裂开。苹果缺硼，枝条的顶端韧皮部及形成层中呈现细小的坏死区，这种坏死区常发生在叶腋下面的组织。另外，葡萄缺硼时叶片皱缩，杏缺硼时叶片常发生卷曲现象。缺硼的果树，一般叶片上都有坏死斑或坏死区。(5)缺锰。锰在一定程度上影响叶绿素的形成，在代谢中通过酶的反应保持体内氧化还原电位平衡。缺锰时，果树也常常表现失绿。叶片沿主脉从边缘开始失绿，以后逐渐扩展到侧脉。症状首先在完全展开的叶片上发生，以后蔓延至全树，但顶梢的新生叶仍为绿色。苹果、梨、桃严重缺锰时，生长受阻；葡萄缺锰时，叶片靠近叶柄的裂片不变宽。在果树生产中，如果发现果树患小叶病、黄叶病、缩果病等生理病害，应及时补施硫酸锌、硫酸亚铁、硼砂等微量元素，以恢复果树正常发育。(1)叶面喷施。叶面喷施是一种常规方法，把微量元素加水稀释后，在生长季节直接喷洒到叶面上(以叶片为主)，从上至下让果树均匀挂液，微量元素可从叶表皮细胞和气孔进入树体内发挥效能。若发生黄叶病，每半月可喷一次0.3%～0.5%的硫酸亚铁溶液；若发生小叶病，可喷0.1%～0.4%的硫酸锌溶液；当果实出现畸形、果皮变硬、皱缩时，可用0.1%～0.5%的硼砂溶液或0.1%～0.5%的硼酸溶液喷洒树冠；如果叶变黄、早落，应及时喷洒15%的硫酸镁溶液治疗；缺锰的果树也表现为失绿，可用0.3%～0.5%的氧化锰溶液喷洒。(2)土壤施。将硫酸亚铁、硼砂、氧化锰、硫酸镁等与有机肥料混合，于早秋果实采收后与基肥一起施入根系分布区。盛果期的果树每棵施硼砂150～250 g、硫酸亚铁240～260 g、氧化锰15～18 g。(3)树干引注法。先取两个50 ml的玻璃瓶，内装待补微量元素溶液，在距地面20cm高的树干两侧钻孔，深至形成层，并在每个孔附近各挂一个瓶，然后用棉花捻成棉芯，将其一端插在树干孔内，另一端放入瓶内，让其慢慢吸收。注射0.2%的硫酸亚铁溶液可防治黄叶病，注射0.25%的硼砂溶液可防治缩果。(4)树根吸湿法。选择容积100ml的玻璃瓶，内盛待补的微量元素营养液，在距果树根1 m处挖坑，当露出树根后，挑选一个粗0.5～1cm的树根，剪去根梢，把连接树根的那段根插入瓶内，瓶口用塑料布包裹，把树根连同瓶子一起埋入地下，让其缓慢吸收。(5)涂枝法。在果树发芽后，对于病枝，可把配好的待补微量元素溶液用刷子或毛笔蘸液抹刷1～2年生枝条，隔10～15d再抹一次，能使果树较快地恢复生机。冻害是指果树受0℃以下低温所造成的伤害。冻害在整个冬季均可发生，但每个具体时期所受害的部位及表现又有差别。(1)树干冻害。树干冻害部位大致是距地表15cm以上至1.5 m以下处。表现为皮层的形成层变黑色，严重时木质部、髓部都变成黑色；受冻后有时形成纵裂，沿缝隙脱离木质部。核果类果树多半有流胶现象，轻者可随温度的升高而逐渐愈合；严重时裂皮外翘不易愈合，植株死亡。(2)枝条冻害。一年生枝以先端成熟不良部分最易受冻，表现为自上而下地脱水和干枯。多年生枝，特别是大骨干枝，其基角内部、分枝角度小的分支处或有伤口的部位，很易遭受积雪冻害或一般性冻害。枝条冻害常表现为树皮局部冻伤，最初微变色下陷，皮部变黑、裂开和脱落，逐渐干枯死亡；如受害较轻，形成层没有受伤，则可逐渐恢复。枝干受冻后极易感染腐烂病和干腐病，应注意预防。(3)根颈冻害。根颈冻害指地上部与地下部交界的部位受冻。根颈受冻后，表现为皮层变黑，易剥离。轻则只在局部发生，引起树势衰弱；重则形成黑色，环绕根颈一圈后全树死亡。(4)根系冻害。各种果树的根系均较其地上部耐寒力弱。根系受冻后变褐，根韧皮部与木质部易分离。地上部表现为发芽晚、生长弱。(5)花芽冻害。花芽冻害多出现在冬末春初，另外，深冬季节如果气温短暂升高，也会降低花芽的抗寒力，导致花芽被冻害。花芽活动与萌发越早，遇早春回寒就越易受冻。花芽受冻后，表现为芽鳞松散，髓部及鳞片基部变黑。严重时，花芽干枯死亡，俗称“僵芽”。花芽前期受冻是花原基整体或其一部分受冻，后期为雌蕊受冻，柱头变黑并干枯，有时幼胚或花托也受冻。(1)选择抗寒品种，利用抗寒砧木。根据当地的气象条件，因地制宜，选择抗寒品种。利用抗寒砧木是预防冻害最为有效而可靠的途径。而对于成龄果园，如所栽植品种抗寒能力差，则应考虑高接，换成抗寒能力强的品种。(2)适时保护树干。在土壤结冻前，对果树主干和主枝涂白、干基培土、主干包草和灌足封冻水。在多雪易成灾的地区，雪后应及时震落树上的积雪，并扫除树干周围的积雪，防止因融雪期融冻交替，冷热不均而引起冻害。(3)阻挡冷气入园。新建果园应避开风口处、阴坡地和易遭冷气袭击的低洼地。已建成的果园，应在果园上风口栽植防风林或挡风墙，减弱冷气侵入果园的强度。(4)保护受冻果树。对已遭受冻害的果树，应及时去除被冻死的枝干，并对较大的伤口进行消毒保护，以防止腐烂病菌侵入。(5)加强综合管理，提高树体储藏营养的水平，增强树体抗冻性。主要包括：做好疏花疏果工作，合理调节负载量；适时采收，减少营养消耗；秋季早施基肥，利用秋季根系生长高峰期，以提高树体储藏营养水平；树体生长后期，叶面多次喷施磷酸二氢钾等速效性肥料，提高叶片光合能力，提高树体的抗冻性。果树抽条是指冬末春初果树枝条失水后皱条、抽干，一般多在一年生枝上发生，随着枝条年龄的增加，抽条率会下降。抽条的发生是因为枝条水分平衡失调所致，即初春气温升高，空气干燥度增大，幼枝解除休眠早，水分蒸腾量猛增，而地温回升慢，温度低，根系吸水力弱，导致枝条失水抽干。（1）冬春期间由于土壤水分冻结或地温过低，根系不能或极少吸收水分，而地上部枝条蒸腾强烈，这是造成抽条的根本原因。（2）晚秋树体贪青旺长，落叶推迟，枝条组织疏松幼嫩，病虫害较重等均会引起严重抽条，相反则抽条较轻或不抽条。(1)适地建园。根据各地区的气象条件，因地制宜地发展适宜的树种和品种。小面积栽植时，可选择小气候好、背风向阳、地下水位低、土层深厚、疏松的地段建园，避开阴坡、高水位和瘠薄地建园。(2)创造良好的根际小气候，提高地温。于土壤结冻前，在树干西北侧距树干50cm左右的地方，培高40cm左右的半月形土埂，为植株根际创造一个背风向阳的小气候环境，从而使地温回升早，结冻提前。有条件的果园，若能在土埂内覆盖地膜，则可显著提高土壤温度，防止抽条效果更佳。(3)对树体进行保护。埋土防寒是防止树枝抽条最可靠的保护措施。在土壤结冻前，在树干基部有害风向(一般是西北方向)处先垫好枕土，将幼树主干适当软化后使其缓慢弯曲，压倒在枕土上，然后培土压实，枝条应全部盖严不外露、不透风。翌春萌芽前挖出幼树并扶直。此法可有效地防止幼树抽条，但仅适用于1～2年生小树，主干较粗时则难以操作。而针对较大的植株防止抽条时，则多用扎草把、缠塑料薄膜条、喷聚乙烯醇或羧甲基纤维素等措施。具体方法是：用塑料膜条缠树干时可选用较宽的塑料膜条，缠枝时可用较窄的塑料膜条，操作时要缠绕严、紧，不得留空隙。另外，扎草把时，要将草把扎到主枝分枝处，在其底部堆土培严即可。无论缠塑料条、扎草把均应在春季土壤解冻后、萌芽前及时去除根颈培土和绑缚物。(4)加强综合管理，提高树体储藏营养的水平，提高树体抗寒性。方法同冻害防治技术。(5)保护抽条树。对已发生抽条的幼树，在萌芽后，剪除已抽干枯死部分，促其下部潜伏芽抽生枝条，并从中选择位置好、方向合适的留下，培养成骨干枝，以尽快恢复树冠。果树日灼病，又名日烧病，简称灼伤或灼害，是由于强烈的阳光长时间直射在树干、树叶和果实上，破坏了照射部位的细胞和组织，使其不能再生长发育。受害的苹果表现为阳面失水焦枯，产生红褐色近圆形斑点，斑点逐渐扩大，最后形成黑褐色病斑，周围有浅黄色晕圈，严重影响苹果商品价值。7—8月是预防日灼病的关键时期，应采取有效措施减少该病的发生。灼伤部常因病菌侵染而引发其他病害，对此应积极预防。（1）受树体病害影响（腐烂病、根腐病、干腐病）。（2）受果园土壤水分含量低影响。高温下蒸腾量猛增，根部吸收水分远不能满足蒸腾损失，严重破坏了果树体内水分平衡，使干旱果园出现严重的叶片烫伤，套袋果实袋内温度比自然界温度高出10%以上，一般在48℃以上，发生日灼。日灼病对套袋苹果和树势弱的梨树叶片危害极为严重，常使部分果园出现严重烫伤。经调查，苹果树病果率一般在5%～20%，梨树病叶率一般在5%～15%,严重的高达30%左右。(1)灌水法。在高温期前全园浇水，提高土壤含水量。据试验，未灌水区日烧果率为14%,而灌水区日烧果率只有5%，并且单果较大。(2)施肥法。加强果园管理，增施有机肥，多施磷肥，促进根系向深层生长，使果树生长根健壮，或者间种绿肥作物，掩青沤肥，增加土壤有机质，提高土壤持水力。并且多注意病虫害的防治，增强树体抗御高温的能力。(3)覆盖法。在高温、干旱来临之前，在树盘上覆一层20cm厚的秸秆、草或麦糠等，既可保墒，又能降低地温，可以防止日灼病的发生。一般覆盖区比裸露区土壤含水量高出2%～3%。此法尤其适用沙地果树。(4)果面遮盖。在易出现日灼病的果实阳面覆盖叶面积较大的桐树叶、蓖麻叶或阔叶草等，可减少烈日直射。(5)喷涂石灰乳。在苹果阳面涂抹一层石灰乳，既能反光，防止日烧，又能杀菌。(6)涂白法。用生石灰10～12份、石硫合剂2份、食盐1～2份、黏土2份、水36～40份，先将石灰用水化开，滤去不溶的渣砾，倒入已化开的食盐水，用刷子涂在树干及大枝上，利用白涂剂反射日光，使日光直射光折回一部分，减轻日灼的发生。(7)结合喷药傍晚喷清水。如果出现苹果日灼病可能发生的天气，应在太阳落山时或斜射时向树叶片和果面喷施0.2%～0.3%磷酸二氢钾，或者向树冠喷清水，以减轻日灼。未选用优质的果实袋、套袋果实未悬在袋内当空而是靠贴在袋上，以及一次性除去套袋或在高温且强日照天气时除去套袋，套袋苹果也会引发日灼。此外，树势衰弱、挂果部位不好、果树管理较差，都会使套袋苹果发生日灼。防治套袋苹果发生日灼，首先要选择优质袋，套袋的技术操作要规范。套袋时间以8∶00—10∶00和14∶00—16∶00为宜。除袋要分次进行，不要在中午高温天气时去袋，上午除去树冠西、北两侧的套袋，下午除去东、南两侧的套袋。如果天气干旱，套袋前或除去套袋前3～5d要各浇水一次。霜冻是指果树在生长期夜晚土壤和植株表面温度暂时降至零度或零度以下，引起果树幼嫩部分遭受伤害的现象。而霜冻又有早霜和晚霜之分。在秋末发生的霜冻，称为早霜。早霜只对一些生长结果较晚的品种和植株形成危害，常使叶片和枝梢枯死，果实不能充分成熟，进而影响果实品质和产量。早霜发生越早，危害越重。在春季发生的霜冻，称为晚霜。它于自萌芽至幼果期发生，并且发病越晚则造成的危害越重。(1)选择适地建园。霜冻是冷空气集聚的结果，如空气流通不畅的低洼地、闭合的山谷地容易形成霜穴，使霜害加重，这就是果农常说的“风刮岗、霜打洼”。因此，新建果园时，应避开霜穴地段，可减轻霜冻危害。(2)选择抗冻品种。选择花期较晚的品种躲避霜害或花期虽早但抗冻力较强的树种和品种。(3)果园熏烟防霜。熏烟防霜是指利用浓密烟雾防止土壤热量的辐射散发，烟粒吸收湿气，使水汽凝成液体而放出热量，提高地温。这种方法只能在最低温度为-2℃的情况下才有明显的效果。当果园内气温降到2℃时，及时点燃放烟。防霜烟雾剂的常用配方是：硝酸铵20%～30%，锯末50%～60%，废柴油10%，细煤粉10%,将其搅拌均匀装入容器内备用，每667m2地设置3～4个发烟器即可。(4)延迟萌芽期，避开霜灾。有灌溉条件的果园，在花开前灌水，可显著降低地温，推迟花期2～3d。将枝干涂白，通过反射阳光，减缓树体温度升高的速度，延迟花期3～5d。树体萌芽初期，全树喷布氯化钙200倍液，可延迟花期3～5d。(5)保护受霜害的果园。对花期遭受霜害的果树加强人工授粉，树体喷施氨基酸微肥，增强树体营养，喷施硼砂或硼酸等提高坐果率，降低减产幅度。