采集安徽不同地区感染马铃薯Y病毒（PVY）的烟草和马铃薯病样，购买美国Agdia公司PVY-N株系试剂盒进行ELISA检测，部分病样检测结果呈阳性，TRIZOL法提取总RNA，根据PVY CP基因两侧的保守序列设计特异性引物CP/F、CP/R，M-MLV酶逆转录得cDNA第一链，RT-PCR扩增，克隆至pGEM-T Easy载体，转化大肠杆菌TG1，筛选阳性克隆并测序。PVY-CP-4（来自烟草病样）和PVY-CP-7（来自马铃薯病样）基因全长均为801bp，编码267个氨基酸。利用DNAStar软件对来自两个不同寄主的PVY-CP基因进行序列比较，PVY-CP-4和PVY-CP-7的核苷酸序列相似性为92.1%，这两个PVY的CP序列与已报道的18个其他PVY CP序列相似性分别为88.5%～99.4%和90.9%～98.3%。构建PVY-CP-4和PVY-CP-7与其他18个PVY CP序列的系统关系树，可以看出PVY-CP-4和PVY-CP-7各自归为一类，两者之间亲缘关系较远。PVY-CP-4基因与PVYO（EF026074）亲缘关系最近，而PVY-CP-7基因与PVYNTN（AJ890347）亲缘关系最近，实际上，PVYNTN株系是PVYN株系的一个变种。病毒的外壳蛋白基因在寄主症状、病毒长距离和细胞间运输、病毒的介体传播等方面起着重要的作用。因此，病毒的外壳蛋白基因的同源性在病毒株系的划分中已成为主要依据之一。根据ELISA检测结果，PVY-CP-4和PVY-CP-7均属于PVYN株系，这与PVY-CP-7的分子鉴定结果相吻合，但与PVY-CP-4的分子鉴定结果不相符。Potyvirus 属是已确定的植物病毒属中成员最多的一个，有103个确定成员和92个暂定成员，传统分类标准如种传效率、交叉保护、蚜虫介体种类、寄主范围和症状学等至今仍被用作种的分类标准（Bvrunt，1992；Shukla 等，1994）。据报道（Bos，1992；Shukla 等，1992），原来最常用的用于区分相关病毒的标准——血清学关系很不可靠，在现今病毒分类上一般仅具参考价值。目前普遍认为，只有病毒的基因组结构和序列才能真实地反映植物病毒种的分类本质（Ward等，1995）。因此，根据本实验所测出的PVY CP的核甘酸序列比对结果，安徽地区烟草寄主上感染的PVY应属于PVYO株系，而马铃薯寄主上感染的PVY应属于PVYNTN株系。

主要步骤如下。（1） 将 800 μl 提取缓冲液 CTAB buffer （内含 2%CTAB、100 mmol/L Tris-HCl pH值8.0、20 mmol/L EDTA、1.4 mol/L NaCl、2%PVP30、1%的β-巯基乙醇） 加入2 ml的离心管内65℃预热。（2） 从-70℃超低温冰箱中取0.2 g ‘富士’ 和 ‘金冠’ 及其杂交群体单株的嫩叶，放入研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状，并迅速转移到装有预热的提取缓冲液的离心管内，并上下颠倒混匀。（3） 65℃水浴中保温3 min，数次颠倒使内含物充分混匀。（4） 将离心管取出，加800 μl氯仿∶异戊醇 （体积比为24∶1）。颠倒充分混合，温和震荡2～3 min。（5） 在高速离心机上离心10 min （14000 r/min），将上清液转移到1.5 ml离心管中。（6） 加入6 μl RNase （10 mg/ml） 充分混匀，在37℃恒温箱内温育1 h，再用氯仿∶异戊醇抽提1次。（7） 加500 μl 事先在-20℃冰箱内预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后，于4℃冰箱中沉淀 DNA 10～25 min。（8） 在高速离心机上 14000 r/min 离心 3 min，然后弃掉上清，得到沉于离心管底部的DNA。（9） 用500 μl 75%乙醇洗 DNA沉淀两次。倒掉乙醇，注意不要将DNA倒出。（10） 在超净工作台上干燥 DNA 2 h。（11） 将吹干的DNA溶于100 μl超纯水中。1.缓冲液的的制备取适量50×TBE缓冲液配制成1×TBE稀释缓冲液，待用。2.胶液的制备称取1 g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入 100 ml 1×TBE 稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，制成1%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。3.胶板的制备待凝胶温度稍低后加入5 μl EB （溴化乙锭），混匀，然后倒入模具中 （注意不要有气泡），加上合适的梳子形成加样孔，梳子的位置应该在托盘底面上0.5～1.0 mm。4.待胶完全凝固后拔出梳子注意不要损伤梳底部的凝胶，将模具放入电泳槽内并加入1×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。5.加样取10 μl DNA稀释液，用微量移液枪小心加入样品槽中。每加完一个样品要更换 tip 头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。6.电泳加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。DNA 应该向阳极泳动，用120 V电压电泳15～30 min，停止电泳。1.6%非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法（1） 胶板的制备。先用水将平板和耳朵板冲洗干净，将其平放在桌面上，用餐巾纸将其擦干之后，用 95%酒精擦洗 2 次，待其干后，将0.5%的 Banding silane 溶液均匀的倒在平板上，用餐巾纸迅速将其涂匀，待其晾干，然后将洗干净的梳子和压条整齐的摆在平板之上，将2%的 Repel silane溶液均匀的涂在耳朵板上 （此项操作应在通风橱中进行），待其晾干后，将其整齐摆放在平板之上，用夹子将其夹好。（2） 凝胶的制备。取50%的PA胶50 ml，加入60 μl的TEMED，120 μl 10%的过硫酸铵 （APS），温和混匀。（3） 灌胶。将混合好的胶沿着玻璃板的灌胶口缓缓灌入，注意使灌入的胶基本上沿着一条直线灌入，如不整齐，可用手轻轻拍打胶板，使胶保持同一直线灌入，避免气泡的产生。胶灌入到底部之后，迅速将梳子平面插入到两玻璃板之间，插好梳子之后，用夹子夹好，让其聚合1h后用于电泳。（4） 电泳。加入电极缓冲液lxTBE，50 W恒功率，预电泳10 min后，清除气泡，插入梳齿，将扩增好的 PCR 产物，加入6 μl的溴酚蓝，混匀95℃变性5 min，之后用微量加样器取6 μl，进行电泳1 h左右 （根据分子量的大小调整电泳时间）。2.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染方法 （体积100 ml）（1） 固定。在磁盘中加入 10%的乙醇和 500 μl 冰乙酸，摇匀后加入凝胶，再平行摇动3～5 min。（2） 染色。在固定液中加入 1 ml 20%AgNO3 储备液后，平行摇动 5～8 min。（3） 漂洗。倒掉定影液，加入蒸馏水漂洗 2～3 次，洗净后，倒掉蒸馏水。（4） 显色。在磁盘中加入 100 ml 3%NaOH 溶液和 500 μl 甲醛，迅速振荡，使显影液均匀作用，然后平行摇动，直至显影。（5） 洗涤。清楚显影后，倒掉显影液，用自来水清洗凝胶 1～2次，彻底去掉显影液，以免保存时变色。1.胶回收（1） 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。（2） 在紫外灯下切出含有目的片段 DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的片段 DNA 部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高 DNA 回收率。胶块超过 300 mg时，使用多个 Column 进行回收，否则严重影响回收率。注：切胶时注意不要将 DNA 长时间暴露于紫外灯下，以防 DNA损伤。（3） 切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤 6 的胶块溶解时间，提高 DNA 回收率。（4） 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以 1 mg=1μl 进行计算。（5） 向胶块中加入胶块溶解液 Buffer GM，Buffer GM 的加量如下表。凝胶浓度BufferGM使用量1.0%3个凝胶体积量1.0%～1.5%4个凝胶体积量1.5%～2.0%5个凝胶体积量（6） 将不溶解液与胶块充分混合后，15～25℃溶解胶块 （胶浓度较大或比较难溶时可以在 37℃加热）。间断振荡混合，使胶块充分溶解 （5～10 min）。注：胶块一定要充分溶解，否则将会严重影响 DNA 的回收率。高浓度凝胶可以适当延长溶胶时间。（7） 当凝胶完全溶解后，观察溶胶液的颜色，如果溶胶液颜色由黄色变为橙色或粉色，向上述胶块溶解液中加入 3M 醋酸钠溶液（pH值5.2） 10 μl，均匀混合至溶液恢复黄色。当分离小于 400 bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为 20%的异丙醇。（8） 将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。（9）将上述操作步骤7的溶液转移至Spin Column中，12000r/min离心1min，弃滤液。注：如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高 DNA 的回收率。（10）将700μl的Buffer WB加入Spin Column中，室温12000r/min离心30s，弃滤液。注：确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100%乙醇。（11） 重复操作步骤 10。（12） 将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12000 r/min离心1 min。（13） 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Col-umn膜的中央处加入 30 μl 灭菌蒸馏水或 Elution Buffer，室温静置1 min。注：将灭菌蒸馏水或 Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。（14） 室温12000 r/min离心1 min洗脱DNA。2.大肠杆菌感受态的制备（1） 取大肠杆菌DH5α 在 LB 培养基上划线，37℃培养箱内过夜培养，长出单菌落。（2） 挑取单菌落，接种于4 ml不含抗生素的LB培养基上，37℃振荡 （轻摇） 培养过夜。（3） 过夜培养的菌液与 LB 培养基按 1∶50 的比例转入三角瓶，37℃振荡培养 （约3 h），至OD600=0.4～0.6。（4） 4℃，5000 r/min离心5 min，轻轻倒掉上清，用5 ml （1/5体积） 预冷的0.1 mol/L Mgcl2悬浮细胞 （0.95 g/100 ml）。（5） 4℃，5000 r/min 离心 5 min，轻轻倒掉上清，用 12.5 ml （1/2体积） 预冷的 0.1 mol/L CaCl2悬浮细胞，冰浴放置 20 min（1.1 g/100 ml）。（6） 4℃，5000 r/min离心5 min，轻轻倒掉上清，用2.5 ml预冷的 0.1 mol/L CaCl2 （含 10%的甘油） 悬浮细胞，分装，每管120 μl。（7） 液氮速冻，-80℃保存。3.目的基因连接载体pMD-19T simple 1 μl，目的 DNA 4 μl，solution Ⅰ 5 μl，混匀后于16℃金属浴中反应30 min。4.目的基因转化（1） 1.5 ml离心管中加入10 μl的连接产物和50 μl大肠杆菌感受态细胞。（2） 冰上放置30 min。（3） 42℃金属浴加热45 s 后，冰中放置1 min。（4） 加入 500 μl LB 液体培养基，37℃，200 r/min 振荡培养45 min。（5） 取100 μl菌液涂板 （LB+Amp+），37℃过夜培养。（6） 过夜培养之后，挑取单克隆菌落，加到 LB 液体培养基（Amp+100 mg/L） 中37℃，200 r/min振荡培养6～8 h。（7） 菌液PCR检测正确后，送测序。序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置1CH03g12GCGCTGAAAAAGGTCAGTTTCAAGGATGCGCATGTATTTGChr12CH05g08CCAAGACCAAGGCAACATTTCCCTTCACCTCATTCTCACCChr13Hi02c07AGAGCTACGGGGATCCAAATGTTTAAGCATCCCGATTGAAAGGChr14Hi07d08TGACATGCTTTTAGAGGTGGACGTTTGAGGGGTGTCCGTACAAGChr15Hi12c02GCAATGGCGTTCTAGGATTCGTTTCACCAACAGCTGGGACAAGChr16C10455AAGGCAATACAAGACGGACGTTCACACCGAAAGCCTCTCTChr17Hi21g05GACGAGCTCAAGAAGCGAACGTTTGCTCTTGCCATTTTCTTTCGChr18C13810CGTCCTAGATAGATGCCCCACAGGACTCTAAGGACTGCCGChr1附表1 实验所用已发表SSR引物列表序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置9C13280CTCCTCCTCCCTCAGTACCCCCTTCACTCACCTTTCTCGCChr110C16757AATGGGACCCAACTGGTACATCGACCATACAAATTGCTGCChr111C6948CTTGGAGCTGTGAGAGTCCCCAAACCTCTCATCGCAACCTChr112KA4bAAAGGTCTCTCTCACTGTCTCCTCAGCCCAACTCAAAGCCChr113CH02a04GAAACAGGCGCCATTATTTGAAAGGAGACGTTGCAAGTGGChr214CH02b10CAAGGAAATCATCAAAGATTCAAGCAAGTGGCTTCGGATAGTTGChr215CH02c02aCTTCAAGTTCAGCATCAAGACAATAGGGCACACTTGCTGGTCChr216CH02c06TGACGAAATCCACTACTAATGCAGATTGCGCGCTTTTTAACATChr217CH02f06CCCTCTTCAGACCTGCATATGACTGTTTCCAAGCGATCAGGChr218CH03d01CGCACCACAAATCCAACTCAGAGTCAGAAGCACAGCCTCChr219CH03d10CTCCCTTACCAAAAACACCAAAGTGATTAAGAGAGTGATCGGGGChr220CH05e03CGAATATTTTCACTCTGACTGGGCAAGTTGTTGTACTGCTCCGACChr221Hi02a07TTGAAGCTAGCATTTGCCTGTTAGATTGCCCAAAGACTGGGChr222Hi05g12TCTCTAGCATCCATTGCTTCTGGTTTGTGTGTTCTCTCATCGGATTCChr223Hi07d12GGAATGAGGGAGAAGGAAGTGGTTTCCTCTTCACGTGGGATGTACCChr224Hi08f05GTGTGGGCGATTCTAACTGCGTTTCCTTTATTCTAAACATGCCACGTCChr225Hi08g12AGTTCGGTCGGTTCCGTAATGTTTAGGGCAAGGGGAAAGAAGTChr226Hi22d06CCCCGAGCTCTACCTCAAACATTATGTTTCCGGTTTTTGGChr227Hi24f04CCGACGGCTCAAAGACAACTGAAAAGTGAAGGGAATGGAAGChr228AJ251116GATCAGAAAATTGCTAGGAAAAGGAGAGAACGGTGAGCTCCTGAChr229AT000400CTCCCTTTGCTCCCTCTCTTAGGATGTCAGGGTTGTACGGChr230CN444636CACCACTTGAGTAATCGTAAGAGCGTTTGCCAGTTAAGGACCACAAGGChr231CN493139CACGACCTCCAAACCTATGCGTTTATGAAAGTACGGCACCCATCChr232CN581493GCTTTTCATGGTGGAAAAACTGGTTTGACTCTCCGCTCTGATGGACChr233NH033bGTCTGAAACAAAAAGCATCGCAACTGCCTCGTCTTCCTCCTTATCTCCChr234CH03e03GCACATTCTGCCTTATCTTGGAAAACCCACAAATAGCGCCChr335CH03g07AATAAGCATTCAAAGCAATCCGTTTTTCCAAATCGAGTTTCGTTChr336MS14h03CGCTCACCTCGTAGACGTATGCAATGGCTAAGCATAChr3附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-1序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置37Hi03d06TCATGGATCATTTCGGCTAAGTTTGCCAATTTTATCCAGGTTGCChr338Hi03e03ACGGGTGAGACTCCTTGTTGGTTTAACAGCGGGAGATCAAGAACChr339Hi04c10TGCGCATTTGATAGAGAGAGAAGTTTAACAAAGAACGACCCACCTGChr340Hi05f12TTTGGGTTTGGGTAGGTTAGGGTTTGTGCAGCGCATGCTAATGChr341Hi07e08TTCGTGCTAGGGAGTTGTAGCGTTTGCCTCCATAGGATTATTTGACChr342Hi15b02TATGGTGGCAACAGTGGAGAGTTTCGCCACCTCCACTTAACATCChr343Hi15h12GAACAAGAAGGACGCGAATCGTTTGGGCCTCGTTATCACTACCAChr344AU223657TTCTCCGTCCCCTTCAACTACACCTTGAGGCCTCTGTAGCChr345HGA8bAACAAGCAAAGGCAGAACAACATAGAGAAAGCAAAGCAAAChr346GD12CTAACGAAGCCGCCATTTCTTTTTGAGGTGTTTCTCCCATTGGAChr347IPPN15AACCATGGCATTGGATTGATGAAGCACTCAATGGGGAAAAChr348NZmsCN943818TGAACAGCTCATCGTCGGTACGGGAAGAGGAAATGTGATTChr349C9312TCCACCAGTGACAAGAGCTGAGGATTCAATCAGCTACGCCChr350C6359CGGAAATGGTCACTGGAACTTGGGACGGACACACACACChr351CH01b12CGCATGCTGACATGTTGAATCGGTGAGCCCTCTTATGTGAChr452CH01d03CCACTTGGCAATGACTCCTCACCTTACCGCCAATGTGAAGChr453CH02c02bTGCATGCATGGAAACGACTGGAAAAAGTCACACTGCTCCChr454CH02h11aCGTGGCATGCCTATCATTTGCTGTTTGAACCGCTTCCTTCChr455CH04e02GGCGATGACTACCAGGAAAAATGTAGCCAAGCCAGCGTATChr456CH05d02AAACTCCCTCACCTCACATCACAATAGTCCAATGGTGTGGATGGChr457Hi01e10TGGGCTTGTTTAGTGTGTCAGGTTTGGCTAGTGATGGTGGAGGTGChr458Hi07b02ATTTGGGGTTTCAACAATGGGTTTCGGACATCAAACAAATGTGCChr459Hi08e04GCATGGTGGCCTTTCTAAGGTTTACCCTCTGACTCAACCCAACChr460Hi08h03GCAATGGCGTTCTAGGATTCGGTGGTGAACCCTTAATTGGChr461Hi23d11bGACAGCCAGAAGAACCCAACGTTTATTGGTCCATTTCCCAGGAGChr462Hi23g02TTTTCCAGGATATACTACCCTTCCGTTTCTTCGAGGTCAGGGTTTGChr463Hi23g08AGCCGTTTCCCTCCGTTTGTTTGTGGATGAGAAGCACAGTCAChr464AT000420TTGGACCAATTATCTCTGCTATTGATGTGGTCAGGGAGAGGAGChr4附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-2序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置65MSS6CGAAACTCAAAAACGAAATCAAACGGGAGAGAAACTCAAGACCChr466C12595ATGAAAACCCACAAAACCCAAAACCATACACAACGCCACAChr467C13146CTGGGAAAAATGGGGAAAATGCTTTCCCTTTCCTTCTTCAAChr468C15TTGCGAGAAAGCTAAAAACCACAGACTCTGCAACCCCTCTCChr469CH01d07AGTCGAAATCCCGAACAATCAAAATCCAGTTTTCCACCTCChr470NZ01a6TTAGACGACGCTACTTGTCCTAGGATTGCTGGAAAAGGAGGChr471GD162AAAATGTAACAACCCGTCCAAGTGGAGGCAAGTGACAAAGAAAGATGChr472NH011bTTTGCCGTTGGACCGAGCGGTTCACATAGAGAGAGAGAGChr473CH02a08GAGGAGCTGAAGCAGCAGAGATGCCAACAAAAGCATAGCCChr574CH02b12GGCAGGCTTTACGATTATGCCCCACTAAAAGTTCACAGGCChr575CH03a04GACGCATAACTTCTCTTCCACCTCAAGGTGTGCTAGACAAGGAGChr576CH03a09GCCAGGTGTGACTCCTTCTCCTGCAGCTGCTGAAACTGGChr577CH04e03TTGAAGATGTTTGGCTGTGCTGCATGTCTGTCTCCTCCATChr578CH04g09TTGTCGCACAAGCCAGTTTAGAAGACTCATGGGTGCCATTChr579CH05e06ACACGCACAGAGACAGAGACATGTTGAATAGCATCCCAAATGGTChr580CH05f06TTAGATCCGGTCACTCTCCACTTGGAGGAAGACGAAGAAGAAAGChr581Hi01c04GCTGCCGTTGACGTTAGAGGTTTGTAGAAGTGGCGTTTGAGGChr582Hi02a03GACATGTGGTAGAACTCATCGGTTTAGTGCGATTCATTTCCAAGGChr583Hi04a08TTGAAGGAGTTTCCGGTTTGGTTTCACTCTGTGCTGGATTATGCChr584Hi04d02TTCGTGGCTGAGAAAGGAGTGTTTGTACGGTGCATTGTGAAAGChr585Hi08a04TTGTCCTTCTGTGGTTGCAGGTTTGAAGGTAAGGGCATTGTGGChr586Hi08h08TGAACAAATTCCACCACGAAGTTTGCCAAGGCTACAATTTTCAChr587Hi09b04GCGATGACCAATCTCTGAAACTGGGCTTGAATTGGTGAATCChr588Hi11a03GGAATTGGAGCTTGATGCAGGTTTCATACGGAATGGCAAATCGChr589Hi15e04AAACCTCTGCATTCCGTCTCCTCATACTCCTCCCACATTGTCChr590Hi21c08TTCTTCTCCTCCACCACCTCGTTTGTCACTGAGAAGGCGGTAGCChr591Hi22a07CTCTTCCTTCTCCGCCTCTTGTTTCACTCAGAATGCCTCACAGCChr592Hi22f12GGCCTCACCCAGTCTACATTGTTTGGTGTGATGGGGTACTTTGCChr5附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-3序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置93AU223670GGACTCAATGCCTTTTCTGGAGGATGGCAGCAATCTTGAAChr594CN445599TCAAATGGGTTCGATCTTCACGTTTGCCTGGCTGTAACTGTTTGGChr595CN496002TCAGAATCTCAAGCAAGATCCTCGTTTGATTGATCGTGGCGATATGChr596CH03d07CAAATCAATGCAAAACTGTCAGGCTTCTGGCCATGATTTTAChr697CH03d12GCCCAGAAGCAATAAGTAAACCATTGCTCCATGCATAAAGGGChr698CH05a05TGTATCAGTGGTTTGCATGAACGCAACTCCCAACTCTTCTTTCTChr699Hi03a03ACACTTCCGGATTTCTGCTCGTTTGTTGCTGTTGGATTATGCCChr6100CH01b11AACCTAACCAAACACGTACGGTTCGGCTGTACTCTTTGAGChr6101Hi04d10AAATTCCCACTCCTCCCTGTGTTTGAGACGGATTGGGGTAGChr6102Hi05d10AATGGGTGGTTTGGGCTTAGTTTCTTTGGCTATTAGGCCTGCChr6103Hi07b06AGCTGCAGGTAGAGTTCCAAGGTTTCATTACCATTACACGTACAGCChr6104Hi08g03ATTCACTTCCACCGCCATAGGTTTGGAATGATTGCGAGTGAAGCChr6105CN445290TCTCAGTTGCTCTGGCTTTGGTTTGCAATCAATGCCACTCTTCChr6106U78949TTTGTCTACCTCTGATCTTAACCAACAGCATCGCAGAGAACTGAGChr6107CH04e05AGGCTAACAGAAATGTGGTTTGATGGCTCCTATTGCCATCATChr7108Hi01d05GGTATCCTCTTCATCGCCTGTTAGATTGACGTTCCGACCCChr7109Hi03a10GGACCTGCTTCCCCTTATTCGTTTCAGGGAACTTGTTTGATGGChr7110Hi12f04ATTGTCCCCACAAAATTGGATGTTCGATGTGACTTCAATGCChr7111CN444794CATGGCAGGTGCTAAACTTGAAACTGAAGCCATGAGGGCChr7112CH02b11CACAACGCAGTTCGATCACTACCTTACCTGGTAGAGAGAGAChr7113EMPc111CCGATCAGAAAGAGCTGTGAGTCAAACCTTCCAACCTCAACAATChr7114Hi05b09GTTTCTAACGTGCGCCTAACGTGAAACCCAACCCAAAGAGTGGChr7115MS06c09AATATAAGAGCCAGAGGCACTATTGGAGTAAGTCGAChr7116Z38126AAGAGGGTGTTCCCAGATCCAATTCCAATTTCAGAACAGGChr7117CH01c06TTCCCCATCATCGATCTCTCAGGAGGGATTGTTTGTGCACChr8118CH01f09ATGTACATCAAAGTGTGGATTGCAAACAAACCAGTACCGCAAChr8119CH01h10TGCAAAGATAGGTAGATATATGCCATTTTGACCCCATAAAACCCACChr8120CH02g09TCAGACAGAAGAGGAACTGTATTTGGTTTGAGTTTGATCTCCAACATTACChr8附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-4序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置121CH05a02GTTGCAAGAGTTGCATGTTAGCGTTTGAGCAGAGGTTGCTGTTGCChr8122Hi01c11TTGGGCCACTTCACAACAGGGTGCGCTGTCTTCCATAAAChr8123Hi04b12CCCAAACTCCCAACAAAGCGTTTAGTTGCTAATGGCGTGTCGChr8124Hi04e05AAGGGTGTTTGCGGAGTTAGGTTTGTCTACAACTGTCTGATGGTAGCChr8125Hi20b03AAACTGCAATCCACAACTGCGTTTAAAGGGGCCCACAAAGTGChr8126Hi22g06GAAAGGACCGAATTTCATGCGGACATGGATGAAGAATTGGAChr8127Hi23g12CCCTTCCCTACCAAATGGACCTCCCCGGCTCCTATTCTACChr8128Z71980TCTTTCTCTGAAGCTCTCATCTTTCATCTTTTGGTGCTCCCACACChr8129CH01f03bGAGAAGCAAATGCAAAACCCGGGATGCATTGCTAAATAGGATChr9130CH01h02AGAGCTTCGAGCTTCGTTTGTGATTGCCACATGTCAGTGTTChr9131CH05c07TGATGCATTAGGGCTTGTACTTGTTTACCAATTAGGACTTAAAGCTGChr9132CH05d08TCATGGATGGGAAAAAGAGGGTTTCATGTCAAATCCGATCATCACChr9133Hi01d01CTGAAATGGAAGGCTTGGAGATTTATGGTGATGGTGTGAACGTGChr9134Hi04a05GGCAGCAGGGATGTATTCTGGTTTCAAGAACCGTGCGAAATGChr9135Hi05e07CCCAAGTCCCTATCCCTCTCGCTTAATAGAAACATCGCTGAChr9136Hi23d06TTGAAACCCGTACATTCAACTCGTTTGCAGTGGATTGATGTTCCChr9137AJ320188AACGATGCTTGAGGAAGAACACCTCCCGTCTCCCACCATATTAGChr9138CN444542ATAAGCCAGGCCACCAAATCCGTTTTTGGAGCGTAGGAACChr9139NH029aGAAGAAAACCAGAGCAGGGCAGCAAAAACCACAGGCATAACChr9140CH02a10ATGCCAATGCATGAGACAAAACACGCAGCTGAAACACTTGChr10141CH02b03bATAAGGATACAAAAACCCTACACAGGACATGTTTGGTTGAAAACTTGChr10142CH02b07CCAGACAAGTCATCACAACACTCATGTCGATGTCGCTCTGTTGChr10143CH02c11TGAAGGCAATCACTCTGTGCTTCCGAGAATCCTCTTCGACChr10144CH03d11ACCCCACAGAAACCTTCTCCCAACTGCAAGAATCGCAGAGChr10145COLAGGAGAAAGGCGTTTACCTGGACTCATTCTTCGTCGTCACTGChr10146MS01a03AGCAGTATAGGTCTTCAGTGCGTAGATAACACTCGATChr10147MS02a01CTCCTACATTGACATTGCATTAGACATTTGATGAGACTGChr10148MS06g03CGGAGGGTGTGCTGCCGAAGGCCCAGCCCATATCTGCTChr10附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-5序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置149Hi01a03CGAATGAAATGTCTAAACAGGCAAGCTACAGGCTTGTTGATAACGChr10150Hi01b01GCTACAGGCTTGTTGATAACGCACGAATGAAATGTCTAAACAGGCChr10151Hi02d04TGCTGAGTTGGCTAGAAGAGCGTTTAAGTTCGCCAACATCGTCTCChr10152Hi03c04CGTAAATAGCGAATCCGATACCGTTTCAACATCTGTGGGTCATTGCChr10153Hi03f06ACGATTTGGTGATCCGATTCGTTTCGTCGCATTGTGCTTCACChr10154Hi04f08CGTGAAAACTCTAACTCTCCGTTTGAAAAGCGCATCAAAGTTCCChr10155Hi05b02GATGCGGTTTGACTTGCTTCGTTTCTCCAGCTCCCATAGATTGCChr10156Hi08g06AATCGAACCAGCACAGGAAGGTTTAGATGGAGGTCGTGGTTACGChr10157Hi08h12GAAGGAAATCATCATCAAGACGGTTTCAAGACCATGGAACAACTTGGChr10158Hi21f08GAGAAAACGCAGAAGCATTGAGTAATGATTTCATCGCGAGTCChr10159Hi22f04TCAATCCTCTGCTCTTCAAGGGTTTAATCACCTGCTGCTGCTTGChr10160AF057134ACTACCCAATGCCCACAAAGTATCCTCGCCCAAAAGACTGChr10161AU223548ACCACCACTGCAGAGACTCAGACGCACCCATTCATCTTTTChr10162CH02d08TCCAAAATGGCGTACCTCTCGCAGACACTCACTCACTATCTCTCChr11163CH02d12AACCAGATTTGCTTGCCATCGCTGGTGGTAAACGTGGTGChr11164CH03d02AAACTTTCACTTTCACCCACGACTACATTTTTAGATTTGTGCGTCChr11165CH04a12CAGCCTGCAACTGCACTTATATCCATGGTCCCATAAACCAChr11166CH04d07TGTCCTCCAATCTTAACCCGCACACAGACGACACATTCACCChr11167CH04d10GAGGGATCTGTAGCTCCGACTGGTGAGTATCTGCTCGCTGChr11168CH04g07CCCTAACCTCAATCCCCAATATGAGGCAGGTGAAGAAGGAChr11169CH04h02GGAAGCTGCATGATGAGACCCTCAAGGATTTCATGCCCACChr11170Hi01d06GGAGAGTTCCTGGGTTCCACAAGTGCACCCACACCCTTACChr11171Hi02a09ATCTCTAAGGGCAGGCAGACCTGACTCTTTGGGAAGGGCChr11172Hi02c06AGCAAGCGGTTGGAGAGAGTTTGCAACAGGTGGACTTGCTCTChr11173Hi04g11CAGAGGATTATCAATTGGACGCAAACTATCTCCAGTTATCCTGCTTCChr11174Hi06b06GGTGGGATTGTGGTTACTGGGTTTCATCGTCGGCAAGAACTAGAGChr11175Hi07d11CCTTAGGGCCTTTGTGGTAAGGTTTGAGCCGATTAGGGTTTAGGGChr11176Hi07g10TATTGGGTTTTGGGTTTGGAGTTTCAACCCTTTTGGTTGTGAGGChr11附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-6序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置177Hi09a01GAAGCAACCACCAGAAGAGCGTTTCCCATTCGCTGGTACTTGAGChr11178Hi16d02AACCCAACTGCCTCCTTTTCGTTTCGACATGATCTGCCTTGChr11179Hi23d02CCGGCATATCAAAGTCTTCCGTTTGATGGTCTGAGGCAATGGAGChr11180CN491050CGCTGATGCGATAATCAATGGTTTCACCCACAGAATCACCAGAChr11181CH01d09GCCATCTGAACAGAATGTGCCCCTTCATTCACATTTCCAGChr12182CH01f02ACCACATTAGAGCAGTTGAGGCTGGTTTGTTTTCCTCCAGCChr12183CH01g12CCCACCAATCAAAAATCACCTGAAGTATGGTGGTGCGTTCChr12184CH03c02TCACTATTTACGGGATCAAGCAGTGCAGAGTCTTTGACAAGGCChr12185CH04d02CGTACGCTGCTTCTTTTGCTCTATCCACCACCCGTCAACTChr12186CH04g04AGTGGCTGATGAGGATGAGGGCTAGTTGCACCAAGTTCACAChr12187CH05d04ACTTGTGAGCCGTGAGAGGTTCCGAAGGTATGCTTCGATTChr12188CH05d11CACAACCTGATATCCGGGACGAGAAGGTCGTACATTCCTCAAChr12189CH05g07CCCAAGCAATATAGTGAATCTCAATTCATCTCCTGCTGCAAATAACChr12190MS14b04CCTTAAGAATCATGTGATACTAATGGCACAAAGATTGTChr12191Hi02b07TGTGAGCCTCTCCTATTGGGTGGCAGTCATCTAACCTCCCChr12192Hi02d05GAGGGAGAATCGGTGCATAGCATCCCTCAGACCCTCATTGChr12193Hi03b03TGAATTGAGTTTGAGAATGGAATGGTTTGTCAGGACGGGTAATCAAGGChr12194Hi07f01GGAGGGCTTTAGTTGGGAACGTTTGAGCTCCACTTCCAACTCCChr12195CN496913TGCCTTTGAGAATCGAAATGTGTTTGTCAATTTCTTGGAACTCChr12196CH03a08TTGGTTTGCTAGGAAAAGAAGGAAGTTTATCGGGCCTACACGChr13197CH03h03AAGAAATCGGATCCAAAACAACTCCCTCAAAGATTGCTCCTGChr13198CH05c04CCTTCGTTATCTTCCTTGCATTGAGCTTAAGAATAAGAGAAGGGGChr13199CH05f04GATGATGGTGCTCTCGGTTATTTTATGTTGGGTAATGTCTTCCGChr13200Hi03e04CTTCACACCGTTTGGACCTCGTTTCATATCCCACCACCACAGAAGChr13201Hi04a02TTCGTGGAAACCTAATTGCAGGTTTCCTCTGCTTCTTCATCTTTGCChr13202Hi04f09ACTGGGTGGCTTGATTTGAGGTTTCAACTCACACCCTCTACATGCChr13203Hi04g05CTGAAACAGGAAACCAATGCGTTTCGTAGAAGCATCGTTGCAGChr13204Hi08e06GCAATGGCGTTCTAGGATTCGTTTGGCTGCTTGGAGATGTGChr13附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-7序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置205Hi08f06CTTAGAGCATAGATGACCTGCAAGTTTAGAAATCCAACGGCCAAAGChr13206AU223486TGACTCCATGGTTTCAGACGAGCAATTCCTCCTCCTCCTCChr13207GD147TCCCGCCATTTCTCTGCGTTTAAACCGCTGCTGCTGAACChr13208NH009bCCGAGCACTACCATTGACGTCTGTTTACCGCTTCTChr13209CH01e01GGTTGGAGGGACCAATCATTCCCACTCTCTGTGCCAGATCChr14210CH01g05CATCAGTCTCTTGCACTGGAAAGACAGAGTAAGCTAGGGCTAGGGChr14211CH03a02TTGTGGACGTTCTGTGTTGGCAAGTTCAACAGCTCAAGATGAChr14212CH03d08CATCAGTCTCTTGCACTGGAAATAGGGCTAGGGAGAGATGATGAChr14213CH03g04ATGTCCAATGTAGACACGCAACTTGAAGATGGCCTAACCTTGTTChr14214CH04c07GGCCTTCCATGTCTCAGAAGCCTCATGCCCTCCACTAACAChr14215CH04f06GGCTCAGAGTACTTGCAGAGGATCCTTAAGCGCTCTCCACAChr14216CH05d03TACCTGAAAGAGGAAGCCCTTCATTCCTTCTCACATCCACTChr14217CH05e05TCCTAGCGATAGCTTGTGAGAGGAAACCACCAAACCGTTACAATChr14218CH05g11GCAAACCAACCTCTGGTGATAAACTGTTCCAACGACGCTAChr14219MS01a05GGAAGGAACATGCAGACTTGATGTTTCATCTTTACAChr14220Hi01c09AAAGGCGAGGGATAAGAAGCGTTTGCACATTTGAGCTGTCAAGCChr14221Hi02d11GCAATGTTGTGGGTGACAAGGTTTGCAGAATCAAAACCAAGCAAGChr14222Hi08c05TCATATAGCCGACCCCACTTAGGTTTCACACTCCAAGATTGCATACGChr14223Hi21e04TGGAAACCTGTTGTGGGATTTGCAGAGCGGATGTAAGTTGChr14224Hi23b12TGAGCGCAATGACGTTTTAGGTTTCAGGCTTTCCCTTCAGTGTCChr14225AJ000761aCTGGGTGGATGCTTTGACTTTCAATGACATTAATTCAACTTACAAAAChr14226AJ000761bCCCTAAACACACAGCCTCCTGTTTCAGCATCGCAGAGAACTGAGChr14227U78948GATCGTCCGCCACCTTAATAGGGTTTTCATCATGCACATTChr14228CH01d08CTCCGCCGCTATAACACTTCTACTCTGGAGGGTATGTCAAAGChr15229CH02c09TTATGTACCAACTTTGCTAACCTCAGAAGCAGCAGAGGAGGATGChr15230CH02d11AGCGTCCAGAGCAACAGCAACAAAAGCAGATCCGTTGCChr15231CH03b06GCATCCTTGAATGAGGTTCACTCCAATCACCAAATCAATGTCACChr15232CH03b10CCCTCCAAAATATCTCCTCCTCCGTTGTCCTGCTCATCATACTCChr15附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-8序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置233CH04g10CAAAGATGTGGTGTGAAGAGGAGGAGGCAAAAAGAGTGAACCTChr15234Hi01c06TTAGCCCGTATTTGGACCAGGTTTCACCTACACACACGCATGGChr15235Hi02d02TTCCTAGGCTACCCGAAATATGGTTTCTGGCATGGACATTCAACCChr15236Hi02f06TAAATACGAGTGCCTCGGTGGCAGTTGAAGCTGGGATTGChr15237Hi02g06AGATAGGTTTCACCGTCTCAGCGACCTCTTTGGTGCGTCTGChr15238Hi03a06TGGTGAGAGAAGGTGACAGGGTTTAAGGCCGGGATTATTAGTCGChr15239Hi03g06TGCCAATACTCCCTCATTTACCGTTTAAACAGAACTGCACCACATCCChr15240Hi04c05AGGATGCTCTGCCTGTCTTCGTTTCTCACTCGCCTGCTCTATCCChr15241Hi06f09AACCAAGGAACCCACATCAGGTTTCACTTACACACGCACACACGChr15242Hi09f01CACCACCAAATTCTCCATCTTCGTTTACCGCCAAATGCTTTGTTACChr15243Hi11a01ACCGCCAAATGCTTTGTTACGTTTCCTCCATTAAACTCCTCAGTGChr15244Hi15c07TCACTTCCCATCATCACTGCGTTTCAATGTCGAGGCTGGTAATGChr15245Z71981GCACTTACCTTTGTTGGGTCACCGGCATTCCAAATGTAACTChr15246CH02a03AGAAGTTTTCACGGGTGCCTGGAGACATGCAGAATGGAGChr16247CH02d10aTGATTTCCTTTTTCGCAAGGTTCATCGTTCCCTCTCAAACChr16248CH04f10GTAATGGAAATACAGTTTCACAATTAAATGCTTGGTGTGTTTTGCChr16249CH05a04GAAGCGAATTTTGCACGAATGCTTTTGTTTCATTGAATCCCCChr16250CH05c06ATTGGAACTCTCCGTATTGTGCATCAACAGTAGTGGTAGCCGGTChr16251CH05e04AAGGAGAAGACCGTGTGAAATCCATGGATAAGGCATAGTCAGGAChr16252Hi01a08AAGTCCAATCGCACTCACGCGTAGCTCTCTCCCGATACGChr16253Hi02b10TGTCTCAAGAACACAGCTATCACCGCCGTTTCTTGGAGGCAGTAGTGCAGChr16254Hi02h08AACGGCTTCTTGTCAACACCGTTTGGCTGGGAATATATGATCAGGTGChr16255Hi04e04GACCACGAAGCGCTGTTAAGGTTTCGGTAATTCCTTCCATCTTGChr16256Hi08d09ACTCATACCCATCGTATTGGTTTACTGCATCCCTTACCACCACChr16257Hi08f12GGTTTGTAACCCGTCTCTCGGTTTCGTAGCTCTCTCCCGATACGChr16258Hi12a02GCAAGTCGTAGGGTGAAGCTCGTTTAGTATGTTCCCTCGGTGACGChr16259Hi15a13TTCTCCCCTTCTAAACCAACCGGTTTCTTGGCGTAACATTGChr16260Hi15g11TGACATGCATAGGGTTACATGCGTTTGGGTTCGTAATCGTTCTTGTGChr16附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-9序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置261Hi22f06CAATGGCGTCTGTGTCACTCGTTTACGACGGGTAAGGTGATGTCChr16262AU301431TCTTCCTCCTCCTCCTCCTCTCTTTTTCTTGGGGTCTTGGChr16263NB102aTGTTATCACCTGAGCTACTGCCCTTCCTCTTTATTTGCCGTCTTChr16264CH01h01GAAAGACTTGCAGTGGGAGCGGAGTGGGTTTGAGAAGGTTAChr17265CH02g04TTTTACCTTTTTACGTACTTGAGCGGCTTGGAAAAGGTCACTTGCChr17266CH04c06GCTGCTGCTGCTTCTAGGTTGGCAAAACTCTGCAAGTCCChr17267CH05g03GCTTTGAATGGATACAGGAACCCCTGTCTCATGGCATTGTTGChr17268Hi02f12ACATGGCCGAAGACAATGACGTTTCAACCTTTATCCCTCCATCTTTCChr17269Hi03c05GAAGAGAGAGGCCATGATACGTTTAACTGAAACTTCAATCTAGGChr17270Hi05c06TGCGTGTATGGTTGGTTTTGTGTTTTCTTTGGTTTTAGTTGGTGChr17271Hi07h02CAAATTGGCAACTGGGTCTGGTTTAGGTGGAGGTGAAGGGATGChr17272AF527800TGGAAAGGGTTGATTGACCTAACAGCGGGTGGTAAATCTCChr17273AJ001681CCTGAGGTTATTGACCCAAAACACTCAGTTGGAAAACCCTACAChr17274AT000174CGGAGGCCGCTATAATTAGGCCTGGAAAGAAAGTAAAAGGACAChr17275AY187627GAGGACTGAATTGGTTGAGGTCGTTTCTCACCCGTATATAGGCCAACChr17276CH05a09TGATTTAGACGTCCACTTCACCTTGATTGGATCATGGTGACTAGGChr17277BGA35AGAGGGAGAAAGGCGATTGCTTCATCACCGTCTGCTChr17278BGT23bCACATTCAAAGATTAAGATACTCAGCCTTTTTTTCCCACChr17279KA5CAACAACAACAAAAAACAGTAAAGCCTTAGAAATAGAAACAACAChr17280KA14ATGGCAAGGGATATTATTAGTCATTGTAGCATTTTTATTTTTChr17281KA16GCCAGCGAACTCAAATCTAACGAGAACGACGAGCGChr17282KB16GATTTTGTCCGCAGGTAAAGAACAGCAAGAACCAChr17283KU10AGTATGTGACAACCCCGATGTTAGAGTCGGTTGGGAAATGATTGChr17284NB103aTTGTAGGGAAAATGATGCCAGTGTTGATACTCTCTCTCTCChr17285NB105aAAACAACCGACTGAGCAACATCAAAATCTTAGCCCAAAATCTCCChr17286NB106aGTACGTCGACATGAGAGAGTCTCTTGTTCCTTCCTGCACChr17287NB109aATGCTCTATAAAACCCACCTACCAGAGGGACCATTGTGTTATTGTATChr17288NB110aTGATGATGTGATTTGATGGAGTGCCATTCCATTGTACGGATTChr17附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-10序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置289NB111aCCAAGCTGTGATTATAGGAAGAGGCTGAAAGATTGTAAGGTChr17290NB113aATGAAATATGTCGTGTTGCCCTTAGCCCTTCCTCAGCATGTTTCCTAGACChr17291NH007bACCTTGATGGGAACTGAACAATAGTAGATTGCAATTACTCChr17292NH019bGAGATGGAGTAGTAAAGAAGAAGGACGACATAGTGAAAACAGAAGChr17293NH020aGGATCAGCCAAGAGGAGGTGCGAGATGCAGAGGACGACGChr17294NH021aATCTCAATTTTCTCGGTAACCACTGATATCTCTCTGCACTCCCTChr17295NH022aCATGAAGTGCGTAGAAGTTGGTGTCCCAATAATGATAAGTTCCCAAAGChr17296NH023aGATGCTAGAAGGAAGGAATGATGGCTTTTCAACCCCTTCACCTTCTCChr17297NH024bACCAAAAGTAGAGAGAGAGACCCAACCAGACTAAAAGAGAChr17298NH025aCTGGACACAAACATTCAAGAGGGCACACCAGAAACTCCAAAACAGGChr17299NH027aTAATGTGTTGGGGAGAGAGAGGCTCTTGTTCCTTGCTCCTAAChr17300NH030aGCAACAGATAGGAGCAAAGAGGCTCCAAAGTTCAAChr17附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-111.基因MDP0000686092编码的氨基酸序列MSDDKMAHDIEXQLDNLSGLSPERCIYRVPERLRQVNEKAYTPQVV XVGPLHHGNGPLKAMEEHKLRYLKHFLSKTKVKLSDCLQKIQEQXKELR GFYAEPIXFDKGEFVRIVSVDAAFVIDLLLRFEVVNYREDEDDYIFSKPTM KSDVIRDLQLLENQLPFFILQDLFKLIPPQLQLQLPSLLEISYNFFQSXIDSE VKXEKFNKISSSGVEVKHFVDLIRILYLPLEPKXKPKTTATPKTRDXPNVT ELHQAGAKFKVGKGSSLFDIKFSCGILKIXKLRVDDTTDLKLRNLLAFEQC HHRKEEEDXLANYVFLMKRLAKTREDVQLLVEKGIIENWLGDTQKISNLL HDLGTGMIVDDWYYAPHXEKLIEYRXVLCRGWMVILKQKYFNTPWSTIS VAAAVILLILTLIQTACSYKSVPLL*2.基因MDP0000205432编码的氨基酸序列MAIEGRFNWSRTSHSFSALCKNRKAATLSRRNLRRESPPQPCKKTGI KSVGLKPTWSFSLLASCCCWTIGRAMRGLEETTCRWRRGGRKMKRKDY EELDDDFFSPSSKSRRLDAGLFATLNEDQSSAAQVFDEKPAPETSVVMQT DDLPTDPLPSGDEXALVLYNPTNTRIFKAPDSQDFSVIVNSDLIPGLREDX GSDEENKEVSNRCMAVVPWVAPNFPPASRDETQAASQSESMEVEMMDT DDNGYNGAEASGFGGTMMEGPGGIQYWQQQQLRWMEPQLFQNNITPVT3.基因MDP0000120033编码的氨基酸序列KNNWRVELSHNSRGGGGGRGGGGRGRSGGSDLKCYECGEPGHFAR ECRLRGGGGGGGGGGRRRSRTPPRYRRSPSYGRRSYSPRGRSPRRRSLT PRGNSRSRSPPYRGREELPYANGMTFHLIHAMMQWSEGSPPKQELRSAY MATWRCFRRYTGIKCCLVCLDISTTMFKLGDALSLYCLSDLVKFLPFLTLA GFIYLCKIGVGIRILKVSSASSASLVLFFCTPLAPGIFVLHYCPALGSSILNGC RSQPARASILCFCTLPGISSLPCYWDLQFXIVVDPSLLSAELLFSLNFVGSN APPSNYYSXICLIEQWVTPRMFLFYRSWRFGSDNRFSDPTPIFLPLIFNWIQ KYRNKFGSKGNLDHTETLTPCFVVG4.基因MDP0000864010编码的氨基酸序列MESEGTPYAPKSILITGAAGFIGSHVTNRLIKNYPSYKIVALDKIDYCS SFKNLRPCRSSPNFKFVKGDIACADLINHLLIADEIDTIMHFAAQTHVDNSF GNSFEFTNNNVYGTHVLLEACKVTQRVKRFIHVSTDEVYGETDMETNIGN PEASQLLPTNPYSATKAGAEMLVMAYHRSYGLPTITTRSNNVYGPHQYP EKLIPKFSLLAMKGEKLPIHGNGSNVRSYLYCDDVAEAFDVILHKGVIGH VYNIGTKKERSVLNVAEDICKMIGLNSKEAITFVQDRPFNDQRYFLDDQK LKRLGWDVRTSWEEGLKLTTEWYTKHADWWGDVSAALHPHPSFAVISR PNDDSWFFEYGFTRLSRTCNEGSNSSELKFLIYGRTGWIGGLLGKLCKGEG IXFEYGKGRLEDRKSLLEDITRVQPTHVFNAAGVTGRPNVDWCEXHKAQ TIRTNVAGTLNLADVCKDQGLLMMNFATGCIFEYDKEHPLGSGIGFKEED NPNFTGSFYSKTKAMVEELLKEYDKVCTLRVRMPISSDLSNPRNFITKIAR XDKVVNIPNSMTVLDELLPISIEMARRNCRGIWNFTNPGVISHNEILEMYR DYIDPKLKWQNFDLEEQAKVIVAPRSNNELDASKLKKEFPELLSIKDSIIK YVFEPIKKT*5.基因MDP0000945764编码的氨基酸序列MDVLVGPTFSLDVSSYGPAPTQDNRNRGGLYLNQDRGAAVAEEASS DSSSSIGVPDDSEEEEDSKGDNGDEVQSKFNGGGGGGLGSLGSFGSLEDSL PIKRGLSNYFSGKSKSFASLSEVSSTVSSVKEVEKQDNPFNKRRRVLIASK WSRRSSSSSSLYNWPNPKSMPLLALAEDGDEDDDEHDRDREGEGENASS EQSSSDEKEDQERRRXPQKLLDRRLKSFKSKSCYCLSDLQEHDEQ*引物名称正向引物序列反向引物序列SNP4970R：TGGACAAACAGGAAGCACGF：CAGCGACAGTGGCGACAASNP4236R：GCTTATCATAAAAAGCAAGACCACF：ATCATATAATTGTGTAATTTAGTAGAACASNP4257R：GGAGTCATAAGCCACAACGAGF：TCAGCTTTGAAGCATCCAATTSNP4336R：AGTTCGTTCTTTTCCGTTGCTF：GCGGTCCTGATTCAGGTACAGSNP3955R：CCCTTAAAAGCCATGGAAGAGF：GTTCTGCATAAAAACCTCGCASNP4094R：GGGTTTTGTGAGGAGGAGGAGF：CGAAGATTGCGACGGGATAGSNP3969R：CTCGTTAGGCCAAGACAAGCF：TTCAAAGAGTAGGTAGGAAGGGT附表2 SNP、InDel引物设计引物名称正向引物序列反向引物序列SNP4137R：GCACGAGTATGATGTTGCTAATGF：CCATCTTATGTCCCCAATTTGTAGSNP42992R：GGTTATACATAGAGGCACTTAGAGCF：GCACAAAACTTAGATCAAAGATGAGSNP42994R：TCAACTCATGTGCAGGAATTGGF：GCTGTGACATAAACCAGGTGAGASNP4376R：GTTTGCTGAGAAATTGATTGGAF：CCATTTCTCCTGGGGCATAGSNP4390R：AGGGCTTGGCTCACAATACTCF：TCAGGTCACAGTTGTTTTGGCSNP4432R：CGAGGAGCAAACGATAGTCAGF：ATTGGTCTCCGAATTAGAAGTCCSNP4782R：GGAGAGCGATTTATTCTACCCTACF：AGACGAAGAAAGCAACGAAAGASNP4842R：GGTCAAAATTGTCCTAGCCTATTTCF：TCCCTCATTTCCTCTTTTTACCTACSNP4878R：GAAGCAGCAGTGCAGGATGAGF：CCATAGCCCTTTGCTCTATTTGTSNP4903R：CTAGGCAAATTTAGGTAAATTTCTTAF：GACAGGTTATCAGTTTATAGCATCAAGSNP4960R：TGAGGCTATCACATTTCCAACGF：GGTTAGATGCAGCCCGATTTindel4199R：ATTGTGAAACCTTGATTGGGF：GAGATTATCCTTATTTTGTGGGindel4209R：ATGGAACGTAAGAACAAGGAF：TTGCTGAGAAGAGTACAAGTGindel4225R：AGGCGCGGTGTTGTCTAAF：CCTCAGGTGCAATAATCATCAindel4227R：AGCGTTGCTATGCTTCTAATGF：AAGATGGAAATGGTATGTGATindel4229R：AACAGAAACATTCGAGGCGTAF：TCCTTGAACTTCGTCGGTAGCindel4235R：GTGTGAAAGCTCAACTCTCCF：CAGCCTTCTCATCGGGTAGindel4246R：GGTAGCACATGCATACTGACAF：CGTTTTGGTAACTAAATCTCCindel4247R：ATGAATGTTTCGCCGAGCF：GTTCAACCATTTTATTGGATTTTindel4254R：ATAAAGTCACTTCTAGCACAAATAF：CGAAAAACGCTTTACTTAGGindel4268R：TCCACAGAAAACAACTAAAAAF：GTTTGCCAATGGGAATGindel42686R：GGCATGAATAGTTTCCACAGAF：TTTGCCAATGGGAATGTTTindel4273R：GAATGTAAGCCATGCCCTCTF：TTCCTACCATTTGTTGCCTCindel4273aR：AATGAAGAGGCAACAAATGGF：TTTTTTATCAAATCCAAATGTGindel4273bR：GTGGTTAAAGGGATTATGTCTF：TGCGAATAGGATTGAGGTindel4274R：TTGAGGGAATGAAATATGCTAF：TTGTTTATCGAATTGGGTTTindel4305R：GTAAACTCATTAAATTATGCTTGF：TGCTTTACTCCGATTCTTCindel4305aR：GTTACTTGGGCTTCCAGACAF：CCCCCAGAGAAATAGAGAGTTindel4307R：AGAAATCCGATCCTTACCACF：TGTTATCCCGTGGGTCTTindel4311R：AAACTGATAAACTTGGAGATTGF：GACGCCTACCGAACTACAindel4334R：ATACTATGAGGTGAAGGATTTAAF：GTATCTTCTACATTATCTTTCGTGindel4336R：CTCGTCGTCTATCGGTGTTF：GGGGTTTACTTGATTGGGA附表2 SNP、InDel引物设计（续）-1引物名称正向引物序列反向引物序列indel4341R：AGTCGGAAAATTCATTCATATF：GAGCTTACAGTTTTTGGTTTTindel4346R：GTTCACGGGATTAAGTCATGF：CAACGGCAAAAAATTATTATAindel4348R：GCTTATGCTCAGGGTCGTF：TTTTGATTTAAGTTATTATTTTCCAindel4349R：CAATCCATTTCAATTTTTCTGF：TTATTTTACCCCTACCCCATindel4362R：TTGAGGTTCGTTTTGGTATF：TTCAATTTTATCTCTTGGTCCindel4362aR：ACAAGTTAACAGATTTTCAAAGTF：GCTTGTAATTTGTTTTTTATGAAindel4371R：TTATTGTGTTTCTGTGCGTACF：CCAAATTATCGTTCACTGCTndel4372R：TTTGAAAACACCCTTGAATGF：TGGTTCCTGAGTGGGTAAAGindel4374R：TCAGTGACTTCGGCGTATTF：AGTTCAATCAATCTCCCAAA附表2 SNP、InDel引物设计（续）-2

梨在中国有几千年的栽培史。既营养丰富，又具很高的医用价值。根系分布较深，达2m以上，但大量的水平骨干根和须根分布在距地面15～40cm处。根系生长有两次高峰：第一次高峰在6月上中旬，新梢停止生长时；第二次高峰在9月中下旬，果实采收后。梨花芽分化的时期在6月上旬至7月下旬；先开花后展叶，先边花后中间花；大部分品种自花不实；大多花芽顶生。坐果率高，易形成大小年；果柄较长，易受风灾，果实重(大多品种在250～400g),易受风害脱落。分为生长枝和结果枝。结果枝又分为长果枝、中果枝和短果枝。梨花为伞形或伞房花序，在一个花序中外围花先开，中心花后开，一花序着生5～9朵，每朵花有花瓣5～6个。开花需在10℃以上气温。气温低，湿度大，开花慢，花期长。而气温干燥，阳光充足，则开花快，花期短。梨树是自花不实的树种，需要适当配置授粉树，才能达到受精坐果。在生产实践中常看到受精后梨果实形状、色泽、品质上有一定的变化，这种变化称为花粉直感现象，可见正确选择授粉树和辅助授粉十分重要。梨在年周期中一般有3次落花落果，第一次是落花，第二次是落果，出现在落花后，第三次在第一次落果后1周左右，这次落果多在5月上旬发生。引起落花落果的原因，第一、第二次主要是授粉受精不完全而产生落花落果，第三次落果虽与前者有关，但主要是营养和水分不足，土壤管理不善或氮肥过多，夏梢过量，引起梢与果争夺养分矛盾，均会造成大量落果。我国栽培梨的四大系统。原产黄河流域，500多个品种，著名的有鸭梨、雪花梨、苹果梨、库尔勒香梨、贡梨等。原产于长江以南和日本、韩国。有黄金梨、水晶梨、幸水、丰水、晚三吉梨、黄金20世纪、新世纪等。原产于东北等地，现有150多个品种，著名的有南果梨、京白梨、鸭广梨。原产于欧美等国，抗寒力较低，易生病。如巴梨、茄梨、贵妃梨等。选择较冷凉干燥，有灌溉条件交通方便的地方，梨树对土壤适应性强，以土层深厚、土壤疏松肥沃、透水和保水性强的沙质壤土最好。梨大多数品种自花不实，必须配置其他品种作授粉树，授粉品种应选择与主栽品种亲和力强、花期相同或相近、花粉量多，发芽率高，并与主栽品种互为授粉树的优质丰产品种，一个主栽品种宜配1～2个授粉品种，比例为(3～4)∶1。(1)定植时期。一般秋季10月定植最好，也可在春季梨苗萌芽前定植。(2)栽植密度。株行距(2.0～2.5)m×(4～5)m。(3)苗木准备。选用苗高1m以上，干径1cm以上，嫁接口愈合良好，根系发达，无病虫害的优质壮苗，苗木根系注意保湿。(4)定植。在改土后挖大穴，将苗木根系舒展、均匀放于坑中，然后回填细表土，边填土边提苗，再踏实，使根系与土壤接触紧密，使嫁接口与土面水平，灌足定根水，待下渗后，再盖一层干细土，用黑色塑料薄膜或稻草覆盖保湿。(1)制订果园管理计划。准备肥料、农药及工具等生产资料，组织技术培训。(2)病虫害防治。刮树皮，树干涂白。清理果园残留病叶、病果、病虫枯枝等，集中烧毁。(3)全园冬季整形修剪。早春喷布防护剂等防止幼树抽条。(1)做好幼树越冬的后期保护管理。新定植的幼树定干、刻芽、抹芽。根基覆地膜增温保湿。(2)全园顶凌刨园耙地，修筑树盘。中耕除草。生草园准备播种工作。(3)及时灌水和追肥。宜使用腐熟的有机肥水(人粪尿或沼肥)结合速效氮肥施用，满足开花坐果需要，施肥量占全年20%左右。若按每667m2定产2000kg,每产100kg果实应施入氮0.8kg,五氧化二磷0.6kg、氧化钾0.8kg的要求，每667m2施猪粪400kg,尿素4kg，猪粪加4倍水稀释后施用，施后全园春灌。(1)注意梨开花期当地天气预报。采用灌水、熏烟等办法预防花期霜冻。(2)据田间调查与预测预报及时防治病虫害。喷1次10%吡虫啉可湿性粉剂2000倍液等，防治梨蚜、梨木虱。剪除梨黑星病梢，摘梨大食心虫、梨实蜂虫果，利用灯光诱杀或人工捕捉金龟子、梨茎蜂等害虫。悬挂性诱捕器或糖醋罐，测报和诱杀梨小食心虫。落花后喷80%代森锰锌可湿性粉剂800倍液防治黑星病。梨木虱、梨实蜂严重的梨园加喷10%吡虫啉可湿性粉剂1000～1500倍液。(3)花期放蜂、人工授粉、喷硼砂。做好疏花。(1)生长季节可选用异菌脲可湿性粉剂1000～1500倍液等防治黑星病、锈病、黑斑病。选用10%吡虫啉可湿性粉剂1500倍液或苏云金芽孢杆菌、浏阳霉素等防止蛾类及其他害虫。及时剪除梨茎蜂虫梢和梨实蜂、梨大食心虫等虫果，人工捕杀金龟子。(2)果实套袋。在谢花后15～20d喷施1次腐植酸钙或氨基酸钙，在喷钙后2～3d集中喷1次杀菌剂与杀虫剂的混合液，药液干后立即套袋。(3)土肥水管理。树体进入“亮叶期”后施肥，土施腐熟有机肥水(人粪尿或沼液等)或速效氮肥，适当补充钾肥(加草木灰等)，每667m2施猪粪1000kg、尿素6kg、硫酸钾20kg，并灌水。并根据需要进行叶面补肥。同时进行中耕除草，树盘覆草。(4)夏季修剪。抹芽、摘心、剪梢、环割或环剥等调节营养分配，促进坐果、果实发育与花芽分化。(1)保护果实，注重防治病虫害。病害喷施杀菌剂，如1∶2∶200波尔多液、异菌脲(扑海因)可湿性粉剂1000～1500倍液等。防虫主要选用10%吡虫啉可湿性粉剂1500倍液、20%灭幼脲3号每667m2 25g、1.2%烟碱乳油1000～2000倍液、2.5%鱼藤酮乳油300～500倍液或0.2%苦参碱1000～1500倍液等。(2)土肥水管理。追施氮、磷、钾复合肥，施后灌水，促进果实膨大。结合喷药多次根外追肥。干旱时全园灌水，中耕控制杂草，树盘覆草保墒。(3)夏季修剪。疏除徒长枝、萌蘖枝、背上直立枝，对有利用价值和有生长空间的枝进行拉枝、摘心。幼旺树注意控冠促花，调整枝条生长角度。(4)吊枝和顶枝。防止枝条因果实增重而折断。(1)红色梨品种。摘袋透光，摘叶、转果等促进着色。(2)防治病虫害，促进果实发育。喷异菌脲可湿性粉剂1000～1500倍液，同时混合代森锰锌可湿性粉剂800倍液等。果面艳丽、糖度高的品种采前注意防御鸟害。(3)叶面喷沼液等氮肥或磷酸二氢钾。采前适度控水，促进着色和成熟，提高梨果品质。采前30d停止土壤追肥，采前20d停止根外追肥。(4)果实分批采收。及时分级、包装与运销。(5)清除杂草，准备秋施基肥。(1)土壤改良，扩穴深翻，秋施基肥。每667m2秋施秸秆2000kg,猪粪600kg、钙镁磷肥30kg,加适量速效肥和一些微肥。(2)幼旺树要及时控制贪青生长。促进枝条成熟，提高越冬抗寒力。(3)土壤封冻前灌一次透水，促进树体安全越冬。(4)叶面喷布5%菌毒清水剂600倍液加吡虫啉3000倍液加0.5%尿素等保护功能叶片。树干绑草诱集扑杀越冬害虫。落叶后扫除落叶、杂草、枯枝、病腐落果等，并深埋或烧毁。树干涂白。

2006年10月以来，浙江温州市乐清、瑞安、苍南、瓯海、龙湾等地的大棚番茄上相继发生了一种以前从未见过的病毒病。为此，我们立即分别从不同地点采集了较典型的罹病植株样本送浙江大学生物技术研究所鉴定，经该所用超薄切片电镜观察、ELISA和分子水平检测后确认是台湾番茄曲叶病毒（也称烟草曲叶病毒）（TLCV）所致。该病毒病在浙江省系首次发现，经检索国内也鲜有报道。台湾番茄曲叶病毒病是一种毁灭性的蔬菜新病害，是世界许多地区番茄生产上的重要限制因素，该病为害猖獗、蔬菜生产部门及有关方面须高度警惕。据调查，温州地区秋季定植的大棚番茄株发病率一般为3%～30%；严重田块株发病率高达95%以上，当地农民基本放弃管理或拉秧改种。初步统计温州各县（市、区）台湾番茄曲叶病毒病的发生面积约为333.3hm2，其中株发病率在50%的田块约为53.3 hm2以上，给各地番茄生产造成了严重损失。染病番茄植株矮化，生长缓慢或停滞，顶部叶片大多褪绿发黄、叶变小，边缘上卷，叶片增厚、变硬，叶脉呈紫色。生长发育早期染病的植株严重矮缩，不能正常开花结果；中后期染病的植株仅上部叶片和新芽表现症状，结果减少、果实变小，成熟期果实着色不均匀（红不透），商品价值低；生长发育后期，随着气温上升染病植株症状减轻。该病病原为Tomato leaf curl Tanwan virus，属双生病毒组的一种病毒，据资料报道该病毒只能由烟粉虱（Bemisia tabaci）传毒，土壤、种子和土壤均不传毒。近年来烟粉虱在温州地区的发生为害呈暴发态势，现已证实外来入侵生物B型烟粉虱的入侵蔓延并成为优势种是温州地区烟粉虱暴发的主要起因，估计台湾番茄曲叶病毒由B型烟粉虱带入的可能性较大。2006年秋冬，温州地区总体上呈高温干爽天气，对该病虫媒烟粉虱的发生、繁衍十分有利，虫量发生大、加上带毒种群及其携带病毒的多年积累和扩增，为台湾番茄曲叶病毒病的流行提供了病原数量基础，这可能是该病暴发的主要原因。此外，目前温州生产上推广的大多数番茄品种如红梅王、FA-189、516、托马雷斯、合作903等对该病毒病的抗性较差也是不可忽视的重要原因。据报道，该病极有可能在首次暴发后数年内迅速发展并导致大暴发，故须立即采取措施进行应急防控，以便将该病发生为害控制在最小限度内。抓紧引进、筛选抗耐病的优良品种，同时加强培育适合温州市栽培的抗病品种。对重发田实施与非茄科作物轮作，最好是水旱轮作。①育苗床与生产大棚要分开；②清洁消毒苗床；③使用30～40目防虫网隔离育苗，防止烟粉虱入侵；④苗床挂“黏虫色胶板”诱杀烟粉虱；⑤移栽时带药下田。①加强肥水管理，增强植株抗病能力；②地膜覆盖，去除边际杂草；③及时去除植株下部烟粉虱虫、卵枝叶；④收获后及时清洁棚室和周围环境。消灭虫媒，及时防治烟粉虱。可选用99.9%绿颖农用矿物油200～300倍稀释液、20%啶虫脒（兰宁）可溶性液剂3000倍稀释液、25%扑虱灵可湿性粉剂1000～1500倍稀释液、25%阿克泰水分散粒剂2000～3000倍稀释液、2.5%天王星乳油2000～3000倍稀释液、1.8%阿维菌素1500倍稀释液、1%甲胺基阿维菌素2000倍稀释液等进行防治。应在烟粉虱发生初期防治，并交替使用农药。

芽孢杆菌属（Bacillus spp.）是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤、植物体表面及水体中，其在工业、农业、医学、军事和科学研究中有广泛的应用价值。在《Bergey氏鉴定细菌学手册》第8、第9版中，蜡样芽孢杆菌的分类地位为芽孢杆菌属的第I群，该群有22个种。根据营养型菌细胞的宽度分为两类，蜡样芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌属“大细孢菌种”。蜡样芽胞杆菌是一种杆状、产内生芽孢的革兰氏阳性细菌，由于蜡样芽孢杆菌自然界分布甚广，常存在于土壤、灰尘、腐草和空气中，极易在食品加工、运输、贮存、销售过程中，通过苍蝇、蟑螂等昆虫和不卫生的用具和手污染，通常被认为是一种条件致病菌，在临床上可导致脓肿、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎等报道，但最常见的是导致两种不同类型的食物中毒：腹泻型和呕吐型。关于B.c.引起非肠道感染及食物中毒的例子很多，从1898年起，就有B.c.造成泌尿系统感染及肠胃炎的记载，有些感染的病例甚至很严重，以致造成死亡。在微生物发展的早期，好氧芽孢杆菌就被怀疑可造成食物中毒，Lubenau1906年描述了发生在一家医院的严重的食物中毒事件，300名医务人员及病人用餐后出现急性肠胃炎，对剩余的食物进行检测，发现含有大量的好氧芽孢杆菌，该污染菌为B.c.。Seitz 1913 年从一例患肠炎与腹泻的病人分离出B.c.。Brekenfeld 分别于1926年及1959年报道了两起B.c.造成的食物中毒事件。1936～1942年，瑞典卫生部对367例食物中毒事件综合分析，证实117例是由B.c.引起，并且认识到被B.c.污染的食物，储藏温度不当时，可能会造成食物中毒，在1973年Bulyba等人报道了污染蜡样芽孢杆菌的乳制品引起食物中毒。由于Smith、Gorden 及其同事在芽孢杆菌分类学上的进展，Hauge 经过对4起食物中毒事件的调查，于1995年首次确认B.c.是一种引起食物中毒的致病菌。目前大部分国家对各类食品中的蜡样芽孢杆菌数量有所限定，多数情况下，引起食物中毒的食品中蜡样芽孢杆菌的数量在105～108 CFU/g，常因食用肉类、海鲜、乳品和蔬菜等食物引起，潜伏期一般为6～15h，一般持续24h；而致呕吐的毒素是该菌在食物中预先产生的，该毒素非常稳定，进入人体后在胃中与其受体5-HT3 结合，导致呕吐。呕吐型食物中毒的潜伏期一般为0.5～6h，一般限于富含淀粉质的食品，特别是炒饭和米饭。主要症状为恶心、呕吐，有时有腹泻、头晕、发烧和四肢无力等症状，引起这两种食物中毒的食品通常都是经过热加工处理的，但蜡样芽孢杆菌具有耐热的芽孢，能在食品加工及烹饪后残留下来，热处理诱发芽孢的萌发，在没有其他微生物与之竞争的条件下，大量生长繁殖，产生毒素并引起食品的腐败。蜡样芽孢杆菌产生的呕吐毒素（cereulide，1.2kD）是一种小的十二边形的热稳定性环状毒素，分子式为（D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val）3。其结构、性质和毒理与缬氨霉素很相似，是特异性的钾离子载体，能将K 转入线粒体内，破坏线粒体的氧化还原能力。该毒素非常稳定，目前的各种食品加工方法，包括灭菌，均无法使其失活（能耐受126℃ 90min），而且还耐强酸（pH 2.0）、耐蛋白酶水解。N.Agata等对多种食品中呕吐毒素的产量进行了检测，发现对B.cereus NC7401来说，在煮熟后的米饭中其产毒量很高，在富含淀粉质的食物中的产毒量也足以引起食物中毒；而在肉类、蛋品和密封的液体食品如牛奶和豆奶中虽可以检测到该毒素，但其含量较低。还发现在与醋、蛋黄酱及酱类一起煮的食物中，该菌株的生长和产毒都受到抑制，推测这可能是醋导致pH 降低的缘故。在12～15℃时该毒素的产量却明显高于30℃时的产量，而且该毒素的产生与芽孢的产生没有相关性。还有报道称该毒素只有在有氧条件下才能产生，所以缺氧条件如：充氮包装和真空包装能有效地防止该毒素的产生和积累。因为该毒素的分子量很小，无抗原性，这使其检测比较难，到目前为止尚缺乏一种快速可靠的检测方法。最常用是采用HEp-2 细胞进行细胞培养分析。近年来用分子生物学手段检测产毒菌株的报道也较多，如P F Horwood 等人根据NRPS基因的两个可变区的序列，针对产呕吐毒素的菌株设计了特异性的引物，进行PCR 以检测蜡样芽孢杆菌是否产毒，取得了良好的效果，该法灵敏度高，而且检测速度快。在呕吐食物中毒事件中分离的蜡样芽孢杆菌均产生呕吐毒素，而且有着共同的独特表型特征，对其基因进行分析发现它们同源性很高。B.c.所造成的腹泻型食物中毒的致病因子是肠毒素，目前至少已经发现4 种不同的肠毒素，包括2 个三联体肠毒素：溶血素BL和非溶血素Nhe；2个单一亚基肠毒素：细胞毒素K（cytK）、肠毒素T（bceT）。2.2.1 溶血素BL（HBL）Beecher1991年从B.c.菌株中分离提纯了一种具有活性的三亚基肠毒素，命名为溶血素BL（hemolysinBL），能够引起家兔肠段的液体积累，可以改变豚鼠皮肤血管的通透性，具有对vero细胞的溶细胞毒性。其由一个结合亚基B（37.5kD）、两个溶血亚基L1（38.2kD）及L2（43.5kD）组成，编码3个亚基的基因hblA、hblD、hblC经克隆、测序与分析，表明其在同一个mRNA中受一个操众子调控转录如图1。这些组分的物理化学性质非常相似，等电点（pI）为5.34，5.33和5.33。其中hblA编码结合亚基B，hblD、hblC分别编码溶血亚基L1及L2，hblB编码B’蛋白，hblC和hblD仅隔37bp个碱基，B、L1、L2蛋白分别有31、30、32个氨基酸的信号肽，hblD和hblA之间最少有100bp碱基，hblA和 hblB有381 bp的碱基隔开，B’蛋白与B蛋白开始的158个氨基酸非常相似，但其功能尚未清楚。Douglas J.Beecher等人利用等电聚焦电泳技术和快速蛋白液相层析技术证明单独成分的溶血素亚基并不会在血平板上产生溶血环，只有当3个亚基结合后，才会产生溶血环。图1 芽孢杆菌溶血素BL操纵子图谱2.2.2 非溶血素肠毒素（Nhe）非溶血素肠毒素（Nhe）由45、39和105kD的蛋白组成，其蛋白成分已被分离出来。1999年Granum等给出了nhe操纵子的序列，该操纵子有3个开放式阅读框，相应的3个基因分别是：nheA、nheB和nheC。前两个基因的产物分别为45kD和39kD 蛋白，而nheC 的产物尚未纯化出来，其功能未知。Nhe与Vero细胞相互作用的研究表明105kD蛋白是复合物的结合部位，而其他两个组分是无法单独结合到细胞上去。该105kD 蛋白是一种金属蛋白，具有分解明胶和胶原的活力。与hbl 基因不同，编码该毒素的基因位于质粒上。图2 芽孢杆菌非溶血素Nhe操纵子图谱溶血素BL（HBL）与非溶血素肠毒素（Nhe）同时受到PlcR的调控。2.2.3 肠毒素T（entertoxin T）肠毒素T为单一亚基的蛋白质，由 bceT基因编码，日本学者Agata对其基因克隆、测序和分析表明其由336个氨基酸组成。并认为其有细胞毒性，可导致家兔肠段的液体积累，可以改变豚鼠皮肤血管的通透性，具有对vero细胞的溶细胞毒性。其产物属于肠毒素蛋白。该毒素同溶血素BL无同源性，而且认为肠毒素T 不会导致食物中毒。2.2.4 细胞毒素K 早期在法国报道过食物中毒，其氨基酸序列显示它属于β-桶孔形成毒素，能在磷脂双分子层中形成直径至少为7A°的孔，该孔具有微弱的离子选择性，已证实它对人类肠道Caco-2上皮细胞具有毒性。PlcR是条件性人类病原菌B.cereus和共生病原菌B.thuringiensis细胞外毒性因子的一个多效调节子，它在细胞进入稳定期时诱导生长。受到PlcR调节的基因有：plcA编码一个专一性磷脂酰肌醇磷脂酶C（PI-PLC），Plc编码一个改良的磷脂酰胆碱磷脂酶 C（PC-PLC），nhe编码一个无溶血性的肠毒素，hbl编码一个溶血性的肠毒素 BL（HBL）；以及推定为S-层类似表面蛋白的基因，以及一个推定为细胞外RNA酶。通过分析37.1kb的hbl，plcA和plcR周围的DNA序列，推定存在28个ORF。3条新基因推定受到PlcR 的调节并编码一个中性蛋白酶，subtilase家族丝氨酸蛋白酶（Sfp）以及一个推定的细胞壁水解酶（Cwh）得到确认。相应的sfp和cwh 基因定位于plcA的上游调节区域，能同时受到位于逆转录基因之间的PlcR结合位点的调控。Sylvie Salamitou等构建plcR基因缺失的突变菌株，该基因编码一个多效细胞外因子的调节子。幼虫期同时取食亲本菌株产生的106孢子亚致死浓度的Cry1C毒性导致70%死亡率，如果使用plcR突变体的孢子，则只有7%的死亡率。小鼠鼻腔灌入108的孢子，亲本菌株导致了100%的死亡率，而灌入相同数量的突变体孢子，死亡率大大降低，甚至没有死亡。应用营养体细胞代替孢子也可以达到相同的效果。导致死亡的原因未知，不可能是由于小鼠内细菌的实际增长所导致。由于受B.thuringiensis 过量突变体感染的小鼠产生的病变，说明溶血素参与其中，发生了作用。B.thuringiensis和B.cereus具细胞溶解毒性的特性。这种细胞溶解毒性的水平在plcR基因缺失的菌株中剧烈下降。表明 B.thuringiensis407菌株和B.cereusATCC14579的致病性受到PlcR的调控。由于蜡样芽孢杆菌及其芽孢广泛存在于周围的环境中，它极易污染食物而引起食物中毒，因此需要发展一种快速的检测方法来实现对致病性蜡样芽孢杆菌的检测，目前对该类蜡样芽孢杆菌的检测主要采用生化检测方法是一项费时费力的方法，需要长时间的选择性培养过程。现在有两种试剂盒可供选择，但由于价格昂贵且不太灵敏，有些致病菌不能够检测。王利国等人对实验室14株芽孢杆菌溶血素BL的检测结果表明，8株蜡样芽孢杆菌全部检测到溶血素BL的基因且产生溶血环，而其他的蜡样芽孢杆菌只检测到hblA基因以外的基因且不产生溶血环，表明只要检测到hblA基因，证明其为致病性菌株，所以通过设计hblA基因特异引物用PCR或通过血平板培养的方法是既经济又快速的检测方法。对其他毒素的检测目前主要是通过设计特异性引物来检测。所以对蜡样芽孢杆菌毒素的检测还需要进一步对其研究，确定最佳的检测方法。

猕猴桃细菌性溃疡病是一种严重威胁猕猴桃生产的毁灭性病害，被列为全国森林植物检疫对象。此病来势凶猛，流行年份致使全园濒于毁灭，造成重大经济损失。猕猴桃细菌性溃疡病不仅可造成产量降低，而且导致果皮变厚、果味变酸、果实变小、果形不一、品质下降、商品价值降低。（1） 枝干症状。病菌能够侵染至木质部造成局部溃疡腐烂，影响养分的输送和吸收，造成树势衰弱，流出白色至红褐色菌脓，严重时可环绕茎秆引起，形成龟裂斑，甚至致使树体死亡（图9-1）。（2） 叶部症状。在新生叶片上呈现褪绿小点，水渍状，后发展成不规则形或多角形、褐色斑点，病斑周围有较宽的黄色晕圈。在连续低温阴雨的条件下，因病斑扩展很快，有也不产生黄色晕圈。严重时，叶片卷曲成杯状 （图9-2）。猕猴桃细菌性溃疡病的病菌从气孔、水孔、皮孔、伤口（虫伤、刀伤、冻伤等） 等进入植株体内裂殖。传播途径主要是借风、雨、嫁接等活动进行近距离传播，并通过苗木、接穗的运输进行远距离传播。猕猴桃细菌性溃疡病病菌对高温适应性差，在气温5℃时开始繁殖，15～25℃是生长最适宜温度，在感病后7天即可见明显病症，30℃时短时间也可繁殖。所以容易在冷凉、湿润地区发生并造成大的为害。2月初在多年生枝干上出现菌脓白点，自粗皮、皮孔、剪口、裂皮等伤口溢出，并迅速扩散变乳白色，然后变红褐色。3月末以后，溢出的菌脓增多，病部组织软腐变黑，枝干出现溃疡斑或整株枯死，成熟新叶出现褐色病斑，周围组织有黄色晕圈。6月后发病减轻，夏、秋、冬季处于潜伏状态。图9-1 猕猴桃溃疡病图9-2 叶片溃疡病染病状态（1） 叶片发病规律。叶部感病，先形成红色小点，外围有不明显的黄色晕圈。后扩大为不规则的暗绿色病斑，叶色浓绿，黄色晕圈明显。在潮湿条件下迅速扩大成水渍状大斑，受叶脉限制呈多角形。秋季产生的病斑呈暗紫色或暗褐色，晕圈较窄（图9-3）。（2） 枝干发病规律。溃疡病多从茎蔓的幼芽、皮孔、落叶痕、枝条分叉部开始，初呈水渍状，后病斑扩大，色加深，皮层与木质部分离，手压感觉松软。后期病部皮层呈纵向线状龟裂，流出青白色黏液，后转为红褐色。病斑绕茎迅速扩展，病茎横切面可见皮层和髓部变褐色，髓部充满白色菌脓 （图9-4）。受害茎蔓上部枝叶萎蔫死亡。图9-3 猕猴桃细菌性溃疡病叶部发病规律（1） 病斑处理。此技术主要针对猕猴桃植株的主杆上的溃疡病病斑，目的是减少溃疡病活菌数量及清除发病部位的腐烂组织。①用具与药剂。工具：小刀、酒精瓶 （内装75%酒精）、无菌塑料布条、毛笔等工具；药液：72%的硫酸链霉素可溶粉剂稀释100～200倍液、3%中生菌素可湿性粉剂50～100倍液、6%春雷霉素可湿性粉剂50～100 倍液、1%申嗪霉素悬浮剂100～150倍液等。②实施方案。时间：每年冬季、春季，树干出现病斑、流脓等症状的时期；方法：用消毒后的小刀，刮除猕猴桃树干病斑，包括发病表皮、变色木质部和距病斑边缘0.5厘米左右的健康表皮，选取上述药液涂抹在刮除部分，然后用无菌塑料布包好。③注意事项。小刀用完后及时消毒，避免交叉传染；刮除的病部组织要及时带出园区，集中烧毁。图9-4 猕猴桃细菌性溃疡病白色菌脓（2） 涂干。此技术主要是针对猕猴桃植株冬季越冬制定的。①用具与药剂。工具：水桶、刷子等；药剂：涂白剂可自行配制，生石灰10 份、石硫合剂2 份、食盐1～2 份、黏土2份、水35～40份，也可选商品制剂。②实施方案。时间：每年采果后对树体进行保护，在11月初至12月初进行，猕猴桃植株涂干技术的应在冬季修剪、清园后进行；方法：将调制好的涂白剂用刷子均匀地涂抹在冬剪后主干和主蔓上，以覆盖全部主干和主蔓为准，特别是一些树缝隙处。本方法既可防止病菌浸入树干，又可预防树干冬季冻害。（3） 灌根。①用具与药剂。工具：水桶、量杯、玻璃棒等；药液：72%的硫酸链霉素可溶粉剂稀释500～1000倍液、3%中生菌素可湿性粉剂200～500倍液、6%春雷霉素可湿性粉剂200～500倍液、36%三氯溴异氰尿酸可湿性粉剂300～500倍液、1%申嗪霉素悬浮剂500～1000倍液、荧光假单胞杆菌500倍液等。②实施方案。时间：猕猴桃溃疡病重点发生期，4月初至6月；方法：选取以上药剂两种以上，复配制成上述浓度药液。按每棵猕猴桃树3～5升的施药量进行灌根施用，以湿润猕猴桃根系附近土壤为准，发生严重的果园，每15天施用1次。③注意事项。选择药剂时应选择内吸性较好的药剂，药剂需要交替使用和混合施用。猕猴桃褐斑病又称叶斑病，主要为害叶片和枝干，是猕猴桃生长期严重的叶部病害之一。严重时导致叶片大量枯死或提早脱落，影响果实产量和品质。发病初期，多在叶片边缘产生近圆形暗绿色水溃状斑，在多雨高湿的条件下，病斑迅速扩展，形成大型近圆形或不规则形斑。后期病斑中央为褐色，周围呈灰褐色或灰褐相间，边缘深褐色，其上产生许多黑色小点 （图9-5）。图9-5 猕猴桃褐斑病——叶部病斑在多雨高湿条件下，病情发展迅速，病部由褐色变成黑色，引起霉烂。严重时，受害叶片卷曲破裂，干枯易脱落 （图9-6、图9-7）。病菌可以在病残体上越冬，翌年春季萌发新叶后，借助风雨飞溅到嫩叶上，一年内可多次发病。5—6月为病菌侵染高峰期，病菌从叶背面入侵。7—8月为发病高峰期。高温高湿易发此病。图9-6 猕猴桃褐斑病图9-7 猕猴桃褐斑病严重时期（1） 农业防治。加强果园管理，清沟排水，增施有机肥，适时修剪，清除病残体。（2） 化学防治。发病初期使用75%百菌清500倍液、25%嘧菌酯1500倍、68%精甲霜锰锌400倍液，隔5～7天喷1次，连喷2～3次。发病中期使用30%苯甲丙环唑2000倍液，32.5%苯甲嘧菌酯1500倍液。在采果前30天，用56%嘧菌·百菌清1000倍液喷1～2次，可延长叶片寿命，提高果实品质。用70%代森锰锌400～800倍液叶面喷施，要均匀周到片片见药或喷洒猕杀粉剂600～800倍液，如发现园内叶片有红蜘蛛，可在药液中加入阿维菌素或阿维甲氰1500～2000倍液，兼杀红蜘蛛。猕猴桃黄叶病在各地普遍发生，造成严重为害，尤其在地下水位较高的湿地，发病率较高，发病株率占到栽培总株数的20%左右，严重田块发病株率高达30%～50%。发生黄化病的叶片，除叶脉为淡绿色外，其余部分均发黄失绿 （图9-8），叶片小，树势衰弱。严重时叶片发白，外缘卷缩、枯焦，果实外皮黄化，果肉切开呈白色，丧失食用价值，长时间发病还会引起整株树死亡。图9-8 猕猴桃黄叶病叶部症状发病原因发病严重的有5种情况。（1） 进入盛果期的老果园因结果负载量大而发病严重。（2） 以往的上浸地和无法浇灌的干旱果园。（3） 不注意氮、磷、钾及微量元素平衡配套施肥的果园。（4） 忽视防治线虫病、根腐病为害的果园。（5） 管理粗放的果园。以上几种情况都从根本上导致树势衰弱，根系吸收、输送能力下降而发生黄叶病。（1） 农业防治。结合修剪抹芽、疏花疏果，剪除病枝蔓，抹掉病弱芽，合理留花留果，以免果树负载量过大，造成树势衰弱，降低自身抗病能力；注意平衡施肥，结合浇水，在施足氮、磷 （磷肥不宜施用过量） 肥料的同时注意增施氯化钾或硫酸钾，盛果园每亩7千克。（2） 化学防治。中草药保护性杀菌剂靓果安和叶面肥沃丰素配合使用。靓果安重点使用时期：萌芽展叶期、新梢生长期各喷施1次 （4—5月）、果实膨大期6—8月，每个月全园喷施靓果安效果佳。沃丰素重点使用时期：新梢期、花后、果实膨大期使用，按500～600 倍液 （每350 毫升对水200 千克使用）各时期喷施1次。受害叶背面生出许多点状、团块状至不规则形，黑褐色或灰黑色厚而密的扩散霉层。叶片初期生褪绿的黄色小点，后扩大成圆形至不规则形的黄褐色至深褐色病斑，其上依稀可见许多近黑色小点，一片叶子上有数个或数十个病斑，病斑上有黑色小霉点 （图9-9），后期融合成大病斑 （图9-10）。严重时叶片变黄早落，影响产量。图9-9 猕猴桃黑斑病叶部症状图9-10 猕猴桃黑斑病中期叶背病斑病菌在叶片病部或病残组织中越冬，翌年春天猕猴桃开花前后开始发病。进入雨季病情扩展较快，有些地区有些年份可造成较大损失。栽植过密、棚 （篱） 架低矮、枝叶稠密或疯长而通风透光不良的果园极利于病害的发生与流行。（1） 农业防治。建园时选用抗病品种，如梅沃德、建宁79D-13等品种 （株系）；生产管理上除做好冬剪、夏剪、落叶后清园外，还应注意防止病菌传入。（2） 化学防治。对发病植株，在发病初期、中期对全植株喷洒70%甲基硫菌灵可湿性粉剂1000倍液，或25%多菌灵可湿性粉剂500倍液，或20%三环唑可湿性粉剂1000倍液。主要为害叶片，7—8月发生。叶上初生黄褐色小点，后扩展成枯斑，边缘褐色，中部灰褐色，有较明显轮纹。病部生有黑色小粒点 （图9-11）。图9-11 猕猴桃轮纹斑病病菌在叶片等病残体上越冬，翌年6—8月高温多雨季节进入发病盛期。品种间抗病性有差异。（1） 农业防治。重病区选用抗病品种；发病初期，于5—6月及时剪除发病枝条；秋冬认真清园，结合修剪，彻底清除枯枝、落叶，剪除病枝，集中烧毁病残体，消除病源。（2） 化学防治。春季萌芽前喷布1次3～5波美度的石硫合剂。发病初期喷施25%苯菌灵乳油700倍液或50%甲基硫菌灵可湿性粉剂900～1000倍液、12%松脂酸铜乳油600倍液。为害症状一般从猕猴桃叶片边缘开始，初呈水溃状，后变为褐色不规则形病斑。病健交界处明显。病斑后期中间变为灰白色，边缘深渴色。受害叶片边缘卷曲，干燥时叶片易破裂，病斑正面散生许多小黑点 （图9-12、 图9-13）。图9-12 生长期果实炭疽病图9-13 成熟果实炭疽病病菌主要以菌丝体或分生孢子在病残体或芽鳞、腋芽等部位越冬。病菌从伤口、气孔或直接侵入，病菌有潜伏侵染现象。（1） 农业防治。注意及时摘心绑蔓，使果园通风透光，合理施用氮、磷、钾肥，提高植株抗病能力，注意雨后排水，防止积水；结合修剪、冬季清园、集中烧毁病残体。（2） 化学防治。在猕猴桃生长期，果园初次出现孢子时，3～5天内开始喷药，以后每10～15天喷1次，连喷3～5次。使用药剂有 （1 ∶ 0.5 ∶ 200） 波尔多液，0.3波美度的石硫合剂加0.1%洗衣粉，50%甲基硫菌灵可湿性粉剂 800～1000 倍液，65%代森锌可湿性粉剂500倍液，50%代森铵水剂800倍液。猕猴桃灰斑病一般从叶片叶缘开始发病，叶片上有灰色病斑，初期病斑呈水渍状褪绿褐斑，随着病情的发展，病斑逐渐沿叶缘迅速纵深扩大，侵染局部或大部叶面。叶面的病斑受叶脉限制，呈不规则状。病斑穿透叶片，叶背病斑呈黑褐色，叶面暗褐至灰褐色，发生较严重的叶片上会产生轮纹状灰斑。发生后期，在叶面病部散生许多小黑点。严重时可造成叶片干枯、早落，影响正常产量 （图9-14）。图9-14 猕猴桃灰斑病病菌在病残体上越冬，在春芽萌发展叶后，随风雨传播到嫩叶背面进行潜伏侵染，在叶片坏死病斑上，进行再次侵染。5—6月，病菌开始入侵。到7—8月叶部症状明显，开始是小病斑，之后逐步扩大，叶片后期干枯，大量落叶。到8月下旬开始大量落果。10月下旬至11月开始进入越冬期。被侵染的叶片，抗性减弱，该病原常发生再侵染，所以有时在同一叶片上出现两种病征。（1） 农业防治。加强果园管理，合理施肥灌水，增强树势，提高树体抗病力；科学修剪，剪除病残枝及茂密枝，调节通风透光，保持果园适当的温湿度；冬季彻底清园，将地面落叶和枝条清扫干净，集中烧毁。（2） 化学防治。翻土后喷5～6波美度石硫合剂于枝蔓。5月是最佳保护预防期，开花前后各喷1次药会减少初侵染。7—8月，用代森锰锌1000倍液、甲基硫菌灵800倍液进行树冠喷雾，进行2～3次即可。在叶面、枝梢上形成黑色小霉斑，后扩大连片，使整个叶面、嫩梢上布满黑霉层。由于煤烟病病菌种类很多，同一植物上可染上多种病菌，其症状上也略有差异。呈黑色霉层或黑色煤粉层是该病的重要特征 （图9-15）。病菌在病部及病落叶上越冬，翌年孢子由风雨、昆虫等传播。寄生到蚜虫、介壳虫等昆虫的分泌物及排泄物上，或植物自身分泌物上，或寄生在寄主上发育。高温多湿，通风不良，蚜虫、介壳虫等害虫发生多且分泌蜜露，均加重发病。图9-15 煤烟病（1） 农业防治。植株种植不要过密，适当修剪，温室要通风透光良好，以降低湿度，切忌环境湿闷。（2） 化学防治。植物休眠期喷施3～5波美度的石硫合剂，消灭越冬病源；该病发生与分泌蜜露的昆虫关系密切，喷药防治蚜虫、介壳虫等是减少发病的主要措施，防治介壳虫还可用松脂合剂10～20倍液、石油乳剂等；在喷洒杀虫剂时加入紫药水10000倍液防效较好；对于寄生菌引起的煤烟病，可喷用代森铵。主要为害猕猴桃的花蕾、花，其次为害幼果和叶片，引起大量落花、落果，还可造成小果和畸形果，严重影响猕猴桃的产量和品质。受害严重的猕猴桃植株，花蕾不能膨大，花萼变褐，花蕾脱落，花丝变褐腐烂；中度受害植株，花能开放，花瓣呈橙黄色，雄蕊变黑褐色腐烂，雌蕊部分变褐，柱头变黑，阴雨天子房也受感染，有的雌花虽然能授粉受精，但雌蕊基部不膨大，果实不正常，种子少或无种子，受害果大多在花后一周内脱落；轻度受害植株，果实子房膨大，形成畸形果或果实心柱变成褐色，果顶部变褐腐烂，导致套袋后才脱落。受花腐病为害的树挂果少、果小，造成果实空心或果心褐色坏死脱落，不能正常后熟 （图9-16、 图9-17）。图9-16 猕猴桃花腐病引起的果实病斑图9-17 猕猴桃花腐病为害花蕾 （左） 和花 （右）受害严重的猕猴桃植株，花蕾不能膨大，花萼变褐，花蕾脱落，花丝变褐腐烂；中等受害植株，花能开放，花瓣呈橙黄色，雄蕊变黑褐色腐烂，雌蕊部分变褐，柱头变黑，阴雨天子房也受感染，有的雌花虽然能授粉受精，但雌蕊基部不膨大，果实不正常，种子少或无种子，受害果大多在花后一周内脱落。（1） 农业防治。加强果园土肥管理，提高树体的抗病能力，秋冬季深翻扩穴，增施大量的腐熟有机肥，保持土壤疏松，春季以速效氮肥为主，配合速效磷钾肥和微量元素肥施用，夏季以速效磷钾肥为主，适量配合速效氮肥和微量元素肥；适时中耕除草，改善园地环境，特别在平坝区5—9月要保持排水沟渠畅通，降低园地湿度。（2） 化学防治。冬季用5波美度石硫合剂对全园进行彻底喷雾，在猕猴桃芽萌动期用3～5波美度石硫合剂全园喷雾，展叶期用65%的代森锌可湿性粉剂500倍液或50%退菌特可湿性粉剂800倍液或0.3波美度的石硫合剂喷洒全树，每10～15天喷1次。特别是在猕猴桃开花初期要重防1次。在收获的果实一侧出现类似大拇指压痕斑，微微凹陷，褐色，酒窝状，直径大约5毫米，其表皮并不破，剥开皮层显出微淡黄色的果肉，病斑边缘呈暗绿色或水渍状，中间常有乳白色的锥形腐烂，数天内可扩展至果肉中间乃至整个果实腐烂（图9-18）。该病菌靠风、雨、气流传播，从修剪造成的枝条伤口感染。图9-18 熟腐病（1） 农业防治。谢花后1周开始幼果套袋，避免侵染；清除修剪下来的枝条和枯枝落叶，集中烧毁，减少病菌寄生场所。（2） 化学防治。从谢花后两周至果实膨大期 （5—8月） 向树冠喷布 50%多菌灵可湿性粉剂 800 倍液或波尔多液 （1 ∶0.5 ∶ 200），或80%甲基硫菌灵可湿性粉剂1000倍液，喷洒2～3次，喷药期间隔20天左右。受害果起初在果蒂处出现水渍状病斑，以后病斑均匀向下扩展，果肉由果蒂处向下腐烂，蔓延全果，略有透明感，有酒味，病部果皮上长出一层不均匀的绒毛状灰白霉菌，后变为灰色 （图9-19、 图9-20）。病菌以分生孢子在病部越冬，通过气流传播。图9-19 猕猴桃蒂腐病图9-20 蒂腐病在花季期的表现（1） 农业防治。搞好冬季清园工作；及时摘除病花，集中烧毁。（2） 化学防治。开花后期和采收前各喷1次杀菌剂，如倍量式波尔多液或65%代森锌可湿性粉剂500倍液；采前用药应尽量使药液喷洒到果蒂处，采后24小时内用药剂处理伤口和全果，如用50%多菌灵可湿性粉剂1000倍液加2，4-D 100～200毫克/千克浸果1分钟。秃斑表面若是由外果肉表层细胞愈合形成，比较粗糙，常伴之有龟裂缝；若是由果实表层细胞脱落后留下的内果皮愈合，则秃斑光滑。湿度大时，在病斑上疏生黑色的粒状小点，即病原分生孢子盘。病果不脱落，不易腐烂 （图9-21）。病菌先侵染其他寄主后，随风雨吹溅分生孢子萌发侵染。图9-21 猕猴桃秃斑病为害果实状（1） 农业防治。加强果园管理，增施钾肥，避免偏施氮肥，增强抗病力。（2） 化学防治。发病初期喷施27%碱式硫酸铜悬浮剂600倍液或50%氯溴异清尿酸水溶性粉剂1000倍液、50%咪鲜胺可湿性粉剂900倍液、75%百菌清可湿性粉剂600倍液。受病菌感染的雌花和雄花都会变成褐色枯萎状，常萎蔫下垂，难以开放。发病花器的病残组织与果实接触后可使果实感染病菌，果实受害后，果面形成下陷褐色病斑，上面覆盖白色菌丝体 （图9-22）。多雨潮湿，温度较低时，有利于菌核萌发和子囊孢子的形成。土壤黏重的地方，发病也较重。图9-22 猕猴桃果实褐腐病前期症状大量的菌丝体在受害部位变成黑硬的菌核，菌核落到果园后，病菌继续蔓延，在果园中传播。（1） 农业防治。加强果园土肥水管理，及时清除树盘周围枯枝落叶并集中烧毁。（2） 化学防治。菌核萌发期、落瓣后及采收前应喷洒0.5波美度的石硫合剂或800倍液甲基硫菌灵。展叶前后喷施50%代森锌可湿性粉剂500倍液。为害果实，多在果肩或朝上果面上发生，病斑近圆形，红褐色，较小，突起呈疱疹状，果实上许多病斑连成一片，表面粗糙，似疮痂状。病斑仅发生在表皮组织，不深入果肉，因此，为害较小，但降低商品价值。多在果实生长后期发生 （图9-23）。图9-23 猕猴桃疮痂病以菌丝体和分生孢子器随病残体遗落土中越冬或越夏，并以分生孢子进行初侵染和再侵染，借雨水溅射传播蔓延。通常温暖高湿的天气有利发病。（1） 农业防治。及时收集病残物烧毁。（2） 化学防治。结合防治其他叶斑病喷施75%百菌清可湿性粉剂1000倍液加70%甲基硫菌灵可湿性粉剂1000倍液，或75%百菌清可湿性粉剂1000倍液加70%代森锰锌可湿性粉剂1000倍液，每隔10天左右喷施1次，连续喷施2～3次。多与枝干粗皮、裂口、藤肿等症状相伴生，如膏药一样贴在枝干上。病菌表面较光滑，初期呈白色，扩展后为白色或灰色，病菌衰老时通常在枝干部发生龟裂，容易剥离，受害严重的造成树体早衰，枝条干枯 （图9-24）。图9-24 猕猴桃膏药病在患病枝干越冬，翌年春夏之交，在高温多湿条件下形成子实体。本病多出现于土壤速效硼含量偏低的猕猴桃植株及含硼较低 （10毫克/千克以下） 的两年生以上的老枝上。本病的发生是土壤和树体缺硼的生理性原因，和弱寄生菌侵染共同作用的结果。土壤施硼 （萌芽至抽梢期根际土壤每平方米1克硼砂） 和树冠喷硼，以0.2%硼砂液治粗皮、裂皮、藤肿和流胶等现象，减少弱寄生菌侵染的场所。用小刀刮除菌膜，涂抹3波美度石硫合剂或涂三灵膏 （凡士林50克，多菌灵2.5克，赤霉素0.05克调匀）。主要在树冠外围结果枝出现枝条叶片萎蔫，继而整枝失水枯死，但结果母枝正常。在一个园中，整园或整株发病较少，往往是局部园或一株上局部枝出现枝枯 （图9-25）。图9-25 猕猴桃发生枝枯病后新梢萎垂状一般发生在猕猴桃新梢迅速抽生期，即4—5月春夏交替期。此期北方地区在春旱情况下，往往是干热风盛行期，给猕猴桃这种阔叶果树带来一定影响。一般在春季持续性干旱时易诱发此病。发生的两个条件：一是春旱，二是强风。在春旱情况下，若出现6级以上强风，持续5小时以上，猕猴桃树即可发病。4年以上未遮阴封行的幼龄果树发病较重，因为该树龄的树生长势较强，对水分要求较迫切，而根系分布较浅，吸收功能有限，抗旱性相对较差，一旦强风天气出现，发病严重。（1） 早摘心。主要针对外围结果枝控制顶端优势，加速枝条木质化，减少迎风面，提高抗风性。（2） 规范绑枝。冬剪后结果母枝必须枝枝绑缚，且排列有序，杜绝交叉、重叠、拥挤，以防结果枝抽生后空间局限，密集生长，遇风移位，增大摩擦，造成伤口，抗风能力下降。（3） 注意灌水。尤其在春旱风害严重情况下，提倡灌水，以减缓强风形成的地面蒸发及叶面蒸腾对树体水分生理平衡的破坏。猕猴桃根腐病为毁灭性真菌病害，能造成根颈部和根系腐烂，严重时整株死亡。初期在根颈部出现暗褐色水溃状病斑，逐渐扩大后产生白色绢丝状菌丝。病部皮层和木质部逐渐腐烂，有酒糟气味，菌丝大量发生后经8～9天形成菌核，似油菜籽大小，淡黄色。下面的根系逐渐变黑腐烂，地上部叶片变黄脱落，树体萎蔫死亡 （图9-26）。病菌在根部病组织皮层内越冬或随病残体在土壤中越冬，病菌在土壤病组织中可存活1年以上，病根和土壤中的病菌是翌年的主要侵染源。翌年4 月开始发病，高温高湿季节发病，由病残体传播，经接触传染。水过多，果园积水，施肥距主根较近或施肥量大，翻地时造成大的根系损伤，栽植过深，土壤板结，挂果量大，土壤养分不足，栽植时苗木带菌，这些情况都容易引发根腐病。图9-26 猕猴桃根腐病（1） 农业防治。实行高垄栽培，合理排水、灌水，保证果园无积水；及时中耕除草，破除土壤板结，增加土壤通气性，促进根系生长；增施有机肥，提高土壤腐殖质含量，促进根系生长；科学施肥，合理耕作，避免肥害和大的根系损伤；控制负载量，增强树势。（2） 植物检疫。把好苗木检疫关。（3） 化学防治。在早春和夏末进行扒土晾根，刮治病部或截除病根，然后使用青枯立克300倍液+海藻生根剂——根基宝300倍液进行灌根，小树1株灌7.5～10千克，大树1株灌15～25千克。猕猴桃白纹羽病分布范围广，为害树种很多，是主要根系病害之一。其症状是多从细根开始发病，然后扩展到侧根和主根。病根皮层腐烂，病部表面缠绕有白色或灰白色丝网状物，即根状菌索。后期霉烂根皮层变硬如鞘。有时在病根木质部生有黑色圆形菌核。根际地面有菌丝膜，其上有时有小黑点即病菌的子囊壳。当病部根皮全部腐烂后，在坏死的木质部上形成大量的白色或灰白色放射状菌索。受害植株生长势逐渐衰弱，直至最后死亡 （图9-27、 图9-28）。图9-27 猕猴桃白纹羽病图9-28 受白纹羽病为害的猕猴桃树病菌以菌丝体、根状菌索和菌核随病根在土壤中越冬。温湿度适宜时，菌核或菌索长出新的菌丝，首先侵害新根的幼嫩组织，使幼根腐烂，然后逐渐蔓延到大根。病菌接触传染。（1） 农业防治。加强果园肥水管理，增强树势，提高树体抗病性。（2） 化学防治。栽植前，红心猕猴桃苗木用10%硫酸铜溶液，或20%石灰水，或70%甲基硫菌灵可湿性粉剂500倍液浸泡1小时进行消毒。先为害根的外部，受害根皮层呈褐色腐烂状，病部不断扩展，最后整个根颈部环割腐烂，有酒糟味，从而导致整株死亡。树体发病后使萌芽期推迟、叶片枯萎、叶面积小、枝条干枯，为害严重时因影响水分和养分的运输而使植株死亡 （图9-29、图9-30）。图9-29 猕猴桃疫霉病形成的菌落图9-30 猕猴桃疫霉病的果实在排水不良的果园以及多雨季节，病菌通过猕猴桃根颈伤口侵染皮层而引起根腐。春天或夏天，根部在土壤中被侵染。（1） 农业防治。选择排水良好的土壤建园。防止植株创伤。（2） 化学防治。当植株感病时，在 3 月或 5 月中下旬用2500毫克/升的代森锌或100～200 毫克/升的瑞毒霉或1 ∶ 2 ∶200的波尔多液灌根部；挖出病部，刮除病部腐烂组织，并用0.1%升汞溶液消毒，后涂上波尔多液或石硫合剂原液，两个星期后再更换新土覆盖。在植株受害嫩根上产生细小肿胀或小瘤，数次感染则变成大瘤。瘤初期白色，后变为浅褐色，再变为深褐色，最后变成黑褐色。受根结线虫为害的植株根系发育不良，大量嫩根枯死，细根呈丛状，根发枝少，且生长短小，对幼树影响较大 （图9-31、 图9-32）。图9-31 猕猴桃根结线虫病（1） 线虫繁殖生长条件。土壤相对湿度40%～70%、土壤温度0～30℃、土壤pH值为4～8。（2） 其他有利条件。雨季有利于线虫孵化和侵染；地势高燥、土壤质地疏松、盐分低等利于线虫病发生。图9-32 猕猴桃根结线虫为害状（3） 自身传播。自身一年能移动1米的距离，远距离的传播主要依靠灌水、病土、带病的种子、苗木和其他营养材料及农事操作活动等传播。（1） 农业防治。猕猴桃定植地及苗圃地不要利用原来种过葡萄、棉花、番茄及其他果树的苗圃地，最好采用水旱轮作地作苗圃地和定植地，此法对防治根结线虫病效果很好。此外要重视植株的整形修剪，合理密植，改善园内通风透光条件；多施农家肥，改良土壤，提高土壤的通透性。（2） 化学防治。患病轻的种苗可先剪去发病的根，然后将根部浸泡在1%的异丙三唑硫磷、克线丹等农药中1小时。对可疑有根结线虫的园地，定植前每亩用10%克线丹3～5千克进行沟施，然后翻入土中。猕猴桃园中发现轻病株可在病树冠下5～10厘米的土层撒施10%克线丹 （每亩撒入3～5千克），施药后要浇水。苗圃地发现病株，可用1.8%阿维菌素乳油，每亩用680克对水200升，浇施于耕作层 （深15～20厘米），效果好，且无残毒遗留，对人畜安全。用3%米尔乐颗粒剂撒施、沟施或穴施，每亩用6～7千克，药效期长达2～3个月。该病主要发生在幼苗期，往往在幼苗出现2～3片真叶、根颈基部尚未木质化之前发病。苗茎部先出现浸渍状病斑 （图9-33）。图9-33 猕猴桃立枯病病苗多从上土表侵入幼苗的茎基部，发病时，先变成褐色，后成暗褐色，受害严重时，韧皮部被破坏，根部成黑褐色腐烂。此时，病株叶片发黄，植株萎蔫，枯死，但不倒伏。此病菌也可侵染幼株近地面的潮湿叶片，引起叶枯，边缘产生不规则、水渍状、黄褐色至黑褐色大斑，很快波及全叶和叶柄，造成死腐，病部有时可见褐色菌丝体和附着的小菌核。病菌在残留的病株上或土壤中越冬或长期生存。带菌土壤是主要侵染来源，病株残体、肥料也有传病可能，还可通过流水、农具、人畜等传播。菌丝呈蛛网状，围绕寄生的组织。土温在13～26℃都能发病，以20～24℃为适宜。对土壤pH值适应范围广，pH值2.6～6.9都能发病。天气潮湿适于病害的大发生，反之，天气干燥病害则不发展。多年连作地发病常较重。（1） 农业防治。严格控制苗床及扦插床的浇灌水量，注意及时排水；注意通风；晴天要遮阳，以防土温过高，灼伤苗木，造成伤口，使病菌易于侵染。（2） 化学防治。对被污染的苗床，如继续用于扦插育苗，或用于扦插的其他土壤，在扦插前，可用甲醛进行土壤消毒，每平方米用甲醛50毫升，加水8～12千克浇灌于土壤中，浇灌后隔1周以上方可用于播种栽苗，或用70%五氯硝基苯粉剂与65%代森锌可湿性粉剂等量混合，处理土壤，每平方米用混合粉剂8～10克，撒施土中，并与土拌和均匀。果实上有明显的日晒伤痕 （图9-34、 图9-35）。猕猴桃日灼病大多发生在高温季节，气候干燥、持续强烈日照容易发生，尤其是在果实生长后期的7—9月，叶幕层薄，叶片稀疏、果实裸露的发生严重。挂果幼园比老果园发生严重。弱树、病树、超负荷挂果的树日灼残果率可达15%～25%。土壤水分供应不足、修剪过重、果实遮阳面少、保水不良的地块，易发生严重日灼。图9-34 猕猴桃日灼病发病初期症状图9-35 不同程度日灼受害状（1） 夏季修剪在最顶果多留2～3 片叶，可以遮挡直射太阳光。（2） 有条件的早晚隔几天喷一次水，也可配成果友氨基酸400倍液，既可降低果园温度，又可快速供给营养。（3） 果园覆盖，可用麦糠或麦草覆盖，如眉县张江成果园直接覆盖行间，减少土壤水分蒸发。（4） 套袋果打开通气孔，通气孔小时可略剪大，利用通气，降低袋内温度，一般可降低1～2℃。

柑橘是世界第一大果树。全世界柑橘年产量有1亿多吨，种植面积高达667万hm2。中国是柑橘最重要的原产中心之一，有着悠久的种植历史。在所有的水果中，其鲜食、加工性能均好，基本上可以做到没有废料。柑橘性喜微酸、湿润环境，最适宜的生长温度为29℃,最适合生长的湿度75%左右；平均生长寿命50年左右。柑橘树形比较矮小，树冠直立或呈自然圆头形或半圆头形。成枝力中等，枝条的顶端优势不强，分枝间势力均衡，常无明显主干，树形比较优美。柑橘的花芽为混合芽，可在生长健壮的各类梢的先端依次形成。如新梢多次生长，则花芽发生的部位随之上移。结果枝有带叶果枝和无叶果枝两种。柑橘的花为雌雄同花，多单生或丛生，为完全花，能自花授粉结实。抗性强、易栽、易管、丰产、品质优良和耐储运等是现代柑橘优良品种的主要特征。砂糖橘、本地早、温州蜜柑、梭柑、蕉柑、南丰蜜橘等。新会橙、柳橙、雪柑、伏令夏橙、血橙、香水橙、脐橙、冰糖橙等。沙田柚、琯溪蜜柚、文旦柚、葡萄柚类等。金弹、四季橘等。选择土壤肥沃、质地疏松、土层深厚、保水排水性好，心土松软的红壤、沙壤土建园。坡向以南向、东南或马蹄形山窝建园为好，西向北向要注意营造防护林。坡度选择5°～15°建园为佳。橘园附近必须有水源。现代柑橘建园技术推广宽行密株和宽行稀株两种模式。在方便管理的同时能大幅度提高柑橘品质，增加柑橘生产效益。宽行密株行距5～6m,株距2～3m,每667m2植38～67株。山地宜密，平地宜稀。一般柑橘苗春、秋两季都可定植，以春季定植为佳，一般在3月上旬橘芽萌发前定植为宜。容器苗全年均可定植，其最佳定植时间是春梢发生结束后。挖大穴，施足基肥。通常要求挖深0.8m，宽1m的定植穴，把心土和表土分开放，每穴施入腐熟有机肥30～50kg，石灰1.5～2.0kg,腐熟菜饼1kg,钙镁磷1.5～2kg，与表土充分混匀填入穴内，肥土要踏紧。定植时苗木置入定植穴后，再用小刀划开并取出营养袋，扶正苗木，填土踏实即可。(1)深翻。每年要进行一次深翻，对柑橘园20～40cm土层进行翻动，近树颈处浅些，树冠外深些，结合增施有机肥，以改良和活化土壤。萌芽期、花期尽量不要深翻。(2)培土覆盖。夏秋高温干旱，在树冠下每株培土高5～10cm防旱，冬季采果后，进行培土高30cm防寒。(3)中耕松土。成年橘园春节杂草容易滋生，雨后土壤板结，结合除草疏松表土，夏季中耕切断毛细管，减少水分蒸发。(1)早施基肥。早熟品种在10月中、下旬，中熟品种宜在11月中旬或采果后，每株施腐熟有机肥20～30kg,磷肥3～5kg，石灰1～1.5kg，复合肥1～2kg,施肥量占全年35%～40%,结果多，大树多施，小树少施。(2)巧施追肥。①春芽肥。一般在2月下旬至3月上旬春梢萌动期进行。以施用高比例的氮、磷复合肥为宜，配合施用腐熟的有机肥。株施尿素0.5～1.0kg，人粪尿20～30kg,复合肥2kg。施肥量占全年施肥的20%。②稳果肥。施肥量占全年10%，5月上中旬一般株施复合肥1kg,开花结果多的多施，结果少的不宜施。③壮果促梢肥。7月下旬至8月上旬株施腐熟饼肥1.5～2kg,人粪尿20～30kg,硫酸钾1～2kg，施肥量占全年的25%～30%。(3)施肥方法。①条状沟施肥。山地果园通常采用条状沟施肥方式，即在树冠滴水线处，开深20～30cm,宽30cm的条沟，沟长根据树冠而定。下次施肥在树冠的另外两侧开沟，施肥后盖土。②放射沟施肥。在树冠距树干1～1.5m处，按树冠大小，向外开放射状沟4～6条，沟深20cm，沟宽30cm，靠近树干处开浅些，逐步向外沿开深些，施肥后盖土。这方法适用于较窄的梯台。在谢花2/3时喷20mg/kg赤霉素或5406细胞分裂素800倍液+0.2%硼砂和0.2%磷酸二氢钾一次；5月上旬和6月中下旬各喷一次30mg/kg水溶性防落素或800倍液5406细胞分裂素+0.2%磷酸二氢钾和0.3%尿素，提高坐果率。供贮藏用的橘果采收时间一般应在九成熟，果面有2/3转黄时采收。短期贮藏或直接上市果实宜在果实全面着色，果实可溶性固形物和含量达到该品种应有的标准时采收。以晴天采收为佳。采收前15d内，应停止灌水、喷药。应该准备好采收工具，橘剪、橘梯、橘篓和橘筐。橘剪必须圆头平口，刀口锋利。特别需要提醒的是，采收人员采收果实时，不宜留指甲，应戴手套，以免采收时在果面上留下伤害。采收柑橘时，应遵照自下而上、由外及内顺序采摘。采果应将不同成熟度的果实分批采收，分批储藏和加工，保证果实品质的一致性。严格采用“一果两剪”法，即第一剪在离果蒂1～2cm处，第二剪把果柄剪至与果肩相平。千万不要从果树上一下把果肩剪平，把果蒂留在植株上，以免消耗更多的养分。采收时尽量不拉枝拉果，注意轻拿轻放。

RNA介导的病毒抗性主要是基于转录后基因沉默（Post-transcriptional gene silencing，PTGS）作用，在真菌、植物和动物中有PTGS相关的基因存在，这些基因沉默现象可统称为RNA干扰现象（RNA interference，RNAi）。许多证据表明，RNA沉默是由双链RNA（dsRNA）所引发的，且需要细胞内的多种酶参与。基于dsRNA在RNA沉默中的诱导作用，构建能转录后形成dsRNA的载体，转化植物后可有效诱发基因沉默。苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）是苹果、梨和多种核果类果树上发生普遍的一种病毒，可降低树势和影响果实品质。本研究根据GeneBank上已登陆的ACLSV序列设计合成了一对引物，根据载体pDS1301的限制性内切酶图谱，在引物的两端分别引入了两个不同的限制性内切酶识别位点。以总RNA或dsRNA为模板，通过RT-PCR扩增获得来源于砂梨的2个ACLSV分离物的大小为358bp的片段，该片段位于ACLSV cp基因高度变异区。将扩增片段克隆到载体pMD18-T，筛选阳性克隆后提取质粒，经Kpn I/Bgl II和Spe I/Sac I分别对目标片段及载体pDS1301酶切后，在T4连接酶作用下，将克隆片段以正向和反向方式分别插入植物表达载体pDS1301一内含子两端的多克隆位点，构建了可转录后形成dsRNA的载体pDR358-SMJ和pDR358-HH。将重组质粒转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞后，采用叶盘共培养的方法转化5～6叶期的健康西方烟叶片，经潮霉素抗性筛选获得转基因西方烟植株。从获得的转基因西方烟植株提取总DNA，根据载体pDS1301多克隆位点两侧的序列合成特异引物，采用 PCR方法对这些植株进行了鉴定，已得到了转R358-SMJ的西方烟49株、转R358-HH的西方烟12株（图1）。图1 部分转基因西方烟的PCR鉴定