一个健康的企业需要一个适宜的企业制度支撑。建立现代企业制度，企业应当按照现代组织理论的要求对企业组织制度实行改革，其基本原则就是专业分工与协作的原则。分工是现代化大生产的重要标志，但是分工并不是生产的专利，企业的管理工作也需要实施分工。生产分工越细越专一，越专一效率越高，这样给企业创造的效益也就越大。对管理工作实行专业分工，可以把各项专业管理工作搞得更加有声有色、更加深入细致，从而有利于提高管理效率，同时也有利于培养专业管理人才等。企业职能机构，作为企业管理职能的载体，是实现企业发展战略的基石，通常又称为企业组织体制或组织结构。按照部门的职能大小和机构的数量多少不同，企业职能机构设置一般分为“小部制”和“大部制”两种类型。小部制的特征是部门设置机构数量大、管理领域窄小、专业分工细、职能交叉多。目前，我国大部分国有企业实行的是小部门体制，在国有企业尤为盛行，由此引起了人员臃肿，部门间沟通不畅，令行不止等诸多诟病。相比而言，大部制是一种现代企业综合管理组织体制，其特征是在管理过程中各部门职能综合性强、管理范围宽，部门与部门之间扯皮少，政令通畅，工作效率极高。党的十七大的召开后，国家职能部委间开始推行大部制改革，企业职能部门的大部制也随即推上了改革日程，这对接下来的企业管理体制改革的发展方向是具有深远意义的。以某国有大型制造业企业为例，该企业目前职能机构的设置就是典型的小部制体制，各种管理职能机构达30个之多。部门与部门之间存在严重的职能交叉、权责脱节的问题。而实行大部制后，企业可以在信息技术基础的配合下，以系统化的管理思想，为企业决策层、执行层、监督层和员工之间提供管理运行手段，这样对企业可以合理调配资源，完善企业运行机制，履行企业管理职能，以达到最大化地创造企业财富的目的，同时也能通过此方式达到裁减冗员的目的，最终实现企业在市场经济中博弈胜出的有利局面。小部制的实施，很多是企业多年沉淀下来的弊病，由此引发职能的分散和管理层的臃肿现象，既不利于集中统一管理，加强企业应有权威，也不利于落实“问责制”和建设责任到人企业。而大部制则强调的是在分工细化基础上的一种有机统一的全局管理机制，这样能够较好地协调职能机构统一和管理分工的关系，对于协调部门关系、强化企业权威和落实责任追究制具有重要意义。如果企业能将职能部门数量控制在10个以内，则有利于政策指令上通下达，便于管理的衔接和延续。一要实现整合机构，减少管理的层次和环节，优化管理结构。二要实现整合职能，有机合并相近职能，实现一个问题由一个部门全程解决的目的，避免职能交叉。三要实现整合权责，健全企业的权责体系，形成部门间的合理权责构成，达到出现问题能找到责任人的目的，能更好的落实“问责制”。四要实现整合机制，使大部门内部的运行机制能平稳执行，降低协调成本，提高企业管理效能。一要总体统筹职能设置，构建行为监管、经济调节、政策落实和运营管理错落有致的职能构架，使得每一个部门设置都有存在的价值、都能在某一领域独当一面的管理框架。二要总体统筹权力配置，增强企业高层领导团队对下属各职能机构的统筹能力，同时划清他们之间的工作权限。三要总体统筹各种关系，统筹企业人力资源、资产财务、生产制造、设计研发、市场营销等各方面的关系，以及明确相互之间的利益关系，做到一切从企业利益出发的决策指导。一要回应市场经济发展的需要，及时收集市场环境信息，根据阶段政策调整企业发展策略，加强企业发展规划，弱化微观管理，促进在大环境下企业健康有序的快速发展。二要回应行业发展的需要，根据行业市场需求充分发挥部门间的自主策略，做到每一项决策都是有据可依，每一项工作都是有理可靠，保障企业基本管理的良好进行。三要回应技术发展的需要，给研发部门充分的发展空间，减少技术管理层面上的多层领导，实行独立发展策略。四要回应利益多元的需要，充分考虑职工利益与企业利益、企业利益与集团利益、集团利益与社会利益的平衡，有效的防止追逐违法利益的现象发生。一是要进行改革的总体设计，形成包括近期规划和远期改革的整体方案，这样能使企业一直在正确的轨道上运营，而不至于被突发事件搞得措手不及。二是要实行分层要求，对各部门的改革既要明确共同性，又要有不同针对性。改革是长远的，不能是一蹴而就的，需要循序渐进，出现不同的情况要有不同的处理方式。三是要实行分步实施，既要考虑改革目标的实现，又要考虑改革的现实可操作性，尽可能减少改革所带来的负面效应和消极成本。实行企业职能机构大部制改革，应更新理念，运用现代化的组织理论来指导企业组织机构改革，避免传统组织理论的束缚。同时，按管理综合化、精细化的原则，从立项到研发，从生产到销售都要做到连续一贯，把职能相关性强的部门归并到一起。其实施可以归并总结为以下五种形式：在制造业企业中，我们可以将原材料采购、辅助材料采购、设备及相关配件采购、基础建设用料采购，以及办公用品等物资采购归并一起，设立大物资采购部。避免现在的兵分几路、层层审批，多个部门负责不同项目采购的现象。对于企业产品的发送运输可以归并给负责产品生产的生产制造部，这样企业就将所有的生产计划以及物流计划都作为一个整体盘算，便于产品生产和运输的有机整合。同时，可以将检验部门也归生产制造部统一管理，对于在生产过程中的产品质量检验都能顺利穿插进行，并都可以在生产计划中统筹安排。设立具有管理和辅助作业双重职能的部门。对于制造业企业，有很多的加工设备需要维护、保养、维修，我们可以把企业所有的设备（包括生产车间的重型加工设备和办公室的计算机等小型设备）维护都归拢给设备动力部统一负责。除此以外，凡涉及设备动力问题的，我们都可以将类似动力源的生产和管理一并交给设备动力部管辖。传统组织理论要求执行机构同监督机构分开设置。也就是所谓的立法部门必须同执法部门分开设置，这样有利于相互制约，是进行有效控制和管理的重要条件。现代组织理论则认为，执行和监督分设总的来讲是正确和必要的，但同样也会导致机构增多、程序复杂、效率下降等弊病。企业不必国家，相比而言，我们可以尝试在一定条件下，可以对这一原则加以突破，以保证效率原则的贯彻。机械制造业企业与别的企业不同的地方，很大一部分在研发方面。基本所有的机械制造业企业都需要一个庞大的研发机构和技术部门体系，所以在技术先行的前提下，技术方面的机构是有“特权”的。在大部制结构体制下，应该设立一个技术开发中心，其中包括研发、设计、工艺、试验、网络等多个部分。这种良好环境的创造，有利于企业在技术方面的综合发展，对保证企业技术先进和留住技术人才都有至关重要的作用。目前大部分小部制企业的决策职能、执行职能和监督职能不分，监督流于形式，使得决策部门普遍受到执行利益的干扰，导致“问责制”的实施更加困难，企业利益部门化。要解决这个问题，就是要探索建立决策、执行、监督既相互协调又适度分离的运行机制，实现决策科学、执行顺畅、监督有力。这样三者间就能形成一个相互制约、共同发展的良好局面，从而达到事半功倍的效果，这样也就从根本上完善了企业决策执行监管体制。目前，多数企业的综合管理职能与专业管理职能配置不科学。综合管理部门权力过于集中，以致专业管理部门类似项目立项、资金支配等事项都要经过综合管理部门的层层审批，统筹协调困难。因此，必须进一步理顺综合管理部门与专业管理部门的关系，做到各负其责、相互协作。一是综合管理部门要明确定位，主要负责研究制定企业战略、重大规划、协调解决生产过程中的重大问题。二是适当拓宽专业管理部门的权责范围，在条件允许的情况下，给专业管理部门开足绿灯，让其根据自身情况，在不违反企业大规划的前提下，调整自身发展策略，良好运作。企业大部制改革作为企业管理体制改革的关键环节，一定会涉及各部门领导之间复杂的利益关系，所以说这是一项系统工程，必须要有完整的改革规划，坚持整体改革的原则，使大部制改革与其他改革同时进行，并相互协调、彼此促进。由此，要借鉴发达国家的相关经验，首先改革财务管理体制，从源头上控制和降低管理成本，充分发挥财务管理改革对巩固改革成果的约束作用。事实上，很多企业的改革往往是迫于种种外界压力，临时应付，一般只是表面上部门数量的减少，并未触及深层的职能机构优化，缺乏指导改革实践的较为系统和理性的、前瞻性的理论阐释。也就是说，这类企业的大部制改革理论滞后于实践。当前，在新形势下加快企业现代管理体制改革和推行企业职能机构大部制的实施，应从价值选择的角度讨论企业改革。要重视实证研究，调查和总结企业职能结构设置和改革的经验，提炼出具有规律性的通行做法，寻找一条适合自身企业发展的有效的职能机构大部制改革方案。

根癌病是根癌土壤杆菌（Agrobactium spp.）引起的一种顽固性病害，此菌寄主范围广，可侵染93科331个属643个种的植物，包括果树、林木、花卉等多种双子叶植物和部分裸子植物，在生产上造成非常大的损失。调查表明在我国多数种植根癌病寄主植物的地区根癌病均有不同程度的发生。目前生产上明显出现为害的有樱桃、桃树、李子、杏树、葡萄、苹果、梨树、海棠、山楂、核桃、杨树、樱花、玫瑰、月季、啤酒花等果树、林木和花卉，不同地区发生情况不同。根癌病的症状表现是在植物的根部（有时在茎部，所以也称冠瘿病）形成大小不一的肿瘤，初期幼嫩，后期木质化，严重时整个主根变成一个大肿瘤。病树树势弱，生长迟缓，产量减少，寿命缩短，甚至死亡，影响苗圃苗木的质量和成树的生长。重茬苗圃发病率在20%～100%之间不等，发病重的甚至造成毁园。根癌病菌可较长时间的存活在土壤中，从植株的伤口侵入，随苗木的调运进行远距离传播，是土壤传播加苗木传播的细菌性病害。此病菌的致病方式是将其致病质粒上的一段DNA整合到植物的染色体DNA上，随着植物本身的生长代谢来刺激植物细胞增生形成肿瘤，而病原细菌的细胞并不进入植物的细胞。鉴于根癌菌来源于土壤，所以防治的时间应选择在种子或植株接触未消毒的土壤之前进行种子或苗木的处理，从根本上阻止根癌菌的侵入。伤口是根癌菌唯一的侵染途径，所以保护伤口是最好的防治切入点。根癌菌具有非常特殊的致病机制，一旦有根癌症状表现就证明T-DNA已经转移到植物的染色体上，再用杀细菌剂杀细菌细胞已无法抑制植物细胞的增生，更无法使肿瘤症状消失。目前，利用抗根癌菌剂对植物根癌病进行生物防治是非常实用可行的方法。中国农业大学植物病理学系细菌课题组利用引进的国外K84菌株研制成抗根癌菌剂1号，已经成功用于防治我国多种果树根癌病；并且，分离、筛选到一些具有自主知识产权的根癌病生防细菌，可以弥补国外K84菌株的抑菌谱缺陷。本项目以其中一株高效菌株AE进行研究，以形成可以防治多种植物根癌病的抗根癌菌剂2号，解决国外K84菌株只对核果类果树根癌病有效的问题和局限。以活菌量和抑菌活性为指标，通过单因子和正交试验，从18种液体培养基筛选得到1种相对最适的发酵培养基，明确了在小型发酵罐的发酵条件：温度26～29℃，接种量1.5%～2.5%，罐压0.03～0.05MPa，通气量0.6～0.8（V/V·min）。在发酵培养时，0～6h为迟滞期，6～13h为对数期，13～22h为稳定期，22h以后为衰退期。培养21h细胞数量最多，达到1.6×1012cfu/ml；24h时发酵物对根癌菌的抑制作用最强。通过筛选，确定草炭可作为吸附剂，甲基纤维素和黄原胶可作为防护剂和稳定剂，并将发酵终产物制成了10×108 cfu/g的菌剂。该菌剂在室温（20～25℃）保质期约为100天。在不同地区的田间应用示范证明该菌剂对根癌病的防治效果在70%以上，并且防治效果与菌剂的应用方法有密切关系。

营销学泰斗菲利浦·科特勒指出，文化因素（包括文化、亚文化和社会阶层）是影响购买决策的最基本的因素。尤其在当今市场竞争越来越激烈的环境下，文化营销作为一种强有力的营销方式正在被越来越多的企业所运用，文化对消费者的渗透力、对消费者购买心理潜移默化的影响力，在营销过程中显示出惊人的力量，使越来越多的企业正在通过文化营销的方式进行品牌传播、美誉度树立、产品营销，最终达到对消费者的文化影响，促使其在文化的认同与信奉中潜移默化地接受企业或产品的营销攻势，从而毫无抗拒地接受商品。文化营销作为一种新的营销观念是以满足消费者需求的产品同质化为前提，以文化分析为基础，以满足消费者的文化需求为目的，为实现组织的目标而营造、实施、保持的文化渗透过程。文化营销从战略意义上讲是企业为满足差异文化下产生的消费者差异需求而制定的实施强有力文化渗透的战略性营销。文化营销观倡导企业以实现社会价值为组织目标，以此来保持持续的企业源于文化需求的核心竞争力，使之与企业文化的核心价值相一致，并最终形成消费动力。随着社会经济发展水平的提高，满足消费者核心价值需求的产品趋于同质化，产品质的差异化消失，因此，产品除对消费者的功能需求满足外，产品要更加注重表达文化的吸引力，去充当消费者对文化需求的载体，突显出独特的文化价值。文化营销就是将满足消费者核心价值需求的产品作为一种影响文化的载体，满足消费者对文化的深层需求的营销过程。在营销中既要适应已经被广泛认同的目标顾客的意识形态，更要善于发现并利用文化的力量影响和激发深埋于目标顾客内心深处的意识形态，文化营销的核心就是要发现并建立一种品牌与消费者在某一意识形态上能和谐共鸣的契合点，正所谓“高山云雾长，流水叹知音”，通过成功的传播手段，最终给消费者的感受：企业了解我，品牌代表我，产品属于我。文化营销必须根植于品牌和企业文化，是借文化传递和提升品牌的内涵与价值的一种手段，其最高境界就是“随风潜入夜，润物细无声”。寻求差别优势和核心竞争能力是企业竞争中最基本策略选择，然而随着市场竞争的加剧以及企业竞争行为的理性化和消费者的日益成熟，企业之间的差异也越来越小，企业以前具有的战略优势，如自然资源、资金、技术、规模等，由于相互间的差距缩小而不再成为优势；企业在产品、价格、渠道及促销等营销层面上的竞争，也由于信息的畅通和市场机制的完善，而迅速的被模仿和借鉴，唯有根植于品牌的独特文化却无法复制，这便使我们找到了一把能够在激烈的市场竞争中杀出重围、重塑品牌价值的利剑。文化营销的本质目的在于营建企业新型文化价值链，以文化亲和力将各种利益关系群体紧密维系在一起，发挥协同效应，以增强企业整体竞争优势。文化营销是适应消费需求变化，塑造企业竞争优势，弥合文化差异的重要手段。市场营销的核心是以需求为导向，从消费者的需求出发，确定企业生产与销售。随着物质产品的极大丰富，同质产品的无限增多，消费者在多样化选择中认同的不再是产品的使用价值，而是更注重产品独特的文化价值，如产品角色的认同，社会识别等文化需求。营销过程在实物上表现为产品传递以满足需要的过程，而在内层方面，则是一种文化价值的传递和达到满意的过程。现代市场营销是物化营销和文化营销的结合，营销离不开文化。从这一角度来看，文化营销是有意识的发现、甄别、培养或创造某种价值观，激发产品的文化属性，构筑亲和力，把企业营销缔造成为文化沟通，通过与消费者及社会文化的价值共振，将各种利益关系群体紧密维系在一起，从而实现企业经营目标的营销活动。塑造差别优势是企业竞争中最基本的策略选择，在随着企业在技术上差异性的缩小、营销手段趋于雷同的情况下，企业占领市场只有依靠自身品牌所包含的文化差异，通过文化营销来实现。高品位高层次的企业文化，正成为企业生存立足和赢得市场的根本。文化营销以文化之“窗口”扬企业之美名，树企业之形象，使企业文化的价值远远高于其产品自身的价值。中国有句古话：“入境而问禁，入国而问俗，入门而问讳”，恰如其分地表达了进行市场营销前了解文化差异的重要性。地域、民族、宗教、行业等不同都会造成文化差异，对同一商品属性重要程度的评价也由于文化价值观念的差异而不一致。所以，现代企业在营销中必须重视社会文化因素，借助于文化营销，才能适应不同特色的环境，形成自身的独特优势。文化营销的作用在于感情的拉近，即把消费者与产品或企业传达的感受结合起来。比如可以通过组织小规模的经验分享交流会、介绍会，使现代社会人们所感兴趣的关注点被挖掘出来，交流会上大家互通有无，将好思路好方法拿出来与大家分享，营造一种就像大家庭一样的互助互利氛围，在大家的经验中吸取营养，得到快乐，为我所用，从而自然而然的在这种融洽的氛围中传递出对高品质生活的追求，这也正是产品所要表达的价值观念，让你在不经意间产生对产品的认同，接受了产品。第一，企业在制订营销战略目标时，应建立文化子目标，子目标包含扩大企业文化影响力或企业品牌文化的顾客感召力等。在企业细分市场时把文化变量作为一个重要的因素来考虑。第二，在每个有可能与客户接触的链接点上发挥文化营销影响力，将文化的力量渗透进营销全过程。从产品定位、市场细分、产品包装与外观设计、展示与展览、促销策划、服务、CI、VI战略到CS战略、品牌战略、公共关系等方面都注入文化因素，发挥文化影响力。第三，通过积极策划、参与各种具有文化内涵的活动，来聚集目标顾客，传递品牌的内涵与价值。第四，开展文化营销的前提是对文化的深刻领悟和对目标客户群内心世界的精确把握。避免因策划者对文化的领悟不够深入而导致的“肤浅文化”、“另类文化”等，要通过有计划地开展文化营销，既提升品牌的价值，又重新塑造品牌形象，还可以聚焦目标客户。文化环境是企业进行文化营销的前提。从文化营销的角度看，文化环境是文化对消费者欲望与行为所产生影响的具体表现。文化在不同的国家与地区具有不同的特征，并会随着时间的变化而发展。因此，对文化环境的研究要从静态与动态两方面开始，既了解目前的文化需求态势，也应该追踪其发展趋势。文化的变迁标志着人们需求的改变，必将影响企业的营销决策，并会带来新的营销机会。企业必须善于审时度势，提高应变能力，跟上流行趋势顺应文化环境的变化，才能抓住营销机会。美国管理学家戴维·A·利克斯曾说过：“大凡跨文化营销的失败，几乎都是仅仅因为忽略了文化差异基本的或微妙的理解和体会所招致的结果。”不管是国际营销还是国内营销，都要与不同民族、不同文化背景的人打交道，所以必须承认和重视文化差异的影响，通过文化营销，实现跨文化参与及融合，积极影响并引导消费需求，消除偏见，减少盲目性，与顾客、中间商和公众共同构筑沟通的桥梁，确保企业营销沟通活动的顺利进行和营销战略目标的实现。首先，企业异地营销必须重视对当地文化的研究，力求“文化适应”。通过“文化营销”创新，达到相互间的沟通和互融，消除文化障碍，实现消费认同与市场开拓。其次，企业要针对目标市场实施创新型的文化互动。这就要求在进行文化营销时不仅是被动地适应当地文化，而且主动地采用各种文化营销手段，向市场传递企业的经营思想与理念，介绍、传播新的产品与概念，示范、推广新的行为方式，从而迅速有效地将一个社会的文化特征移植到另外一个社会中去，创造新的市场。文化营销是企业对消费者文化需求的反映，其核心在于寻求为顾客所接受的价值信条作为立业之本，从而促进顾客对整个企业包括其产品的认同。因此，企业营销的不仅仅是自己的产品与服务，而且是一种观念，一种消费者需要的为企业所独有的价值理念。只有深刻地领会消费者的文化需求并实施于企业的营销及整个管理活动，才可能获得成功，这就要求企业以消费者文化为前提，构建企业文化，确保文化营销与市场变化相适应。文化营销的核心是消费者利益。文化营销的受体是消费者，最大受益者是消费者，它改变了信息传播、销售渠道、服务的方式，将营销费用降到最低。企业对营销进行引导和管理，为企业赢得更多的资源投入产品核心部分，消费者能够得到更完美的核心部分价值利益。文化营销的实施不是企业直接完成，企业提供的只是产品和企业文化，营销行为由经销商或消费者自己完成，这个过程中消费者既是产品的消费者又是产品的经营者，完成信息传播和销售服务的过程，直接参与企业产生的利润分配。因此，消费文化是“因”，企业文化是“果”，文化营销是“桥梁”，只有在消费者文化的前提下建设企业文化并强化营销，才是文化营销建树和推广的必由之路，反过来文化营销又起到统领与传播企业文化的作用，这样才使企业与内外部环境相互调适，表现出强有力的市场竞争力。消费者是企业赖以生存和发展的养分和基石。企业经营活动的核心是顾客，企业经营能否成功，关键在于企业是否赢得顾客的信任。从企业的角度而言，文化营销是企业向目标市场传递企业形象、企业文化、产品信息并与目标消费者群体建立稳固关系的载体。它通过产品设计、制造、定价、递送、服务、宣传等将自身的文化信息附加于品牌之上，形成品牌信息加以传递，事实上蕴涵着产品品质的担保及职责的承担。企业的诚信将成为文化营销成败的关键要素。可以预见的是，随着消费者对自身利益保护意识的提高，企业对经营发展的需要，国家物质文明与精神文明的不断发展，中国即将迎来一个崭新的文化营销时代。

番茄灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）侵染引起的一种在我国乃至全球分布的重要病害。尤其是保护地番茄，其高湿条件为该病流行创造了有利的发病条件。目前番茄生产由于缺少抗病品种，防治番茄灰霉病仍主要依靠化学防治，多采用速克灵等化学药剂喷雾，但在连续使用的情况下，病菌逐渐产生了抗药性，防效逐年下降。此外，大量使用化学药剂也造成了严重的农药残留问题和环境污染问题。近年来人们通过大量筛选和利用抗灰霉病的有益微生物及其代谢产物，使生物防治日益成为番茄灰霉病控制中的一条重要而有效的途径。作者研究了本实验室筛选的拮抗放线菌B1菌株对番茄灰霉病的生防效应，并对其分类地位进行了初步鉴定，为该菌株的应用与开发提供基础。B1菌株是从北京番茄温室土壤中筛选得到的一株拮抗菌，平板抑菌试验结果表明，它对多种植物病原细菌和真菌有较强的抑制作用，其中对灰葡萄孢的抑制能力最强，抑制率达86.3%。B1代谢产物对番茄灰霉菌的菌丝有扭曲、膨大等致畸效应。室内离体检测表明B1菌株对番茄离体叶片和果实的灰霉病均有较好的防治效果。温室试验证实B1菌株对番茄苗期的灰霉病的防治效果在60%以上。根据B1菌株的形态特征、培养特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析结果，将其鉴定为链霉菌属淡紫灰类群（Streptomyces lavendulae）。

番茄早疫病菌（Alternaria solani）是保护地和露地番茄生产的重要病害之一，为真菌性病害，为害植株后出现慢性枯萎，植株矮小，果实膨大等，可大幅度降低番茄的产量和品质。我国自20世纪80年代开始发生以来，已经成为番茄设施栽培的限制性障碍[1]。在防治上由于长期大量的化学农药使用，使病菌产生了抗药性，防效逐年降低，同时造成了一定的农药污染[2]。随着环境保护呼声的日益高涨，高毒农药的负面影响已引起世界范围的广泛关注，以高效，低毒农药逐步替代传统的高毒农药是农药发展的必然趋势。植物源农药可在环境中迅速分解，对环境无任何影响，是符合环境保护，农业持续发展方向的[3]。细辛（Asarum siebotdii）是多年生草本植物，据中华临床中药学（上卷）记载，根能入药，具有祛风，散寒，风湿弊痛，抗炎等功效，在中药学上有广泛的用途[4]。本实验用中药细辛的根提取物对番茄早疫病菌的菌丝生长及分生孢子萌发的抑制作用进行了室内活性测定，旨在为开发出一种经济、安全、有效的新型杀菌剂提供理论依据。1.1.1 供试样品 试验所用细辛采自山西省历山自然保护区，将采集的植物材料洗净后在室内阴干（约25℃），放入恒温箱内（40～45℃）烘干，磨碎，过60目筛，备用。1.1.2 供试菌种 番茄早疫菌（Alternaria solani），由山西农业大学农学院植物病理实验室提供。1.2.1 细辛提取物的制备 准确取3份细辛根粉50g，分别装入500ml小烧杯内，加入干粉5倍量的有机溶剂甲醇、氯仿、石油醚。室温下（30±2）℃浸泡3～5天后，过滤并浓缩至稠膏状，称取一定量的提取物，加2～3滴吐温80做乳化剂，并依次配成实验所需的浓度，4℃下保存。1.2.2 细辛提取物对番茄早疫病菌菌丝生长的抑制作用 采用生长速率法[5]，用打孔器取6mm菌落边缘生长旺盛的菌种，放在加药的PDA平板上培养，以培养基内加等量无菌水作对照，每次重复3次，置25℃下培养。用十字交叉法测每个菌落的直径，以其平均值代表菌落的直径，以下式求出抑制菌丝生长率：抑制菌丝生长率%=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-0.6）×100%1.2.3 细辛提取物对孢子萌发的抑制作用 分别将3种有机溶剂的细辛提取物制成最终浓度为1mg/ml的细辛提取液的PDA培养基。待培养基冷却后，取预先配置好的孢子悬浮液10μl，接种到直径为9cm的培养皿中央，用涂布器涂抹均匀，在25℃培养箱中培养48h，观查记录孢子萌发数量。每处理设5个重复，取平均值。计算孢子萌发率和抑制率。孢子萌发率（%）=已萌发孢子数/镜检孢子总数×100%抑制率（%）=（对照萌发率-处理萌发率）/对照萌发率×100%1.2.4 细辛氯仿提取物对番茄早疫病菌菌丝抑制中浓度（MIC）的测试 将细辛氯仿提取物稀释成5个浓度（4mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml），测试不同浓度的提取物对番茄早疫病的病原菌菌丝生长的抑制作用，计算毒力回归方程及抑制中浓度（MIC）。细辛提取物对番茄早疫病菌菌丝生长的抑制作用实验结果如表1。在48h时，石油醚提取物的抑菌率为28%，氯仿提取物的抑菌率为66.67%，而甲醇提取物的抑菌率达到了50%。并且随着时间的推移，3种溶剂提取物的抑菌率都有所下降。同时与对照相比，处理的菌丝在培养皿中出现气生菌丝减少，变粗，向上生长现象。这一结果说明，3种不同溶剂的细辛提取物在浓度为2mg/ml时对番茄早疫病的病原菌均有不同程度的抑制作用。溶剂menstruum菌落直径（mm）与抑制率（%）ColonyRadiusandInhabitingrate48h抑制率Inhabitingrate96h抑制率Inhabitingrate144h抑制率Inhabitingrate甲醇methanol1.8550.002.9051.584.5748.82氯仿chloroform1.4366.672.5060.002.7359.57石油醚Petroleumether2.428.004.2024.216.918.71CK3.10—5.35—8.35—表1 细辛提取物对番茄早疫病菌丝生长的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of Asarum siebotdii extract against mycelia Growth of Alternaria solani细辛提取物对番茄早疫病菌孢子萌发的影响见表2。48h后，石油醚和氯仿提取物表现出了显著的抑制率，对分生孢子萌发抑制率分别为91.48%和88.79%，甲醇提取物表现出了较强的抑菌率，达到53.81%。实验过程中发现，对照皿在接种后32～48h即开始陆续萌发，而提取物各处理均不同程度地表现出萌发推迟的现象。溶剂menstruum孢子萌发率（%）Rateofgerminationofconidia萌发抑制率（%）Percentageofinhibition甲醇methanol42.8253.81氯仿chloroform10.4288.79石油醚Petroleumether7.9291.48CK92.92—表2 细辛提取物对番茄早疫病菌孢子萌发的抑制作用Table 2 Inhabiting effect of the different menstruum of Asarum siebotdii extract against conidiao production of Alternaria solani由表1可见，3种不同溶剂的提取物中氯仿提取物的抑菌效果最好，为了进一步确定其生物活性，求出MIC，将细辛氯仿提取物稀释成5个不同浓度，对病原菌进行测定。结果见表3、表4，6天后，浓度在4mg/ml时，氯仿提取物表现出了显著的抑菌率，达到77.14%，而浓度为0.25mg/ml时，抑菌率显著下降，只有9.5%。这一结果说明，细辛氯仿提取物对番茄早疫病菌菌丝的抑制作用与浓度成正相关，随着浓度的下降，抑菌效果也随之下降。同时在96h时求得毒力方程和氯仿提取物的抑制中浓度（MIC）为1.57mg/ml。病原菌Pathogen浓度（mg/ml）concentration菌落直径（mm）与抑制率（%）ColonyRadiusandInhabitingrate48h抑制率Inhabitingrate96h抑制率Inhabitingrate144h抑制率Inhabitingrate番茄早疫病菌Botrytiscinerea4.00001001.9573.622.2577.142.0001.2364.682.9354.404.1251.271.0001.6243.303.4344.634.7342.730.5001.8530.304.2329.045.7229.130.2502.0419.505.307.507.139.50CK2.39—5.72—7.82—表3 不同浓度的细辛提取物对番茄早疫病菌菌丝生长的抑制作用Table 3 Inhibitory effect of the different concentration of Asarum siebotdii extract against mycelia Growth of Alternaria solani处理Treatment毒力方程?RegressiveequationMIC??相关系数r番茄早疫病菌AlternariasolaniY=2.0910+1.6950x1.570.9707表4 细辛提取物对番茄早疫病的毒力Table 4 Virulence of the extracts of Asarum siebotdii seeds against Alternaria solani植物源农药活性物质主要来源于植物体内产生的次生代谢产物，据Swain于1977年报道，次生代谢产物已超过400000种，如有机酸、萜烯类、生物碱、类黄酮、甾体、酚类、蛋白质、单宁和多糖等[6]。据文献报道，苦参中含有苦参碱（Matrine）和氧化苦参碱（Oxymat-rine）等17种化学结构相似生物碱，其中以苦参碱为其最主要的活性成分，对病原菌有较强抑制作用[7]。另外，毛蒿植物中的毛蒿素，南欧丹参中的硬尾醇，苜蓿根部的苜蓿酸以及海红豆中的紫檀素，黄连体内的小孽碱等均具有很强的抗真菌作用[8]。本实验研究表明，3种溶剂的细辛提取物对番茄早疫病菌菌丝和分生孢子萌发都有不同程度的抑制作用，但它们之间的抑制作用存在差异，在抑制菌丝生长方面，氯仿提取物效果最好，甲醇提取物次之，石油醚提取物效果最差。在抑制分生孢子萌发方面，石油醚提取物效果最好，氯仿提取物次之，甲醇提取物效果较差。由于3种溶剂的极性不同，从以上实验结果初步推断细辛体内抑制番茄早疫病菌的活性物质不止一种，而且极性大小在石油醚和氯仿之间。今后的研究方向是探索分离细辛提取物中的活性成分，为进一步产品开发奠定基础。至于细辛提取物是否对其他病菌有抑制作用，有待在以后的实验中证明。

Cavalier-Smith（1981；1988）提出将细胞生物分为八界，《真菌词典》第八版（1995）和第九版（2001）均接受了这一分类系统。在这一分界系统中，卵菌门（Oomycota）属于色菌界（Chromista），有1纲9目及其他地位待定的4目，其中引起植物病害的有水霉目（Saprolegniales）、腐霉目（Pythiales）、指梗霉目（Sclerosporales）和霜霉目（Peronosporales）[1]。卵菌门的共同特征是游动孢子具有一根茸鞭和一根尾鞭，鞭毛呈直管状，有性生殖为卵配生殖，线粒体呈脊管状。在许多方面卵菌与真菌有明显差异，而与藻类更为相似，因此又称卵菌为假真菌（pseudofungi）。卵菌中有许多是重要的植物病原菌，它们的世代短，产孢量大，潜育期短，再侵染次数多，对寄主植物的破坏性强，流行速度快，造成严重的经济损失[2]。在对卵菌的综合防治的措施中，化学防治仍然是控制卵菌病害的主要手段之一，但目前生产中普遍发生了卵菌对现有杀菌剂的抗药性问题，这对当前农业的发展构成了严重的威胁[3]。随着显微技术、化学分析技术和分子生物学的发展，已经能从病原真菌的形态、生理生化和分子等不同水平进行杀菌剂作用机理和抗药性机理的研究[4]。本文就目前常用的四类内吸性杀菌剂对卵菌的作用机理及抗性机理进行了概述，希望能对杀菌剂的合理使用和新型杀菌剂的开发提供一定的理论基础。病害名称病原物病害名称病原物十字花科白锈病白锈菌（Albugocandida）马铃薯晚疫病致病疫霉菌（Phytophthorainfes-tans）谷子白发病禾指梗霉菌（Sclerosporagra-minicola）瓜类疫病掘氏疫霉菌（P.drechsleri）烟草猝倒病瓜果腐霉菌（Pythiumaphanider-matum）辣椒疫病辣椒疫霉菌（P.capsici）黄瓜霜霉病古巴假霜霉菌（Pseudoperonospo-racubensis）柑橘褐腐柑橘褐腐疫霉菌（P.citrophthora）葡萄霜霉病葡萄生轴霜霉菌（Plasmoparaviticola）表1 我国卵菌引起的主要植物病害苯基酰胺类杀菌剂的特点是低毒，选择性强，可以被植物的根、叶和幼茎迅速吸收，并通过导管和细胞间隙等质外体系统向植株上部转移[5]。目前我国使用量较大的有甲霜灵（瑞毒霉）、恶霜灵和湖南省化工研究院开发的苯霜灵等。Dr.P.A.Urech在1977年研究开发了甲霜灵，它是苯基酰胺类杀菌剂中第一个商品化的品种，其特点是病菌在植物体内形成吸胞后抑菌作用才能发挥，对卵菌侵入寄主前的各阶段，如游动孢子的释放、萌发和侵入的抑制作用不明显，但对侵入寄主后的各阶段，如菌丝在植物体内的生长、吸器形成及孢子囊的产生等有显著的抑制作用[6]。最初对苯基酰胺类杀菌剂容易引起病原菌抗药性的问题并未引起注意，直到 1981年荷兰的Dekker发现甲霜灵单剂在葡萄上使用仅一个季度就发生田间抗药性之后才给以重视。Davides等[7]、Shattock等[8]先后证实，甲霜灵的杀菌机理是抑制卵菌的核糖体 RNA聚合酶的活性，从而抑制病菌 RNA 的合成，干扰病菌在寄主体内的发展。特别是 γ-RNA的合成，最敏感的是使尿苷掺入 RNA受阻，但不影响尿苷的吸收和尿苷转化为尿苷酸。用不同种的菌试验结果说明，RNA合成受阻的程度不同，通常达 40%～80%，这表明不是全部的 RNA合成受阻。现已知道有3种RNA的聚合物担负着细胞内核苷酸的聚合。这3种聚合酶称为聚合酶A、B、C，A主要是负责核糖体内γ-RNA的合成，B是用于m-RNA的合成，C则用于 t-RNA和5SRNA 的合成。这3种酶一般是用对α-鹅膏碱的敏感性来区分的。甲霜灵和其相似物对3种酶有选择性抑制作用，主要是对聚合酶A的毒力最大，也就是γ-RNA的合成受阻，核糖体就不正常。因此，对菌的生长有抑制作用，但是对菌的孢子囊的直接和间接萌发以及游动孢子的萌发都没有影响[9～11]。通过对抗药和敏感菌株杂交后代的分析，表明抗药性是由隐性的单基因或核内的单作用位点控制，发展速度快，抗性水平高，抗药菌株遗传稳定，适合度、致病力几乎与野生的敏感菌相同，故经过施药的选择敏感菌很快消亡，抗性菌在群体中得以繁殖发展，并很快成为优势种群，出现田间突然药剂失效[12]。研究表明敏感菌系细胞核中有编码敏感 RNA 聚合酶的基因，而抗性菌系则不含这个基因，因而对药物的反应不敏感而表现抗药性。同时苯基酰胺类杀菌剂之间具有正交互抗性，这给该药剂的进一步开发带来了很大的困难[13，14]。丙烯酰胺类杀菌剂中对卵菌病害有很好防治效果的药剂主要有烯酰吗啉和氟吗啉，其作用机理基本上都是抑制菌体内麦角甾醇的生物合成。麦角甾醇是菌体细胞膜的重要组成部分，它与膜脂中的碳氢键相互作用，有保持膜的流动性和稳定膜分子结构的重要作用。如果麦角甾醇生物合成受阻，膜的结构和选择性屏障作用就受到损害，造成细胞内物质的泄漏，最后导致菌体死亡。用丙烯酰胺类杀菌剂处理真菌后往往能使芽管短而膨胀、过度扭曲，菌丝分枝增加。烯酰吗啉在1988年由Shen Group公司研制开发。烯酰吗啉可强烈抑制游动孢子囊的形成、休眠孢子的萌发和菌丝生长，但不影响游动孢子的释放。与菌丝细胞壁合成相比，孢子囊壁的合成对烯酰吗啉更为敏感。Bartnicki[15]认为由于休止孢萌发和芽管伸长这些阶段菌体内有相对较少碳水化合物来调节渗透压和形成细胞壁，所以烯酰吗啉作用后细胞壁容易产生破裂。Kuhn等[16]和Albert等[17]研究表明烯酰吗啉能导致菌丝生长过程中细胞壁畸形和加厚，最终导致菌丝顶端破裂，认为烯酰吗啉明显干扰了病原菌的形态调节因子或抑制细胞壁结构的正确组合，影响细胞壁的合成。烯酰吗啉1992年获得注册登记并投放市场，尽管已经使用多年，但国内外的室内和田间实践均证明，烯酰吗啉在田间表现为低抗药性风险。Dereviagina等[18]对田间采集的110株马铃薯晚疫病菌的测定发现，存在0.3%～0.8%的抗烯酰吗啉突变体，但抗性菌株的适合度低，而且在连续转代培养过程中抗性丧失。Bagirova等[19]在室内通过化学诱变获得了马铃薯晚疫病菌对烯酰吗啉的抗药突变体，但突变频率低，而且突变株的适合度明显下降。王文桥等[20]获得了葡萄霜霉病菌抗烯酰吗啉的突变体，但未获得马铃薯晚疫病菌的抗药突变体。袁善奎等[21]对马铃薯晚疫病菌抗烯酰吗啉突变体的研究结果与以上学者的报道一致，没有获得高抗药性水平的突变体，但突变体的抗性比较稳定。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是以天然抗生素Strobilurin A为先导化合物而开发的新型杀菌剂，自1969年Musikek及其合作者首先报道以来，对此类化合物的研究已成为杀菌剂开发的新热点。这类杀菌剂具有杀菌谱广和杀菌活性高的特性，具有保护、治疗、铲除、渗透作用，对环境和非靶标生物安全[22]。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的作用位点独特，不同于以往任何抑制剂作用于呼吸链上的位置。Cyt bc1呼吸抑制剂有两类：一类是位于线粒体内膜内壁Qi位点（CoQ的还原位点）的cyt b高势能血红色素结合的抑制剂，这类抑制剂称为Qi位点抑制剂，简称QiIs，如抗霉素，cyanoimidazole等。另一类与位于线粒体内膜外壁的Qo位点（CoQ的氧化位点）的cyt b低势能血红色素结合的抑制剂，这类抑制剂称为Qo位点抑制剂，简称QoIs，如甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂、咪唑菌酮、唑菌酮等[22，23]。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂为能量生成抑制剂，其作用机理是通过与真菌细胞色素b上的辅酶Q0氧化中心结合，阻止细胞ATP的合成，影响能量代谢，从而抑制线粒体的呼吸作用。这种作用阻止氢醌（QH2）向Fe-S中心传递电子，而不是直接阻止与氢醌的结合[24～26]。细胞色素b属于细胞色素bc1复合体的一部分，位于真核生物线粒体膜的内侧，一旦某个抑制剂与之键合，它将阻止细胞色素b和c1之间的电子传递，阻止ATP的产生而干扰真菌内的能量循环，从而杀灭病原菌。在甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂开发和应用的早期，人们认为这类杀菌剂的抗性风险是中等水平，但是1998年德国使用苯氧菌酯防治小麦白粉病2年后发现防效明显下降，原因是小麦白粉病菌产生了抗药性，而且抗药性个体的适合度很高。目前认为这类杀菌剂的抗药性风险是高水平[26]。已经报道QoIs的两种类型的抗药性机理[27，28]。第一种是细胞色素b基因上的氨基酸序列发生改变，从而降低了与药剂的亲和力，主要是143位甘氨酸被丙氨酸取代（G143A）（如黄瓜霜霉病菌、小麦白粉病菌、葡萄霜霉病菌等）和129位苯丙氨酸被亮氨酸取代（F129L）（如稻瘟病菌）。由于cyt bc1基因是线粒体编码的，其抗性遗传方式表现为母性遗传。第二种抗性机理涉及电子传递链中旁路氧化酶（Alternative Oxidase，AOX）的活性，通过旁路途径减少甚至消除QoIs对病菌电子传递的抑制作用。（咪）唑类杀菌剂活性高、作用机理独特，与现有杀菌剂无交互抗性，能与多种杀菌剂混配，可有效缓解内吸性杀菌剂的抗性问题。唑菌酮由杜邦公司开发，对锈病、霜霉病、晚疫病等均具有良好保护、治疗、渗透、内吸等作用。它对病原菌在生长过程中所释放出的孢子影响最大，药剂一旦与孢子接触，孢子即停止活动，出现崩死。另外，对孢子的萌发和菌丝的伸长也有一定的抑制作用[30]。唑菌酮能抑制病原菌线粒体的电子传递，主要阻断细胞色素b和细胞色素c之间的电子传递通道中ADP-ATP的氧化磷酸化作用，使病原菌无法产生所必需的能量。417407唑菌酮也是QoIs，作用机理同于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂。由于分子结构的差异，它与cyt b的结合方式不同[31]。唑菌酮能抑制病原菌线粒体的电子传递，主要阻断细胞色素b和细胞色素c之间的电子传递通道中ADP-ATP的氧化磷酸化作用，使病原菌无法产生所必需的能量。417407唑菌酮也是QoIs，作用机理同于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂。由于分子结构的差异，它与cyt b的结合方式不同[31]。类型代表品种杀菌机理抗药性风险水平苯基酰胺类甲霜灵恶霜灵苯霜灵抑制卵菌的核糖体RNA聚合酶的活性，从而抑制病菌RNA的合成，干扰病菌在寄主体内的发展作用位点单一，容易产生高水平抗药性突变菌株丙烯酰胺类烯酰吗啉氟吗啉抑制菌体内麦角甾醇的生物合成，造成细胞内物质的泄漏，最后导致菌体死亡突变频率低，突变菌株适合度差，表现为低抗药性风险甲氧基丙烯酸酯类嘧菌酯苯氧菌酯烯肟菌酯通过与细胞色素b上的辅酶QO氧化中心结合，阻止细胞ATP的合成，从而抑制线粒体的呼吸作用单一位点的突变，表现为高水平的抗药性（咪）唑类唑菌酮咪唑菌酮阻断细胞色素b和细胞色素c之间的电子传递通道中ADP-ATP的氧化磷酸化作用，抑制病原菌线粒体的电子传递田间使用较少，抗药性风险水平暂时不明确表2 防治卵菌病害的内吸性杀菌剂的主要类型、代表品种、杀菌机理、抗药性风险水平杀菌剂对病菌的影响是多方面的，其作用位点也相对比较复杂，由于病原菌抗药性的不断出现和抗性程度的不断上升，对研制开发广谱、新型杀菌剂的要求越来越强烈。但化学杀菌剂开发的难度越来越大，开发费用越来越高，开发新型农药的速度远远落后于病原菌抗性发展的速度。因此，明确杀菌剂的作用机理和抗性机理，对创制作用机理独特、环境友好的杀菌剂尤为重要。卵菌的进化一般认为是从水生到陆生，由腐生到专性寄生。卵菌大部分生活在水中或潮湿的土壤中，部分比较高等接近陆生的卵菌主要寄生在高等植物体内。因此，卵菌具有一个共同的特点“亲水—疏油”。因此，在农药剂型的选择上，水剂、水乳剂、水分散粒剂、悬浮剂与卵菌有更好的亲合性，更适合卵菌病害的防治，能更好地发挥药效[32]。在新型农药品种开发的时候，要进行抗性风险评估，采取科学合理的防治措施和使用规范。在未产生抗药性之前推广使用混合制剂，这样能减少选择压力，延缓抗性的产生，延长已开发产品的使用寿命。因此，根据卵菌的生物学特性、卵菌病害循环的规律和药剂的作用机理，要将病害的预测预报、农药剂型、用药规范、作物种类、作物品种、当地的气候条件和当地作物的抗性水平等因素结合起来，综合考虑制定防治策略，才能保证农业的可持续发展和生态环境的和谐发展。

灰霉病是保护地蔬菜栽培中危害十分严重的病害，传统的化学防治造成了严重的农药残留和环境污染。应用微生物进行生物防治能够克服上述缺点，是一种安全、有效和环保的方法。本研究旨在从黄瓜植株内分离、筛选能够抑制灰霉病的拮抗细菌，并测定拮抗菌株在不同处理下对灰霉病的防治作用。主要结果如下：通过平板对峙培养筛选出8株对黄瓜灰霉病菌具有较强拮抗作用的细菌，再对这8株菌发酵滤液的抑菌活性进行测定，选出抑制效果最好的两个菌株B12和B13，抑制率分别为84.0%和81.8%。在离体叶片上，B12、B13发酵滤液对灰霉病菌的扩展均有较强的抑制作用，抑制率分别为83.2%和81.4%。两菌株活性产物可引起病原菌菌丝扭曲，菌丝膨大成串珠状分枝，顶端膨胀后细胞壁破裂，原生质外溢，产生溶菌作用。B12、B13发酵液对于灰霉病菌孢子的萌发具有强烈的抑制作用。在孢子萌发试验中，经B12、B13发酵液处理的孢子萌发率仅分别为5.5%和8.6%，滤液对孢子萌发的抑制效果与发酵液相近。将两菌的发酵滤液置于不同的温度和pH环境下处理，当温度在100℃以下、pH值在6～9时，滤液的抑菌效果表现出较强的稳定性。在温室试验中，两菌发酵液对灰霉病有较好的预防效果，B12、B13的保护防效分别为70.5% 和68.7%，治疗防效分别为51.2%和47.8%。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是土壤和植物微生态的优势种群，内生芽孢，抗逆能力强，繁殖速度快，营养要求简单，对农作物安全。作为植物根际有益微生物，通过分泌抗生物质和生长竞争，在防治植物病害方面发挥多种有益作用[1]。剂型以活体芽孢为主，田间施用可以较长时间的发挥抑制病菌作用[2～3]。枯草芽孢杆菌Xi-55是本课题组从水稻植株上分离、筛选出来的一株活性较强的生防菌株，研究发现对多种植物病原菌具有良好的防治作用[4]。芽孢杆菌的发酵培养是工业化大规模生产芽孢杆菌制剂的前提。本文对所筛选出的枯草芽孢杆菌的发酵条件进行优化，进行20L发酵罐的放大培养研究，以提高其发酵水平，为芽孢杆菌制剂的工业化生产提供参考依据。1.1.1 供试菌株 枯草芽孢杆菌Xi-55，四川省农业科学院植物保护研究所分离获得。1.1.2 培养基 斜面培养基（LB培养基）：酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH值7.0。种子培养基（BPY培养基）：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，酵母膏 5g，葡萄糖 5g，蒸馏水1000ml，pH值7.0。基础发酵培养基（KB培养基）：蛋白胨 20g，甘油 10ml，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，蒸馏水1000ml，pH值7.0。1.2.1 培养方法 将保存在斜面上的菌种用接种环以划线形式接入LB平板上，28℃恒温培养24h活化。将活化的菌株接入装有100ml种子培养基的250ml三角瓶中，在28℃，180rpm条件下，振荡培养36～48h，制备液体种。按1%的接种量接入发酵培养基（100ml/250ml三角瓶），摇床振荡培养，测定发酵菌数量。1.2.2 生长量的测定 采用平板菌落记数法。培养液用10倍梯度稀释法稀释6～7个梯度（101，102，103，……，107）后，选择3个稀释度较高的梯度稀释液，分别吸取50μl在LB平板上，然后用灭菌的L形玻棒将菌液涂匀，每梯度重复3次。28℃恒温培养24～36h后，调查平板上的菌落数，然后计算活菌数（cfu/ml）[5]。1.2.3 培养基的优化 采用正交表L9（34）[6]，四因素三水平安排试验。1.2.4 发酵条件的优化 采用优化培养基通过单因子试验，测定不同时间、温度、初始pH值、接种量和装液量对发酵菌数的影响。1.2.5 扩大培养 采用德国产Biostat C 20L全自动液体发酵罐，配制发酵培养基10L，添加消泡剂CXX-910 0.5‰。种子培养及接种量均同摇瓶试验。发酵技术参数设为：发酵温度28℃±0.5℃，通气量10L/min，搅拌转速180rpm，溶氧控制设定为以通气量为主、转速为辅，罐压0.05～0.06MPa，初始pH值为7.2。每隔4h取样，测定发酵菌数和观察芽孢形成情况，同时记录罐体内pH值变化。分别以培养时间为横坐标，菌数和pH值为纵坐标，绘制枯草芽孢杆菌在发酵罐中培养的生长曲线和pH值曲线。采用L9（34）正交设计方案，分四因素三水平对Xi-55发酵培养，测定高峰期菌数，正交试验因素水平见表1，正交设计及结果见表2，极差分析见表3。结果表明：4种营养成分对其菌数影响的顺序是A＞C＞D＞B，培养基成分优化组合为A3B2C1D3，即蛋白胨3%，甘油1.0%，K2HPO4 0.05%，MgSO4·7H2O 0.15%。试验因素Experimentalfactor水平（Level）（%）123蛋白胨（Peptone）123甘油（Glycerine）0.51.01.5K2HPO40.050.100.15MgSO4·7H2O0.050.100.15表1 培养基优化正交试验因素水平Table 1 Orthogonal experimental factor levels for medium optimization试验号Experimentalnumble水平（Level）（%）A[蛋白胨]PeptoneB[甘油]GlycerineC[K2HPO4]D[MgSO4·7H2O]菌数（Bacteriumamount）（109cfu/ml）111117.01212225.25313331.834212318.585223110.92623129.927313211.428321325.259332123.00表2 培养基优化L9（34）正交设计及结果Table 2 L9（34） orthogonal design and results for medium opitizationA[蛋白胨]PeptoneB[甘油]GlycerineC[K2HPO4]D[MgSO4·7H2O]K14.7012.3315.6113.64K213.1413.8114.068.86K319.8911.588.0615.22R15.192.237.556.36优化组合Optimization-groupA3B2C1D3因素顺序FactororderA＞C＞D＞B表3 培养基优化L9（34）的极差分析Table 3 Range analysis of L9（34） for medium opitization2.2.1 时间对Xi-55发酵细菌数量的影响 每隔12h从摇床上取样，测定发酵液中细菌数量，绘制Xi-55生长曲线。结果显示（图1），在发酵0～12h 之间，菌体生长繁殖缓慢；12～36h 为菌体生长加速期，也为菌体繁殖高峰时期，发酵液内细菌数量明显增加；36～48h为稳定期，菌体数量基本稳定；60h以后为孢子衰亡期，活菌由于自身产生的分解物质而使菌体分解，发酵液变透明。根据该试验结果，36～48h为Xi-55适宜发酵时间。2.2.2 温度对Xi-55发酵细菌数量的影响 分别置于24℃、26℃、28℃、30℃和32℃摇瓶培养，测定不同培养温度的生长量，结果表明（图2），28℃细菌数量最高，28～30℃细菌数基本稳定，低于28℃和超过30℃菌数明显下降。所以28～30℃为Xi-55适宜发酵温度。图1 时间对发酵菌数的影响Figure 1 Effects of time on the bacteria amount图2 温度对发酵菌数的影响Figure 2 Effects of temperature on the bacteria amount2.2.3 初始pH值对Xi-55发酵细菌数量的影响 设定pH值分别为5，6，7，8，9的培养基摇瓶培养，测定细菌生长量。结果显示（图3），当pH值为7时，细菌数量最高，当pH值为 7～8时，细菌数量基本稳定；pH值低于7和超过8，菌数明显减少；且 pH值为9或5时，菌体数量急剧减少或为零，据此推断pH值高于9或低于5时，Xi-55生长可能严重受抑制甚至不能生长，有待进一步研究。所以发酵培养基的适宜初始pH值为7～8。2.2.4 接种量对Xi-55发酵菌数的影响 分别采用0.5%、1%、2%、3%、4%等5个接种量梯度摇瓶培养，测定细菌生长量，结果显示（图4），接种量在0.5%～2%范围内，菌量数随接种量的增加而增加，接种量为2%时，菌量数最高；接种量超过2%，菌数明显减少。总体上来看，菌体生长量并非随着接种量的增加而增加，而是有一个限度。所以，2%为最佳接种量。图3 初始pH值对发酵菌数的影响Figure 3 Effects of initial pH value on bacteria amount图4 接种量对发酵菌数的影响Figure 4 Effects of inoculation amount on bacteria amount2.2.5 装液量对Xi-55发酵菌数的影响 采用装液量分别为50ml/500ml、100ml/500ml、150ml/500ml、200ml/500ml锥形瓶摇床振荡培养，测定细菌生长量，试验结果表明，通过摇瓶装液量的不同来调节通气量对Xi-55发酵菌数有较大影响。一定范围内，装液量越少，则通气量越高，氧气供应越充足，那么细菌数量就越高。50ml与100ml装液量差别不明显，但从总生长量考虑，100ml/500ml锥形瓶为最佳装液量（图5）。图5 装液量对发酵菌数的影响Figure 5 Effects of pack amount on bacteria amount在摇瓶优化发酵条件的基础上，进行了20L发酵罐的扩大培养。从生长曲线（图6）可以看出，发酵罐扩大培养的发酵周期与摇瓶发酵周期基本一致。由于发酵罐的搅拌和通氧条件均优于摇瓶发酵，因此，菌体浓度和芽孢同步形成率都明显优于摇瓶发酵。36h菌体数量达到最高量，50.61×109cfu/ml；然后进入稳定期，开始大量形成芽孢，44h形成芽孢90%以上。分析pH值曲线（图6）发现，初始pH值7.2，随着菌体生长，pH值缓慢下降；对数生长期菌体迅速繁殖，pH值也急剧下降，表明菌体大量利用养分产生了酸性物质；稳定期随着芽孢逐渐形成，pH值回升，44～48h时，芽孢数量达到最大；52h以后pH值上升至7.4左右，可以看到菌体碎片，细胞自溶，表明生长和代谢受到抑制。因此，发酵终止应在52h前，最佳放罐时间应在44～48h。图6 20L发酵罐中的生长与pH值曲线Figure 6 The growth and pH curve in 20L fermentation tank从以上试验可以看出，培养基的组成和时间、温度、培养基初始pH值、接种量、通气量、摇床转速等培养条件均对菌株的生长有很大的影响。通过单因子试验和正交试验方法，确定枯草芽孢杆菌Xi-55优化培养基为：蛋白胨3%，甘油1.0%，K2HPO4 0.05%，MgSO4·7H2O 0.15%；优化发酵条件为：时间36～48h，温度28～30℃，初始pH值7～8，接种量2%，装液量100ml/500ml锥形瓶，摇床转速180～200rpm。并进行了发酵罐扩大培养，36h达到生长高峰期，最适放罐时间44～48h；此时所获得的菌体数量约为50亿个/ml，为大规模工业化发酵培养提供了有益借鉴。在发酵过程中发现，发酵液的黏度较大，很容易产生泡沫，必须用消泡剂来消除。而本试验中采用的发酵专用含硅消泡剂CXX-910对pH值有轻微影响，故添加消泡剂不宜过多。操作时可预先在培养基里添加少量消泡剂，然后通过发酵罐上的补料装置在发酵过程中自行控制补充，这样可以在满足消泡的同时尽量降低消泡剂的添加量，减少消泡剂对pH值的影响，比一次性添加或单纯通过补料装置添加效果要好。