杨树水泡溃疡病（Botryosphaeria dothidea）是为害杨树的重要病害，影响植株生长甚至导致死亡，近年来随着杨树栽植面积的快速增大，杨树水泡溃疡病发病益显严重。目前对该病的防治对策以壮树防病结合化学药剂防治为主，鉴于人类对环境质量要求的提高，生物防治日益受到人们关注。植物内生细菌是一种重要的生物农药来源，其不仅可以抑制病原微生物的生长，还可以促进寄主的生长。因此，越来越受到植物病理学家的重视。目前国内外已有从不同植物中获得内生菌的报道，但杨树内生菌尚未见报道。我们尝试从杨树上获得内生细菌，为用于杨树病害的生物防治奠定基础。杨树水泡溃疡病（ Botryosphaeria dothidea）害标本由本实验室保存。分离材料取自山东省泰安市区和市郊绿化或用材杨树，将带杨树水泡溃疡病病斑的组织用常规稀释方法[1]，分离内生细菌。对分离得到的内生细菌进行划线培养，挑取单菌落纯化保存。将分离获得内生菌PE0704进行菌落形态观察、革兰氏染色、芽孢染色、鞭毛染色[2]，并对PE0704的16SrDNA序列进行扩增、测序和序列分析。取PE0704菌体，以对峙培养法测定其对杨树水泡溃疡病菌菌丝生长的抑制作用，采用凹穴法测定其对病原菌孢子萌发的抑制作用。设置不同的发酵条件，对PE0704进行发酵培养，测定发酵液对杨树水泡溃疡病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用。不同的分离方法对杨树内生细菌的分离效果不同。尤其是组织块的破碎程度以及经消毒、破碎后的组织块是否振荡处理，对内生细菌的分离影响很大。改进的分离方法如下：首先将组织块用75%的酒精、5%的NaClO进行表面消毒，研碎，然后在25℃下振荡培养2h，取培养液，按常规稀释法稀释、涂板，置28℃下培养。利用该方法，从杨树中获得37个内生细菌菌株。经初步筛选得到了对杨树水泡溃疡病菌抑菌活性较好的内生细菌菌株，其中菌株PE0704抑菌效果表现最好。将PE0704在NB平板培养基上划线培养，培养24h时菌落表现为白色、椭圆形、边缘整齐、中央凹陷、表面干燥、粗糙、不透明。该菌体短棒形，两端钝圆，产芽孢、中生、周生鞭毛、革兰氏染色为阳性。对PE0704的16SrDNA进行扩增、测序，共获得该菌16SrDNA的全长为1500bp的部分序列，该序列通过NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）进行BLAST比对，与已报道的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的16SrDNA序列相似度高，其中与枯草芽孢杆菌（B.subtilis）（AB016721.1）等的相似度高达97%以上。结合该菌的菌体形态和染色反应结果，参照《常见细菌系统手册》（第1版）[3]，基本确定该菌株为B.subtilis。PE0704的菌体对杨树水泡溃疡病菌的菌丝生长有较强的抑制作用，能够明显抑制菌落生长直径，并导致菌丝形态发生了显著变化。镜检发现，其菌丝细胞粗短，扭曲；菌丝顶端和中部细胞膨大成球形或椭圆形；随着时间的延长畸变程度加重，菌丝出现断裂、变成空泡。PE0704的菌体能够抑制杨树水泡溃疡病病菌的孢子萌发，并引起萌发孢子的芽管畸变、其菌丝畸形。对PE0704进行不同条件的发酵培养，结果发现，PE0704的发酵液能够抑制杨树水泡溃疡病菌的菌丝生长和孢子萌发，并引起菌丝形态异常。在几种供试培养基中，在BPY中培养获得的发酵液的抑制作用最强，振荡培养72h的发酵液开始表现明显抑菌作用，96h的抑菌作用最强。杨树中存在着对杨树水泡溃疡病菌具有抑制作用的内生细菌，本试验从杨树中获得了37个内生细菌菌株，部分具有抑菌活性。通过菌落形态观察，革兰氏染色、芽孢染色、鞭毛染色，并经16SrDNA序列分析，确定获得的内生菌株PE0704为枯草芽孢杆菌（B.subtilis）。PE0704菌的菌体和发酵滤液对杨树水泡溃疡病菌菌丝生长和孢子萌发都有较好的抑制效果，能够抑制其菌落生长，并引起菌丝形态产生畸形，能够抑制病原菌孢子萌发，并引起其芽管畸形。鉴于PE0704对杨树水泡溃疡病菌的良好作用效果，可进一步开展菌株拮抗作用机理和发酵条件的研究，为生物农药的研发提供重要依据。

目前的机制解析工作集中在对QS转录调控的研究。利用pcoI：：lacZ的染色体融合报告菌株，通过转座子Tn5随机插入突变，获得了一系列QS系统的上游调控因子。GacS/GacA双因子调控系统正调控QS系统的表达，同时正调控抗生素2，4-DAPG、氢氰酸和蛋白酶等的产生。该系统位于生防相关性状表达的信号传递链上游（图1），对生防功能起到重要的调控作用。通过转座子随机突变，还得到rpoS基因等一系列QS系统的负调控基因，其调控机制及与生防能力的关系正在研究中。图1 Pseudomonas fluorescens 2P24中与生防性状相关调控因子作用模式图

The small brown planthoppers(Laodelphax striatellus)is an important pest in single late rice seedling stage in Zhejiang province and also the vector of the rice stripe virus,threatened paddy rice production.Through the investigation of transplanting time of rice seeding,occurrence quantity and carriage rate of overwinter and the first generation of the small brown planthoppers in wheat field and weed at the beginning of 2007,the small brown planthoppers mainly immigrated Early Sowing single late rice seedling from wheat field and weeds.The generation of the small brown planthoppers is the most serious in sowing single late rice seedling,and easily arouse the outbreak of the rice stripe virus.Currently,control strategy of the rice stripe virus is"cut off a poisonous chain,cure insect to control the disease".During the last years,by investigating the small brown planthoppers quantity in rice seedling stage and adopting chemistry prevention at different number of times to control it,we research the relationship between the small brown planthoppers quantity in rice seedling stage and the incidence of the rice stripe virus for explicating the affection of insect quantity in rice seedling stage and chemistry prevention to incidence of the rice stripe virus.Now we report the result as follows.Agent:40%Chlorpyrifos(zhejiang xinnong chemical company limited).Experimental field is in the experimental area of Shuangqiao academy of agricultural science in Xiuzhou district of Jiaxing City;rice variety is Jia 991 and is offered by Jiaxing academy of agricultural science.1.2.1 Seed treatment May 10 in 2007,rice seed is immersed in 2000 times'402 liquid over72h.May 13,we took it out and flushed with the clear water,then put it in the thermostat in 37℃ in order to pregerminate and seeded on May 15.1.2.2 Experimental design The rice seedling bed is divided into 15 small areas that is 2m2 and each small area stays the partition of 30cm.Each small area is sowed seeds quantity homology.15 small areas are divided into 5 processing and the everywhere manages 3 small areas.5 processing differences expect:no application,once application,2 times application,3 times application and 4 times application in the rice seedling stage.Application of time is such as the table 1.The agent of prevention chooses to 40%Chlorpyrifos that diluted to 500 times liquids to spray.ApplicationtimeApplicationnumberoftimes0times1times2times3times4times5/24√√√√6/1√√√6/8√√6/15√Table 1 Different application number of times and time1.2.3 Investigation of the small brown planthoppers quantity in rice seedling stage and incidence of the rice stripe virus We have investigated the small brown planthoppers quantity of every small area in rice seedling bed before application since May 24.The small area is investigated in 3 point and everywhere is 0.11m2,and we statistics the average of insect quantity in each point and compare with the quantity in different processing.We statistics the amount of rice seedling and the number of infected plants in every small area on June 20 when the rice seedling transplanted to the field,and computed the incidence of the rice stripe virus in each area.1.2.4 Incidence of the rice stripe virus in the field After investigating incidence of the rice stripe virus in rice seedling stage,we transplanted the rice seedling from 5 processing area including no preventing,preventing once,2 times,3 times,4 times into the field,and periodical investigated the incidence of the rice stripe virus in the field.Each small area is chose 5 points while investigating,and investigated 250 stubs on each point and computed incidence in every small area.2.1.1 The small brown planthoppers quantity in rice seedling stage Investigate a result on May 24,The small brown planthoppers all is longwing adults in each small rice seedling area,and the insect quantity is 138 in each 0.11m2;amount of insect in the field has a little bit decrease on June 1;on June 8 it obviously reduces and the number of egg and low instar nymphst increases gradually;until June 15 it has been basically low instar nymphst.The result of investigation indicates,from June 1 to May 24,the insect quantity of every processing area presents to a descend trend,but the decrease range of the insect quantity in applicationarea is higher than in no application;From June 1 to June 15,the insect quantity of no and once application area increases gradually,which are higher than the cardinal number of ex-experiment,but the amount of insect in the other application areas have gradually decrease,see table 2,figure 1.Date(month/day)0time1time2times3times4times5/241381451621431526/11191121251161206/8211175142122986/152471991398465Rateofincreasesordecrease(%)78.9937.24-14.20-41.26-57.24Table 2 Investigation of the small brown planthoppers quantity in different processing areas of rice seedlingFigure 1 Investigation of the small brown planthoppers quantity in different processing aras of rice seeldingWith the insect quantity of ex-application in each small area for cardinal number,compared with the amount of the last investigation,the insect quantity in no and once application area increased by 78.99%and 37.24%respectively,but it in 2 times,3 times and 4 times application area reduced by 14.20%,41.26%and 57.24%respectively.Experiment indicates,application inrice seedling bed can effectively repress the small brown planthoppers quantity in the field,and with application number of times increasing,which restraint effect is strengthen and amount of insect in small area reduces 57.24%with 4 times application.2.1.2 Investigation of the incidence of the rice stripe virus in rice seedling bed The investigation of incidence of the rice stripe virus on that day when the rice seedling was transplanted to the field,there is all discovered diseased plants in each small areas,but which number in the small area of no application is obviously more than the application area.The incidence of no,once,2 times,3 times and 4 times application areas respectively is 5.53%,3.90%,2.27%,1.50%and 1.36%,see table 3.Experiment enunciation,application in the rice seedling bed is not only lower amount of the small brown planthoppers in the field,but also ease occurrence of rice stripe in rice seedling bed.ApplicationtimesInriceseedlingbedDiseasedplantAmountIncidence(%)Reductionrateofriceseedling(%)InthefieldDiseasedplantAmountIncidence(%)Reductionrateofthefield(%)0time993179655.530237129618.2901time719184293.9029.48170113814.9418.322times404178302.2758.95116102011.3737.833times270180211.5072.887311016.6363.754times247181541.3675.416114234.2976.54Table 3 The investigation of incidence of the rice stripe virus in rice seedling bed(Jiaxing,2006)Seen from the investigation of the incidence of rice stripe virus with the different processing,the incidence in rice seedling bed of no application is lowered by 29.48%compared with once time application;compared with 2 times,the incidence is lowered by 29.47%with once application,and it is descended by 13.19%compared 2 times with 3 times;but compared 4 times application with 3 times,the incidence in rice seedling bed is only lowered 2.53%.This is because of the rice stripe virus has an incubation stage in rice plant after infection,and there is 12 days at least from infecting to outbreak;than the outbreak of rice stripe virus in rice seedling bed is on June 20.So that ex-3 times application depressed the cardinal number of the small brown planthoppers,and reduced the infection and the incidence of the rice stripe virus in rice seedling bed.But it is not obviously influencing for the incidence in rice seedling bed with the 4th time application on June 15.The result that we periodic investigate the rice stripe virus in the field,the incidence in the field is basically stability after transplanting 40 days,and no longer appear a new disable plant.Because on the rice seedling stage we adopted the chemistry prevention with different number of times,the incidence of the rice stripe virus exists difference after the rice seedling transplanted to the field.The incidence is the tallest in no application small area and lowest in 4 times application small area.Along with the increment of application number of times,the incidence presents to obviously descend trend.With no,once,2 times,3 times,4 times application the incidence is in order to 18.29%,14.94%,11.37%,6.63%and 4.29%in the field.It is shown that application in the rice seedling bed depressed the small brown planthoppers quantity,and the function is very obviously for ease the occurrence of the rice stripe virus.Analyzed the incidence of the rice stripe virus in various processing,it in the field with once and two times application distinctly descend 18.23%and 37.83%compared with no application;but when with the application number of times increase to 3 times,the descends range of the incidence is 63.75%and prevent effect is obviously higher than that with 2 times application,than after 4 times application the incidence descend to come to 76.54%.The relationship between the small brown planthoppers quantity in rice seedling bed and incidence of rice stripe in rice seedling bed and field analytical,such as table 4,figure 2 shown.The relativity analyzes indicated,the small brown planthoppers quantity(x)and incidence of rice stripe in rice seedling bed(y)relation type is y=0.03 x+2.89,related coefficient r=0.99**;the small brown planthoppers quantity(x)and incidence of rice stripe in the field(y)relation type is y=0.10x+11.03,related coefficient r=0.98**.The relationship between the small brown planthoppers quantity and incidence of rice stripe virus in rice seedling bed and field present positive correlation.ApplicationtimesChangerateofthequantity(%)Incidenceinriceseedlingbed(%)Incidenceinthefield(%)0time78.995.5618.292times37.243.8914.943times-14.202.2711.375times-41.261.506.636times-57.241.364.29Table 4 The investigation of the small brown planthoppers quantity and incidence of the rice stripe virus(Jiaxing,2006)It is very obvious that preventing the small brown planthoppers in rice seedling bed for controlling the occurrence of the rice stripe virus.The result of adopting the different application times indicates,that is repressed growth of the small brown planthoppers quantity,and also eased the occurrence of the rice stripe virus with increasing the application number of times.As the result of the test shows,there is the forward relationship between the range of incidence and application times;through investigating the incidence in the field,we can confirm that reasonable application is effectively to controlling the occurrence of the rice stripe virus.Moreover analysis of the relationship between the small brown planthoppers quantity,incidence of the rice stripe virus in rice seedling bed and it in the flied,there have a positive correlation.Experiment shows,the reasonable and multiple application in rice seedling bed is the effective means to reduce the small brown planthoppers quantity and controlling the rice stripe virus.The controlling effect of the rice stripe virus is reached 70%with application 3 or 4 times on rice seedling stage.Therefore we suggest that we should pay attention to controlling the small brown planthoppers of the rice seedling bed at the rice stripe virus heavier region or age,especially in the rice seedling bed where sow seeds early and easily cause the small brown planthoppers centralize immigration.In order to prevent effectively,we should increase the number of application times to lower the small brown planthoppers quantity in the field,and control the harm of the rice stripe virus.Figure 2 Relationship between the small brown planthoppers quantity andin cidence of rice stripe virus in different prevention of rice seedling bed

2006年10月以来，温州市乐清、瑞安、苍南、瓯海、龙湾等地设施栽培的番茄上相继发生了一种新的严重为害蔬菜的病毒病——番茄曲叶病毒病。在各县有关部门的大力协助下立即从5个不同地点采集了病症表现典型的番茄植株样本，送到浙江大学生物技术研究所鉴定，经该研究所对病样用超薄切片电镜观察、酶学检测（ELISA）、分子检测，确认为台湾番茄曲叶病毒（Tomato leaf curl Tanwan virus，TLCV）。该病毒在温州市系首次发现，经检索国内未见报道。番茄曲叶病毒病是一种毁灭性的病害，是世界许多地区番茄生产上的重要限制因素，各地务必引起高度重视。据调查，2006年12月在苍南县灵溪镇河口叶村蔬菜基地、瑞安市梅屿乡外三甲村蔬菜基地、瓯海区新桥、娄桥街道蔬菜基地、乐清市虹桥镇武宅村，秋季定植的越冬番茄病毒病的株发病率为3%～30%；龙湾区天河镇蔬菜示范园区、乐清市蒲岐镇东门外村番茄受害最重，许多田块株发病率高达95%以上，农民已基本放弃管理或拉秧改种。据初步统计，2006年初冬温州各县（市、区）番茄病毒病的发生面积约3000亩，其中株发病率＞50%的田块面积约300亩，给当地的番茄生产造成了惨重损失。染病番茄植株矮化，生长缓慢或停滞，顶部叶片多稍褪绿发黄、变小，叶片边缘上卷，叶片增厚、叶质变硬，叶脉常呈紫色。早期染病的植株常严重矮缩，开花结果异常，后期染病的植株仅上部叶和新芽表现症状，结果减少、果实变小，成熟期果实着色不均匀（红不透），基本失去商品价值。该病病原为Tomato leaf curl Tanwan virus，属烟粉虱（Bemisia tabaci）传染类双生病毒，种子和土壤均不传毒。该病毒只能经由烟粉虱传播。温州地处亚热带地区，气候温暖，阳光充足，雨量充沛，降雨集中在春季和夏季，秋季较为干爽（年平均气温19.3℃，最热的7～8月平均气温29.1℃）。2006年7～11月，温州市天气总体上呈高温干爽天气，对虫媒烟粉虱的发生、繁衍十分有利，这可能是该病严重发生的诱因之一。据初步调查，2006年9～10月，秋番茄育苗时，烟粉虱发生普遍，经检测以B型为主。烟粉虱发生数量大、活动频繁是导致该病流行的重要原因。据初步调查，目前温州生产上推广的大多数番茄品种如红梅王、FA-189、516、托马雷斯、合作903等对该病毒的抗病性较差。据本所研究，B型烟粉虱在温州地区每年发生10～11代，在温室内无明显的越冬现象，十分适宜在当地生长、繁衍。预计今后该病很有可能会随着带毒烟粉虱的扩展而迅速蔓延开来，应立即采取积极有效的措施进行防控。防治病毒病的关键措施之一是选育抗病品种，抓紧引进、筛选抗耐病的优良品种是当前的重要任务。（1）育苗床与大田生产要分开；（2）使用40～60目防虫网隔离育苗，避免苗期感染；（3）苗床悬挂粘虫色胶板（本所研制）诱杀烟粉虱，减少传毒媒介。（1）加强肥水管理，增强植株抗病能力；（2）地膜覆盖，去除边际杂草；（3）及时去除植株下部烟粉虱虫、卵枝叶；（4）收获后及时清洁棚室和周围环境。及时、及早防治烟粉虱以控制病毒病的发生。从烟粉虱零星发生开始，交替使用99.9%绿颖农用矿物油200～300倍稀释液、20%啶虫脒（兰宁）可溶性液剂3000倍稀释液、25%扑虱灵可湿性粉剂1000～1500倍稀释液、25%阿克泰水分散粒剂2000～3000倍稀释液、2.5%天王星乳油2000～3000倍稀释液、1.8%阿维菌素1500倍稀释液、1%甲胺基阿维菌素2000倍稀释液等药剂喷雾防治烟粉虱。绿野牌即开式环保型高效粘虫色胶板系列产品是温州市农业科学院生态环境研究所（植物保护开发研究中心）最新研制成功的一种工厂化生产的绿色植保产品，现已投入批量生产。本产品根据害虫特有的生物学特性，采用特种纸胶、光技术及先进工艺制成，不含有毒物质，不污染环境，可用于监测和防治经济作物的微小害虫及畜牧场、果蔬储藏室等地的双翅目卫生害虫等。本产品是一种高效、实用的害虫无害化防治新产品，使用本产品可避免和减少施用农药给环境带来的污染及其对人体健康的危害，本产品特别适合于在无公害农产品、绿色食品以及有机食品生产中使用。1.产品特点：特定光谱，诱杀效果显著，双面诱杀，控制范围广；特种纸板，平整不卷曲；胶种防水粘度高，高温不流淌，持久耐用；携带方便，即开即用。2.产品规格：通用A型（黄色），22cm×27cm、每封12张；通用B型（黄色），12cm×15cm、每封20张。3.用途：监测和直接诱杀防治害虫。4.诱杀对象：通用A、B型板诱杀烟粉虱，白粉虱、黄曲条跳甲、潜叶蝇、蚜虫、蓟马及多种双翅目害虫等，也可防治蟑螂等害虫。5.适用场地：温室、塑料大棚、花圃苗房、果园、果蔬储藏室、畜牧场、家居等。6.适用作物：蔬菜、花卉、茶叶、中药材、果树等。7.挂板时间：用于防治时，于害虫发生初期挂；用于监测时从作物苗期开始挂；其他酌情。8.悬挂方法：低矮生蔬菜和作物胶板东西向垂直挂在底边离植株15cm处；搭架作物顺行向垂直挂在架中部（即挂在两行中间）；其他酌情。9.用量：防治用每标准大棚（6m×30m）挂A型板1～2封，其他按面积测算，每粘满虫后换一张；监测用每棚挂B型板1～2小张，或将A型板一分为二后挂。10.专利号：ZL2004 20027355.1

植原体（Phytoplasma），原称 Mycoplasma-like Organism（MLO），是一类无细胞壁、不能人工培养、存在于植物筛管内的专性寄生菌。植原体主要依靠叶蝉等从韧皮部取食的半翅目昆虫传播，也可由菟丝子和嫁接等传播，能够引起植物丛枝、黄化、簇生、矮化、顶枯等症状[1]。我国已报道的植原体病害约有70多种，造成了巨大的经济损失[2]。传统上，主要是根据寄主的种类及其症状等生物学性状和介体昆虫的特性对植原体进行鉴定和命名。但该方法非常复杂和费力，难以鉴定多种植原体复合侵染引起的病害，经常导致片面甚至错误的结论[3]。近年来，随着分子生物学的迅速发展，核酸杂交、RFLP、PCR等技术的广泛应用极大推动了植原体分子鉴定等方面的研究。Lee等[4]根据植原体的16S rRNA基因的RFLP分析将植原体34个典型的株系划分为14个组32个亚组，其中翠菊黄化组（16SrⅠ）变异最大、分布最广。Schneider等[5]对翠菊黄化组、stolbur组和X-disease组的tuf基因进行RFLP分析，认为tuf基因可以作为划分植原体的依据，并且对植原体的检测可以达到单拷贝基因的水平。Marcone等[6]将翠菊黄化组划分为6个亚组。2004年，国际比较菌原体学研究计划署（IRPCM）将植原体划分为17个组，24个种，至少40个亚组，并制定了相应的分类标准[7]。本研究利用巢式PCR对表现丛枝症状的绣线菊和玫瑰进行植原体分子检测，并将克隆到的16S rRNA基因、延伸因子tuf基因及核糖体蛋白基因序列与已知植原体16Sr各组中植原体序列进行同源性比较分析，初步明确了两分离物的分类地位。表现丛枝、黄化、小叶和顶枯症状的绣线菊样品采自山东省青州市；表现叶片畸形、丛枝、顶枯症状的玫瑰样品采自山东省平阴县玫瑰研究所；克隆载体pMD18-T、PCR产物回收试剂盒、限制性内切酶及其他酶类等分子生物学试剂产品均购自TaKaRa公司。以有病害症状的玫瑰为接穗，通过芽接的方法嫁接到5株无症状的玫瑰上。嫁接后放置于无虫温室中，5～7周后观察症状。取表现典型症状的玫瑰韧皮部组织（2mm×2mm），放入3%戊二醛、1%四氧化锇中双重固定，乙醇（10%～70%）、丙酮（0～100%）系列脱水，Epon 812包埋，超薄切片后醋酸铀和柠檬酸铝双染色，在JEM-1200 X型透射电镜下观察。提取方法按参照文献[8]的方法进行，总DNA于-20℃保存备用。参照文献[9，10]所报道的植原体16S rRNA基因通用引物R16mF2/R16mR1进行PCR扩增，然后以此扩增产物为模板用R16F2/R16R1进行巢式PCR（表1）。以提取的玫瑰丛枝植原体的总DNA为模板，参照Schneider等[11]和Lim等[12]报道的延伸因子tuf基因、核糖体蛋白基因的引物对进行PCR扩增（表1）。引物名称Primername引物序列Primersequence退火温度TmR16mF25′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′60R16mR15′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′60R16F25′-ACGACTGCTAAGACTGG-3′55R16R15′-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3′55fTufu5′-CCTGAAGAAAGAGAACGTGG-3′50rTufu5′-CGGAAATAGAATTGAGGACG-3′50rpF15′-GGACATAAGTTAGGTGAATTT-3′55rpR15′-ACGATATTTAGTTCTTTTTGG-3′55Table 1 Primers used in this research to amplify 16S rRNA gene tuf gene and rp genePCR产物回收后与pMD18-T连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取筛选平板上的白色菌落培养，提取质粒，经PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒送上海英骏生物技术有限公司测序。将所得DNA 序列输入GenBank进行Blast检索，采用DNASTAR和MEGA3.1软件对所得到的核苷酸序列与GenBank中收录的相应基因的核苷酸序列进行比较和分析，并构建系统进化树。感病绣线菊植株表现为节间短缩，部分枝条丛生，叶片黄化、变小畸形、顶部嫩梢枯死，植株矮化。感病玫瑰植株表现典型丛枝症状，叶片变小畸形、顶部嫩梢枯死（图1）Figure 1 Symptoms of spiraea witches' broom and rose witches' broom将健康玫瑰嫁接到表现病害症状的玫瑰上，5～7周后，接穗新长出的嫩枝表现黄化、丛枝、畸形等症状。对玫瑰丛枝植原体进行电镜超微结构观察，在嫩茎韧皮部筛管中观察到典型的植原体。其主要形态为圆形和椭圆形，有明显的单位膜结构，直径为300～600nm，胞内可见核糖体蛋白体颗粒和DNA细链。以表现丛枝、叶片黄化等症状的绣线菊总DNA为模板，用巢式PCR扩增其16S rRNA基因，得到长度约为1.2kb的片段。以玫瑰丛枝植原体的总DNA为模板，用PCR扩增16S rRNA基因、tuf基因和核糖体蛋白基因，分别得到了约1.5kb、830bp和1.3kb的目的片断，与预期大小一致，表明植株中存在植原体。将此植原体分离物分别暂命名为绣线菊丛枝植原体（spiraea witches'broom，SWB）、玫瑰丛枝植原体（rose witches'broom，RWB）。通过测定2个PCR克隆到的片段的序列，确定了SWB的16S rRNA基因含有1236个核苷酸，G+C的含量为47.09%；RWB的16S rRNA基因含有1432个核苷酸。GenBank登录号分别为EF176608、EF199938。将两分离物与GenBank中17个植原体分离物的核苷酸序列进行比对和系统进化分析。从系统进化树中可以看出，两个分离物全部聚类到16SrⅠ组中，与16SrⅠ-B亚组的西方翠菊黄化植原体、马里兰翠菊黄化植原体及16SrⅠ-D亚组的泡桐丛枝植原体聚集为一簇。两个分离物与植原体16SrⅠ组中各亚组的分离物核苷酸同源性均达到99%以上，其中SWB与16SrⅠ-B亚组中的西方翠菊黄化植原体（SAY）同源性高达99.6%，与本研究的另外两个分离物RWB、PaWB的同源性为99.7%和99.8%。而RWB分离物与PaWB的同源性最高为99.9%，与植原体僵顶病组（Stolbur group）（16Sr Ⅻ）的草莓花瓣变绿症（Strawberry virescence，AY377868）植原体核苷酸的同源性为95.8%，与其他各组的核苷酸同源性为89.5%～92.8%。说明SWB、RWB分离物属于西方翠菊黄化植原体（图2）。Figure 2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA nucleotide sequence with maximum-likelihood method in MEGA3.1 software package经序列测定，确定玫瑰丛枝植原体的延伸因子（EF-Tu）tuf基因序列长度为810个核苷酸，G+C的含量为37.5%，核糖体蛋白基因含有1174个核苷酸，G+C的含量为35.4%。将玫瑰丛枝植原体分离物与GenBank中17个植原体分离物的延伸因子（EF-Tu）tuf基因进行比对，结果表明：玫瑰丛枝植原体与植原体各个组的核苷酸同源性为70.4%～99.6%，该分离物与16SrⅠ组中各亚组的分离物核苷酸同源性为96.3%～99.6%，其中与16SrⅠ-D亚组中的泡桐丛枝（PaWB）同源性高达99.6%，该分离物与植原体其他组中的僵顶病组（Stolbur group）（16Sr Ⅻ）核苷酸同源性最高为88.6%，与其他各组的核苷酸同源性为70.4%～88.6%。将玫瑰丛枝植原体分离物与GenBank中21个植原体分离物的rp基因进行比对，结果表明：玫瑰丛枝植原体与植原体16SrⅠ组中各亚组的核苷酸同源性为96.7%～99.4%，其中与16SrⅠ-D亚组中的泡桐丛枝（PaWB）同源性最高为99.4%，从而表明该分离物属于Candidatus Phytoplasma asteris。本研究利用巢式PCR从表现丛枝症状的绣线菊中扩增到了1236bp的片段。序列测定和比较的结果表明，与这两种病害相关的植原体均为西方翠菊黄化植原体。前人对植原体侵染绣线菊研究较少，国外仅报道由植原体‘Ca.Phytoplasma pruni'引起的绣线菊矮化病[13]。我们采集了表现丛枝、顶枯症状的玫瑰和表现丛枝症状的泡桐，经PCR检测表明其病原为植原体。序列分析表明，两分离物的16S rRNA基因、延伸因子（EF-Tu）tuf基因和核糖体蛋白基因核苷酸同源性都在99.9%以上，从而确定玫瑰丛枝植原体与泡桐丛枝植原体属同一病原物，属于西方翠菊黄化植原体。尽管翠菊黄化组植原体的报道多在欧洲和美国，但本文是第一次中国关于植原体侵染玫瑰的报道。与2001年和2003年Kaminska M等[14，15]感病玫瑰表现畸形和顶枯不同的是，在本研究中的感病玫瑰表现出丛枝和顶枯的症状。有趣的是，在本研究中的玫瑰、泡桐分离物是在同一玫瑰园内得到，两者之间仅相隔数米，而在同一玫瑰园的其他地方也发现植原体侵染的玫瑰。在调查中发现感病植株多出现在新嫁接的玫瑰上，长势强的玫瑰发病较少，与表现丛枝症状泡桐较近的地块发病严重，其他地块发病较轻。在根据16S rRNA基因进行序列比对及构建系统进化树时发现，两个分离物与16SrⅠ-B亚组的西方翠菊黄化植原体、马里兰翠菊黄化植原体及16SrⅠ-D亚组的泡桐丛枝植原体在构建的系统进化树中聚集成一簇。Lee等[16]认为在基于16S rRNA基因进行序列比对时，16SrⅠ-D亚组的泡桐丛枝植原体会聚集到16SrⅠ-B亚组中，本研究结果与此相符。根据国际比较菌原体学研究计划署（2004）的建议，泡桐丛枝植原体、SAY植原体等都属于同一个种，‘Candidatus Phytoplasma asteris'。

番茄营养丰富、酸甜可口、人们喜食、用途多、产量高，已成为蔬菜的主要品种。它的丰产与歉收，直接影响着市场的供需。近10年来由于保护地栽培，发展很快，引进番茄品种种类繁多，种植技术不断改进，生态环境也随之发生变化，促使新的病虫害种类不断出现，给番茄生产带来了新的问题。在2002～2003年，在北京的密云、延庆和大兴县大棚种植的番茄上发生了一种新的病害，受害番茄植株呈现失水萎蔫，后期植株干枯死亡，纵剖受害植株主茎，髓部呈现褐色腐烂坏死，导致全株凋萎干枯死亡。该病2002～2003年冬季在密云县发生，有212个大棚发病，品种为加西亚，平均受害株率达到100%，造成拔园毁种、绝产无收，给生产带来了惨重的损失。该病已经成为番茄生产上的一种潜在危险性病害。按Koch法则，从接种病株上，分离到原始接种细菌菌株。依此确认，该病是一种细菌性病害，暂称为番茄茎髓黑腐病。该病害与国内已知有发生记载的6种番茄细菌性病害：番茄青枯病[7]（Pseudomonas solamaearum）、番茄溃疡病[7]（Clavibacter michigabensis subsp.michigabensis）、番茄疮痂病[7，8]（Xanthomonas campestris pv.vesicatoria）、番茄斑点病[9]（Pseudomonas syrimgae pv.tomato）、番茄软腐病[7]（Erwinia carotovora subsp.carotovora）和番茄髓部坏死病[10]（Pseudomonas corruga）的受害症状和菌落形态特征不同。故认为该病是一种新的细菌性病害，本文对获得的22个菌株进行了病原菌的鉴定，结果报道如下：1.1.1 供试菌株 供试的22个菌株是2002～2003年从北京市的密云、延庆、大兴等地番茄上分离并纯化后获得的（表1），对照菌株为绿黄假单胞菌典型菌株PDDCC2848[Pseudomonas viridiflava（Burkholder；1930；Dowson 1939）]和边缘假单胞菌边缘致病变种典型菌株PDDCC3553[P.marginalis pv.marginalis（Brown）Stevens 1925]。1.1.2 供试植物 番茄品种加西亚和中蔬四号、烟草、马铃薯。1.1.3 培养基制备 KB固体培养基[1]、牛肉汁固体培养基[1]。1.2.1 病原菌的分离[4] 用灭菌解剖刀切取病株茎部，用75%酒精消毒2min，经无菌水冲洗后取髓部病组织置于小瓷皿中研磨，加无菌水浸泡10min，然后用接种环蘸取该组织液在KB培养基上划线。长出单菌落后用该培养基再划一次线使细菌纯化。纯化后用于致病性测定和病原菌的鉴定。1.2.2 烟草过敏反应[11，12] 将从各地分离获得的22个菌株和对照菌株（表1）在KB培养基上培养24h，以无菌水配制成细菌悬浮液，浓度为1×108cfu/ml，用注射针将细菌液从烟草下表皮注入叶肉细胞间[2]。选用未开花的烟草植株，用灭菌水作阴性对照。接种后，保持在25～28℃，相对湿度85%，日照16h条件下。24h后，调查过敏性反应。菌株号No.strain致病性Pathogenicity采集地点Location分离时间Timeisolated烟草过敏TobaccohypersensitivityPnt1+北京密云（Miyun）2003-1-28-Pnt2+北京密云（Miyun）2003-1-28-Pnt3+北京密云（Miyun）2003-1-28-Pnt4+北京密云（Miyun）2003-1-28-Pnt6+北京密云（Miyun）2003-1-28-Pnt8+北京密云（Miyun）2003-1-28-Pnt9+北京密云（Miyun）2003-1-28-Pnt10+北京密云（Miyun）2003-1-28-Pnt11+北京密云（Miyun）2003-1-28-Pnt12+北京密云（Miyun）2003-1-28-Pnt13+北京密云（Miyun）2003-1-28-Pnt14+北京密云（Miyun）2003-1-28-Pnt15+北京密云（Miyun）2003-1-28-Pnt18+北京密云（Miyun）2003-1-28-Pnt19+北京密云（Miyun）2003-1-28-Pnt23+北京延庆（Yanqing）2003-6-9-Pnt24+北京延庆（Yanqing）2003-6-9-Pnt27+北京延庆（Yanqing）2003-6-9-Pnt20+北京大兴（Daxing）2003-5-20+Pnt21+北京大兴（Daxing）2003-5-20-Pnt30+北京延庆（Yanqing）2003-9-2+Pnt31+北京延庆（Yanqing）2003-9-2-表1 番茄茎髓黑腐病菌株及致病性和烟草过敏1.2.3 马铃薯腐败[1] 选取新鲜无病而且较大的马铃薯块茎，将其表面洗净，在无菌条件下，用75%酒精表面消毒，超净工作台上风干。在无菌条件下，用灭菌牙签蘸取适量在KB培养基上培养24h的细菌，插入马铃薯中，随后将其放在24℃培养箱内，并且用不接菌的马铃薯作对照，调查马铃薯腐败情况。1.2.4 番茄上致病性测定 在温室培养的加西亚和中蔬四号上接种。用灭菌牙签蘸取适量在KB培养基上培养24h的供试细菌，包括对照菌株，插入枝条和茎的交界处，置于自然条件下，调查发病情况。1.2.5 鉴定方法 细菌的形态特性、培养特性、生理生化反应及碳源利用等项实验方法，主要参照《一般细菌常用鉴定方法》[1]、《植物病害研究方法》[2]、N.W.Schaad编著的《植物病原细菌鉴定实验指南》[3]、《植物病原细菌的分类与鉴定》[4]等书中的方法进行。2.1.1 病原菌分离 共获得了22株细菌（表1），纯化后用于致病性测定和病原菌的鉴定。2.1.2 烟草过敏反应 pnt21，pnt30和对照菌株3553注射部位表现过敏性枯斑反应（HR），这证明了其对植物有致病作用。试验结果见表1。2.1.3 马铃薯腐败 供试菌株均对接种马铃薯产生不同程度的症状。其中供试菌株pnt1、pnt2、pnt13、pnt14、pnt15、pnt21、pnt30、pnt31和对照菌株2848、3553均表现出明显的腐烂症状，其余菌株所接种马铃薯都出现水浸状。2.1.4 番茄上致病性测定 致病性测定试验结果见表1。2.2.1 病原细菌革兰氏染色 所有供试菌株革兰氏染色阴性。2.2.2 培养性状 供试的菌株在KB培养基上28℃培养箱里培养48h，形成圆形菌落，全缘，不透明，表面光滑，均能产生荧光。其中菌株pnt1～pnt19的菌落绿黄色，直径1～3mm；菌株pnt20、pnt21、pnt30和pnt31产生黄色菌落，黏稠状，微隆，直径3～5mm；pnt23、pnt24和pnt27为乳黄色菌落，黏稠状，隆起，直径1～2mm。2.2.3 生理生化性状 生理生化性状试验结果见表2～表4。2.2.4 碳源利用 碳源生长利用结果见表2～表4。项目测定Characteristics供试菌株（Strains）Pnt1～pnt19对照菌株（CKstrains）28483553P.f.biovarⅠKB培养基产荧光FluorescentpigmentonKB++++淀粉水解Starchhydrolysis-（2、8、10、12）---[5]配糖体的分解EsculinHydrolysis-（11）+-耐盐性试验Salttolerance3%（1∶5%）3%3%与氧的关系Relationtofreeoxygen好氧好氧好氧好氧[6]马铃薯腐败Potatodecaycapacity水渍状（1、2、13、14、15：+）++表2 番茄茎髓黑腐病病原细菌生理生化性状试验结果（Pnt1～Pnt19）项目测定Characteristics供试菌株（Strains）Pnt1～pnt19对照菌株（CKstrains）28483553P.f.biovarⅠ酪氨酸酶测定Tyrosinasetest+（6、12、18、19）+-氧化酶Oxidase+-++[5]冰核测定Icenucleationactivity-（8、12-18未做）--3%KOH实验3%KOHtest---生长因素要求性测定Growthfacterre-quirement-（2-11、15、19）--烟草过敏实验Tobaccohypersensitivity--+苯丙氨酸脱氨酶Phenylalaninedeaminase---乙酰甲基甲醇测定Voges-Proskauer---甲基红测定Methylred-+-过氧化氢酶Catalase+++硝酸盐的还原Nitrateredution-（2）---[5]3-酮基乳糖的产生3-Ketolactose---精氨酸双水解酶Argininereaction---+[5]蔗糖还原物质产生Reducingsubstancesfromsucrose+（6、11-14、18、19）-+果聚糖的产生Levanformation++++[5]41℃生长Growthat41℃----[5]果胶溶解Pectinaseactivity+-+H2S的产生H2Sproduction---卵磷酸酶Lecithinasetest+（1-3、12、13）+++[5]葡萄糖酸氧化Gluconateoxidation+++葡萄糖氧化发酵试验OFtestOOO脱氮反应Denitrification----[5]尿素测定Ureasetest+（1、2、4、19）++吲哚的产生Indoleproduction---吐温80的测定Tween80hydrolysis+（6、9、10、18）+++[5]明胶液化Gelatinliquefaction++++[5]NH3的产生Ammoniaproduction-（23）-+碳源利用Carbonsourcesusedforgrowth木糖Xylose++++[5]蔗糖Sucrose++++[5]乳糖Lactose-（2、4、11）---[5]麦芽糖Maltose-（3、11-14）---[5]鼠李糖Rhamnose+（6、12、13、19）--山梨醇Sorbitol++++[5]肌醇Insoitol+++d[5]赤藓醇Erythritol+++d[5]丙酸Propionate-（1、11）--+[5]组氨酸Histidine++++[5]L-半乳糖L-Galactose++++[5]葡萄糖Gluconate++++[4，5]甘露醇Mannit++++[5]抗坏血酸Ascorbate---柠檬酸Citricacid+++续表2项目测定Characteristics供试菌株（Strains）Pnt20、pnt21、pnt30、pnt31对照菌株（CKstrains）28483553Pv.syringaeKB培养基产荧光FluorescentpigmentonKB++++淀粉水解Hydrolysisofstarch-（21、31）---[5]配糖体的分解Esculinhydrolysis+（20、31）+-耐盐性试验Salttolerance3%（31：5%）3%3%与氧的关系Relationtofreeoxygen好氧好氧好氧好氧[6]马铃薯腐败Potatodecaycapacity+（20：水渍状）++-[4]酪氨酸酶测定Tyrosinasetest++-氧化酶Oxidase-（20）-+-[4，5]冰核测定Icenucleationactivity+（20未做）--+[4]3%KOH实验3%KOHtest---生长因素要求性测定Growthfacterre-quirement-（31）---[6]烟草过敏实验Tobaccohypersensitivity+（20、31）-++[4]苯丙氨酸脱氨酶Phenylalaninedeaminase---乙酰甲基甲醇测定Voges-Proskauer----[6]甲基红测定Methylred++--[6]过氧化氢酶Catalase++++[6]硝酸盐的还原Nitrateredution----[4]3-酮基乳糖的产生3-Ketolactose---精氨酸双水解酶Argininereaction---蔗糖还原物质产生Reducingsubstancesfromsucrose-（21、30）-+果聚糖的产生Levanformation++++[3～5]41℃生长Growthat41℃----[4，5]果胶溶解Pectinaseactivity+-++[3，4]H2S的产生H2Sproduction----[6]卵磷酸酶Lecithinasetest-++d[5]葡萄糖酸氧化Gluconateoxidation+++葡萄糖氧化发酵试验OFtestOOO脱氮反应Denitrification----[5]尿素测定Ureasetest+（20）++吲哚的产生Indoleproduction----[6]吐温80的测定Tween80hydrolysis++++[5]明胶液化Gelatinliquefaction++++[4，5]NH3的产生Ammoniaproduction-（23）-+碳源利用Carbonsourcesusedforgrowth木糖Xylose+++d[5]蔗糖Sucrose++++[4，5]乳糖Lactose---+[3～5]麦芽糖Maltose---表3 番茄茎髓黑腐病病原细菌生理生化性状试验结果（Pnt20、pnt21、pnt30、pnt31）项目测定Characteristics供试菌株（Strains）Pnt20、pnt21、pnt30、pnt31对照菌株（CKstrains）28483553Pv.syringae鼠李糖Rhamnose-（31）--山梨醇Sorbitol++++[3，4，5]肌醇Insoitol++++[3，4，5]赤藓醇Erythritol+（20）+++[3，4，5]丙酸Propionate---d[4，5]组氨酸Histidine+++d[4，5]L-半乳糖L-Galactose+++葡萄糖Gluconate+++d[4，5]甘露醇Mannit++++[3，4，5]抗坏血酸Ascorbate----[5]柠檬酸Citricacid+++续表3项目测定Characteristics供试菌株（Strains）Pnt23、pnt24、pnt27对照菌株（CKstrains）28483553P.viridiflavaKB培养基产荧光FluorescentpigmentonKB++++淀粉水解Hydrolysisofstarch+（24）---[5]配糖体的分解Esculinhydrolysis-+-耐盐性试验Salttolerance3%3%3%与氧的关系Relationtofreeoxygen好氧好氧好氧好氧[6]马铃薯腐败Potatodecaycapacity水渍状+++[4]酪氨酸酶测定Tyrosinasetest++-氧化酶Oxidase+（24）-+-[3，4，5]冰核测定Icenucleationactivity-（24未做）--3%KOH实验3%KOHtest---生长因素要求性测定Growthfacterre-quirement-（27）---[6]烟草过敏实验Tobaccohypersensitivity--++[4]苯丙氨酸脱氨酶Phenylalaninedeaminase---乙酰甲基甲醇测定Voges-Proskauer----[6]甲基红测定Methylred-（24）+--[6]过氧化氢酶Catalase++++[6]硝酸盐的还原Nitrateredution---3-酮基乳糖的产生3-Ketolactose---精氨酸双水解酶Argininereaction----[3～5]蔗糖还原物质产生Reducingsubstancesfromsucrose+（24）-+果聚糖的产生Levanformation+++-[4，5]表4 番茄茎髓黑腐病病原细菌生理生化性状试验结果（Pnt23、pnt24、pnt27）项目测定Characteristics供试菌株（Strains）Pnt23、Pnt24、Pnt27对照菌株（CKstrains）28483553P.viridiflava41℃生长Growthat41℃----[3～5]果胶溶解Pectinaseactivity+-+H2S的产生H2Sproduction----[6]卵磷酸酶Lecithinasetest-+++[5]葡萄糖酸氧化Gluconateoxidation+++葡萄糖氧化发酵试验OFtestOOO脱氮反应Denitrification----[5]尿素测定Ureasetest+（24）++吲哚的产生Indoleproduction----[6]吐温80的测定Tween80hydrolysis+++-[5，6]明胶液化Gelatinliquefaction++++[4，5]NH3的产生Ammoniaproduction-（23）-+碳源利用Carbonsourcesusedforgrowth木糖Xylose+++d[5]蔗糖Sucrose++++[4，5]乳糖Lactose---麦芽糖Maltose---鼠李糖Rhamnose-（27）---[3，5]山梨醇Sorbitol++++[3～5]肌醇Insoitol++++[5]赤藓醇Erythritol+（23）+++[5]丙酸Propionate---d[5]组氨酸Histidine++++[5]L-半乳糖L-Galactose+++葡萄糖Gluconate+++d[5]甘露醇Mannit++++[3，5]抗坏血酸Ascorbate---柠檬酸Citricacid+++续表4从表2～表4可以看出，供试菌株和对照菌株的试验结果存在不一致性。但在如下的试验中表现出相同的结果，超过41℃不能生长，严格好氧，对葡萄糖能氧化（OF试验）不能发酵，3%KOH拉丝，不产生吲哚，不产生硫化氢，在pH值5.0和pH值7.0下果胶凹陷，明胶液化、过氧化氢酶（接触酶）和葡萄糖酸氧化均为阳性；乙酰甲基甲醇测定（V.P.试验）、3-酮基乳糖的产生、苯丙氨酸脱氨酶和脱氮反应均为阴性。在淀粉水解、配糖体的分解、酪氨酸酶测定、耐盐性测验、甲基红测定、氨气的产生、尿素的测定、生长因素要求性的测定、氧化酶反应、冰核测定、卵磷酸酶测定等生理生化试验项目中结果不同。由表2～表4可知，各菌株均能利用木糖、葡萄糖、山梨醇、肌醇、甘露醇、组氨酸、柠檬酸、L-半乳糖、蔗糖；不能利用抗坏血酸。只有pnt1和pnt11能利用丙酸，试验各菌株对乳糖、麦芽糖、鼠李糖和赤藓醇利用结果不一致。根据上述致病性试验结果，供试的22个菌株和对照菌株PDDCC2848，PDDCC3553分别接种番茄品种中蔬四号和加西亚后，均表现发病症状。细菌学特性鉴定结果表明，供试番茄菌株为革兰氏阴性，接触酶（过氧化氢酶）阳性，对葡萄糖不能厌气发酵产酸，不产生吲哚，不产生硫化氢，乙酰甲基甲醇测定为阴性，据此可确定该病属于假单胞属（Pseudomonas）[5]。供试的22个菌株在各试验项目上表现出不同的结果，综合各个试验结果，可大致将供试菌株分为三类，其中pnt1、pnt2、pnt3、pnt4、pnt6、pnt8、pnt9、pnt10、pnt11、pnt12、pnt13、pnt14、pnt15、pnt18和pnt19可归为一类，记为A类；pnt23、pnt24和pnt27可归为一类，记为B类；pnt20、pnt21、pnt30和pnt31可归为一类，记为C类。A类菌株在KB培养基上产生绿色荧光素，可确定为腐生荧光假单胞类群[4，5]。氧化酶测定、明胶液化、过氧化氢酶试验结果均为阳性；甲基红测定、吲哚的产生、硫化氢的产生等试验结果均为阴性；能利用葡萄糖、蔗糖、肌醇、山梨醇、甘露醇、组氨酸、赤藓醇、L-半乳糖、木糖，据此可初步确定A类菌株属于荧光假单胞生物变种Ⅰ（Pseudomonas fluorescens biovarⅠ），但在鼠李糖和麦芽糖的利用、淀粉水解、生长素要求性的测定、吐温80的测定、卵磷酸酶测定等试验上存在差异。Saygili H[11]报道该病菌可以侵染番茄。B类菌株能利用组氨酸、肌醇、山梨醇、甘露醇、葡萄糖、木糖，不能利用蔗糖、抗坏血酸和鼠李糖；耐盐性测验3%、无冰核活性，在吐温80的分解、酪氨酸酶测定的试验结果中呈阳性，与对照菌株2848完全相同；在氧化酶测定、淀粉水解、卵磷酸酶测定、配糖体的分解、尿素测定、生长素要求性的测定等试验上略有差异，据此初步确定该菌类属于绿黄假单胞菌（Pseudomonas viridiflava）。Alippi A.M.（2003）[12]报道该病菌可以侵染番茄。对于C类，在卵磷酸酶测定、氨气的产生试验结果中呈阴性；在吐温80的分解、酪氨酸酶测定、甲基红测定的试验结果中呈阳性；根据LOPAT试验，从蔗糖形成果聚糖（Levan formation），氧化酶反应（Oxidase），马铃薯软腐试验（Potato decay capacity），精氨酸双水解酶（Arginine reaction），烟草过敏反应（Tobacco hypersensitivity）的结果；不能利用鼠李糖，能利用木糖、葡萄糖、山梨醇、肌醇、甘露醇、组氨酸、赤藓醇；葡萄糖酸氧化呈阴性反应，可以初步确定属于丁香致病变种（P.syringae pv.syringae）。近年来番茄发生茎髓黑腐病，分析其原因，一是可能与品种有关，即引进的番茄品种不抗细菌病害；二是与栽培有关，发病的番茄大棚前茬栽培过芦荟，有线虫为害，可能是线虫为害番茄造成了伤口使得细菌侵入，鉴定出的3种细菌均是弱寄生菌，也正说明了这一点，它们可以侵染生长势弱的番茄。

狗牙根草是一种重要的草坪牧草。普遍用于城市的绿化。2007年5月从湖北华中农业大学校园的草坪上，采集到狗牙根草（Cynogon dactylon）黑粉病的病株标本，发病症状是花序的小穗变为线状的粉末状黑褐色的孢子堆，除小穗的中轴外完全被破坏，黑粉易脱落（图1-A）。用稀释分离法自发病植株的黑粉部位分离获得该病原菌，并对其进行了形态学鉴定和rDNA-ITS序列分析等研究。结果表明：狗牙根草黑粉菌在PDA培养基上，菌落初期形态为乳白色，呈酵母式增殖，多为短棒状的担孢子。后期逐渐变为暗黄色，有不均匀的皱褶隆起，菌落边缘有少量菌丝产生。冬孢子黑色或黑褐色，圆形至椭圆形，表面有轮纹，大小为（10.3～6.2）μm×（10.9～5.5）μm，见图1-B。对病原菌进行了rDNA-ITS序列分析结果表明：该病菌5.8S rDNA及两侧的ITS区序列与狗牙根黑粉菌U.cynodontis AY740168的同源性达到99%。将同一株狗牙根草的小孽分别取样，用CTAB法自各样本组织的总DNA，并对其进行ITS-PCR的扩增。结果表明：取自同一株狗牙根草的不同小孽，无论有症状还是没有症状均含有狗牙根黑粉菌的特异性条带，这说明该病菌对狗牙根草是系统性侵染为害的。这是国内首次报道相关狗牙根草黑粉病病害。图1 狗芽根黑粉病状（A）及其冬孢子形态（B）（标尺：10μm）Figure 1 The symptom（A）of Bermudan grass（Cynogon dactylon）smut and teliospore （B），bar=10μm

柴胡（Bupleurum chinense DC.），别名北柴胡、竹叶柴胡，为伞形科多年生草本植物。野生资源主要分布于我国的华北、西北和东北，主产于陕西、山西、河南、吉林、辽宁、黑龙江等地[1]。柴胡过去多为野生，病害零星发生，随着人工抚育及栽培面积的逐年扩大，柴胡根腐病害的发生和为害程度不断增加。目前，国内外尚未见有关柴胡根腐病的系统报道，对其发生、流行规律，病原菌种类及病原菌生物学特性尚不清楚，因此生产过程中缺乏有针对性的防治手段。为了尽快明确上述问题，本研究在对柴胡根腐病病原菌进行分离鉴定的基础上，就病原菌的生物学特征进行了较为系统的研究，这为进一步开展柴胡根腐病害的防治奠定了理论基础。从北京市延庆县永宁镇和本所柴胡试验基地采集病害标样。病原菌的分离采用常规的组织分离法，具体操作参照方中达[2]编著的《植病研究方法》。观察柴胡根腐病对柴胡根部的为害症状；菌落的形状、色泽；在显微镜下观察大、小分生孢子的形状及多少，测量其大小，观察有无隔膜及隔膜的数目，观察产孢细胞的类型，厚垣孢子的有无以及着生部位和子实体类型等。1.3.1 室内离体根组织接种 选取健康无病的柴胡根组织，用无菌水清洗干净，采用针刺法接种，保湿培养。1.3.2 室内活体植株接种 将取自田间的柴胡植株移栽于室内花盆，将配好的孢子悬浮液用微孔注射器注入柴胡根部，定期观察柴胡发病情况。1.4.1 温度对菌丝生长的影响 将病原菌接种PDA培养基，分别于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃恒温培养箱中培养，6天后测量菌落直径，每个处理重复3次。1.4.2 培养基pH值对菌丝生长的影响 培养基灭菌后，分别调节pH4、6、8、10、12，接种后于25℃恒温培养箱中培养，6天后测量菌落直径。每个处理重复3次。1.4.3 分生孢子萌发 孢子萌发试验采用载玻片孢子悬滴萌发法。每1h计数孢子萌发数量，计算孢子萌发率。1.4.4 温度对分生孢子萌发的影响 共设5℃、10℃、20℃、25℃、30℃和35℃共6个温度梯度，24h镜检记录孢子萌发数，计算萌发率。每个处理重复3次。1.4.5 pH值对分生孢子萌发的影响 用pH值分别为2、4、6、8、10、12的水溶液配制孢子悬浮液，于25℃恒温培养箱中培养，24h后测定孢子萌发率。每个处理3次重复。1.4.6 湿度对分生孢子萌发的影响 在密闭容器中分别配制（NH4）2SO4、ZnSO4、NH4H2PO4和CaSO4饱和溶液，使其相对湿度（RH，Relative Humidity）分别维持在81%、90%、93%和98%，以清水（RH=100%）作对照，于25℃下培养，24h后测定孢子萌发率。每个处理3次重复。1.4.7 不同培养基对病原菌产孢的影响 分别配制PDA和小麦汁培养基，25℃恒温箱中培养，8天后观察分生孢子的产生情况。每个处理3次重复。1.4.8 分生孢子致死温度测定 将孢子悬浮液装在200μl离心管中，在PCR仪上以温度35～70℃（温度间隔为5℃）处理10min后，于25℃恒温箱中培养24h，观察孢子萌发情况。得到分生孢子致死的大致温度范围后，再以1℃为温度间隔求得精准致死温度。2.1.1 病害症状 该病主要为害柴胡的主根，亦可为害侧根。发病初期，自根茎交界处产生黑褐色斑点，后逐渐扩大呈圆形、近圆形或不规则病斑。发病后期，根部表皮自顶端向下产生纵向干裂，裂口变褐或发黑并逐渐加宽、加深。裂口多为竖条形，椭圆形或菱形。发病初期地上部分与健株无明显区别。发病后期裂口遍及根部整个外周，病部稍膨大、变硬、变脆，裂口深及木质部并造成水分、营养运输中断，最终导致整个植株萎蔫死亡。一年生柴胡当年秋季地上部枯萎后至结冻前即有发生，来年5～8月份为病害盛发期。2.1.2 柴胡根腐病菌培养性状 自柴胡根部病组织分离的病原菌在PDA培养基培养，菌落呈乳白色，气生菌丝发达，菌落底部呈浅褐色；在麦汁培养基上培养后菌落颜色呈灰白色，气生菌丝稀少。显微镜观察发现，麦汁培养基上培养的菌丝有分生孢子梗，分生孢子大量簇生，且菌丝上直接长有大量厚垣孢子。PDA培养基上培养的菌丝中间有隔，上面无分生孢子梗，也未发现分生孢子及厚垣孢子。图1 柴胡根腐病田间发病症状Figure 1 The symptom of root-rot disease in Bupleurum chinense DC.图2 柴胡根腐病菌的菌落形态Figure 2 The appearance of Fusarium solani isolated from Bupleurum chinense DC.2.1.3 病原菌鉴定 室内镜检发现大量分生孢子梗和大、小分生孢子。分生孢子梗一般簇生、直立，分隔。小分生孢子数量多，卵形、长椭圆形或短棒状，无隔膜；大分生孢子镰刀形或细长椭圆形，1～3个隔膜（3个隔膜者占到总数的96%以上）。厚垣孢子近圆形，在菌丝顶端单生。参考真菌分类相关文献，确认柴胡根腐病的病原菌为茄镰孢菌（Fusarium solani）。2.1.4 致病性测定 接种一定时期后，接种部位开始表现症状，且与田间发病症状类似。在接种病株上再次分离病原菌，经PDA培养基培养数天后，显微镜观察发现再次分离到的病原菌与接种的病原菌为同一病原菌。图3 柴胡根腐病菌孢子形态Figure 3 Fusarium solani Conidia isolated from Bupleurum chinense DC.2.2.1 温度对菌丝生长的影响 温度对病原菌菌丝的生长具有显著影响，菌丝在10～30℃范围内均能生长，25～30℃是菌丝生长的最佳温度范围。环境温度≤5℃或≥35℃均对菌丝的生长产生明显的抑制作用。2.2.2 培养基pH值对菌丝生长的影响 柴胡根腐病菌菌丝在pH值4～12的PDA培养基上均能够生长。在pH值4培养基上菌丝的生长速度较其他培养基上的菌丝慢，且菌落的背面呈红褐色，其他培养基上的菌落背面呈暗白色。2.2.3 分生孢子萌发 在20℃条件下培养，分生孢子萌发速度较快。4h萌发率达到14%，6h萌发率为46%，9h萌发率达到98%，10h后分生孢子全部萌发。图4 柴胡根腐病菌分生孢子在20℃下的萌发率Figure 4 Germinating ratio of Fusarium solani Conidia isolated from Bupleurum chinense DC.at 20℃2.2.4 温度对分生孢子萌发的影响 温度对分生孢子的萌发十分关键。由表1可以看出，20～25℃是最适宜的产孢温度，温度低于10℃，孢子不能萌发，温度高于30℃，孢子萌发率显著降低。温度（℃）Temperature（℃）分生孢子Conidia萌发率（%）Germinationrate（%）重复1Repeat1重复2Repeat2重复3Repeat3平均值Mean51020253035Ma0000Mi0000Ma0000Mi0000Ma100969898Mi80848684Ma95969395Mi90949292Ma80838181Mi40454644Ma60646262Mi10868表1 温度对镰刀菌分生孢子萌发的影响Table 1 The effect of temperature to germination of Fusarium solani conidia isolated from Bupleurum chinense DC.2.2.5 pH值对分生孢子萌发的影响 pH值对分生孢子存在显著影响，且大、小分生孢子对pH值的敏感程度也明显不同。从表2可以看出，大分生孢子在pH值2～10的范围内均能维持较高的萌发率（＞90%），pH值大于12值萌发率显著降低；而小分生孢子在pH值4～6的范围内能够维持较高的孢子萌发率（大于或接近90%），pH值小于2或大于6时，孢子萌发率均显著降低。pH值pH分生孢子Conidia萌发率（%）Germinationrate（%）重复1Repeat1重复2Repeat2重复3Repeat3平均值Mean24681012Ma90949091Mi40353737Ma100989999Mi95979495Ma100969898Mi90869289Ma100949697Mi40453639Ma90928990Mi20182421Ma60566259Mi10121011表2 pH值对镰刀菌分生孢子萌发的影响Table 2 The effect of pH to germination of Fusarium solani conidia isolated from Bupleurum chinense DC.2.2.6 湿度对分生孢子萌发的影响 研究发现，病原菌分生孢子在相对湿度≥90%的环境下均能够萌发，萌发率与相对湿度呈线性正相关，分生孢子的最适相对湿度为100%；相对湿度低于90%，分生孢子不能萌发。2.2.7 不同培养基对病原菌产孢的影响 分别用PDA和麦汁培养基培养柴胡根腐病菌。培养8天后，PDA培养基上的病菌气生菌丝发达，颜色纯白，挑取少量菌丝在显微镜下观察，未发现分生孢子；麦汁培养基上培养的病菌气生菌丝稀少，颜色发暗，挑取少量菌丝在显微镜下观察，可见大量的大、小分生孢子。2.2.8 分生孢子致死温度测定 研究发现，柴胡根腐病菌分生孢子在35～50℃之间均能够萌发，而在55～70℃均不能正常萌发。进一步研究发现，51℃为柴胡根腐病菌分生孢子的致死温度（表3）。处理时间（min）Treattime（min）温度（℃）Temperature（℃）35404550515253545560657010++++--------表3 柴胡镰刀菌分生孢子的致死温度测定Table 3 Lethal temperature of Fusarium solani conidia isolated from Bupleurum chinense DC.本研究通过对柴胡根腐病病原菌的分离鉴定、致病性测定以及病原菌的生物学特征的初步研究，得出如下结论：3.1 根据病原菌的形态特征和致病性测定结果，确认柴胡根腐病病原为镰刀菌（Fusarium solani）。3.2 实验结果表明，柴胡根腐病菌菌丝生长的最适温度为25～30℃，在pH值6～12条件下均能正常生长；分生孢子萌发的最适温度为20～25℃，最适相对湿度为100%，最适pH值为4～6。分生孢子的致死温度为51℃。3.3 柴胡根腐病早有发现，但因以前多为野生，病害只是零星发生。近年来，随着柴胡需求量的逐年提高，柴胡的人工栽培面积不断扩大，这为柴胡根腐病的发生和发展提供了便利条件，柴胡根腐病的发生逐年加重。目前，尚未见有关柴胡根腐病的发生、流行及防治策略的研究报道，开展柴胡根腐病害的侵染、流行及综合防治领域的研究工作势在必行。