苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus，ASPV）是侵染苹果和梨树的主要病毒之一，可导致苹果和梨的生长势下降，并影响其果实产量和品质。本研究在生物学、血清学和分子生物学鉴定的基础上，筛选出侵染砂梨的APSV毒源材料。参照已报道的ASPV全基因组核苷酸序列设计合成引物，以来源于砂梨（6-1-13）ASPV的 dsRNA为模板，RT-PCR扩增获得大小为1328bp特异性扩增条带，并对扩增产物进行纯化、克隆和序列测定。序列分析结果表明，其核苷酸序列与国外在GenBank上登录的14个ASPV分离株的同源率为82%～88%。将克隆获得的目的基因与pET28c连接得到原核表达载体pET28c-ASPV cp，并在大肠杆菌BL21（DE3）中成功诱导该基因表达，表达蛋白大小约44kDa。将表达正义链和反义链的该病毒分离物cp基因cDNA分别与植物表达载体pCAMBIA1301连接，转化大肠杆菌DH10B的感受态细胞，经过PCR和双酶切鉴定和筛选阳性克隆，成功构建了ASPV cp基因的正义链和反义链植物表达载体pCAMBIA1301-ASPV cp+和pCAMBIA1301-ASPV cp-。将重组质粒转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞后，采用叶盘共培养的方法转化5～6叶期的健康西方烟叶片，经潮霉素抗性筛选和PCR鉴定，获得88株西方烟转化植株，其中ASPV cp基因正义链的西方烟植株68株，表达cp基因反义链的西方烟植株20株。

2006年10月以来，浙江温州市乐清、瑞安、苍南、瓯海、龙湾等地的大棚番茄上相继发生了一种以前从未见过的病毒病。为此，我们立即分别从不同地点采集了较典型的罹病植株样本送浙江大学生物技术研究所鉴定，经该所用超薄切片电镜观察、ELISA和分子水平检测后确认是台湾番茄曲叶病毒（也称烟草曲叶病毒）（TLCV）所致。该病毒病在浙江省系首次发现，经检索国内也鲜有报道。台湾番茄曲叶病毒病是一种毁灭性的蔬菜新病害，是世界许多地区番茄生产上的重要限制因素，该病为害猖獗、蔬菜生产部门及有关方面须高度警惕。据调查，温州地区秋季定植的大棚番茄株发病率一般为3%～30%；严重田块株发病率高达95%以上，当地农民基本放弃管理或拉秧改种。初步统计温州各县（市、区）台湾番茄曲叶病毒病的发生面积约为333.3hm2，其中株发病率在50%的田块约为53.3 hm2以上，给各地番茄生产造成了严重损失。染病番茄植株矮化，生长缓慢或停滞，顶部叶片大多褪绿发黄、叶变小，边缘上卷，叶片增厚、变硬，叶脉呈紫色。生长发育早期染病的植株严重矮缩，不能正常开花结果；中后期染病的植株仅上部叶片和新芽表现症状，结果减少、果实变小，成熟期果实着色不均匀（红不透），商品价值低；生长发育后期，随着气温上升染病植株症状减轻。该病病原为Tomato leaf curl Tanwan virus，属双生病毒组的一种病毒，据资料报道该病毒只能由烟粉虱（Bemisia tabaci）传毒，土壤、种子和土壤均不传毒。近年来烟粉虱在温州地区的发生为害呈暴发态势，现已证实外来入侵生物B型烟粉虱的入侵蔓延并成为优势种是温州地区烟粉虱暴发的主要起因，估计台湾番茄曲叶病毒由B型烟粉虱带入的可能性较大。2006年秋冬，温州地区总体上呈高温干爽天气，对该病虫媒烟粉虱的发生、繁衍十分有利，虫量发生大、加上带毒种群及其携带病毒的多年积累和扩增，为台湾番茄曲叶病毒病的流行提供了病原数量基础，这可能是该病暴发的主要原因。此外，目前温州生产上推广的大多数番茄品种如红梅王、FA-189、516、托马雷斯、合作903等对该病毒病的抗性较差也是不可忽视的重要原因。据报道，该病极有可能在首次暴发后数年内迅速发展并导致大暴发，故须立即采取措施进行应急防控，以便将该病发生为害控制在最小限度内。抓紧引进、筛选抗耐病的优良品种，同时加强培育适合温州市栽培的抗病品种。对重发田实施与非茄科作物轮作，最好是水旱轮作。①育苗床与生产大棚要分开；②清洁消毒苗床；③使用30～40目防虫网隔离育苗，防止烟粉虱入侵；④苗床挂“黏虫色胶板”诱杀烟粉虱；⑤移栽时带药下田。①加强肥水管理，增强植株抗病能力；②地膜覆盖，去除边际杂草；③及时去除植株下部烟粉虱虫、卵枝叶；④收获后及时清洁棚室和周围环境。消灭虫媒，及时防治烟粉虱。可选用99.9%绿颖农用矿物油200～300倍稀释液、20%啶虫脒（兰宁）可溶性液剂3000倍稀释液、25%扑虱灵可湿性粉剂1000～1500倍稀释液、25%阿克泰水分散粒剂2000～3000倍稀释液、2.5%天王星乳油2000～3000倍稀释液、1.8%阿维菌素1500倍稀释液、1%甲胺基阿维菌素2000倍稀释液等进行防治。应在烟粉虱发生初期防治，并交替使用农药。

芽孢杆菌属（Bacillus spp.）是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤、植物体表面及水体中，其在工业、农业、医学、军事和科学研究中有广泛的应用价值。在《Bergey氏鉴定细菌学手册》第8、第9版中，蜡样芽孢杆菌的分类地位为芽孢杆菌属的第I群，该群有22个种。根据营养型菌细胞的宽度分为两类，蜡样芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌属“大细孢菌种”。蜡样芽胞杆菌是一种杆状、产内生芽孢的革兰氏阳性细菌，由于蜡样芽孢杆菌自然界分布甚广，常存在于土壤、灰尘、腐草和空气中，极易在食品加工、运输、贮存、销售过程中，通过苍蝇、蟑螂等昆虫和不卫生的用具和手污染，通常被认为是一种条件致病菌，在临床上可导致脓肿、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎等报道，但最常见的是导致两种不同类型的食物中毒：腹泻型和呕吐型。关于B.c.引起非肠道感染及食物中毒的例子很多，从1898年起，就有B.c.造成泌尿系统感染及肠胃炎的记载，有些感染的病例甚至很严重，以致造成死亡。在微生物发展的早期，好氧芽孢杆菌就被怀疑可造成食物中毒，Lubenau1906年描述了发生在一家医院的严重的食物中毒事件，300名医务人员及病人用餐后出现急性肠胃炎，对剩余的食物进行检测，发现含有大量的好氧芽孢杆菌，该污染菌为B.c.。Seitz 1913 年从一例患肠炎与腹泻的病人分离出B.c.。Brekenfeld 分别于1926年及1959年报道了两起B.c.造成的食物中毒事件。1936～1942年，瑞典卫生部对367例食物中毒事件综合分析，证实117例是由B.c.引起，并且认识到被B.c.污染的食物，储藏温度不当时，可能会造成食物中毒，在1973年Bulyba等人报道了污染蜡样芽孢杆菌的乳制品引起食物中毒。由于Smith、Gorden 及其同事在芽孢杆菌分类学上的进展，Hauge 经过对4起食物中毒事件的调查，于1995年首次确认B.c.是一种引起食物中毒的致病菌。目前大部分国家对各类食品中的蜡样芽孢杆菌数量有所限定，多数情况下，引起食物中毒的食品中蜡样芽孢杆菌的数量在105～108 CFU/g，常因食用肉类、海鲜、乳品和蔬菜等食物引起，潜伏期一般为6～15h，一般持续24h；而致呕吐的毒素是该菌在食物中预先产生的，该毒素非常稳定，进入人体后在胃中与其受体5-HT3 结合，导致呕吐。呕吐型食物中毒的潜伏期一般为0.5～6h，一般限于富含淀粉质的食品，特别是炒饭和米饭。主要症状为恶心、呕吐，有时有腹泻、头晕、发烧和四肢无力等症状，引起这两种食物中毒的食品通常都是经过热加工处理的，但蜡样芽孢杆菌具有耐热的芽孢，能在食品加工及烹饪后残留下来，热处理诱发芽孢的萌发，在没有其他微生物与之竞争的条件下，大量生长繁殖，产生毒素并引起食品的腐败。蜡样芽孢杆菌产生的呕吐毒素（cereulide，1.2kD）是一种小的十二边形的热稳定性环状毒素，分子式为（D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val）3。其结构、性质和毒理与缬氨霉素很相似，是特异性的钾离子载体，能将K 转入线粒体内，破坏线粒体的氧化还原能力。该毒素非常稳定，目前的各种食品加工方法，包括灭菌，均无法使其失活（能耐受126℃ 90min），而且还耐强酸（pH 2.0）、耐蛋白酶水解。N.Agata等对多种食品中呕吐毒素的产量进行了检测，发现对B.cereus NC7401来说，在煮熟后的米饭中其产毒量很高，在富含淀粉质的食物中的产毒量也足以引起食物中毒；而在肉类、蛋品和密封的液体食品如牛奶和豆奶中虽可以检测到该毒素，但其含量较低。还发现在与醋、蛋黄酱及酱类一起煮的食物中，该菌株的生长和产毒都受到抑制，推测这可能是醋导致pH 降低的缘故。在12～15℃时该毒素的产量却明显高于30℃时的产量，而且该毒素的产生与芽孢的产生没有相关性。还有报道称该毒素只有在有氧条件下才能产生，所以缺氧条件如：充氮包装和真空包装能有效地防止该毒素的产生和积累。因为该毒素的分子量很小，无抗原性，这使其检测比较难，到目前为止尚缺乏一种快速可靠的检测方法。最常用是采用HEp-2 细胞进行细胞培养分析。近年来用分子生物学手段检测产毒菌株的报道也较多，如P F Horwood 等人根据NRPS基因的两个可变区的序列，针对产呕吐毒素的菌株设计了特异性的引物，进行PCR 以检测蜡样芽孢杆菌是否产毒，取得了良好的效果，该法灵敏度高，而且检测速度快。在呕吐食物中毒事件中分离的蜡样芽孢杆菌均产生呕吐毒素，而且有着共同的独特表型特征，对其基因进行分析发现它们同源性很高。B.c.所造成的腹泻型食物中毒的致病因子是肠毒素，目前至少已经发现4 种不同的肠毒素，包括2 个三联体肠毒素：溶血素BL和非溶血素Nhe；2个单一亚基肠毒素：细胞毒素K（cytK）、肠毒素T（bceT）。2.2.1 溶血素BL（HBL）Beecher1991年从B.c.菌株中分离提纯了一种具有活性的三亚基肠毒素，命名为溶血素BL（hemolysinBL），能够引起家兔肠段的液体积累，可以改变豚鼠皮肤血管的通透性，具有对vero细胞的溶细胞毒性。其由一个结合亚基B（37.5kD）、两个溶血亚基L1（38.2kD）及L2（43.5kD）组成，编码3个亚基的基因hblA、hblD、hblC经克隆、测序与分析，表明其在同一个mRNA中受一个操众子调控转录如图1。这些组分的物理化学性质非常相似，等电点（pI）为5.34，5.33和5.33。其中hblA编码结合亚基B，hblD、hblC分别编码溶血亚基L1及L2，hblB编码B’蛋白，hblC和hblD仅隔37bp个碱基，B、L1、L2蛋白分别有31、30、32个氨基酸的信号肽，hblD和hblA之间最少有100bp碱基，hblA和 hblB有381 bp的碱基隔开，B’蛋白与B蛋白开始的158个氨基酸非常相似，但其功能尚未清楚。Douglas J.Beecher等人利用等电聚焦电泳技术和快速蛋白液相层析技术证明单独成分的溶血素亚基并不会在血平板上产生溶血环，只有当3个亚基结合后，才会产生溶血环。图1 芽孢杆菌溶血素BL操纵子图谱2.2.2 非溶血素肠毒素（Nhe）非溶血素肠毒素（Nhe）由45、39和105kD的蛋白组成，其蛋白成分已被分离出来。1999年Granum等给出了nhe操纵子的序列，该操纵子有3个开放式阅读框，相应的3个基因分别是：nheA、nheB和nheC。前两个基因的产物分别为45kD和39kD 蛋白，而nheC 的产物尚未纯化出来，其功能未知。Nhe与Vero细胞相互作用的研究表明105kD蛋白是复合物的结合部位，而其他两个组分是无法单独结合到细胞上去。该105kD 蛋白是一种金属蛋白，具有分解明胶和胶原的活力。与hbl 基因不同，编码该毒素的基因位于质粒上。图2 芽孢杆菌非溶血素Nhe操纵子图谱溶血素BL（HBL）与非溶血素肠毒素（Nhe）同时受到PlcR的调控。2.2.3 肠毒素T（entertoxin T）肠毒素T为单一亚基的蛋白质，由 bceT基因编码，日本学者Agata对其基因克隆、测序和分析表明其由336个氨基酸组成。并认为其有细胞毒性，可导致家兔肠段的液体积累，可以改变豚鼠皮肤血管的通透性，具有对vero细胞的溶细胞毒性。其产物属于肠毒素蛋白。该毒素同溶血素BL无同源性，而且认为肠毒素T 不会导致食物中毒。2.2.4 细胞毒素K 早期在法国报道过食物中毒，其氨基酸序列显示它属于β-桶孔形成毒素，能在磷脂双分子层中形成直径至少为7A°的孔，该孔具有微弱的离子选择性，已证实它对人类肠道Caco-2上皮细胞具有毒性。PlcR是条件性人类病原菌B.cereus和共生病原菌B.thuringiensis细胞外毒性因子的一个多效调节子，它在细胞进入稳定期时诱导生长。受到PlcR调节的基因有：plcA编码一个专一性磷脂酰肌醇磷脂酶C（PI-PLC），Plc编码一个改良的磷脂酰胆碱磷脂酶 C（PC-PLC），nhe编码一个无溶血性的肠毒素，hbl编码一个溶血性的肠毒素 BL（HBL）；以及推定为S-层类似表面蛋白的基因，以及一个推定为细胞外RNA酶。通过分析37.1kb的hbl，plcA和plcR周围的DNA序列，推定存在28个ORF。3条新基因推定受到PlcR 的调节并编码一个中性蛋白酶，subtilase家族丝氨酸蛋白酶（Sfp）以及一个推定的细胞壁水解酶（Cwh）得到确认。相应的sfp和cwh 基因定位于plcA的上游调节区域，能同时受到位于逆转录基因之间的PlcR结合位点的调控。Sylvie Salamitou等构建plcR基因缺失的突变菌株，该基因编码一个多效细胞外因子的调节子。幼虫期同时取食亲本菌株产生的106孢子亚致死浓度的Cry1C毒性导致70%死亡率，如果使用plcR突变体的孢子，则只有7%的死亡率。小鼠鼻腔灌入108的孢子，亲本菌株导致了100%的死亡率，而灌入相同数量的突变体孢子，死亡率大大降低，甚至没有死亡。应用营养体细胞代替孢子也可以达到相同的效果。导致死亡的原因未知，不可能是由于小鼠内细菌的实际增长所导致。由于受B.thuringiensis 过量突变体感染的小鼠产生的病变，说明溶血素参与其中，发生了作用。B.thuringiensis和B.cereus具细胞溶解毒性的特性。这种细胞溶解毒性的水平在plcR基因缺失的菌株中剧烈下降。表明 B.thuringiensis407菌株和B.cereusATCC14579的致病性受到PlcR的调控。由于蜡样芽孢杆菌及其芽孢广泛存在于周围的环境中，它极易污染食物而引起食物中毒，因此需要发展一种快速的检测方法来实现对致病性蜡样芽孢杆菌的检测，目前对该类蜡样芽孢杆菌的检测主要采用生化检测方法是一项费时费力的方法，需要长时间的选择性培养过程。现在有两种试剂盒可供选择，但由于价格昂贵且不太灵敏，有些致病菌不能够检测。王利国等人对实验室14株芽孢杆菌溶血素BL的检测结果表明，8株蜡样芽孢杆菌全部检测到溶血素BL的基因且产生溶血环，而其他的蜡样芽孢杆菌只检测到hblA基因以外的基因且不产生溶血环，表明只要检测到hblA基因，证明其为致病性菌株，所以通过设计hblA基因特异引物用PCR或通过血平板培养的方法是既经济又快速的检测方法。对其他毒素的检测目前主要是通过设计特异性引物来检测。所以对蜡样芽孢杆菌毒素的检测还需要进一步对其研究，确定最佳的检测方法。

主要步骤如下。（1） 将 800 μl 提取缓冲液 CTAB buffer （内含 2%CTAB、100 mmol/L Tris-HCl pH值8.0、20 mmol/L EDTA、1.4 mol/L NaCl、2%PVP30、1%的β-巯基乙醇） 加入2 ml的离心管内65℃预热。（2） 从-70℃超低温冰箱中取0.2 g ‘富士’ 和 ‘金冠’ 及其杂交群体单株的嫩叶，放入研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状，并迅速转移到装有预热的提取缓冲液的离心管内，并上下颠倒混匀。（3） 65℃水浴中保温3 min，数次颠倒使内含物充分混匀。（4） 将离心管取出，加800 μl氯仿∶异戊醇 （体积比为24∶1）。颠倒充分混合，温和震荡2～3 min。（5） 在高速离心机上离心10 min （14000 r/min），将上清液转移到1.5 ml离心管中。（6） 加入6 μl RNase （10 mg/ml） 充分混匀，在37℃恒温箱内温育1 h，再用氯仿∶异戊醇抽提1次。（7） 加500 μl 事先在-20℃冰箱内预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后，于4℃冰箱中沉淀 DNA 10～25 min。（8） 在高速离心机上 14000 r/min 离心 3 min，然后弃掉上清，得到沉于离心管底部的DNA。（9） 用500 μl 75%乙醇洗 DNA沉淀两次。倒掉乙醇，注意不要将DNA倒出。（10） 在超净工作台上干燥 DNA 2 h。（11） 将吹干的DNA溶于100 μl超纯水中。1.缓冲液的的制备取适量50×TBE缓冲液配制成1×TBE稀释缓冲液，待用。2.胶液的制备称取1 g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入 100 ml 1×TBE 稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，制成1%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。3.胶板的制备待凝胶温度稍低后加入5 μl EB （溴化乙锭），混匀，然后倒入模具中 （注意不要有气泡），加上合适的梳子形成加样孔，梳子的位置应该在托盘底面上0.5～1.0 mm。4.待胶完全凝固后拔出梳子注意不要损伤梳底部的凝胶，将模具放入电泳槽内并加入1×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。5.加样取10 μl DNA稀释液，用微量移液枪小心加入样品槽中。每加完一个样品要更换 tip 头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。6.电泳加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。DNA 应该向阳极泳动，用120 V电压电泳15～30 min，停止电泳。1.6%非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法（1） 胶板的制备。先用水将平板和耳朵板冲洗干净，将其平放在桌面上，用餐巾纸将其擦干之后，用 95%酒精擦洗 2 次，待其干后，将0.5%的 Banding silane 溶液均匀的倒在平板上，用餐巾纸迅速将其涂匀，待其晾干，然后将洗干净的梳子和压条整齐的摆在平板之上，将2%的 Repel silane溶液均匀的涂在耳朵板上 （此项操作应在通风橱中进行），待其晾干后，将其整齐摆放在平板之上，用夹子将其夹好。（2） 凝胶的制备。取50%的PA胶50 ml，加入60 μl的TEMED，120 μl 10%的过硫酸铵 （APS），温和混匀。（3） 灌胶。将混合好的胶沿着玻璃板的灌胶口缓缓灌入，注意使灌入的胶基本上沿着一条直线灌入，如不整齐，可用手轻轻拍打胶板，使胶保持同一直线灌入，避免气泡的产生。胶灌入到底部之后，迅速将梳子平面插入到两玻璃板之间，插好梳子之后，用夹子夹好，让其聚合1h后用于电泳。（4） 电泳。加入电极缓冲液lxTBE，50 W恒功率，预电泳10 min后，清除气泡，插入梳齿，将扩增好的 PCR 产物，加入6 μl的溴酚蓝，混匀95℃变性5 min，之后用微量加样器取6 μl，进行电泳1 h左右 （根据分子量的大小调整电泳时间）。2.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染方法 （体积100 ml）（1） 固定。在磁盘中加入 10%的乙醇和 500 μl 冰乙酸，摇匀后加入凝胶，再平行摇动3～5 min。（2） 染色。在固定液中加入 1 ml 20%AgNO3 储备液后，平行摇动 5～8 min。（3） 漂洗。倒掉定影液，加入蒸馏水漂洗 2～3 次，洗净后，倒掉蒸馏水。（4） 显色。在磁盘中加入 100 ml 3%NaOH 溶液和 500 μl 甲醛，迅速振荡，使显影液均匀作用，然后平行摇动，直至显影。（5） 洗涤。清楚显影后，倒掉显影液，用自来水清洗凝胶 1～2次，彻底去掉显影液，以免保存时变色。1.胶回收（1） 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。（2） 在紫外灯下切出含有目的片段 DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的片段 DNA 部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高 DNA 回收率。胶块超过 300 mg时，使用多个 Column 进行回收，否则严重影响回收率。注：切胶时注意不要将 DNA 长时间暴露于紫外灯下，以防 DNA损伤。（3） 切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤 6 的胶块溶解时间，提高 DNA 回收率。（4） 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以 1 mg=1μl 进行计算。（5） 向胶块中加入胶块溶解液 Buffer GM，Buffer GM 的加量如下表。凝胶浓度BufferGM使用量1.0%3个凝胶体积量1.0%～1.5%4个凝胶体积量1.5%～2.0%5个凝胶体积量（6） 将不溶解液与胶块充分混合后，15～25℃溶解胶块 （胶浓度较大或比较难溶时可以在 37℃加热）。间断振荡混合，使胶块充分溶解 （5～10 min）。注：胶块一定要充分溶解，否则将会严重影响 DNA 的回收率。高浓度凝胶可以适当延长溶胶时间。（7） 当凝胶完全溶解后，观察溶胶液的颜色，如果溶胶液颜色由黄色变为橙色或粉色，向上述胶块溶解液中加入 3M 醋酸钠溶液（pH值5.2） 10 μl，均匀混合至溶液恢复黄色。当分离小于 400 bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为 20%的异丙醇。（8） 将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。（9）将上述操作步骤7的溶液转移至Spin Column中，12000r/min离心1min，弃滤液。注：如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高 DNA 的回收率。（10）将700μl的Buffer WB加入Spin Column中，室温12000r/min离心30s，弃滤液。注：确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100%乙醇。（11） 重复操作步骤 10。（12） 将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12000 r/min离心1 min。（13） 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Col-umn膜的中央处加入 30 μl 灭菌蒸馏水或 Elution Buffer，室温静置1 min。注：将灭菌蒸馏水或 Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。（14） 室温12000 r/min离心1 min洗脱DNA。2.大肠杆菌感受态的制备（1） 取大肠杆菌DH5α 在 LB 培养基上划线，37℃培养箱内过夜培养，长出单菌落。（2） 挑取单菌落，接种于4 ml不含抗生素的LB培养基上，37℃振荡 （轻摇） 培养过夜。（3） 过夜培养的菌液与 LB 培养基按 1∶50 的比例转入三角瓶，37℃振荡培养 （约3 h），至OD600=0.4～0.6。（4） 4℃，5000 r/min离心5 min，轻轻倒掉上清，用5 ml （1/5体积） 预冷的0.1 mol/L Mgcl2悬浮细胞 （0.95 g/100 ml）。（5） 4℃，5000 r/min 离心 5 min，轻轻倒掉上清，用 12.5 ml （1/2体积） 预冷的 0.1 mol/L CaCl2悬浮细胞，冰浴放置 20 min（1.1 g/100 ml）。（6） 4℃，5000 r/min离心5 min，轻轻倒掉上清，用2.5 ml预冷的 0.1 mol/L CaCl2 （含 10%的甘油） 悬浮细胞，分装，每管120 μl。（7） 液氮速冻，-80℃保存。3.目的基因连接载体pMD-19T simple 1 μl，目的 DNA 4 μl，solution Ⅰ 5 μl，混匀后于16℃金属浴中反应30 min。4.目的基因转化（1） 1.5 ml离心管中加入10 μl的连接产物和50 μl大肠杆菌感受态细胞。（2） 冰上放置30 min。（3） 42℃金属浴加热45 s 后，冰中放置1 min。（4） 加入 500 μl LB 液体培养基，37℃，200 r/min 振荡培养45 min。（5） 取100 μl菌液涂板 （LB+Amp+），37℃过夜培养。（6） 过夜培养之后，挑取单克隆菌落，加到 LB 液体培养基（Amp+100 mg/L） 中37℃，200 r/min振荡培养6～8 h。（7） 菌液PCR检测正确后，送测序。序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置1CH03g12GCGCTGAAAAAGGTCAGTTTCAAGGATGCGCATGTATTTGChr12CH05g08CCAAGACCAAGGCAACATTTCCCTTCACCTCATTCTCACCChr13Hi02c07AGAGCTACGGGGATCCAAATGTTTAAGCATCCCGATTGAAAGGChr14Hi07d08TGACATGCTTTTAGAGGTGGACGTTTGAGGGGTGTCCGTACAAGChr15Hi12c02GCAATGGCGTTCTAGGATTCGTTTCACCAACAGCTGGGACAAGChr16C10455AAGGCAATACAAGACGGACGTTCACACCGAAAGCCTCTCTChr17Hi21g05GACGAGCTCAAGAAGCGAACGTTTGCTCTTGCCATTTTCTTTCGChr18C13810CGTCCTAGATAGATGCCCCACAGGACTCTAAGGACTGCCGChr1附表1 实验所用已发表SSR引物列表序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置9C13280CTCCTCCTCCCTCAGTACCCCCTTCACTCACCTTTCTCGCChr110C16757AATGGGACCCAACTGGTACATCGACCATACAAATTGCTGCChr111C6948CTTGGAGCTGTGAGAGTCCCCAAACCTCTCATCGCAACCTChr112KA4bAAAGGTCTCTCTCACTGTCTCCTCAGCCCAACTCAAAGCCChr113CH02a04GAAACAGGCGCCATTATTTGAAAGGAGACGTTGCAAGTGGChr214CH02b10CAAGGAAATCATCAAAGATTCAAGCAAGTGGCTTCGGATAGTTGChr215CH02c02aCTTCAAGTTCAGCATCAAGACAATAGGGCACACTTGCTGGTCChr216CH02c06TGACGAAATCCACTACTAATGCAGATTGCGCGCTTTTTAACATChr217CH02f06CCCTCTTCAGACCTGCATATGACTGTTTCCAAGCGATCAGGChr218CH03d01CGCACCACAAATCCAACTCAGAGTCAGAAGCACAGCCTCChr219CH03d10CTCCCTTACCAAAAACACCAAAGTGATTAAGAGAGTGATCGGGGChr220CH05e03CGAATATTTTCACTCTGACTGGGCAAGTTGTTGTACTGCTCCGACChr221Hi02a07TTGAAGCTAGCATTTGCCTGTTAGATTGCCCAAAGACTGGGChr222Hi05g12TCTCTAGCATCCATTGCTTCTGGTTTGTGTGTTCTCTCATCGGATTCChr223Hi07d12GGAATGAGGGAGAAGGAAGTGGTTTCCTCTTCACGTGGGATGTACCChr224Hi08f05GTGTGGGCGATTCTAACTGCGTTTCCTTTATTCTAAACATGCCACGTCChr225Hi08g12AGTTCGGTCGGTTCCGTAATGTTTAGGGCAAGGGGAAAGAAGTChr226Hi22d06CCCCGAGCTCTACCTCAAACATTATGTTTCCGGTTTTTGGChr227Hi24f04CCGACGGCTCAAAGACAACTGAAAAGTGAAGGGAATGGAAGChr228AJ251116GATCAGAAAATTGCTAGGAAAAGGAGAGAACGGTGAGCTCCTGAChr229AT000400CTCCCTTTGCTCCCTCTCTTAGGATGTCAGGGTTGTACGGChr230CN444636CACCACTTGAGTAATCGTAAGAGCGTTTGCCAGTTAAGGACCACAAGGChr231CN493139CACGACCTCCAAACCTATGCGTTTATGAAAGTACGGCACCCATCChr232CN581493GCTTTTCATGGTGGAAAAACTGGTTTGACTCTCCGCTCTGATGGACChr233NH033bGTCTGAAACAAAAAGCATCGCAACTGCCTCGTCTTCCTCCTTATCTCCChr234CH03e03GCACATTCTGCCTTATCTTGGAAAACCCACAAATAGCGCCChr335CH03g07AATAAGCATTCAAAGCAATCCGTTTTTCCAAATCGAGTTTCGTTChr336MS14h03CGCTCACCTCGTAGACGTATGCAATGGCTAAGCATAChr3附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-1序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置37Hi03d06TCATGGATCATTTCGGCTAAGTTTGCCAATTTTATCCAGGTTGCChr338Hi03e03ACGGGTGAGACTCCTTGTTGGTTTAACAGCGGGAGATCAAGAACChr339Hi04c10TGCGCATTTGATAGAGAGAGAAGTTTAACAAAGAACGACCCACCTGChr340Hi05f12TTTGGGTTTGGGTAGGTTAGGGTTTGTGCAGCGCATGCTAATGChr341Hi07e08TTCGTGCTAGGGAGTTGTAGCGTTTGCCTCCATAGGATTATTTGACChr342Hi15b02TATGGTGGCAACAGTGGAGAGTTTCGCCACCTCCACTTAACATCChr343Hi15h12GAACAAGAAGGACGCGAATCGTTTGGGCCTCGTTATCACTACCAChr344AU223657TTCTCCGTCCCCTTCAACTACACCTTGAGGCCTCTGTAGCChr345HGA8bAACAAGCAAAGGCAGAACAACATAGAGAAAGCAAAGCAAAChr346GD12CTAACGAAGCCGCCATTTCTTTTTGAGGTGTTTCTCCCATTGGAChr347IPPN15AACCATGGCATTGGATTGATGAAGCACTCAATGGGGAAAAChr348NZmsCN943818TGAACAGCTCATCGTCGGTACGGGAAGAGGAAATGTGATTChr349C9312TCCACCAGTGACAAGAGCTGAGGATTCAATCAGCTACGCCChr350C6359CGGAAATGGTCACTGGAACTTGGGACGGACACACACACChr351CH01b12CGCATGCTGACATGTTGAATCGGTGAGCCCTCTTATGTGAChr452CH01d03CCACTTGGCAATGACTCCTCACCTTACCGCCAATGTGAAGChr453CH02c02bTGCATGCATGGAAACGACTGGAAAAAGTCACACTGCTCCChr454CH02h11aCGTGGCATGCCTATCATTTGCTGTTTGAACCGCTTCCTTCChr455CH04e02GGCGATGACTACCAGGAAAAATGTAGCCAAGCCAGCGTATChr456CH05d02AAACTCCCTCACCTCACATCACAATAGTCCAATGGTGTGGATGGChr457Hi01e10TGGGCTTGTTTAGTGTGTCAGGTTTGGCTAGTGATGGTGGAGGTGChr458Hi07b02ATTTGGGGTTTCAACAATGGGTTTCGGACATCAAACAAATGTGCChr459Hi08e04GCATGGTGGCCTTTCTAAGGTTTACCCTCTGACTCAACCCAACChr460Hi08h03GCAATGGCGTTCTAGGATTCGGTGGTGAACCCTTAATTGGChr461Hi23d11bGACAGCCAGAAGAACCCAACGTTTATTGGTCCATTTCCCAGGAGChr462Hi23g02TTTTCCAGGATATACTACCCTTCCGTTTCTTCGAGGTCAGGGTTTGChr463Hi23g08AGCCGTTTCCCTCCGTTTGTTTGTGGATGAGAAGCACAGTCAChr464AT000420TTGGACCAATTATCTCTGCTATTGATGTGGTCAGGGAGAGGAGChr4附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-2序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置65MSS6CGAAACTCAAAAACGAAATCAAACGGGAGAGAAACTCAAGACCChr466C12595ATGAAAACCCACAAAACCCAAAACCATACACAACGCCACAChr467C13146CTGGGAAAAATGGGGAAAATGCTTTCCCTTTCCTTCTTCAAChr468C15TTGCGAGAAAGCTAAAAACCACAGACTCTGCAACCCCTCTCChr469CH01d07AGTCGAAATCCCGAACAATCAAAATCCAGTTTTCCACCTCChr470NZ01a6TTAGACGACGCTACTTGTCCTAGGATTGCTGGAAAAGGAGGChr471GD162AAAATGTAACAACCCGTCCAAGTGGAGGCAAGTGACAAAGAAAGATGChr472NH011bTTTGCCGTTGGACCGAGCGGTTCACATAGAGAGAGAGAGChr473CH02a08GAGGAGCTGAAGCAGCAGAGATGCCAACAAAAGCATAGCCChr574CH02b12GGCAGGCTTTACGATTATGCCCCACTAAAAGTTCACAGGCChr575CH03a04GACGCATAACTTCTCTTCCACCTCAAGGTGTGCTAGACAAGGAGChr576CH03a09GCCAGGTGTGACTCCTTCTCCTGCAGCTGCTGAAACTGGChr577CH04e03TTGAAGATGTTTGGCTGTGCTGCATGTCTGTCTCCTCCATChr578CH04g09TTGTCGCACAAGCCAGTTTAGAAGACTCATGGGTGCCATTChr579CH05e06ACACGCACAGAGACAGAGACATGTTGAATAGCATCCCAAATGGTChr580CH05f06TTAGATCCGGTCACTCTCCACTTGGAGGAAGACGAAGAAGAAAGChr581Hi01c04GCTGCCGTTGACGTTAGAGGTTTGTAGAAGTGGCGTTTGAGGChr582Hi02a03GACATGTGGTAGAACTCATCGGTTTAGTGCGATTCATTTCCAAGGChr583Hi04a08TTGAAGGAGTTTCCGGTTTGGTTTCACTCTGTGCTGGATTATGCChr584Hi04d02TTCGTGGCTGAGAAAGGAGTGTTTGTACGGTGCATTGTGAAAGChr585Hi08a04TTGTCCTTCTGTGGTTGCAGGTTTGAAGGTAAGGGCATTGTGGChr586Hi08h08TGAACAAATTCCACCACGAAGTTTGCCAAGGCTACAATTTTCAChr587Hi09b04GCGATGACCAATCTCTGAAACTGGGCTTGAATTGGTGAATCChr588Hi11a03GGAATTGGAGCTTGATGCAGGTTTCATACGGAATGGCAAATCGChr589Hi15e04AAACCTCTGCATTCCGTCTCCTCATACTCCTCCCACATTGTCChr590Hi21c08TTCTTCTCCTCCACCACCTCGTTTGTCACTGAGAAGGCGGTAGCChr591Hi22a07CTCTTCCTTCTCCGCCTCTTGTTTCACTCAGAATGCCTCACAGCChr592Hi22f12GGCCTCACCCAGTCTACATTGTTTGGTGTGATGGGGTACTTTGCChr5附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-3序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置93AU223670GGACTCAATGCCTTTTCTGGAGGATGGCAGCAATCTTGAAChr594CN445599TCAAATGGGTTCGATCTTCACGTTTGCCTGGCTGTAACTGTTTGGChr595CN496002TCAGAATCTCAAGCAAGATCCTCGTTTGATTGATCGTGGCGATATGChr596CH03d07CAAATCAATGCAAAACTGTCAGGCTTCTGGCCATGATTTTAChr697CH03d12GCCCAGAAGCAATAAGTAAACCATTGCTCCATGCATAAAGGGChr698CH05a05TGTATCAGTGGTTTGCATGAACGCAACTCCCAACTCTTCTTTCTChr699Hi03a03ACACTTCCGGATTTCTGCTCGTTTGTTGCTGTTGGATTATGCCChr6100CH01b11AACCTAACCAAACACGTACGGTTCGGCTGTACTCTTTGAGChr6101Hi04d10AAATTCCCACTCCTCCCTGTGTTTGAGACGGATTGGGGTAGChr6102Hi05d10AATGGGTGGTTTGGGCTTAGTTTCTTTGGCTATTAGGCCTGCChr6103Hi07b06AGCTGCAGGTAGAGTTCCAAGGTTTCATTACCATTACACGTACAGCChr6104Hi08g03ATTCACTTCCACCGCCATAGGTTTGGAATGATTGCGAGTGAAGCChr6105CN445290TCTCAGTTGCTCTGGCTTTGGTTTGCAATCAATGCCACTCTTCChr6106U78949TTTGTCTACCTCTGATCTTAACCAACAGCATCGCAGAGAACTGAGChr6107CH04e05AGGCTAACAGAAATGTGGTTTGATGGCTCCTATTGCCATCATChr7108Hi01d05GGTATCCTCTTCATCGCCTGTTAGATTGACGTTCCGACCCChr7109Hi03a10GGACCTGCTTCCCCTTATTCGTTTCAGGGAACTTGTTTGATGGChr7110Hi12f04ATTGTCCCCACAAAATTGGATGTTCGATGTGACTTCAATGCChr7111CN444794CATGGCAGGTGCTAAACTTGAAACTGAAGCCATGAGGGCChr7112CH02b11CACAACGCAGTTCGATCACTACCTTACCTGGTAGAGAGAGAChr7113EMPc111CCGATCAGAAAGAGCTGTGAGTCAAACCTTCCAACCTCAACAATChr7114Hi05b09GTTTCTAACGTGCGCCTAACGTGAAACCCAACCCAAAGAGTGGChr7115MS06c09AATATAAGAGCCAGAGGCACTATTGGAGTAAGTCGAChr7116Z38126AAGAGGGTGTTCCCAGATCCAATTCCAATTTCAGAACAGGChr7117CH01c06TTCCCCATCATCGATCTCTCAGGAGGGATTGTTTGTGCACChr8118CH01f09ATGTACATCAAAGTGTGGATTGCAAACAAACCAGTACCGCAAChr8119CH01h10TGCAAAGATAGGTAGATATATGCCATTTTGACCCCATAAAACCCACChr8120CH02g09TCAGACAGAAGAGGAACTGTATTTGGTTTGAGTTTGATCTCCAACATTACChr8附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-4序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置121CH05a02GTTGCAAGAGTTGCATGTTAGCGTTTGAGCAGAGGTTGCTGTTGCChr8122Hi01c11TTGGGCCACTTCACAACAGGGTGCGCTGTCTTCCATAAAChr8123Hi04b12CCCAAACTCCCAACAAAGCGTTTAGTTGCTAATGGCGTGTCGChr8124Hi04e05AAGGGTGTTTGCGGAGTTAGGTTTGTCTACAACTGTCTGATGGTAGCChr8125Hi20b03AAACTGCAATCCACAACTGCGTTTAAAGGGGCCCACAAAGTGChr8126Hi22g06GAAAGGACCGAATTTCATGCGGACATGGATGAAGAATTGGAChr8127Hi23g12CCCTTCCCTACCAAATGGACCTCCCCGGCTCCTATTCTACChr8128Z71980TCTTTCTCTGAAGCTCTCATCTTTCATCTTTTGGTGCTCCCACACChr8129CH01f03bGAGAAGCAAATGCAAAACCCGGGATGCATTGCTAAATAGGATChr9130CH01h02AGAGCTTCGAGCTTCGTTTGTGATTGCCACATGTCAGTGTTChr9131CH05c07TGATGCATTAGGGCTTGTACTTGTTTACCAATTAGGACTTAAAGCTGChr9132CH05d08TCATGGATGGGAAAAAGAGGGTTTCATGTCAAATCCGATCATCACChr9133Hi01d01CTGAAATGGAAGGCTTGGAGATTTATGGTGATGGTGTGAACGTGChr9134Hi04a05GGCAGCAGGGATGTATTCTGGTTTCAAGAACCGTGCGAAATGChr9135Hi05e07CCCAAGTCCCTATCCCTCTCGCTTAATAGAAACATCGCTGAChr9136Hi23d06TTGAAACCCGTACATTCAACTCGTTTGCAGTGGATTGATGTTCCChr9137AJ320188AACGATGCTTGAGGAAGAACACCTCCCGTCTCCCACCATATTAGChr9138CN444542ATAAGCCAGGCCACCAAATCCGTTTTTGGAGCGTAGGAACChr9139NH029aGAAGAAAACCAGAGCAGGGCAGCAAAAACCACAGGCATAACChr9140CH02a10ATGCCAATGCATGAGACAAAACACGCAGCTGAAACACTTGChr10141CH02b03bATAAGGATACAAAAACCCTACACAGGACATGTTTGGTTGAAAACTTGChr10142CH02b07CCAGACAAGTCATCACAACACTCATGTCGATGTCGCTCTGTTGChr10143CH02c11TGAAGGCAATCACTCTGTGCTTCCGAGAATCCTCTTCGACChr10144CH03d11ACCCCACAGAAACCTTCTCCCAACTGCAAGAATCGCAGAGChr10145COLAGGAGAAAGGCGTTTACCTGGACTCATTCTTCGTCGTCACTGChr10146MS01a03AGCAGTATAGGTCTTCAGTGCGTAGATAACACTCGATChr10147MS02a01CTCCTACATTGACATTGCATTAGACATTTGATGAGACTGChr10148MS06g03CGGAGGGTGTGCTGCCGAAGGCCCAGCCCATATCTGCTChr10附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-5序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置149Hi01a03CGAATGAAATGTCTAAACAGGCAAGCTACAGGCTTGTTGATAACGChr10150Hi01b01GCTACAGGCTTGTTGATAACGCACGAATGAAATGTCTAAACAGGCChr10151Hi02d04TGCTGAGTTGGCTAGAAGAGCGTTTAAGTTCGCCAACATCGTCTCChr10152Hi03c04CGTAAATAGCGAATCCGATACCGTTTCAACATCTGTGGGTCATTGCChr10153Hi03f06ACGATTTGGTGATCCGATTCGTTTCGTCGCATTGTGCTTCACChr10154Hi04f08CGTGAAAACTCTAACTCTCCGTTTGAAAAGCGCATCAAAGTTCCChr10155Hi05b02GATGCGGTTTGACTTGCTTCGTTTCTCCAGCTCCCATAGATTGCChr10156Hi08g06AATCGAACCAGCACAGGAAGGTTTAGATGGAGGTCGTGGTTACGChr10157Hi08h12GAAGGAAATCATCATCAAGACGGTTTCAAGACCATGGAACAACTTGGChr10158Hi21f08GAGAAAACGCAGAAGCATTGAGTAATGATTTCATCGCGAGTCChr10159Hi22f04TCAATCCTCTGCTCTTCAAGGGTTTAATCACCTGCTGCTGCTTGChr10160AF057134ACTACCCAATGCCCACAAAGTATCCTCGCCCAAAAGACTGChr10161AU223548ACCACCACTGCAGAGACTCAGACGCACCCATTCATCTTTTChr10162CH02d08TCCAAAATGGCGTACCTCTCGCAGACACTCACTCACTATCTCTCChr11163CH02d12AACCAGATTTGCTTGCCATCGCTGGTGGTAAACGTGGTGChr11164CH03d02AAACTTTCACTTTCACCCACGACTACATTTTTAGATTTGTGCGTCChr11165CH04a12CAGCCTGCAACTGCACTTATATCCATGGTCCCATAAACCAChr11166CH04d07TGTCCTCCAATCTTAACCCGCACACAGACGACACATTCACCChr11167CH04d10GAGGGATCTGTAGCTCCGACTGGTGAGTATCTGCTCGCTGChr11168CH04g07CCCTAACCTCAATCCCCAATATGAGGCAGGTGAAGAAGGAChr11169CH04h02GGAAGCTGCATGATGAGACCCTCAAGGATTTCATGCCCACChr11170Hi01d06GGAGAGTTCCTGGGTTCCACAAGTGCACCCACACCCTTACChr11171Hi02a09ATCTCTAAGGGCAGGCAGACCTGACTCTTTGGGAAGGGCChr11172Hi02c06AGCAAGCGGTTGGAGAGAGTTTGCAACAGGTGGACTTGCTCTChr11173Hi04g11CAGAGGATTATCAATTGGACGCAAACTATCTCCAGTTATCCTGCTTCChr11174Hi06b06GGTGGGATTGTGGTTACTGGGTTTCATCGTCGGCAAGAACTAGAGChr11175Hi07d11CCTTAGGGCCTTTGTGGTAAGGTTTGAGCCGATTAGGGTTTAGGGChr11176Hi07g10TATTGGGTTTTGGGTTTGGAGTTTCAACCCTTTTGGTTGTGAGGChr11附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-6序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置177Hi09a01GAAGCAACCACCAGAAGAGCGTTTCCCATTCGCTGGTACTTGAGChr11178Hi16d02AACCCAACTGCCTCCTTTTCGTTTCGACATGATCTGCCTTGChr11179Hi23d02CCGGCATATCAAAGTCTTCCGTTTGATGGTCTGAGGCAATGGAGChr11180CN491050CGCTGATGCGATAATCAATGGTTTCACCCACAGAATCACCAGAChr11181CH01d09GCCATCTGAACAGAATGTGCCCCTTCATTCACATTTCCAGChr12182CH01f02ACCACATTAGAGCAGTTGAGGCTGGTTTGTTTTCCTCCAGCChr12183CH01g12CCCACCAATCAAAAATCACCTGAAGTATGGTGGTGCGTTCChr12184CH03c02TCACTATTTACGGGATCAAGCAGTGCAGAGTCTTTGACAAGGCChr12185CH04d02CGTACGCTGCTTCTTTTGCTCTATCCACCACCCGTCAACTChr12186CH04g04AGTGGCTGATGAGGATGAGGGCTAGTTGCACCAAGTTCACAChr12187CH05d04ACTTGTGAGCCGTGAGAGGTTCCGAAGGTATGCTTCGATTChr12188CH05d11CACAACCTGATATCCGGGACGAGAAGGTCGTACATTCCTCAAChr12189CH05g07CCCAAGCAATATAGTGAATCTCAATTCATCTCCTGCTGCAAATAACChr12190MS14b04CCTTAAGAATCATGTGATACTAATGGCACAAAGATTGTChr12191Hi02b07TGTGAGCCTCTCCTATTGGGTGGCAGTCATCTAACCTCCCChr12192Hi02d05GAGGGAGAATCGGTGCATAGCATCCCTCAGACCCTCATTGChr12193Hi03b03TGAATTGAGTTTGAGAATGGAATGGTTTGTCAGGACGGGTAATCAAGGChr12194Hi07f01GGAGGGCTTTAGTTGGGAACGTTTGAGCTCCACTTCCAACTCCChr12195CN496913TGCCTTTGAGAATCGAAATGTGTTTGTCAATTTCTTGGAACTCChr12196CH03a08TTGGTTTGCTAGGAAAAGAAGGAAGTTTATCGGGCCTACACGChr13197CH03h03AAGAAATCGGATCCAAAACAACTCCCTCAAAGATTGCTCCTGChr13198CH05c04CCTTCGTTATCTTCCTTGCATTGAGCTTAAGAATAAGAGAAGGGGChr13199CH05f04GATGATGGTGCTCTCGGTTATTTTATGTTGGGTAATGTCTTCCGChr13200Hi03e04CTTCACACCGTTTGGACCTCGTTTCATATCCCACCACCACAGAAGChr13201Hi04a02TTCGTGGAAACCTAATTGCAGGTTTCCTCTGCTTCTTCATCTTTGCChr13202Hi04f09ACTGGGTGGCTTGATTTGAGGTTTCAACTCACACCCTCTACATGCChr13203Hi04g05CTGAAACAGGAAACCAATGCGTTTCGTAGAAGCATCGTTGCAGChr13204Hi08e06GCAATGGCGTTCTAGGATTCGTTTGGCTGCTTGGAGATGTGChr13附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-7序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置205Hi08f06CTTAGAGCATAGATGACCTGCAAGTTTAGAAATCCAACGGCCAAAGChr13206AU223486TGACTCCATGGTTTCAGACGAGCAATTCCTCCTCCTCCTCChr13207GD147TCCCGCCATTTCTCTGCGTTTAAACCGCTGCTGCTGAACChr13208NH009bCCGAGCACTACCATTGACGTCTGTTTACCGCTTCTChr13209CH01e01GGTTGGAGGGACCAATCATTCCCACTCTCTGTGCCAGATCChr14210CH01g05CATCAGTCTCTTGCACTGGAAAGACAGAGTAAGCTAGGGCTAGGGChr14211CH03a02TTGTGGACGTTCTGTGTTGGCAAGTTCAACAGCTCAAGATGAChr14212CH03d08CATCAGTCTCTTGCACTGGAAATAGGGCTAGGGAGAGATGATGAChr14213CH03g04ATGTCCAATGTAGACACGCAACTTGAAGATGGCCTAACCTTGTTChr14214CH04c07GGCCTTCCATGTCTCAGAAGCCTCATGCCCTCCACTAACAChr14215CH04f06GGCTCAGAGTACTTGCAGAGGATCCTTAAGCGCTCTCCACAChr14216CH05d03TACCTGAAAGAGGAAGCCCTTCATTCCTTCTCACATCCACTChr14217CH05e05TCCTAGCGATAGCTTGTGAGAGGAAACCACCAAACCGTTACAATChr14218CH05g11GCAAACCAACCTCTGGTGATAAACTGTTCCAACGACGCTAChr14219MS01a05GGAAGGAACATGCAGACTTGATGTTTCATCTTTACAChr14220Hi01c09AAAGGCGAGGGATAAGAAGCGTTTGCACATTTGAGCTGTCAAGCChr14221Hi02d11GCAATGTTGTGGGTGACAAGGTTTGCAGAATCAAAACCAAGCAAGChr14222Hi08c05TCATATAGCCGACCCCACTTAGGTTTCACACTCCAAGATTGCATACGChr14223Hi21e04TGGAAACCTGTTGTGGGATTTGCAGAGCGGATGTAAGTTGChr14224Hi23b12TGAGCGCAATGACGTTTTAGGTTTCAGGCTTTCCCTTCAGTGTCChr14225AJ000761aCTGGGTGGATGCTTTGACTTTCAATGACATTAATTCAACTTACAAAAChr14226AJ000761bCCCTAAACACACAGCCTCCTGTTTCAGCATCGCAGAGAACTGAGChr14227U78948GATCGTCCGCCACCTTAATAGGGTTTTCATCATGCACATTChr14228CH01d08CTCCGCCGCTATAACACTTCTACTCTGGAGGGTATGTCAAAGChr15229CH02c09TTATGTACCAACTTTGCTAACCTCAGAAGCAGCAGAGGAGGATGChr15230CH02d11AGCGTCCAGAGCAACAGCAACAAAAGCAGATCCGTTGCChr15231CH03b06GCATCCTTGAATGAGGTTCACTCCAATCACCAAATCAATGTCACChr15232CH03b10CCCTCCAAAATATCTCCTCCTCCGTTGTCCTGCTCATCATACTCChr15附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-8序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置233CH04g10CAAAGATGTGGTGTGAAGAGGAGGAGGCAAAAAGAGTGAACCTChr15234Hi01c06TTAGCCCGTATTTGGACCAGGTTTCACCTACACACACGCATGGChr15235Hi02d02TTCCTAGGCTACCCGAAATATGGTTTCTGGCATGGACATTCAACCChr15236Hi02f06TAAATACGAGTGCCTCGGTGGCAGTTGAAGCTGGGATTGChr15237Hi02g06AGATAGGTTTCACCGTCTCAGCGACCTCTTTGGTGCGTCTGChr15238Hi03a06TGGTGAGAGAAGGTGACAGGGTTTAAGGCCGGGATTATTAGTCGChr15239Hi03g06TGCCAATACTCCCTCATTTACCGTTTAAACAGAACTGCACCACATCCChr15240Hi04c05AGGATGCTCTGCCTGTCTTCGTTTCTCACTCGCCTGCTCTATCCChr15241Hi06f09AACCAAGGAACCCACATCAGGTTTCACTTACACACGCACACACGChr15242Hi09f01CACCACCAAATTCTCCATCTTCGTTTACCGCCAAATGCTTTGTTACChr15243Hi11a01ACCGCCAAATGCTTTGTTACGTTTCCTCCATTAAACTCCTCAGTGChr15244Hi15c07TCACTTCCCATCATCACTGCGTTTCAATGTCGAGGCTGGTAATGChr15245Z71981GCACTTACCTTTGTTGGGTCACCGGCATTCCAAATGTAACTChr15246CH02a03AGAAGTTTTCACGGGTGCCTGGAGACATGCAGAATGGAGChr16247CH02d10aTGATTTCCTTTTTCGCAAGGTTCATCGTTCCCTCTCAAACChr16248CH04f10GTAATGGAAATACAGTTTCACAATTAAATGCTTGGTGTGTTTTGCChr16249CH05a04GAAGCGAATTTTGCACGAATGCTTTTGTTTCATTGAATCCCCChr16250CH05c06ATTGGAACTCTCCGTATTGTGCATCAACAGTAGTGGTAGCCGGTChr16251CH05e04AAGGAGAAGACCGTGTGAAATCCATGGATAAGGCATAGTCAGGAChr16252Hi01a08AAGTCCAATCGCACTCACGCGTAGCTCTCTCCCGATACGChr16253Hi02b10TGTCTCAAGAACACAGCTATCACCGCCGTTTCTTGGAGGCAGTAGTGCAGChr16254Hi02h08AACGGCTTCTTGTCAACACCGTTTGGCTGGGAATATATGATCAGGTGChr16255Hi04e04GACCACGAAGCGCTGTTAAGGTTTCGGTAATTCCTTCCATCTTGChr16256Hi08d09ACTCATACCCATCGTATTGGTTTACTGCATCCCTTACCACCACChr16257Hi08f12GGTTTGTAACCCGTCTCTCGGTTTCGTAGCTCTCTCCCGATACGChr16258Hi12a02GCAAGTCGTAGGGTGAAGCTCGTTTAGTATGTTCCCTCGGTGACGChr16259Hi15a13TTCTCCCCTTCTAAACCAACCGGTTTCTTGGCGTAACATTGChr16260Hi15g11TGACATGCATAGGGTTACATGCGTTTGGGTTCGTAATCGTTCTTGTGChr16附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-9序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置261Hi22f06CAATGGCGTCTGTGTCACTCGTTTACGACGGGTAAGGTGATGTCChr16262AU301431TCTTCCTCCTCCTCCTCCTCTCTTTTTCTTGGGGTCTTGGChr16263NB102aTGTTATCACCTGAGCTACTGCCCTTCCTCTTTATTTGCCGTCTTChr16264CH01h01GAAAGACTTGCAGTGGGAGCGGAGTGGGTTTGAGAAGGTTAChr17265CH02g04TTTTACCTTTTTACGTACTTGAGCGGCTTGGAAAAGGTCACTTGCChr17266CH04c06GCTGCTGCTGCTTCTAGGTTGGCAAAACTCTGCAAGTCCChr17267CH05g03GCTTTGAATGGATACAGGAACCCCTGTCTCATGGCATTGTTGChr17268Hi02f12ACATGGCCGAAGACAATGACGTTTCAACCTTTATCCCTCCATCTTTCChr17269Hi03c05GAAGAGAGAGGCCATGATACGTTTAACTGAAACTTCAATCTAGGChr17270Hi05c06TGCGTGTATGGTTGGTTTTGTGTTTTCTTTGGTTTTAGTTGGTGChr17271Hi07h02CAAATTGGCAACTGGGTCTGGTTTAGGTGGAGGTGAAGGGATGChr17272AF527800TGGAAAGGGTTGATTGACCTAACAGCGGGTGGTAAATCTCChr17273AJ001681CCTGAGGTTATTGACCCAAAACACTCAGTTGGAAAACCCTACAChr17274AT000174CGGAGGCCGCTATAATTAGGCCTGGAAAGAAAGTAAAAGGACAChr17275AY187627GAGGACTGAATTGGTTGAGGTCGTTTCTCACCCGTATATAGGCCAACChr17276CH05a09TGATTTAGACGTCCACTTCACCTTGATTGGATCATGGTGACTAGGChr17277BGA35AGAGGGAGAAAGGCGATTGCTTCATCACCGTCTGCTChr17278BGT23bCACATTCAAAGATTAAGATACTCAGCCTTTTTTTCCCACChr17279KA5CAACAACAACAAAAAACAGTAAAGCCTTAGAAATAGAAACAACAChr17280KA14ATGGCAAGGGATATTATTAGTCATTGTAGCATTTTTATTTTTChr17281KA16GCCAGCGAACTCAAATCTAACGAGAACGACGAGCGChr17282KB16GATTTTGTCCGCAGGTAAAGAACAGCAAGAACCAChr17283KU10AGTATGTGACAACCCCGATGTTAGAGTCGGTTGGGAAATGATTGChr17284NB103aTTGTAGGGAAAATGATGCCAGTGTTGATACTCTCTCTCTCChr17285NB105aAAACAACCGACTGAGCAACATCAAAATCTTAGCCCAAAATCTCCChr17286NB106aGTACGTCGACATGAGAGAGTCTCTTGTTCCTTCCTGCACChr17287NB109aATGCTCTATAAAACCCACCTACCAGAGGGACCATTGTGTTATTGTATChr17288NB110aTGATGATGTGATTTGATGGAGTGCCATTCCATTGTACGGATTChr17附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-10序号引物名称正向引物序列反向引物序列染色体位置289NB111aCCAAGCTGTGATTATAGGAAGAGGCTGAAAGATTGTAAGGTChr17290NB113aATGAAATATGTCGTGTTGCCCTTAGCCCTTCCTCAGCATGTTTCCTAGACChr17291NH007bACCTTGATGGGAACTGAACAATAGTAGATTGCAATTACTCChr17292NH019bGAGATGGAGTAGTAAAGAAGAAGGACGACATAGTGAAAACAGAAGChr17293NH020aGGATCAGCCAAGAGGAGGTGCGAGATGCAGAGGACGACGChr17294NH021aATCTCAATTTTCTCGGTAACCACTGATATCTCTCTGCACTCCCTChr17295NH022aCATGAAGTGCGTAGAAGTTGGTGTCCCAATAATGATAAGTTCCCAAAGChr17296NH023aGATGCTAGAAGGAAGGAATGATGGCTTTTCAACCCCTTCACCTTCTCChr17297NH024bACCAAAAGTAGAGAGAGAGACCCAACCAGACTAAAAGAGAChr17298NH025aCTGGACACAAACATTCAAGAGGGCACACCAGAAACTCCAAAACAGGChr17299NH027aTAATGTGTTGGGGAGAGAGAGGCTCTTGTTCCTTGCTCCTAAChr17300NH030aGCAACAGATAGGAGCAAAGAGGCTCCAAAGTTCAAChr17附表1 实验所用已发表SSR引物列表（续）-111.基因MDP0000686092编码的氨基酸序列MSDDKMAHDIEXQLDNLSGLSPERCIYRVPERLRQVNEKAYTPQVV XVGPLHHGNGPLKAMEEHKLRYLKHFLSKTKVKLSDCLQKIQEQXKELR GFYAEPIXFDKGEFVRIVSVDAAFVIDLLLRFEVVNYREDEDDYIFSKPTM KSDVIRDLQLLENQLPFFILQDLFKLIPPQLQLQLPSLLEISYNFFQSXIDSE VKXEKFNKISSSGVEVKHFVDLIRILYLPLEPKXKPKTTATPKTRDXPNVT ELHQAGAKFKVGKGSSLFDIKFSCGILKIXKLRVDDTTDLKLRNLLAFEQC HHRKEEEDXLANYVFLMKRLAKTREDVQLLVEKGIIENWLGDTQKISNLL HDLGTGMIVDDWYYAPHXEKLIEYRXVLCRGWMVILKQKYFNTPWSTIS VAAAVILLILTLIQTACSYKSVPLL*2.基因MDP0000205432编码的氨基酸序列MAIEGRFNWSRTSHSFSALCKNRKAATLSRRNLRRESPPQPCKKTGI KSVGLKPTWSFSLLASCCCWTIGRAMRGLEETTCRWRRGGRKMKRKDY EELDDDFFSPSSKSRRLDAGLFATLNEDQSSAAQVFDEKPAPETSVVMQT DDLPTDPLPSGDEXALVLYNPTNTRIFKAPDSQDFSVIVNSDLIPGLREDX GSDEENKEVSNRCMAVVPWVAPNFPPASRDETQAASQSESMEVEMMDT DDNGYNGAEASGFGGTMMEGPGGIQYWQQQQLRWMEPQLFQNNITPVT3.基因MDP0000120033编码的氨基酸序列KNNWRVELSHNSRGGGGGRGGGGRGRSGGSDLKCYECGEPGHFAR ECRLRGGGGGGGGGGRRRSRTPPRYRRSPSYGRRSYSPRGRSPRRRSLT PRGNSRSRSPPYRGREELPYANGMTFHLIHAMMQWSEGSPPKQELRSAY MATWRCFRRYTGIKCCLVCLDISTTMFKLGDALSLYCLSDLVKFLPFLTLA GFIYLCKIGVGIRILKVSSASSASLVLFFCTPLAPGIFVLHYCPALGSSILNGC RSQPARASILCFCTLPGISSLPCYWDLQFXIVVDPSLLSAELLFSLNFVGSN APPSNYYSXICLIEQWVTPRMFLFYRSWRFGSDNRFSDPTPIFLPLIFNWIQ KYRNKFGSKGNLDHTETLTPCFVVG4.基因MDP0000864010编码的氨基酸序列MESEGTPYAPKSILITGAAGFIGSHVTNRLIKNYPSYKIVALDKIDYCS SFKNLRPCRSSPNFKFVKGDIACADLINHLLIADEIDTIMHFAAQTHVDNSF GNSFEFTNNNVYGTHVLLEACKVTQRVKRFIHVSTDEVYGETDMETNIGN PEASQLLPTNPYSATKAGAEMLVMAYHRSYGLPTITTRSNNVYGPHQYP EKLIPKFSLLAMKGEKLPIHGNGSNVRSYLYCDDVAEAFDVILHKGVIGH VYNIGTKKERSVLNVAEDICKMIGLNSKEAITFVQDRPFNDQRYFLDDQK LKRLGWDVRTSWEEGLKLTTEWYTKHADWWGDVSAALHPHPSFAVISR PNDDSWFFEYGFTRLSRTCNEGSNSSELKFLIYGRTGWIGGLLGKLCKGEG IXFEYGKGRLEDRKSLLEDITRVQPTHVFNAAGVTGRPNVDWCEXHKAQ TIRTNVAGTLNLADVCKDQGLLMMNFATGCIFEYDKEHPLGSGIGFKEED NPNFTGSFYSKTKAMVEELLKEYDKVCTLRVRMPISSDLSNPRNFITKIAR XDKVVNIPNSMTVLDELLPISIEMARRNCRGIWNFTNPGVISHNEILEMYR DYIDPKLKWQNFDLEEQAKVIVAPRSNNELDASKLKKEFPELLSIKDSIIK YVFEPIKKT*5.基因MDP0000945764编码的氨基酸序列MDVLVGPTFSLDVSSYGPAPTQDNRNRGGLYLNQDRGAAVAEEASS DSSSSIGVPDDSEEEEDSKGDNGDEVQSKFNGGGGGGLGSLGSFGSLEDSL PIKRGLSNYFSGKSKSFASLSEVSSTVSSVKEVEKQDNPFNKRRRVLIASK WSRRSSSSSSLYNWPNPKSMPLLALAEDGDEDDDEHDRDREGEGENASS EQSSSDEKEDQERRRXPQKLLDRRLKSFKSKSCYCLSDLQEHDEQ*引物名称正向引物序列反向引物序列SNP4970R：TGGACAAACAGGAAGCACGF：CAGCGACAGTGGCGACAASNP4236R：GCTTATCATAAAAAGCAAGACCACF：ATCATATAATTGTGTAATTTAGTAGAACASNP4257R：GGAGTCATAAGCCACAACGAGF：TCAGCTTTGAAGCATCCAATTSNP4336R：AGTTCGTTCTTTTCCGTTGCTF：GCGGTCCTGATTCAGGTACAGSNP3955R：CCCTTAAAAGCCATGGAAGAGF：GTTCTGCATAAAAACCTCGCASNP4094R：GGGTTTTGTGAGGAGGAGGAGF：CGAAGATTGCGACGGGATAGSNP3969R：CTCGTTAGGCCAAGACAAGCF：TTCAAAGAGTAGGTAGGAAGGGT附表2 SNP、InDel引物设计引物名称正向引物序列反向引物序列SNP4137R：GCACGAGTATGATGTTGCTAATGF：CCATCTTATGTCCCCAATTTGTAGSNP42992R：GGTTATACATAGAGGCACTTAGAGCF：GCACAAAACTTAGATCAAAGATGAGSNP42994R：TCAACTCATGTGCAGGAATTGGF：GCTGTGACATAAACCAGGTGAGASNP4376R：GTTTGCTGAGAAATTGATTGGAF：CCATTTCTCCTGGGGCATAGSNP4390R：AGGGCTTGGCTCACAATACTCF：TCAGGTCACAGTTGTTTTGGCSNP4432R：CGAGGAGCAAACGATAGTCAGF：ATTGGTCTCCGAATTAGAAGTCCSNP4782R：GGAGAGCGATTTATTCTACCCTACF：AGACGAAGAAAGCAACGAAAGASNP4842R：GGTCAAAATTGTCCTAGCCTATTTCF：TCCCTCATTTCCTCTTTTTACCTACSNP4878R：GAAGCAGCAGTGCAGGATGAGF：CCATAGCCCTTTGCTCTATTTGTSNP4903R：CTAGGCAAATTTAGGTAAATTTCTTAF：GACAGGTTATCAGTTTATAGCATCAAGSNP4960R：TGAGGCTATCACATTTCCAACGF：GGTTAGATGCAGCCCGATTTindel4199R：ATTGTGAAACCTTGATTGGGF：GAGATTATCCTTATTTTGTGGGindel4209R：ATGGAACGTAAGAACAAGGAF：TTGCTGAGAAGAGTACAAGTGindel4225R：AGGCGCGGTGTTGTCTAAF：CCTCAGGTGCAATAATCATCAindel4227R：AGCGTTGCTATGCTTCTAATGF：AAGATGGAAATGGTATGTGATindel4229R：AACAGAAACATTCGAGGCGTAF：TCCTTGAACTTCGTCGGTAGCindel4235R：GTGTGAAAGCTCAACTCTCCF：CAGCCTTCTCATCGGGTAGindel4246R：GGTAGCACATGCATACTGACAF：CGTTTTGGTAACTAAATCTCCindel4247R：ATGAATGTTTCGCCGAGCF：GTTCAACCATTTTATTGGATTTTindel4254R：ATAAAGTCACTTCTAGCACAAATAF：CGAAAAACGCTTTACTTAGGindel4268R：TCCACAGAAAACAACTAAAAAF：GTTTGCCAATGGGAATGindel42686R：GGCATGAATAGTTTCCACAGAF：TTTGCCAATGGGAATGTTTindel4273R：GAATGTAAGCCATGCCCTCTF：TTCCTACCATTTGTTGCCTCindel4273aR：AATGAAGAGGCAACAAATGGF：TTTTTTATCAAATCCAAATGTGindel4273bR：GTGGTTAAAGGGATTATGTCTF：TGCGAATAGGATTGAGGTindel4274R：TTGAGGGAATGAAATATGCTAF：TTGTTTATCGAATTGGGTTTindel4305R：GTAAACTCATTAAATTATGCTTGF：TGCTTTACTCCGATTCTTCindel4305aR：GTTACTTGGGCTTCCAGACAF：CCCCCAGAGAAATAGAGAGTTindel4307R：AGAAATCCGATCCTTACCACF：TGTTATCCCGTGGGTCTTindel4311R：AAACTGATAAACTTGGAGATTGF：GACGCCTACCGAACTACAindel4334R：ATACTATGAGGTGAAGGATTTAAF：GTATCTTCTACATTATCTTTCGTGindel4336R：CTCGTCGTCTATCGGTGTTF：GGGGTTTACTTGATTGGGA附表2 SNP、InDel引物设计（续）-1引物名称正向引物序列反向引物序列indel4341R：AGTCGGAAAATTCATTCATATF：GAGCTTACAGTTTTTGGTTTTindel4346R：GTTCACGGGATTAAGTCATGF：CAACGGCAAAAAATTATTATAindel4348R：GCTTATGCTCAGGGTCGTF：TTTTGATTTAAGTTATTATTTTCCAindel4349R：CAATCCATTTCAATTTTTCTGF：TTATTTTACCCCTACCCCATindel4362R：TTGAGGTTCGTTTTGGTATF：TTCAATTTTATCTCTTGGTCCindel4362aR：ACAAGTTAACAGATTTTCAAAGTF：GCTTGTAATTTGTTTTTTATGAAindel4371R：TTATTGTGTTTCTGTGCGTACF：CCAAATTATCGTTCACTGCTndel4372R：TTTGAAAACACCCTTGAATGF：TGGTTCCTGAGTGGGTAAAGindel4374R：TCAGTGACTTCGGCGTATTF：AGTTCAATCAATCTCCCAAA附表2 SNP、InDel引物设计（续）-2

多数苹果属植物野生种或栽培种的花和果都具有观赏价值，在观赏园艺花卉树木中占有重要地位。20世纪以来，国外植物学家从我国引种并进行了大量杂交选育工作，培育了一系列具观赏用途的海棠品种，统称为观赏海棠（Malus spp.）。近年来，国内学者从国外引进的观赏海棠品种几十个，它们姿态各异，色彩斑斓，大量果实点缀枝头直到深冬，丰富了景观内容。但是，这些观赏海棠不少品种的植株枝干上往往产生大量轮纹状、马鞍形的瘤状突起，严重时，病斑相连，导致树皮粗糙，严重影响树势甚至引起枝干坏死。本研究对其病原进行了初步研究，以期为进一步研究其发生发展规律和防治技术奠定基础。观赏海棠（M.spp.）植株为山东省泰安市区栽植树种。在6月份从病树上采集病斑，显微切片观察其病原形态，并对其大小进行测定。按常规方法，进行分离培养并纯化。观察其培养性状和产孢特征。在6月底，将分离纯化的病原菌分别采用烫伤接种法、针刺接种法、喷雾接种法对健康的海棠枝条进行接种，定期观察其发病情况，确定其致病性。设置不同温度条件（5℃、15℃、25℃、28℃、37℃、40℃）、不同pH值条件（pH值4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）、不同培养基条件（琼脂、蛋白胨、LB、BPY、PMA、PSA、PDA），用菌碟法分别测定不同条件下病原菌的菌丝生长状况；并在以上不同温度、不同pH值条件以及不同营养条件（0.5%、1%、2%葡萄糖，0.5%、1%、2%蔗糖）下，采用凹穴法测定病原菌孢子萌发情况。受害海棠枝干从皮孔开始发病，以皮孔为中心形成近圆形斑点，暗褐色，凹陷，边缘稍隆起；随后病斑中央突起，呈瘤状，质地坚硬，成为灰白色；病健交界处发生龟裂，病皮翘起，有点呈马鞍状，或呈轮纹状；病斑表面产生黑色的小粒点。严重时，病斑相连，病皮粗糙，导致部分枝干死亡。对病斑上黑色粒点切片镜检，发现：子座扁球形，其上分生孢子器1～3个，分生孢子器扁圆形或椭圆形，大小为（142～284）μm×（162～289）μm；内壁密生分生孢子梗，分生孢子梗棍棒状，单胞，顶端着生分生孢子；分生孢子单细胞，无色，纺锤形或长椭圆形，一端钝圆，一端截平，大小为（20.1～32.9）μm×（7.6～9.8）μm。从发病枝干上分离培养获得病原菌纯培养，菌落初灰白色，逐渐呈灰黑色，气生菌丝浓密，呈絮状隆起，后期菌落中产生灰黑色子座。对病原菌进行致病性测定，通过不同方法对海棠进行接种试验，发现烫伤接种法和针刺接种法处理的海棠发病率为100%，而喷雾接种法处理的海棠则几乎没有发病。其症状表现为，伤口先凹陷变黑，后形成褐色小突起。同时发现，在山东省泰安市，在6月底接种，该病原菌侵染的潜伏期为7～10天。经鉴定，认为该病害的病原为Botryosphaeria berengeriana，病害为观赏海棠轮纹病。25～28℃、pH值4.0～7.0、BPY和PDA培养基等条件，最适合菌丝生长，菌落生长快，且菌丝白色浓密呈絮状隆起，易产生黑色分生孢子器。28℃、pH值7.0、1%蔗糖条件最适合病原菌分生孢子萌发，12h观察孢子萌发率能达到80%左右，孢子萌发芽管较短、粗，多数两端萌发。观赏海棠轮纹病发病严重，目前对其病原鉴定方面未见报道。本研究初步确定其病原为Botryosphaeria berengeriana，并测定了其部分生物学特性。结果也显示该病原菌从形态和生物学特性上与引起苹果轮纹病的病原菌[1]和梨轮纹病[2，3]的病原菌有一定的差异。该菌的寄主范围、对苹果属、梨属植物的致病性、ITS的序列测定等工作正在开展中，这些信息对于该菌分类地位的进一步确定有重要价值。

姜（Zingiber officinale Rosc.）为姜科（Zingiberaceae）、姜属（Zingiber），多年生草本植物，是一种既能作为调味蔬菜，又能入药的重要的经济作物。山东省是我国姜的主要产区，近年来，由于多数品种长期无性繁殖及连年重茬种植，出现了一种严重影响姜产量和质量的病害，该病害主要为害姜叶部，发病初期呈现水浸状小斑点，随后变成黄色，逐渐扩大成为椭圆形、近圆形或不规则形的白色病斑，边缘则为黄褐色，病斑继而彼此融合，导致整叶干枯；在老熟病斑上可见大量黑色小颗粒。目前国内外有关文献报道认为，引起姜叶斑病的病原菌为姜叶点霉（Phyllosticta zingiberiHori）[1]，白金铠[2]在《中国真菌志》中描述过Phyllosticta zingiberi的形态特征，而Mathur[3]曾提到Phyllosticta zingiberi T.S.Ramakr.为Phoma zingiberi Khune的基原异名，但关于Phoma zingiberi的产孢细胞等形态特征及ITS序列分析未见报道。由于茎点霉属（Phoma）真菌与叶点霉属（Phyllosticta）真菌有诸多类似的地方，如分生孢子器和分生孢子的形态、颜色、大小等。因此，Phoma和Phyllostica两属间的分类及属下种的分类问题一直存在着许多争议。Saccardo[4]认为，两者的主要区别在于寄生部位的不同，即Phoma寄生于植物叶以外的部位，而Phyllosticta寄生于植物叶片上，这种主观的划分受到许多真菌学家的批评。由于产孢方式是Phyllosticta和Phoma两属共同具有的稳定特征。因此，目前已作为被多数学者所接受的分类标准。对于植物病原真菌，传统的分类方法多以真菌的形态特征为依据，而近年来分子生物学手段的应用为真菌的分类鉴定提供了更多遗传信息方面的依据。核糖体基因内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，简称ITS）在真菌种间存在丰富的差异，已广泛应用于真菌亲缘关系较近分类群的系统发育研究。目前，对于形态学上难以区分的Phoma和Phyllosticta两属真菌，尚未开展ITS序列的比对研究，其ITS序列资源也有待进一步丰富。本文发现的病害症状与已报道的由Phyllosticta zingiberi引起的姜叶斑病症状基本一致。为了正确鉴定分离到的姜叶斑病的致病菌，本文利用传统的形态学观察并结合分子手段对该病原菌的分类归属进行了研究。姜病叶采自山东省生姜主要产地莱芜市姜田。1.2.1 病菌的培养及光镜观察 将发病叶片表面消毒后置于PDA培养基上培养4～5天，从菌落边缘取直径为5mm的菌落圆片进行纯培养，在Olympus光学显微镜下观察并描述分生孢子器、分生孢子、产孢细胞形态特征，用显微测量尺测定分生孢子器及分生孢子的大小。1.2.2 透射电镜样品制备与观察 将新鲜的感病叶片切成小于0.5cm×0.5cm的材料，固定于3%戊二醛中，再用1%锇酸二次固定，乙醇梯度脱水、Epon812树脂浸透、包埋、超薄切片，经醋酸双氧铀、柠檬酸铅双重染色，JEM-1200EX透射电镜观察、拍照。将配制好的孢子悬浮液（低倍镜下每视野约30个孢子）喷洒在4～5叶期健康的姜新叶上，接种后套袋保湿48h。定期观察并记录发病情况和症状特点。取病斑上产生的子实体镜检，并从发病组织中再次分离致病菌，观察并描述病原菌形态特征。菌丝染色体DNA的提取参照何月秋[5]的方法并做适当的修改，质粒提取采用碱裂解法，大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态制备、连接、转化等参考《分子克隆实验指南》（第三版）[6]。以总DNA为模板，以通用引物ITS1：5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′和ITS2：5′-GCT GCG TTC ATC GAT GC-3′，ITS3：5′-GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC-3′和ITS4：5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′分别扩增ITSI和ITSII片段。PCR反应程序如下：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1min，50 ℃退火1min，72 ℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物连接到pMD18-T（大连宝生物工程有限公司），转化E.coli DH5α，经鉴定的重组质粒送上海英俊生物技术公司测序。该病原菌在PDA培养基上菌丝初为白色，后变为褐色，25 ℃培养20～25天后，逐渐出现分生孢子器。光镜观察分生孢子器为球形、扁球形，暗褐色，直径55～135μm，高75～130μm，器壁褐色，由3～5层细胞组成，壁厚9～13μm，内壁形成产孢细胞，上着生分生孢子；分生孢子椭圆形、卵形，无色，单胞，两端各含有一油球，5～8.5μm×2～4.5μm，其形态与报道的Phyllosticta zingiberi基本一致（Figure 1），但光镜和透射电镜观察其产孢方式为内壁芽生瓶梗式（eb-ph）（Figure 2）。Figure 1 Picnidium(Micro)(×400)Figure 2 Morphology of conidiogenous cell(Micro)(×1 000)用分生孢子悬浮液接种姜嫩叶后，发病症状和病原菌形态特征与自然发病株相同。取病健交界处组织再分离，其培养性状和形态特征与第1次分离结果一致。根据柯赫氏法则，接种菌即为姜叶斑病的致病菌。2.3.1 菌丝染色体DNA的提取与核糖体DNA ITS的PCR扩增 用改进的CTAB法提取该菌染色体DNA，琼脂糖凝胶电泳检测。采用真菌核糖体基因ITS区域通用引物ITS1和ITS2、ITS3和ITS4分别扩增了茎点霉的ITSI和ITSII，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果均为单一条带，大小分别为224bp和343bp。2.3.2 核糖体DNA ITS序列分析 将克隆到的ITSI和ITSII测序后进行拼接，确定了ITS片段的核苷酸序列（Genbank登录号为EF408240）。用DNAStar软件对所得序列进行编辑和排序比对，得出该病原菌ITS序列与叶点霉的同源性最高为58.7%，与茎点霉的同源性最高为95.6%。利用MEGA3.1软件分析核苷酸组成并计算种间遗传距离，结果显示该病原菌与茎点霉亲缘性更大。以往报道认为，引起姜叶斑病的病原为Phyllosticta zingiberi Hori，Hara记载并描述了Phyllosticta zingiberi Hori的形态特征：叶上病斑圆形、不规则形，中央灰白色，直径1～3mm；分生孢子器球形、扁球形，暗褐色，直径50～120μm，分生孢子椭圆形、卵形，单胞，无色，两端各含有一油球，5～9μm×2.5～3.5μm。后人Sawada[7]对中国台湾省姜叶上的Phyllosticta zingiberi Hori、戚佩坤等[8]对广东姜叶上的Phyllosticta zingiberi Hori以及本研究对分离菌的描述与上述基本一致，应视为同种。Ramakrishnan[9]描述的印度姜叶上的Phyllosticta zingiberi T.S.Ramakr.的形态特征为，叶上病斑卵圆形，中央灰白色，可形成穿孔，9～10μm×3～4μm；分生孢子器球形，78～150μm，分生孢子无色，椭圆形，3.7～7.4μm×1.2～2.5μm，两端各含有一油球，此形态与Phyllosticta zingiberi Hori基本一致。因此，Phyllosticta zingiberi T.S.Ramakr.应视为Phyllosticta zingiberi Hori的同物异名。Sutton[10]通过对Phoma和Phyllosticta产孢方式的研究，认为Phoma是内壁芽生瓶梗式（eb-ph），Phyllosticta是全壁芽生单生式（hb-sol），这与Dictionary of the fungi第九版[11]对两属产孢方式的描述一致，而吕国忠电镜观察结果显示，两属的产孢方式相同，均为全壁芽生环痕式（hn-ann），同样，王琪[12]对龙眼叶点霉（Phyllosticta dimocarpi）研究结果也是全壁芽生环痕式（hn-ann），周永力[13]则认为Phyllosticta为内壁芽生瓶梗式（eb-ph）。因此，有关两属的产孢方式目前尚有争论。本研究对该病原菌的光镜和电镜观察结果表明，其产孢方式为内壁芽生瓶梗式（eb-ph），符合Kendrick等对Phoma产孢细胞特征的描述，ITS序列分析结果发现，该菌与Phoma ITS序列同源性高达95.6%，远远高于与Phyllosticta ITS序列的同源性（58.7%）。本研究结果支持Mathur的观点，认为Phyllosticta zingiberi T.S.Ramakr.为Phoma zingiberi Khune的基原异名。由于Phyllosticta zingiberi T.S.Ramakr.是Phyllosticta zingiberi Hori的同物异名。因此，引起姜叶斑病的病原菌应为姜茎点霉（Phoma zingiberi Hori）。致谢：山东农业大学张天宇教授、张修国教授对本研究提供了热情帮助，并对论文修改提出了建议。

柑橘树经合理修剪后，应形成坚实的骨架，能承载较多果实，使树冠紧凑丰满，枝梢疏密得当，增强通风透光能力，形成立体结果。营养生长是生殖生长的基础，只有在树冠枝叶量达到一定体积的前提下，柑橘树才能正常开花结果和获得丰产。但如果营养生长过旺，又会抑制生殖生长，推迟结果年限。要使柑橘树保持营养生长与生殖生长的平衡，应对不同状况的植株实施必要的修剪措施。当营养生长太旺盛时，应采用必要的促花手段，促进其开花结果。当树体开花结果过多，生殖生长太旺盛时，应通过短截、回缩成花母枝，使其抽生营养枝，以增加营养枝比例，达到调节二者矛盾的目的。通过合理的整形修剪，可使树冠甚至整个柑橘园通风透光，有利于减少病虫滋生。同时，通过修剪，及时剪除枯枝、病虫枝，既有效减少了病源、虫源，又降低了病虫基数，从而减少了柑橘园农药的施用和对环境的污染，有利于柑橘无公害生产。柑橘树主要依靠新梢结果，保持合理的新梢数量才能确保稳定的产量。长期不修剪，自然抽生的枝条达到一定级数，新梢抽生能力会下降甚至停止，抽生的枝条细弱，结果能力差。柑橘不同的品种，结果母枝的类型不同，一般以春梢和早秋梢为结果母枝。通过不同时期的修剪，促发足够数量的春梢和早秋梢，是保证柑橘丰产稳产的关键技术。不同地区应采取不同的修剪方式，如对土层深厚或空气湿度较高的柑橘园，在进行整形修剪时应考虑采用高干树型；坡地、瘠薄地或栽植密度较大的果园，则宜采用矮干、小树冠的树型。进行抹芽放梢时，南亚热带地区可放4次梢，中亚热带放梢3次，北缘产区则只能放梢2次。不同植株因品种、砧木、砧穗组合、树龄、树势、产量等的不同，所采用的修剪方法应各不相同。(1)品种。对乔砧树，或生长势较强旺的种类如柚类，或长势旺盛的甜橙品种，要培育较高大的树型，投产前宜轻剪，注意疏除密弱枝，多拉枝，少短截。对枝条较披垂的品种，如温州蜜柑等，要注意及时对较长新梢摘心或短截。对分枝较小而丛生性较明显的品种，如桠柑、金柑等，要注意以抽心的方式疏散丛生枝，并拉大分枝角度。(2)树龄。幼树宜轻剪，衰老树宜重剪。结果树以疏剪、短截结合的方式促进产量增加和树冠扩大。盛果期树宜加重修剪量，以枝组回缩为主，及时对结果枝组和衰退枝组进行更新复壮，促进丰产稳产；衰老树主要是对大枝、侧枝甚至主枝进行回缩，使之减少结果，促进营养生长，使树体及时更新复壮。(3)树势。对长势强旺的植株宜轻剪少短截，多长放和拉枝，以缓和树势，促进开花结果。对中庸树要注意在及时回缩衰退枝组、结果枝组的基础上，适当短截部分当年生营养枝，维持营养生长与生殖生长的平衡。对衰弱树应在加强肥水的前提下，回缩衰弱枝组，疏剪密弱枝群，多短截当年生营养枝，以促进营养生长，恢复树势。(4)花量、果量。对翌年花量大、产量多的植株，即大年树，要注意适当重剪。在疏除密弱枝组的基础上适量短截当年生夏、秋梢结果母枝，以减少花量，防止大年过量结果。对翌年花量小、产量低的植株要注意轻剪，尽量保留当年生营养枝，以保花增产。正确应用不同的修剪方法，促、抑结合，以调节生长与开花、产量与品质、当年产量与树体持续丰产等方面的矛盾。要求植株主枝少、枝组多，既保证整个树冠有足量的枝梢，相互又不拥挤，使树冠自上而下、从外到内都能获得充足的光照，以利立体结果。对整个柑橘园而言，既要保证树冠有一定高度和大小，又要保证株间不交叉郁闭，使整个果园的有效树冠容积维持在最高水平，全面开花结果，以提高单位面积产量。短截、疏剪、回缩、摘心、抹芽、环割、拉枝是柑橘树整形修剪中常用到的几种方法，但多采用前3种。将枝梢剪去一部分，留下基部的一段称短截或短切。一般短截长度不超过枝梢长度的1/4为轻度短截，剪去枝梢总长的1/3为中度短截，在枝梢的中下部短截为重度短截。短截程度越轻，从剪口下梢段抽生的枝梢越多，但新梢的生长势越弱；短截程度越重，从剪口以下梢段抽生的枝梢越少，但新梢的生长势越强。短截可促进营养生长，降低分枝高度。疏剪是将枝梢或大枝从基部剪除。疏剪可改善树体光照条件，可使养分集中供应留下的枝叶，使之生长充实，有利于开花结果。回缩是将两年生以上的衰弱大枝从其上的一个较强壮分枝处减去先端衰退部分，再对剪口处留下的枝梢进行中度短截。回缩主要用于对植株的更新复壮或压缩树冠，防止交叉郁闭。对结果前幼树的修剪，应以促进生长为主，以尽快扩大树冠和增加树冠枝梢数量为目的。在这一阶段，植株生长大多比较旺盛，应以轻剪为主。除对各级骨干枝的延长枝进行短截促进树冠不断扩大外，其余枝梢尽量轻剪，避免过多的疏剪和重短截。注意蓄留内膛辅养枝，以增加枝梢密度，缓和生长势，为实现早结果、早丰产奠定基础。结果前幼树修剪的重点是短截处理中央干延长枝和主枝延长枝。具体做法是:选择骨干枝顶部强旺的夏、秋梢作为延长枝，进行重度短截，通过剪口芽方位的选留来调节延长枝的生长方向，并通过对延长枝短截程度的轻重来调节其生长势的强弱。延长枝附近如出现徒长枝，应及时疏除。摘心在生长季节进行。当春、夏梢转绿时，及时摘去顶端部分。此项技术是促进幼旺树增加分枝数量、降低分枝部位，使树冠紧凑饱满，形成立体结果的重要修剪措施。一般不对秋梢摘心，尤其是在幼树结果的前一年，要控制晚秋梢的抽发，使养分积累，以利花芽分化。幼树树冠枝叶一般都不会过密，外部和内膛都能得到充足的光照，因此，树冠内膛的小枝和披垂枝都是有效的营养器官，制造的光合产物除供自身发育外，还可为根系提供养分。内膛的小枝和披垂枝还是幼树最先开花结果的部位，因此，对这类枝要注意保留。如果盲目剪掉，则减少树体枝叶数量，削弱树势，延迟植株结果年限，还会导致树冠内膛空秃，叶幕层外移。从幼树试花结果到盛果期这一时期为初结果期。在这一时期，树冠仍继续扩大，新梢生长旺盛。随着树龄的增加，树势会逐渐缓和，花芽分化能力增强，开花结果部位逐渐增多。此期修剪的目的是使树冠继续扩大的同时保证产量逐年上升，尽快进入盛果期。随着树龄和产量的增加，修剪程度应逐渐加重，及时回缩结果后的枝组及落花落果枝组，使树体及时更新，维持植株健壮的生长势。对初结果期的柑橘树，仍需要短截骨干枝的延长枝，直至与相邻植株交叉时。对骨干枝延长枝的及时回缩，可以控制树冠继续扩大。结果后的枝组由于果实压迫而下垂，养分也大量消耗，大多会逐渐衰退，如不及时更新，将很快转为衰退枝组，失去结果能力。冬季修剪时可对已结果枝组进行回缩，注意选留较强的枝梢作为剪口枝。为了防止剪口枝开花消耗养分而削弱枝组的长势，因此，应对剪口枝作短截处理。以促发长势较强的营养枝，使枝组得以更新。对于落花落果枝，可在生长季节(6月上旬至7月)及时短截，促发晚夏梢或早秋梢，使其当年更新，翌年结果。已进入结果年龄而不开花或花量少的植株，一般都是由于树体生长势过旺而引起。对这类植株可在秋季进行环割、断根、拉枝等处理，在冬季修剪时尽量避免短截。春季现蕾后，对抽生的春梢营养枝及时抹除，以保证花枝的正常发育。及时处理树冠中部直立枝条和主干，通过拿大枝的方法保持内膛通透性。及时疏除树冠上部徒长枝，防止形成新的带头枝。用多次抹芽放梢的方法处理内膛新梢，培养内膛结果枝组。进入盛果期的植株，树冠仍在继续扩大，尤其是栽植较密的柑橘园，容易发生交叉郁闭。要注意对骨干枝的延长枝及时进行“去头”回缩修剪。过密果园用间伐方式保持行距，基本要求是不封行。盛果期的植株，能抽发较多的夏、秋梢营养枝，这些枝梢翌年会过量开花结果，消耗树体大量养分，使树势逐渐变弱或导致大小年结果。因此，需要对部分夏、秋梢进行短截和疏剪，使花枝和营养枝保持适宜的比例，维持树体稍强的营养生长。