近年来发生的巴林银行倒闭案、安然事件、世通公司等财务欺诈案以及我国一些企业控制失灵事件，使重视企业内部控制与风险管理成为全球化趋势。内部审计，作为公司治理结构中形成权力制衡机制并促使其有效运行的重要手段，随着现代企业审计制度的建立和完善，其职能早已超越了传统的财务收支审计，而涉及对各项工作的经济性、效率性和效果性的核查。这使得内部审计部门不仅仅是现实资产的守护者、财务报表的复核者、会计核算的勾稽者，更成为了强化管理的促进者、提高效能的推动者和价值增值的促导者。内部审计在企业中的作用与地位日益提高，这也需要审计工作的方式方法与时俱进。在近年来全球信息化浪潮的影响下，信息技术的应用已渗透到国民经济和社会经济发展的各个领域和各个层面。随着中国国内会计电算化的迅速普及，以及内部审计在企业管理层面承担的新任务，现代审计理论和审计实务面临着许多前所未有的问题和挑战。对审计环境的影响：现在，已有80%以上的基层单位基本实现了会计电算化（财政部1994年5月4日《关于大力发展我国会计电算化事业的意见》目标要求），许多大型企业还实施了ERP系统，信息化使企业的经济环境、组织结构、经营方式、业务重心和管理模式等都发生了重大变化。业务执行的各种细节在信息系统中转化为海量数据，这要求审计部门必须有能力在信息化的业务流程和海量数据的背景下开展有效的审计工作。而无形的电子数据及处理数据的信息系统，用户权限和系统安全都更加严格，这也使得审计环境变得更加复杂。对审计线索的影响：在传统的手工会计系统中，审计线索非常清楚，从原始凭证到记账凭证，由过账到财务报表的编制，整个财务处理过程由不同职责分工的人员来共同完成，每一步都有文字记录和经手人签字，这些书面资料为审计提供了清晰的线索，审计人员在对会计报表进行审计时就可以根据需要对这些审计线索进行顺查或逆查、详查或抽查。而在会计电算化系统中，传统的账簿没有了，取而代之的是磁介质，这些磁介质上所存储的会计资料不能为肉眼所直接识别，修改不留痕迹。同时，由于数据处理过程的自动化，业务数据进入计算机系统之后，即所有会计处理均由计算机按程序指令自动生成，传统的审计线索在这里中断了、消失了。传统的查账方法，对电算化的会计个体已不完全适用。对审计内容的影响：在手工条件下，审计内容主要是对人的审查，采用的方法主要是对纸面信息进行核对和检查。责任容易确定，结果也较直观。在计算机审计的条件下，审计人员应该在查核财务会计报表及账簿记录的真实性和正确性的基础上，把重点放到被审计单位所用信息系统是否合法、合规和第一次输出的信息是否真实、正确，以及当运行环境发生变化，或经过系统维护后，输出信息的真实性、正确性上。对审计技术的影响：在手工会计处理的条件下，审计可根据具体情况进行顺查、逆查或抽查。审查一般采用审阅、核对、分析、比较、调查和证实等方法。所有审查工作都是由人工完成的。在会计电算化条件下，会计的特点决定了审计技术的改变。对电算化会计信息系统的审计，如果仍然采用常规的手工系统的那一套审计技术，就不可能达到审计的目的。对审计风险的影响：在信息化环境下，由于企业运行环境的改变，审计线索和审计证据的可靠性主要取决于信息系统的相关控制是否健全、有效。而企业信息系统的开放性和共享性、外部环境的不安全性，都会使计算机病毒和黑客对信息的真实性和可靠性产生威胁，并且其破坏性巨大，这些都加大了信息化环境下企业风险管理审计的风险。对审计人员素质的影响：开展信息化环境下的审计管理，要求审计人员必须具备计算机软硬件知识，对计算机网络和信息系统的安全性具有特殊的敏感意识，对财务会计和企业内部控制具有深刻的理解，既是审计专家，又是信息系统专家，并以对计算机信息系统软硬件的技术性审计来保证计算机审计质量的可靠性。自20世纪90年代，随着信息技术的发展和会计电算化的普及，使审计工作由手工审计转向计算机审计，由此而诞生了计算机审计软件，此阶段属于审计软件的初级阶段——“财务收支审计作业软件包时代”。随着经济的发展和社会的进步，审计的职能早已超越了查账的范畴，涉及对各项工作的经济性、效率性和效果性的查核。这就需要与之相配套的审计信息化产品不再局限于财务收支审计，而应拓展到对各类业务数据的审核。审计信息化产品的应用也将从“财务收支作业软件包时代”进入了一个全新的时代——ARP（Audit Resource Planning，审计资源计划）时代。ARP是指在先进的管理思想的基础上，应用信息通信技术，以加强企业/政府内部控制、提高风险防范能力为目标的审计信息系统，全面解决新形势下内部控制、风险管理与审计监督的难题。这就需要审计信息化产品能够科学的处理和利用审计信息，帮助政府与企业实现对各类业务的全面监测与自动预警，反应出企业财务经营状况，查找经营管理中存在的问题和疑点，评价经营管理和风险程度，注重把查处问题与促进改革、完善制度结合起来，从标本兼治的角度有针对性地提出审计建议，进一步提升审计的质量和水平，为领导科学决策提供依据。第一，实现审计管理信息化是适应现代企业制度要求、改变传统审计模式、紧跟现代审计发展步伐的必然要求。企业内部审计应突破传统的审计思路，逐步向管理审计转移，强化企业内部约束机制，促使企业建立严密的、完善的控制系统，严格的、科学的管理制度，有效的、畅通的运行机制。重点通过内部控制审计、经济效益审计和管理过程审计，优化人力、物力、财力资源配置，改善经营管理，挖掘生产与工作中的潜力，全面分析、评价企业综合效益，增强企业的市场竞争力，以管理创新为基础，促进企业提高经济效益。现代企业制度下，内部审计作为企业管理的一个职能部门，不仅具有监督职能，而且具有服务的职能，可以说是一种寓服务于监督之中的职能。其监督的目的是维护企业整体的合法经济利益不受侵害，实现企业活动最优化，经济效益最大化。因此，要适应现代企业制度，由监督导向型向服务导向型转变，实现财务收支审计向管理审计延伸是必由之路。随着内部审计由财务领域向经营管理领域的扩展，原来旧的审计方法显然不适应现状，审计人员应力求在审计方法上有所创新。交易电子化、自动化是当今经济业务运转的发展趋势和潮流，内部审计要继续发挥监督、评价和服务的职能，就必须紧随审计环境的变化，建立适应信息化的审计管理信息系统，利用信息技术真正改变和提升审计工作的业务方式、业务能力。第二，实现审计管理信息化是科学管理审计工作，规范审计流程，提高审计工作效率的必然要求。在审计监督面临的业务量上看，不断发展的经济规模要求审计监督的规模相应增长。被审计单位财政财务管理、业务运营的技术手段已经逐步从传统的人工处理方式，转向全面依赖信息系统支持的阶段。一方面业务执行的各种细节在信息系统中转化为海量数据，另一方面业务执行在信息化的支持下发生了流程重组。发生变革的被审计业务执行过程，需要审计监督的技术手段做出信息化调整。审计部门必须有能力在信息化的业务流程和海量数据的背景下开展有效的审计工作。从审计工作质量的要求上看，企业、上级主管部门、社会各界等外部主体对审计监督的质量要求连年提升。预算执行审计、固定资产投资审计、经济责任审计等专业审计工作在行政职能中发挥的作用和意义越来越大。按照现代企业内部审计的要求，结合计算机技术特点，兼顾审计业务发展需要，从实际出发，实现审计管理信息化需要开发能满足实际审计工作的应用软件，该软件应以审计质量为核心，审计多样性为根本，审计独立性为先导，审计问题为出发点，审计程序为主线，审计工具为标准，审计文档管理为依托，具备以下功能特点：一是能够分析海量业务数据，准确发现疑点。系统应能够智能的采集财务软件、大型ERP中的各类财务、业务数据，采集方式多样，如：直连采集、备份采集，U盘采集，定量采集、定时采集等。系统应具有强大、灵活的分析工具，能够对财务、业务数据进行各种综合分析，也可以预置各种方法、模型，在项目中调用，便于经验共享和规范工作。系统应具有动态的、实时的数据分析、预警平台，可以对海量的数据进行实时的分析、预警，为制定审计计划提供依据，为审计项目提供疑点。二是审计质量的有效控制。系统应具备完善的审计项目管理功能，辅助审计项目质量控制，完成审计准备、审计实施、审计报告、后续审计四个阶段全过程管理，并具有项目台账、项目成本、成员管理、预备归档等管理功能，并提供与审计现场作业软件接口，方便及时地记录现场审计环节的重要信息，为领导决策支持、全面掌控审计项目的进度提供保障。三是全面的审计工作客观评价体系。构建考核主体、考核周期、考核流程、考核对象、考核指标、基准分数、评价等级等考核体系，对审计项目、审计部门、审计人员进行量化评价。通过对业务流程的各个环节投入、产出进行审核评价，从而获得员工的绩效考核分析，为工作安排、奖金计算、人员调整等提供决策依据。四是完善的决策支持，实现审计成果的高级综合应用。可以对各级审计部门的人员、计划、项目、档案、台账、绩效考核、审计预算等进行多条件、精确到模糊、简单到复杂的高级综合查询。按照管理要求快速生成审计报表和统计报表，能够以多种格式输出。同时可以构建指标分析体系，辅以图表的生动展现，为领导决策提供有力支持。五是集团化多组织的计划管控。系统应能够支持多级（集团公司和下属公司）、多组织独立的计划管理。能够对审计计划的填报、审核、审批、分配、调整、结转，到计划执行进度进行全过程的管理和监控。随着审计管理信息系统的建立，审计工作将逐步实施“实时跟踪+联网核查”审计模式，逐步实现审计监督的三个“转变”：从单一的事后审计转变为事后审计与事中审计相结合；从单一的静态审计转变为静态审计与动态审计相结合；从单一的现场审计转变为现场审计与远程审计相结合，使内部审计的监督职能的实现得到革命性的提升。ARP时代的审计管理信息系统，依托先进的审计理念和强大的信息科学技术，能帮助企业对业务流程的执行效率，资源利用效率进行实时监控，适时提供改进建议，防范风险于未然，促进企业又好又快发展，为有中国特色的社会主义建设保驾护航。

杨树是杨柳科（Salicaceae）杨属（Populus L.）植物的统称。为落叶乔木，是世界上分布最广、适应性最强的树种之一，分布于北温带。近年随着我国农业产业结构调整，杨树已成为平原重要的经济林木，优良的用材和绿化树种，但同时也造成了其病虫害的严重流行与发生，其中杨树溃疡病已成为为害其生长的重要病害之一。杨树溃疡病又称水疱型溃疡病，是为害杨树枝干的一种常见病害，通常以水渍状病斑为主，圆形或椭圆形，手压病斑有褐色水流出。初为圆形，极小，后水疱变大，直径0.5～2.0cm，疱内充满淡褐色液体，随后水疱破裂，流出淡褐色液体，遇空气变成黑褐色，同时把病斑周围染成黑褐色，最后病斑干缩下陷，中央有一纵裂小缝。该病几乎遍及我国各杨树种植区，其中以华北、西北和东北地区最为普遍、严重，近年来随着全国范围内“杨树热”的不断升温，各类品种层出不穷及种植面积的急剧膨胀，同时由于受经济利益的驱使，试验较少或不加试验，便盲目引进一些抗病性较差或不抗病的品种，加之气候异常，致使该病暴发流行，严重制约了杨树产业的发展。为了有效地防治杨树溃疡病，一方面可以筛选抗病的杨树品种；另一方面可一改善防治方法，加强防治力度。传统的杨树溃疡病防治方法多采用化学药剂（如福美胂、多菌灵）防治，但随着一些高毒药剂（如福美胂）的禁用，以及病原菌产生抗药性，需要不断研发高效、低毒、环境相容型的农药新品种。本文对河北省景县农林复合系统中的杨树溃疡病病原进行了分离和鉴定，同时采用植物提取物对杨树溃疡病菌进行室内活性筛选和室外病害防治的试验，研究结果如下。杨树溃疡病病原为真菌，菌丝在PDA培养基上生长较好，初期菌落白色，有发达的气生菌丝，呈绒毛状至棉絮状。3天后菌落逐渐变为灰白色，最后为黑色，菌落初期有明显的灰黑色轮纹。分生孢子器暗色、球形，生于寄主表皮下，后外露，单生或集生，分生孢子梗短，不分支；分生孢子卵形、纺锤状或梭形，单孢，无色，有隔或无隔，具云纹。通过真菌的ITS序列与GenBank中其他真菌种类的ITS序列进行比对，综合形态和分子检测结果，病原鉴定为茶麃子葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea），属于子囊菌亚门的真菌。分别制备杨树（Populus×euramericana）叶提取物、皂荚（Gleditsia sinensis）刺提取物、黄芩（Scutellaria baicalensis）根状茎提取物、博落回（Macleaya cordata）果实提取物、虎杖（Polygonum cuspidatum）根提取物，采用带毒平板—菌丝生长抑制法，测定了上述5种植物提取物的抗菌活性，其中，黄芩、博落回和虎杖提取物对杨树溃疡病菌均具有很好的抑制活性。当培养基中提取物浓度为2mg/ml时，黄芩、博落回和虎杖提取物对杨树溃疡病菌菌丝生长的抑制率分别为52.94%、78.10%和57.19%。皂荚（刺）提取物和杨树（叶）提取物在浓度为2mg/ml时对杨树溃疡病菌菌丝生长的抑制率分别为37.91%和35.13%。进一步测定了黄芩、博落回和虎杖提取物对杨树溃疡病菌菌丝生长的半抑制浓度（IC50）分别为0.9675mg/ml、0.3125mg/ml和1.0219mg/ml。在5种植物提取物对杨树溃疡病的防治试验中，经两次（前后相隔15天）喷药后，博落回提取物的防治效果最好，浓度为0.40%时的防效为85.92%。虎杖提取物、黄芩提取物和皂荚提取物在浓度为0.40%时，防效分别为84.52%、74.18%和71.74%。杨树提取物在浓度为0.40%时，反而能促进杨树溃疡病病情的发展。以上研究结果将有利于杨树溃疡病的防治，促进杨树产业的快速发展，同时也为用于杨树溃疡病防治的新型杀菌剂研制提供了依据，为植物源农药资源的开发与利用提供线索。

番茄早疫病菌（Alternaria solani）是保护地和露地番茄生产的重要病害之一，为真菌性病害，为害植株后出现慢性枯萎，植株矮小，果实膨大等，可大幅度降低番茄的产量和品质。我国自20世纪80年代开始发生以来，已经成为番茄设施栽培的限制性障碍[1]。在防治上由于长期大量的化学农药使用，使病菌产生了抗药性，防效逐年降低，同时造成了一定的农药污染[2]。随着环境保护呼声的日益高涨，高毒农药的负面影响已引起世界范围的广泛关注，以高效，低毒农药逐步替代传统的高毒农药是农药发展的必然趋势。植物源农药可在环境中迅速分解，对环境无任何影响，是符合环境保护，农业持续发展方向的[3]。细辛（Asarum siebotdii）是多年生草本植物，据中华临床中药学（上卷）记载，根能入药，具有祛风，散寒，风湿弊痛，抗炎等功效，在中药学上有广泛的用途[4]。本实验用中药细辛的根提取物对番茄早疫病菌的菌丝生长及分生孢子萌发的抑制作用进行了室内活性测定，旨在为开发出一种经济、安全、有效的新型杀菌剂提供理论依据。1.1.1 供试样品 试验所用细辛采自山西省历山自然保护区，将采集的植物材料洗净后在室内阴干（约25℃），放入恒温箱内（40～45℃）烘干，磨碎，过60目筛，备用。1.1.2 供试菌种 番茄早疫菌（Alternaria solani），由山西农业大学农学院植物病理实验室提供。1.2.1 细辛提取物的制备 准确取3份细辛根粉50g，分别装入500ml小烧杯内，加入干粉5倍量的有机溶剂甲醇、氯仿、石油醚。室温下（30±2）℃浸泡3～5天后，过滤并浓缩至稠膏状，称取一定量的提取物，加2～3滴吐温80做乳化剂，并依次配成实验所需的浓度，4℃下保存。1.2.2 细辛提取物对番茄早疫病菌菌丝生长的抑制作用 采用生长速率法[5]，用打孔器取6mm菌落边缘生长旺盛的菌种，放在加药的PDA平板上培养，以培养基内加等量无菌水作对照，每次重复3次，置25℃下培养。用十字交叉法测每个菌落的直径，以其平均值代表菌落的直径，以下式求出抑制菌丝生长率：抑制菌丝生长率%=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-0.6）×100%1.2.3 细辛提取物对孢子萌发的抑制作用 分别将3种有机溶剂的细辛提取物制成最终浓度为1mg/ml的细辛提取液的PDA培养基。待培养基冷却后，取预先配置好的孢子悬浮液10μl，接种到直径为9cm的培养皿中央，用涂布器涂抹均匀，在25℃培养箱中培养48h，观查记录孢子萌发数量。每处理设5个重复，取平均值。计算孢子萌发率和抑制率。孢子萌发率（%）=已萌发孢子数/镜检孢子总数×100%抑制率（%）=（对照萌发率-处理萌发率）/对照萌发率×100%1.2.4 细辛氯仿提取物对番茄早疫病菌菌丝抑制中浓度（MIC）的测试 将细辛氯仿提取物稀释成5个浓度（4mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml），测试不同浓度的提取物对番茄早疫病的病原菌菌丝生长的抑制作用，计算毒力回归方程及抑制中浓度（MIC）。细辛提取物对番茄早疫病菌菌丝生长的抑制作用实验结果如表1。在48h时，石油醚提取物的抑菌率为28%，氯仿提取物的抑菌率为66.67%，而甲醇提取物的抑菌率达到了50%。并且随着时间的推移，3种溶剂提取物的抑菌率都有所下降。同时与对照相比，处理的菌丝在培养皿中出现气生菌丝减少，变粗，向上生长现象。这一结果说明，3种不同溶剂的细辛提取物在浓度为2mg/ml时对番茄早疫病的病原菌均有不同程度的抑制作用。溶剂menstruum菌落直径（mm）与抑制率（%）ColonyRadiusandInhabitingrate48h抑制率Inhabitingrate96h抑制率Inhabitingrate144h抑制率Inhabitingrate甲醇methanol1.8550.002.9051.584.5748.82氯仿chloroform1.4366.672.5060.002.7359.57石油醚Petroleumether2.428.004.2024.216.918.71CK3.10—5.35—8.35—表1 细辛提取物对番茄早疫病菌丝生长的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of Asarum siebotdii extract against mycelia Growth of Alternaria solani细辛提取物对番茄早疫病菌孢子萌发的影响见表2。48h后，石油醚和氯仿提取物表现出了显著的抑制率，对分生孢子萌发抑制率分别为91.48%和88.79%，甲醇提取物表现出了较强的抑菌率，达到53.81%。实验过程中发现，对照皿在接种后32～48h即开始陆续萌发，而提取物各处理均不同程度地表现出萌发推迟的现象。溶剂menstruum孢子萌发率（%）Rateofgerminationofconidia萌发抑制率（%）Percentageofinhibition甲醇methanol42.8253.81氯仿chloroform10.4288.79石油醚Petroleumether7.9291.48CK92.92—表2 细辛提取物对番茄早疫病菌孢子萌发的抑制作用Table 2 Inhabiting effect of the different menstruum of Asarum siebotdii extract against conidiao production of Alternaria solani由表1可见，3种不同溶剂的提取物中氯仿提取物的抑菌效果最好，为了进一步确定其生物活性，求出MIC，将细辛氯仿提取物稀释成5个不同浓度，对病原菌进行测定。结果见表3、表4，6天后，浓度在4mg/ml时，氯仿提取物表现出了显著的抑菌率，达到77.14%，而浓度为0.25mg/ml时，抑菌率显著下降，只有9.5%。这一结果说明，细辛氯仿提取物对番茄早疫病菌菌丝的抑制作用与浓度成正相关，随着浓度的下降，抑菌效果也随之下降。同时在96h时求得毒力方程和氯仿提取物的抑制中浓度（MIC）为1.57mg/ml。病原菌Pathogen浓度（mg/ml）concentration菌落直径（mm）与抑制率（%）ColonyRadiusandInhabitingrate48h抑制率Inhabitingrate96h抑制率Inhabitingrate144h抑制率Inhabitingrate番茄早疫病菌Botrytiscinerea4.00001001.9573.622.2577.142.0001.2364.682.9354.404.1251.271.0001.6243.303.4344.634.7342.730.5001.8530.304.2329.045.7229.130.2502.0419.505.307.507.139.50CK2.39—5.72—7.82—表3 不同浓度的细辛提取物对番茄早疫病菌菌丝生长的抑制作用Table 3 Inhibitory effect of the different concentration of Asarum siebotdii extract against mycelia Growth of Alternaria solani处理Treatment毒力方程?RegressiveequationMIC??相关系数r番茄早疫病菌AlternariasolaniY=2.0910+1.6950x1.570.9707表4 细辛提取物对番茄早疫病的毒力Table 4 Virulence of the extracts of Asarum siebotdii seeds against Alternaria solani植物源农药活性物质主要来源于植物体内产生的次生代谢产物，据Swain于1977年报道，次生代谢产物已超过400000种，如有机酸、萜烯类、生物碱、类黄酮、甾体、酚类、蛋白质、单宁和多糖等[6]。据文献报道，苦参中含有苦参碱（Matrine）和氧化苦参碱（Oxymat-rine）等17种化学结构相似生物碱，其中以苦参碱为其最主要的活性成分，对病原菌有较强抑制作用[7]。另外，毛蒿植物中的毛蒿素，南欧丹参中的硬尾醇，苜蓿根部的苜蓿酸以及海红豆中的紫檀素，黄连体内的小孽碱等均具有很强的抗真菌作用[8]。本实验研究表明，3种溶剂的细辛提取物对番茄早疫病菌菌丝和分生孢子萌发都有不同程度的抑制作用，但它们之间的抑制作用存在差异，在抑制菌丝生长方面，氯仿提取物效果最好，甲醇提取物次之，石油醚提取物效果最差。在抑制分生孢子萌发方面，石油醚提取物效果最好，氯仿提取物次之，甲醇提取物效果较差。由于3种溶剂的极性不同，从以上实验结果初步推断细辛体内抑制番茄早疫病菌的活性物质不止一种，而且极性大小在石油醚和氯仿之间。今后的研究方向是探索分离细辛提取物中的活性成分，为进一步产品开发奠定基础。至于细辛提取物是否对其他病菌有抑制作用，有待在以后的实验中证明。

根癌病是根癌土壤杆菌（Agrobactium spp.）引起的一种顽固性病害，此菌寄主范围广，可侵染93科331个属643个种的植物，包括果树、林木、花卉等多种双子叶植物和部分裸子植物，在生产上造成非常大的损失。调查表明在我国多数种植根癌病寄主植物的地区根癌病均有不同程度的发生。目前生产上明显出现为害的有樱桃、桃树、李子、杏树、葡萄、苹果、梨树、海棠、山楂、核桃、杨树、樱花、玫瑰、月季、啤酒花等果树、林木和花卉，不同地区发生情况不同。根癌病的症状表现是在植物的根部（有时在茎部，所以也称冠瘿病）形成大小不一的肿瘤，初期幼嫩，后期木质化，严重时整个主根变成一个大肿瘤。病树树势弱，生长迟缓，产量减少，寿命缩短，甚至死亡，影响苗圃苗木的质量和成树的生长。重茬苗圃发病率在20%～100%之间不等，发病重的甚至造成毁园。根癌病菌可较长时间的存活在土壤中，从植株的伤口侵入，随苗木的调运进行远距离传播，是土壤传播加苗木传播的细菌性病害。此病菌的致病方式是将其致病质粒上的一段DNA整合到植物的染色体DNA上，随着植物本身的生长代谢来刺激植物细胞增生形成肿瘤，而病原细菌的细胞并不进入植物的细胞。鉴于根癌菌来源于土壤，所以防治的时间应选择在种子或植株接触未消毒的土壤之前进行种子或苗木的处理，从根本上阻止根癌菌的侵入。伤口是根癌菌唯一的侵染途径，所以保护伤口是最好的防治切入点。根癌菌具有非常特殊的致病机制，一旦有根癌症状表现就证明T-DNA已经转移到植物的染色体上，再用杀细菌剂杀细菌细胞已无法抑制植物细胞的增生，更无法使肿瘤症状消失。目前，利用抗根癌菌剂对植物根癌病进行生物防治是非常实用可行的方法。中国农业大学植物病理学系细菌课题组利用引进的国外K84菌株研制成抗根癌菌剂1号，已经成功用于防治我国多种果树根癌病；并且，分离、筛选到一些具有自主知识产权的根癌病生防细菌，可以弥补国外K84菌株的抑菌谱缺陷。本项目以其中一株高效菌株AE进行研究，以形成可以防治多种植物根癌病的抗根癌菌剂2号，解决国外K84菌株只对核果类果树根癌病有效的问题和局限。以活菌量和抑菌活性为指标，通过单因子和正交试验，从18种液体培养基筛选得到1种相对最适的发酵培养基，明确了在小型发酵罐的发酵条件：温度26～29℃，接种量1.5%～2.5%，罐压0.03～0.05MPa，通气量0.6～0.8（V/V·min）。在发酵培养时，0～6h为迟滞期，6～13h为对数期，13～22h为稳定期，22h以后为衰退期。培养21h细胞数量最多，达到1.6×1012cfu/ml；24h时发酵物对根癌菌的抑制作用最强。通过筛选，确定草炭可作为吸附剂，甲基纤维素和黄原胶可作为防护剂和稳定剂，并将发酵终产物制成了10×108 cfu/g的菌剂。该菌剂在室温（20～25℃）保质期约为100天。在不同地区的田间应用示范证明该菌剂对根癌病的防治效果在70%以上，并且防治效果与菌剂的应用方法有密切关系。

木霉菌（Trichoderma spp.）广泛存在于土壤及其他基物中，作为生防菌以其生长速度快，产孢量大、作用谱广、作用机制多样、能在植株、土壤中增殖并形成有效群体等诸多优势而备受关注。我们针对蔬菜上常见病害，从土壤中分离、筛选获得对蔬菜病原菌具有较强抑菌活性的绿色木霉菌株Tr9701，通过对其产几丁质酶活性等对其抗病机理进行了初探，同时试验了其在黄瓜叶片、根部的定殖能力，为今后开发可替代某些化学农药的微生物杀菌剂做了基础性工作，现将初步研究结果记述如下。1.1.1 供试菌株 绿色木霉Tr9701（Trichderma viride），由天津市植物保护研究所生防室筛选、鉴定。供试病原菌立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、番茄灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea），由天津市植物保护研究所病害室分离、鉴定。1.2.1 绿色木霉菌制剂几丁质酶检测据Harman等的方法[1]，在胶体几丁质培养基中培养绿色木霉菌，进行产几丁质酶预试验，然后将绿色木霉菌分生孢子液接种到合成诱导液体培养基中诱发几丁质酶产生，以不加胶体几丁质为阳性对照，在28℃，150r/min振荡培养，连续提取培养液制备几丁质酶粗提液。检测采用还原糖法[2]处理，在试管中加入几丁质酶粗提液、10g/L胶态几丁质各1ml，37℃恒温水浴30min，加入DNS10ml，混匀后沸水浴10min，用水冷却至室温，观察颜色变化，以100℃高温灭活处理15min几丁质酶粗提液为对照，试验重复3次。1.2.2 绿色木霉几丁质酶粗提液对病菌的抑菌活性测定 将黄瓜立枯丝核菌、番茄灰葡萄孢霉菌菌丝块转移到平板上，每平皿接种4块，分布于4角，平皿中心放滤纸片并加入100μl几丁质酶粗提液或阳性对照液，重复3次，空白加入等量无菌水，定期观察抑菌圈大小。1.2.3 绿色木霉菌对立枯丝核菌重寄生作用的显微观察 将灭菌赛璐玢膜置于直径90mm的水琼脂培养皿上，在平板两侧各植入经活化培养的绿色木霉和立枯丝核菌菌丝块，25℃下对峙培养，待菌丝接触后置于光学显微镜下观察。1.2.4 绿色木霉菌在黄瓜叶片和根部的定殖 取菜田表层10cm深处土壤，混腐熟的猪粪和蛭石（按3：1：1比例），过筛后，用150倍甲醛液消毒，边喷边混，喷匀后堆起，盖塑料布闷5天，然后晾晒14天，待残药挥发后铺于苗床待用。同时将冰箱保存的绿色木霉菌活化，转接到小麦粉培养基上，在25℃温度下培养7天，培养基上长满菌丝和孢子后，在组织捣碎机中捣碎、过滤，配成绿色木霉菌孢子悬浮液（5×106个孢子/ml）备用。木霉菌叶面定殖：将培养制成的孢子悬浮液用消过毒的手持喷雾器喷雾，均匀喷至黄瓜叶面正反两面，直到叶面上均匀布满一层细微水珠而不流淌为止。喷雾后1h取第一次样，以后每隔一周取一次样，共4次。每次每处理取的叶片剪成0.5cm见方小片，称量取样叶片加入10倍无菌水中振荡（120r/分）15min。取稀释液0.1ml涂布于木霉选择性培养基上，25℃下培养3～4天，5皿重复，计菌落数。以第一次取样所检测到的菌量为接种量，菌量以cfu/g叶表示。木霉菌根际定殖：将培养制成的孢子悬浮液，均匀浇灌至黄瓜根部，直至黄瓜苗根部土壤全部浸润为止。浇灌后1h取第一次样（地下1～2cm处根围土壤），以后每隔3天取一次样，共4次。检查时，分别称取根围土壤1g，加入无菌水20ml中振荡（120rpm）15min。取稀释液0.1ml涂布于木霉选择性培养基上，25℃下培养3～4天，5皿重复，计菌落数。以第一次取样所检测到的菌量为接种量，菌量以cfu/g叶表示。通过预试验，绿色木霉菌Tr9701在胶体几丁质培养基上生长可以形成显著几丁质酶解透明圈，因此进行了绿色木霉菌几丁质酶的诱导试验。诱导条件下几丁质酶粗酶液加入DNS后变为深棕红色，与阳性对照相比有显著差异，说明绿色木霉菌菌株产生几丁质酶，且经诱导处理的绿色木霉菌几丁质酶产生量明显提高，经检测，在培养第5d时达到最大值。绿色木霉菌Tr9701几丁质酶粗提液对立枯丝核菌、灰葡萄孢霉的抑菌活性在平皿接种后2天内，立枯丝核菌、灰葡萄孢霉菌丝生长迅速，但菌丝接近木霉几丁质酶粗提液接种点周围时，生长缓慢，最后停止，从而形成明显抑菌圈。空白对照无抑菌圈，立枯丝核菌菌丝长满平皿，灰葡萄孢霉菌丝长满平皿并形成大量菌核。试验表明，绿色木霉Tr9701的几丁质酶粗提液对立枯丝核菌、灰葡萄孢霉的抑菌圈直径分别为28mm和15mm，比阳性对照的抑菌圈直径大，其差异达到了显著水平。显微观察显示绿色木霉菌对立枯丝核菌具有较强的寄生能力，绿色木霉菌丝与立枯丝核菌菌丝接触后并列生长或缠绕，有时以钩状结构入侵立枯丝核菌菌丝。在接触后期则观察到被寄生的立枯丝核菌菌丝断裂和消解的现象。2.4.1 绿色木霉菌在黄瓜叶面的定殖 绿色木霉菌在叶面上的定殖动态见表1。由结果可知，绿色木霉菌在叶面环境中由于各种条件的影响，第一周内的菌量比初始菌量降低。此后绿色木霉菌适应了叶面环境，菌量逐渐回升，第14天检测菌量为1.02×104cfu/g叶片。21天后菌量持续下降，尤其是第28天菌量降至0.12×104cfu/g叶片。镜检观察绿色木霉菌Tr9701在叶面喷雾后，主要定殖于叶面气孔周围、腺毛基部及叶面凹陷处。这些位点或是分泌物产生处，或是叶面水分分布较多处，能为绿色木霉菌的生长繁殖提供适宜的条件。同时，这些位点也是其他病原菌的竞争位点，通过绿色木霉菌的人工接种，相比病原菌具有种群数量大，出现早的特点。因此，绿色木霉菌对这些位点的抢先占领，不仅有利于本身的生存，而且使黄瓜叶面受到保护，免于病原菌的侵染。重复调查时间1h3天7天14天21天28天11.241.210.941.150.830.1820.960.950.810.920.660.0831.151.080.860.980.790.1441.371.400.951.030.720.10平均1.181.160.891.020.750.12表1 绿色木霉菌孢子在黄瓜叶片上定殖情况（孢子着生量×104个孢子/g）2.4.2 绿色木霉菌在黄瓜根际的定殖 绿色木霉菌在黄瓜根际土壤中定殖结果见表2。由结果可知，第一周内土壤的菌量比初始菌量降低，可能是在根际土壤环境中，由于各种因素的影响，木霉菌受到一定抑制，此后绿色木霉菌适应了土壤环境，菌量逐渐回升，第14天检测菌量为2.64×104cfu/g叶片。21天后菌量持续下降，尤其是第28天菌量降至0.68×104cfu/g叶片。在调查中发现，绿色木霉菌定殖黄瓜根部能力受水分含量和pH值影响明显，水分偏高或偏低都影响绿色木霉菌菌株在黄瓜根部的定殖，pH偏酸性条件下的定殖量明显高于偏碱性条件下的定殖。重复调查时间1h3天7天14天21天28天12.432.371.852.521.090.6422.692.592.032.731.240.7232.362.321.892.611.080.6542.842.561.942.701.110.71平均2.582.461.922.641.130.68表2 绿色木霉菌孢子在黄瓜根部定殖情况（孢子着生量×104个孢子/g）木霉菌腐生性强，适应性广，生长和繁殖快，可迅速利用营养和占据空间，是当前微生物菌剂控制病害的研究热点[3]。本试验结果表明，我们所筛选的绿色木霉菌Tr9701有较强的产几丁质酶活性，且经诱导处理酶产量明显提高，其酶粗提液经试验对立枯丝核菌、灰葡萄孢霉有显著抑制作用，通过诱导产生的木霉几丁质酶在对于抑制病原菌的生长具有重要意义。经显微观察发现，绿色木霉Tr9701对于立枯丝核菌是通过趋向生长、识别、接触缠绕和穿透，寄生于病原真菌之上，对立枯丝核菌具有较强的寄生能力。此现象证明，当绿色木霉菌遇到立枯丝核菌等病原菌时，受到刺激和诱导，产生溶菌酶，抑制立枯丝核菌等的生长，并可降解菌丝。生防菌在植物表面的定殖能力反映了生防菌在植物表面与病原菌竞争空间和营养的能力。本研究表明，绿色木霉菌可以在黄瓜叶面和根部定殖。据Darah（1991）报道，根圈微生物的分布与沿根的可溶性碳的分布距离有关，微生物量的积累有赖于根分泌物的释放，因此添加一定的营养可以促进绿色木霉Tr9701的定殖。本研究进一步证明，绿色木霉Tr9701产几丁质酶、寄生、定殖能力强，是较好的生防材料。当前由于生防微生物控制植物病害具无污染、价格低廉的优点，具有广阔的应用前景。因此对绿色木霉菌Tr9701的发酵工艺、田间应用范围等有待进一步研究。

番茄灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）侵染引起的一种在我国乃至全球分布的重要病害。尤其是保护地番茄，其高湿条件为该病流行创造了有利的发病条件。目前番茄生产由于缺少抗病品种，防治番茄灰霉病仍主要依靠化学防治，多采用速克灵等化学药剂喷雾，但在连续使用的情况下，病菌逐渐产生了抗药性，防效逐年下降。此外，大量使用化学药剂也造成了严重的农药残留问题和环境污染问题。近年来人们通过大量筛选和利用抗灰霉病的有益微生物及其代谢产物，使生物防治日益成为番茄灰霉病控制中的一条重要而有效的途径。作者研究了本实验室筛选的拮抗放线菌B1菌株对番茄灰霉病的生防效应，并对其分类地位进行了初步鉴定，为该菌株的应用与开发提供基础。B1菌株是从北京番茄温室土壤中筛选得到的一株拮抗菌，平板抑菌试验结果表明，它对多种植物病原细菌和真菌有较强的抑制作用，其中对灰葡萄孢的抑制能力最强，抑制率达86.3%。B1代谢产物对番茄灰霉菌的菌丝有扭曲、膨大等致畸效应。室内离体检测表明B1菌株对番茄离体叶片和果实的灰霉病均有较好的防治效果。温室试验证实B1菌株对番茄苗期的灰霉病的防治效果在60%以上。根据B1菌株的形态特征、培养特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析结果，将其鉴定为链霉菌属淡紫灰类群（Streptomyces lavendulae）。

在自然界，植物、微生物和环境之间的关系是极其复杂的。只有详细了解生防微生物在植物根际或叶围与病原物及其他生物、植物及其分泌物、土壤及各种环境因子之间的相互作用及其变化规律，才能有效地调控无机、有机环境，更好地发挥生防微生物的防病功能[1]。国内外在探索环境因素在植物与微生物互作过程中的影响方面，已经开展了较多工作，包括温度、湿度、降雨、光照等气候条件，土壤理化性质，作物栽培条件等。在纳米技术出现之前，人们很难认识到自然环境中的纳米颗粒物对微生物的影响。近年来，大气等环境中纳米颗粒（超细颗粒物）的生物效应已开始深入研究[2，3]，如光催化纳米二氧化钛对很多微生物都具有杀菌作用[4，5]。这样对于暴露在自然条件下的细菌尤其是叶围微生物，适应这种较为苛刻的环境将是细菌生存的一个重要考验。蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus 905菌株是本实验室从植物上分离获得的生防细菌，具有促进植物生长，增强农产品品质和防治多种植物病害的功效[6]，并已开发应用于农业生产，取得了预期的经济、生态及社会效益。前期研究发现，离体条件下该菌株在纳米颗粒光催化作用的影响下存活率明显降低。二氧化钛表面产生的·OH和其他如H2O2、O·2等活性氧都参与了灭菌作用[7]。鉴于光催化纳米二氧化钛具有广谱的杀菌作用，我们必须考虑到它对于自然界中有益微生物的影响。本研究以已在生产中应用的有益芽孢杆菌（Bacillus cereus 905）为研究对象，分析纳米TiO2作用下，该细菌在黄瓜叶围存活能力的变化，有助于阐明纳米颗粒对植物叶围微生物的影响。分别称取适量的纳米TiO2（P25，Degussa Co.），高压灭菌，保存于暗处。使用前加入无菌磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH 7.0），超声波水浴振荡30min使纳米TiO2均一地分散于溶液中。Bacillus cereus 905（GFP），由中国农业大学植病系生防室分离保存并用GFP标记[8]。将B.cereus 905（GFP）接种至含有相应抗生素的LB培养基，30℃160 r/min悬浮振荡培养过夜，1000×g离心收集菌体，用无菌磷酸缓冲液洗涤菌体两次，收获的菌体重新悬浮于磷酸缓冲液中，菌体浓度由平板活菌计数法来确定。所有试验选择在日光温室生长的，4片真叶龄的健康黄瓜植株（Cucumis sativus cv.CAU NO.32）上进行。用B.cereus 905（GFP）菌悬液（108CFU/mL）喷雾接种叶面，或直接将叶面浸润菌悬液3s钟接种。这样的接种程序可以达到107CFU/叶的接种量。接种1h后用美术喷笔（Airbrush，HD-470，台湾）将TiO2悬浮液（0.2mg/mL）均匀喷雾在接种过的叶面上。使用美术喷笔是为了使TiO2以极小的雾粒（平均体积750μm3）覆盖叶围，既不蘸湿叶面也避免了叶围微生物的空间移动[9]。处理后的植株继续在日光温室内培养一定时间后，取样进行原位观察或平板回收。每个处理，随机取5片叶子，每片叶子随机切割6个1cm×1 cm的组织用以原位观察，用激光共聚焦扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope，Nikon EZ-C1）迅速扫描叶的上表面，寻找发绿色荧光细菌，操作要求熟练，防止荧光淬灭。每个取样点，每个处理随机取5片叶子，每片叶子置于预装30mL无菌缓冲液（0.1mol/L磷酸缓冲液，0.1%Bacto-Peptone，pH 7.0）的离心管或灭菌袋中，超声波水浴振荡7min，充分洗脱叶围微生物[10]。叶围洗脱液梯度稀释后，涂布至含有相应抗生素的LB平板上，30℃培养1～2天，通过菌落计数估计B.cereus 905的群体数量。对于纳米二氧化钛光催化杀菌作用机制的研究表明，二氧化钛吸收波长≤387.5nm近紫外光的光能，产生·OH，以及H2O2、O2等活性氧，从而起到杀灭B.cereus 905的作用，纳米二氧化钛本身对于B.cereus 905没有暗毒性[7]，则实验中同时设一个低水平的光照条件作为参比。由于是利用太阳光作为光源，能穿透玻璃到达植物叶面并被纳米二氧化钛所吸收利用的光波绝大多数为UVA（320～400nm），在日光温室的一角通过设遮阳网来创造低UVA剂量的光照条件。纳米二氧化钛处理后的植株继续在日光温室内培养8h，立即取样进行原位观察或平板回收。8h内低UVA剂量的光照条件和正常日照条件下的平均UVA辐射强度分别为0.2mw/cm2和1.3mw/cm2。图1 纳米二氧化钛对B.cereus 905（GFP）在黄瓜叶围存活能力的影响Figure 1 The impact of nano-TiO2 to the survival of B. cereus 905 on the cucumber phyllosphere如图1所示，两种不同UVA剂量光照8h后，在纳米二氧化钛的影响下，B.cereus 905的残余量分别降低为对照（纳米二氧化钛浓度为零）的52.4%（0.2mw/cm2）和11.6%（1.3mw/cm2）。对照处理B.cereus 905的存活能力保持在106CFU/叶的水平，甚至在低UVA剂量的光照条件下，纳米二氧化钛处理的B.cereus 905的存活能力也能维持与对照同一数量级的水平；而在高UVA剂量的光照条件下，B.cereus 905的存活能力明显下降，甚至发生数量级的变化，群体数量比对照下降了88.4%。原位观察结果也与平板回收的结果保持一致（见图2）。对每个叶片随机切取组织块扫描观察发现，在所有的处理中不论是单个细菌还是细菌聚集体，它们在叶围的存在位置与叶表面的结构特征有关。叶表面对于细菌来说是一个非常不平坦的生活环境。它实际上是掩藏有许多不同结构的区域的集合体，包括腺毛、钩毛、气孔、表皮细胞和纹理等。大多数观察到的细菌位于叶的纹理或腺毛处，也有一部分位于表皮细胞上或气孔附近。在纳米二氧化钛处理的叶面，观察到的细菌数量较少，并且很难观察到单个细菌，大多数细菌以聚集体的形式存在。Monier J-M和 Lindow SE也发现菜豆叶面菌Pseudomonas syringae以单个细胞的存在形式比以聚集体的形式对于环境的干燥胁迫更为敏感[11]。图2 Bacillus cereus 905（GFP）在黄瓜叶围存活情况（原位观察）Figure 2 The survival of Bacillus cereus 905 on the cucumber phyllosphere（Microscopy of Bacteria in Situ）本研究表明，在正常日照情况下，B.cereus 905的存活能力明显下降，群体数量比对照下降了88.4%。无论是原位观察还是传统的平板回收结果说明，受二氧化钛光催化杀菌作用的影响，有益微生物B.cereus 905在黄瓜叶围的存活能力明显降低，这与在离体条件下得到的结论[7]相一致。鉴于光催化纳米二氧化钛广谱的杀菌作用，我们必须考虑到它对于自然界中有益微生物的影响。对纳米颗粒物生物效应的研究，是一个急需研究的领域。空气及植物表面等许多地方都存在许多纳米级颗粒，对于暴露在自然条件下的细菌，适应这种较为苛刻的环境将是细菌生存的一个重要考验。尤其是随着纳米包膜肥料、纳米土壤改良剂、二氧化钛光合作用促进剂等的产业化，以及农业生产中的投入使用，会使越来越多的人们注意到这一问题。目前对于纳米颗粒作为环境因素对植物、微生物影响的研究并不多见，本文探讨了有益微生物在植物表面受纳米颗粒影响而产生的存活能力问题，但如何创造生防微生物的适宜环境，或改进其对环境的适应能力以提高生防制剂效果的稳定性，还需要进一步深入的研究。

灰霉病是保护地蔬菜栽培中危害十分严重的病害，传统的化学防治造成了严重的农药残留和环境污染。应用微生物进行生物防治能够克服上述缺点，是一种安全、有效和环保的方法。本研究旨在从黄瓜植株内分离、筛选能够抑制灰霉病的拮抗细菌，并测定拮抗菌株在不同处理下对灰霉病的防治作用。主要结果如下：通过平板对峙培养筛选出8株对黄瓜灰霉病菌具有较强拮抗作用的细菌，再对这8株菌发酵滤液的抑菌活性进行测定，选出抑制效果最好的两个菌株B12和B13，抑制率分别为84.0%和81.8%。在离体叶片上，B12、B13发酵滤液对灰霉病菌的扩展均有较强的抑制作用，抑制率分别为83.2%和81.4%。两菌株活性产物可引起病原菌菌丝扭曲，菌丝膨大成串珠状分枝，顶端膨胀后细胞壁破裂，原生质外溢，产生溶菌作用。B12、B13发酵液对于灰霉病菌孢子的萌发具有强烈的抑制作用。在孢子萌发试验中，经B12、B13发酵液处理的孢子萌发率仅分别为5.5%和8.6%，滤液对孢子萌发的抑制效果与发酵液相近。将两菌的发酵滤液置于不同的温度和pH环境下处理，当温度在100℃以下、pH值在6～9时，滤液的抑菌效果表现出较强的稳定性。在温室试验中，两菌发酵液对灰霉病有较好的预防效果，B12、B13的保护防效分别为70.5% 和68.7%，治疗防效分别为51.2%和47.8%。